Tüberküloz Moleküler Bakteriyel Yük Analizi (TB-MBLA)

Bu Tüberküloz Moleküler Bakteriyel Test, üç anahtar soruyu cevaplıyor. Bir: Hastanın hastalık yükünün büyüklüğü nedir? İki: Hasta hastalığı yükü anti-tüberküloz ilaçlarına nasıl tepki verir?

Ve üç:Hastalık yükü ile tedavi yanıtı arasındaki ilişki nedir? Bu titre, hastanın tüberküloz yükünün nicel bir sonucunu ortaya çıkarır ve bu yükün kısa sürede tedavi ile nasıl değiştiğini ölçer. Modifikasyon ile bu metodoloji diğer bakteriyel patojenlere uygulanabilir.

Tüberküloz olmayan mikobakterilerin ve kronik obstrüktif akciğer hastalığı ile ilişkili bakterilerin tanısı için benzer bir teknoloji geliştirdik. Bu tekniği ilk kez uygularken videoyu izleyin ve adımları uygulayın. Hasta tanı sonuçları için gerekli olmayan örneklerle pratik yapmak çok önemlidir.

Görsel gösterim, özellikle metnin metinde açıklanması zor olan adımları öğrenmeyi ve ustalaşmayı basitleştirdiği için önemlidir. Hücre kültürlerini hazırlayarak başlayın. Temiz bir laboratuvar bankında veya birinci sınıf kabinde, 15 mililitrelik plastik tüplere bir mililitre lik üstel faz Bacille Calmette-Guerin veya BCG kültürünü hasat edin ve sıkıca kapatın.

Hastanın balgam örneklerini hazırlarken, iyi havalandırılan bir alanda çalışın ve GL One Stop TB el kitabındaki yönergeleri izleyin. Dikkatle 15 mililitre plastik santrifüj tüpler içine numune fincan ve pipet bir mililitre aliquots açın. Sonra, tüpleri sıkıca kapatın.

Numune tüplerini, her tüpün 3/4'ünün batırıldığından emin olmak için, önceden ısıtılmış 95 dereceye kadar önceden ısıtılmış bir su banyosuna daldırılmış bir tutucu rafa aktarın. Örnekleri 20 dakika kaynatın. Daha sonra tüpleri oda sıcaklığında beş dakika soğuması için tezgaha aktarın.

Fenol kloroform veya tümör sermayee etanol ile bir kit kullanıyorsanız bir duman kaputunda RNA ekstraksiyon gerçekleştirin. Burada gösterilen RNA prosedürü fenol kloroform ekstraksiyon prosedürüdür. Ancak, RNA ekstraksiyonu için alternatif yöntemler de kullanılabilir.

Isı inaktive örnek bir mililitre aliquots aktarın 1.5 mililitre tüpler ve her örnek içine ekstraksiyon kontrolü başak 100 mikrolitre. Tüpleri kapatın ve üç kez ters çevirerek karıştırın. Tüpleri 20,000 kez 10 dakika santrifüj edin.

Sonra, süpernatant aspire, tortu 50 mikrolitre bırakarak. 950 mikrolitre likit tampondaki tortuyu borular halinde tutarak askıya alıyoruz ve tüm süspansiyonu RNA ekstraksiyon kiti ile birlikte verilen lysing matris tüplere aktarıyoruz. Tüpleri sıkıca kapatın ve hem kapakta hem de yan tarafta etiketlendiklerinden emin olun.

Daha sonra, 6, 000 rpm 40 saniye boyunca örnekleri homojenize. Oda sıcaklığında beş dakika boyunca 12, 000 kez g lysate santrifüj. Bu arada, taze bir mililitre tüpler hazırlamak ve kloroform 300 mikrolitre ekleyin.

Lysing matrisine dokunmadan süpernatantı dikkatlice aspire etmek ve kloroform ile tüpe aktarmak için bir mililitrelik pipet kullanın. Girdap tüpler beş saniye için ve beş dakika ya da üç aşamaları açıkça görülebilir kadar yerleşmek için bırakın. Tüpleri 12,000 kez g beş dakika santrifüj edin.

Daha sonra, dikkatle üst faz pipet ve 1.5 mililitrelik bir tüp aktarın. Numuneye 500 mikrolitre buz soğuksu %100 etanol ekleyin, tüpü kapatın ve karıştırmak için üç kez ters çevirin. Tüpleri eksi 80 derecede 15 dakika veya eksi 20 derecede 30 dakika kuluçkaya yatırın.

Daha sonra tüpleri önceden soğutulmuş mikro santrifüj ve santrifüje 13, 000 kez g ve 4 santigrat derecede 20 dakika yükleyin. Supernatant atın, 13, 000 kez g başka bir 10 dakika için% 70 buz soğuk etanol ve santrifüj 500 mikrolitre ekleyin. Tüm supernatant atın.

Ve tüpleri 50 derecede 20 dakika boyunca kuluçkaya yatırArak nükleik asit peletini kurutun, tüpleri kısmen açık tutarak etanolün buharlaşmasını sağlar. Daha sonra, pelet çekirdeksiz su 100 mikrolitre ekleyin ve beş dakika oda sıcaklığında kuluçka. Üç saniye boyunca örnek girdap ve DNA kaldırma ile devam edin veya eksi 80 santigrat derece kullanmaya hazır olana kadar saklayın.

Hazırlanan DNA'nın bir karışımı, el yazması yönlere ve pipetlere göre RNA ekstresi içeren her tüpe 11 mikrolitre. Üç saniye boyunca girdap ve tüp duvarından herhangi bir damlacıkları kaldırmak için kısa bir süre aşağı spin. Daha sonra tüpü sıcak blokta veya kuluçka makinesinde 30 dakika boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın.

Kuluçkadan sonra, doğrudan tüpe DNA'nın bir enziminin bir mikrolitresini ekleyin ve girdap yaparak iyice karıştırın. Sonra tüpleri 37 derecede 30 dakika daha kuluçkaya yatırın. Çözülme ve girdap DNA'nın inaktivasyon reaktifi.

Daha sonra, her RNA ekstresi için 10 mikrolitre ekleyin. Ve tüpleri oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçka adımı sırasında tüpleri üç kez girdap.

Daha sonra karışımı 13,000 kez g'de iki dakika santrifüj edin ve süpernatant'ı 1,5 mililitrelik RNA'nın serbest tüpüne dikkatlice aktarın ve inaktivasyon matrisinin hiçbirine dokunmadığından emin olun. Tüm bilinmeyen RNA örneklerini RNA'nın serbest suyunda 1'den 10'a kadar seyreltin, beş saniye girdap yaparak karıştırın ve kısa bir süre için aşağı doğru döndürün. MTB ve EC-RNA örneklerini eritin ve standart bir eğri için sırasıyla yedi ve altı on kat seyreltme yapın.

RT plus ve RT eksi PCR ana karışımlarını el yazması yönlere göre hazırlayın. Vortex RT artı karışımı ve her RT artı PCR tüp içine 16 mikrolitre aktarın. Sonra, girdap RT eksi karışımı ve her RT eksi PCR tüp içine 16 mikrolitre ekleyin.

Rt artı tüplere dört mikrolitre RNA ekstresi veya su ekleyin ve çoğaltın. Su şablon olmayan kontrol veya NTC'dir. RT eksi tüplere dört mikrolitre RNA ekstresi veya su ekleyin.

Reaksiyon tüplerini gerçek zamanlı PCR makinesine yükleyin, el yazmasında açıklandığı gibi reaksiyonu programlayın ve reaksiyonu çalıştırın. Tedavi yanıtını yorumlamak için, CQ değerlerini bakteriyel yüke dönüştürmek için standart eğriyi kullanın ve tedavi takip süresi boyunca bakteriyel yükteki değişim olarak yanıtı hesaplayın. Tedavi sonrası bakteriyel yükteki düşüş olumlu bir tepki yitirmezken, bakteriyel yükte herhangi bir değişiklik veya artış olumsuz yanıt anlamına gelir.

Tüm M.tüberküloz basillerinin ısı inaktive edildiğini doğrulamak için hücrelerin optik yoğunluğu ölçüldü ve canlı hücrelerle karşılaştırıldı. Büyüme olmadığını gösteren ısı inaktive örnekleriiçin zaman içinde OD'de bir değişiklik gözlenmedi. Isı inaktive örnekleri 37 santigrat derecede, Hücrelerin ısı inaktivasyonu sonrasında RNA'nın bozulup bozulmadığını belirlemek için kuluçkaya yatırıldı.

Isı inaktivasyonundan hemen sonra hasat edilen RNA ile RNA'nın hem BCG kültüründe hem de Tüberküloz pozitif balgamda bir, iki, üç ve dört gün sonra izole edilmesi arasında fark saptanmadı. RNA'nın A enzimi numunelere ekolarak, ısı inaktivasyonundan önce ve sonra ekolarak eklendiğinde, dört günlük kuluçka dönemi boyunca tüm ısı inaktive örneklerinde RNA kaybı meydana geldi. Isı inaktivasyonunun ribozomal RNA üzerindeki etkisi BCG kültürlerinde ve balgamda Tüberküloz pozitif hastalarda ölçüldü.

Kontrol kültürünün ölçülen bakteriyel yükü, hem BCG hem de balgam örnekleri için 80 santigrat derece, 85 santigrat derece ve 95 santigrat derece sıcaklık la aktive edilmiş kültürün toplam bakteriyel yükünden daha yüksekti. Örneklerin ısı inaktivasyonu rna en az kaybına neden olur, downstream TB-MBLA ve diğer downstream moleküler testler için yeterli RNA bırakarak. İletim Elektron Mikroskobu, hücrelerin ısı inaktivasyonu ile lysed olup olmadığını araştırmak için kullanılmıştır.

Alt ve yüksek büyütme hücrelerinin incelenmesi bozulmamış hücre duvarları ve görünür hücre içi lipid organları ortaya koymuştur. Hücreler uzamış görünüyordu, ama lysed değil. Bu yordamı denerken, kötü RNA çıkarma nedeniyle herhangi bir yanlış negatif sonuç için kontrol çıkarma denetimi eklemek için hatırlamak önemlidir.

Bu yaklaşım kronik obstrüktif akciğer hastalığı, tüberküloz olmayan mikobakteri enfeksiyonu ve diğer solunum patojenleri ile ilişkili bakterilere uygulanabilir. TB-MBLA'nın kantitatif sonuçları, hastaların tüberküloz tedavisine nasıl tepki veremrilik lerinin matematiksel ve farmako-modellemesini sağlamıştır. Tüberküloz hastalarının tedavi edildiği rutin bakımda bu tekniği uygulamayı dört gözle bekliyoruz.