Situ Hibridizasyonda 16S rRNA Floresan ile Mesane Biyopsilerinde Doku Dağı Bakterilerin In Salgılanması

Bu protokol, hasta biyopsilerinde doku ilişkili bakterilerin situ hibridizasyon ve konfokal mikroskopide 16S rRNA ile tarafsız olarak saptanması içindir.

Burada biyopsi yapılan mesane dokusundaki bakterilerin tespiti için sağlam bir protokol sunmaktayız ve bakterilerin mevcut olduğundan şüphelenilen birçok doku tipine geniş uygulamalar uygulama maktadır. Bu tekniğin en büyük avantajı tarafsız olmasıdır. Araştırmacının hangi bakteri türünün mevcut olduğu hakkında bir priori bilgisi olmadan doku içindeki bakterileri tespit etmesini sağlar.

Bu teknik, bakterilerin tekrarlayan idrar yolu enfeksiyonu olan kadınların mesane duvarlarını işgal edip etmemiş olduğunu belirlemeye yardımcı olabilir ve doku yada antibiyotik seçimi gibi terapötik seçenekleri bilgilendirmek. Mesane dokuları için tasarlanmış iken, Bu teknik geniş minimal optimizasyon ile yerleşik bakteri popülasyonları ile diğer dokulara uygulanabilir. Bu teknikte yeni olan bireyler kapak kaymaları yerleştirme ve görüntüleme ile mücadele edebilirler.

Kabarcıkları azaltmak için kapak lı yerleşimi optimize etmeye odaklanın ve değerli olmayan numuneler üzerinde görüntüleme alıştırması yapın. Bu prosedürü göstermek için yardımcı Jashkaran Gadhvi, benim laboratuvarda bir lisansüstü öğrencisi olacaktır. Bu prosedürü başlatmak için, boş bir duman kaputunu veya uygun şekilde donatılmış biyogüvenlik dolabını %70 etanolile temizleyin.

Metin protokolünde belirtildiği gibi gerekli tüm arabellekleri ve reaktifleri hazırlayın. Sonra,% 70 etanol ile beş Coplin kavanoz temiz ve kavanoz kuru izin. Kavanozlar kuruduğunda, burada gösterildiği gibi etiketleyin ve uygun çözeltinin 100 mililitresi ile doldurun.

Duman kaputuna, biyopsi başına iki slaytı dikey bir slayt rafına yerleştirin. Dikey slayt rafını Xylenes 1 Coplin kavanozuna 10 dakika yerleştirin. Bundan sonra, kavanozdan slayt rafı çıkarın ve fazla ksilenleri kaldırmak için bir kağıt havlu üzerinde alt leke.

10 dakika xylenes 2 kavanoz içine raf yerleştirin. Sonra parafinize edilmiş doku kesitlerini ardışık etanolyıkamada 10'ar dakika boyunca yeniden sulandırın. Yıkar lar tamamlandığında, fazla etanol çıkarmak için kağıt havluüzerinde slayt rafının alt leke ve 100 mililitre filtre içeren Coplin kavanozuna raf yerleştirin sterilize, 10 dakika boyunca çift distile su.

Bu yıkama sırasında, sondaları hibridizasyon tamponunda 10 nanomolar ile seyrelterek boyama çözeltisi oluşturun ve slayt başına 150 mikrolitre boyama çözeltisi hazırladığından emin olun. Bir P1000 uç kutusunun rezervuarına ıslatılmış, buruşturulmuş hassas bir görev mendili ve steril su ekleyerek her sonda için bir nemlendirici hazne hazırlayın. Slaytların oturacağı yer olduğu için uç tutucu kartuşunu üste yerleştirin.

Son yıkama tamamlandığında, slaytı raftan çıkarın ve doku tarafı yukarı, taze bir kağıt havlu üzerine yerleştirin. Slayt ı kurutmak için hassas bir görev silme kullanın, sadece yavaşça yakın dab için dikkatli olmak ama su wick için biyopsi bölümünde değil. Hidrofobik kalem kullanarak, biyopsi bölümünün etrafına bir kenarlık çizin ve slayt dokusu tarafını nemlendirici hazneye yerleştirin.

Daha sonra, nemlendirme odasını 50 santigrat dereceye ayarlanmış bir kuluçka makinesine yerleştirin. Pipet arasında 50 ve 150 mikrolitre boyama çözeltisi doğrudan doku üstüne böylece doku etrafında hidrofobik sınır tarafından yapılan dikdörtgen doldurulur ve yavaşça kutuyu kapatın. Karanlıkta bir gecede 50 santigrat derecede kuluçkaya yat.

Kuvöz bir pencere varsa, karanlık bir ortam yaratmak için alüminyum folyo zekâ kapağı. Ertesi sabah, nemlendirici odalarından slaytları çıkarın ve hassas bir görev silme ile kalan hibridizasyon çözümuzak hızlı bir şekilde fit. Sonra dikey bir boyama raf içine kenarları yerleştirin.

10 dakika önceden ısıtılmış yıkama tampon100 mililitre içeren alüminyum folyo sarılmış Coplin kavanoz içine boyama raf yerleştirin. Yeni Coplin kavanoztaze yıkama tampon ile bu yıkama adımı iki kez daha tekrarlayın. Bu yıkama adımları sırasında, 1-1000 oranında, yıkama tampon Hoechst 33342 bir stok çözeltisi seyrelterek karşı leke hazırlamak.

Aynı tüp için, 33 nanomolar son konsantrasyonuna mililitre başına beş mikrogram ve Alexa-555 Phalloidin son konsantrasyonuna Alexa-555 buğday tohumu agglutinin ekleyin. Kullanıma hazır olana kadar karanlıkta saklayın. Son yıkama tamamlandığında, Coplin kavanozundaki slaytları çıkarın ve hassas bir görev mendiliyle fazla yıkama tamponuna hafifçe fitil leyin.

Bir kağıt havlu üzerine slaytlar doku tarafı yerleştirin ve hidrofobik sınır dolu, ancak taşan değil, doğrudan doku üstüne karşı leke 50 ila 150 mikrolitre arasında ekleyin. Bir kriyobox-top ile dört slayt kadar kapak ve 10 dakika oda sıcaklığında kuluçka. Bundan sonra, geri boyama rafiçine slaytlar yerleştirin ve her yıkama 10 dakika süren, taze yıkama tampon içeren Coplin kavanozlarda iki kez daha yıkayın.

Sonra iyice slaytlar kuru ve bir kriyobox-top altında bir kağıt havlu üzerinde doku tarafı yerleştirin. Bir damla montaj ortamını doğrudan dokunun üzerine sıkıştırın ve üzerine uygun büyüklükte bir kapak kaymasını nazikçe yerleştirin. Yavaşça herhangi bir kabarcıklar dışarı basın ve kapak kayma slaytlar karanlıkta bir gecede tedavi sağlar.

Ertesi gün, açık oje açık bir kat ile slayt için kapakların kenarlarını mühür ve 10 dakika boyunca karanlıkta kurumaya bırakın, dört derece santigrat karanlıkta saklamadan önce. Lekeli biyopsileri görüntülenmeye hazır olduğunuzda, konfokal mikroskobu ve mikroskopla ilişkili yazılımı açın. FISH pozitif slaytla başlayın ve bilgisayar görselleştirme moduna geçin.

405, 488 ve 555 için kanalları seçin. Bu durumda 555 olan en uzun dalga boyu kanalını kullanarak iğne deliğini ayarlayın. Daha sonra 488 kanalda etiketli bakterilerin görselleştirilmesi için geçerli odak düzlemi bulun.

Odak düzlemini değiştirmeden, her kanal için kazanç, lazer gücü ve ofset ayarlayın, böylece sinyal doygun değildir ve arka plan aşırı düzeltilmez. Görüntüyü üç kanaldan da edinin. Bu çalışmada insan mesane biyopsilerinde doku ilişkili bakteriler 16S rRNA FISH ile saptanmıştır.

Bu protokol, parafin gömülü mesane biyopsisi bölümlerinde mesane mukozası ile ilişkili bakterilerin tarafsız tespiti için optimize edilmiştir. Burada gösterilen tekrarlayan idrar yolu enfeksiyonları olan kadınlardan elde edilen mesane biyopsisi bölümlerinde bu protokolü kullanarak yapılan bir deneyden temsili konfokal mikrograflar gösterilmiştir. İki seri bölüm ya evrensel 16S rRNA veya scramble probları ile melezlenir.

Doku ve bakterilerin aynı bölgeden çekilen görüntüler 16S rRNA probları ile melezleştirilmiş dokuda temiz bir şekilde görülebilir, ancak karıştırma sondası ile birlikte değildir. Yanlış pozitif sonuçlar da mümkündür. Bu temsili yanlış pozitif, bir sinyal otofloresan kollajen veya elastin karşılık gelen bir sinyal tespit 405 ve 488 kanalları nda hem 16S rRNA ve scramble prob hibrid biyopsi bölümleri, her zaman bir scramble prob kontrolü kullanarak önemini vurgulayan.

Foto-beyazlatma önlemek için, problar uygulandıktan sonra ışığa doku maruz ilerler. Bu teknik insan dokularında bakterilerin tarafsız tespiti için izin sağlarken, türlere özel bilgi vermez. Taksonomi özel probları ile Multiplex-FISH cins veya türlerin tanımlamak için kullanılabilir.

Bu teknik geliştirilmeden önce, daha önce bakterilerin insan tekrarlayan İye hastalarının mesane duvarını istila edebileceği kanıtlanmamıştı. Şu anda hangi bakteri türlerinin mevcut olduğunu belirlemek için cins ve türe özgü sondalar kullanıyoruz. Ksilenler toksisite nedeniyle bir duman başlık kullanılmalıdır.

Görüntüleme sırasında lazere doğrudan bakmamaya özen yapılmalıdır. Lazer, slaytınızı hedef altında konumlandırırken kapatılmalıdır.