Name: Tüberküloz Moleküler Bakteriyel Yük Analizi (TB-MBLA) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Öğrenin, tüberküloz bakteri yükünü güvenli ölçmek için ısı inaktivasyonu ve gerçek zamanlı PCR kullanarak moleküler analiz yöntemini. Bu teknik, tedavi yanıtını izlemeye ve bulaşıcı hastalık teşhisine uygulanabilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Çalışma, Avrupa ve Gelişmekte Olan Ülkeler Klinik Deneyler Ortaklığı (EDCTP) – Pan Afrika Biyomarker Genişletme programı (PanBIOME) hibeS.2011.41304.008'den gelen finansman la mümkün kılındı. Destek de Üniversitesi St Andrews Tıp Fakültesi araştırma hibe elde edildi. Bu makalenin ve TB-MBLA protokolünün görsel bir kaynak olarak yayınlanması, İskoç Finansman Konseyi ve Küresel Zorluklar Araştırma Fonu'ndan St Andrews Üniversitesi'ne yapılan fonla mümkün kılınmıştır. Klinik balgam örnekleri sağlayan Maputo Maternal hastanesi ve Mavalane Sağlık Merkezi ve klinik balgam örneklerinin ısı inaktivasyon deneylerine yardımcı olan Maputo Tuberculosis Tedavi Birimi ekibi sayesinde.

1. Örnek Hazırlama
<ol><li>
Kültür
	<ol>
<li>Temiz bir tezgah veya sınıf 1 kabin üzerinde çalışan, 15 mL plastik santrifüj tüpler içine üstel faz Bacillus Calmette-Guérin (BCG) kültürünün 1 mL aliquots hasat. Tüpleri sıkıca kapatın. NOT: 5 mL numunenin tamamını işlemek için beş tane 15 mL santrifüj tüp gereklidir. DİkKAT: Herhangi bir tüberküloz kültürü ile çalışırken biyogüvenlik kabinesi gereklidir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Hasta balgam örneği
	<ol>
<li>İyi havalandırılan bir alanda çalışan ve burun maskesi takan, numune kabını dikkatlice açın, pipet 1 mL aliquots 15 mL plastik santrifüj tüpler içine ve sıkıca tüpleri kapatın. NOT: Geniş bir ağız ucu pipet balgam önerilir. Bir makas kullanarak, daha geniş bir ağız oluşturmak için 1 mL ucu ağzın ince kısmını kırpın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Isı İnaktivasyonu
<ol><li>Numune hazırlamadan önce su banyosunu 95 °C'ye ayarlayın. NOT: 95 °C sıcaklık, RNase aktivitesini azaltma şansını artırır ve böylece tb-MBLA'nın aşağı sıcanında daha fazla RNA korur.</li>
	<li>Örnek tüpleri su banyosuna daldırılmış bir tutucu rafa aktarın. Her numune tüpünün dörtte üçünün suya daldırıldığından emin olun.</li>
	<li>20 dk için 95 °C'de kaynatın, rna ekstraksiyonbaşlamadan önce oda sıcaklığında 5 dakika soğuması için tezgah tüpleri aktarın. NOT: M. tüberküloz basili ve BCG'nin tam ısı inaktivasyonu, büyümeyi doğrulamak için 37 °C'de 37 °C'de ısı inaktive edilen numune ve kontrollerin kuluçkaya yatırılarak doğrulandı. 600 nm (OD600)optik yoğunluk ölçümü taban çizgisinde ve daha sonra 42 günlük kuluçka dönemi için haftalık olarak alınmıştır.</li>
</ol>3. RNA Çıkarma
NOT: Burada açıklanan RNA çıkarma işlemi, Malzeme Tablosu'ndalistelenen RNA kiti içindir. Farklı üreticiler tarafından diğer uygun RNA ekstraksiyon kitleri kullanılabilir.
<ol><li>Ekstraksiyon kontrolü (EC) ilavesi
	<ol>
<li>Isı inaktive örneklerinin 1 mL aliquots'u 1,5 mL tüplere aktarın. Her numuneye 100°L'lik BIR AK saplayın, tüpü kapatın ve tüpü ters 3 kat ters çevirerek karıştırın. NOT: EC TB-MBLA hayati bakteri kiti(Tablo Malzemeler)ile birlikte verilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Hücre sedimantasyonu
	<ol>
<li>Bir tezgah üstü mikrocentrifuge kullanarak, oda sıcaklığında 10 dakika için 20.000 x g tüplersanrifuge. Pipet süpernatant kapalı, tortu 50 μL bırakarak.</li>
		<li>Tortuyu 950 μL lysis tamponunda yukarı ve aşağı borular oluşturarak askıya alın ve tüm süspansiyonu RNA ekstraksiyon kiti(Malzeme Tablosu)ile birlikte verilen lysing matris tüpüne aktarın. Tüplerin sıkıca kapatıldığından emin olun ve hem kapağı hem de tüpün yan tarafını etiketlayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Hücre lizisi için tüpleri adım 3.2.2'den homogenizer aktarın. 6,000 rpm'de 40 s için örnekleri homojenize.</li>
	<li>Nükleik asit saflaştırma
	<ol>
<li>Oda sıcaklığında 5 dk için 12.000 x g adım 3.3 den lysate santrifüj.</li>
		<li>Taze 1 mL tüpler hazırlayın ve her tüpe 300 μL kloroform ekleyin.</li>
		<li>1 mL'lik bir ucu nilya lama matrisine dokunmadan süpernatanttandan dikkatlice pipet kullanın.</li>
		<li>5 s. Için tüpler ve girdap içeren klorotant transfer üç faz (üst, orta ve alt) açıkça görülebilir kadar 5 dakika veya daha uzun yerleşmek için tüp bırakın.</li>
		<li>Oda sıcaklığında 5 dk için 12.000 x g santrifüj. Üst fazı dikkatlice pipetle ve taze 1,5 mL tüplere aktarın.</li>
		<li>Adım 3.4.5 tüpler için, buz gibi% 100 etanol 500 μL ekleyin, tüpleri kapatın ve yavaşça baş aşağı 3x ters çevirerek karıştırın. Tüpleri 15 dakika veya -20 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın ve ekstraksiyona devam edin veya ertesi gün ekstraksiyonu tamamlamak için gece boyunca -20 °C'de bırakın.</li>
		<li>Mikrocentrifuge'u 4 °C'ye ayarlayın ve santrifüje başlamadan önce en az 12 °C'ye soğumaya bırakın. 13.000 x g20 dk için mikrocentrifuge ve santrifüj içine tüpler yükleyin. Supernatant atın,% 70 buz gibi etanol ile değiştirin ve 13.000 x gbaşka bir 10 dakika için santrifüj . NOT: %70 etanol moleküler sınıf nükleaz içermeyen su ile yapılmalıdır.</li>
		<li>3.4.7 adımdaki tüm süpernatant'ı atın ve tüpleri 50 °C'de ayarlanmış bir kuluçka makinesine aktarın. RNA/DNA peletini kurutmak için 20 dk kuluçkaya yatırın. Tüm etanol buharlaşma sağlamak için tüpler kısmen açık tutun.</li>
		<li>Kuru peletve oda sıcaklığında 5 dakika kuluçka için nükleaz serbest su 100 μL ekleyin. Girdap için 3 s içeriğini karıştırmak için. NOT: Bu aşamada ekstre buzdolabında 2−3 gün veya -80 °C'de 3.5 bölümü yapılana kadar saklanabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>DNA kaldırma NOT: Ekstrede DNA varlığı MBLA sonucunu geçersiz kıldığı için bu adım çok önemlidir. Bu bölüm DNA kaldırma kiti(Malzeme Tablosu)dayanmaktadır.<ol>
<li>Numune sayısı için DNase I 10x tampon ve DNase I enziminin bir karışımını hazırlayın (numune başına 10 μL tampon ve 1 μL DNase) artı pipetlemeden kaynaklanan herhangi bir kaybı karşılamak için %10 ekstra. RNA ekstresi içeren her tüp içine girdap ve daha sonra pipet 11 μL ile karıştırın.</li>
		<li>3 s girdap tarafından karıştırın ve sonra kısaca spin (10 s at 13,000 x g) duvarlarda herhangi bir damlacıkları kaldırmak için. Sıcak blok veya kuluçka makinesinde 30 dakika boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın. Her tüpe doğrudan 1 000 Adet DNase I enzimi ekleyin, girdap yaparak iyice karıştırın ve 37 °C'de 30 dakika daha kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>DNase kuluçka süresinin bitiminden 10 dk önce DNase inaktivasyon reaktifini eritin. Vortex 20 s homojen, sütlü süspansiyon sağlamak ve sonra adım 3.5.2 her RNA ekstresi içine DNase inaktivasyon reaktif10 μL ekleyin.</li>
		<li>5 dk kuluçka adımı sırasında 5 dk. Vortex 3x oda sıcaklığında karışımı kuluçka.</li>
		<li>Karışımı 13.000 x g'de 2 dk. Dikkatli bir şekilde süpernatant'ı 1,5 mL RNase serbest tüpe inaktivasyon matrisine dokunmadan aktarın.</li>
		<li>RT-qPCR'ı aynı gün veya uzun süreli depolama için -80 °C'de çalıştırıyorsanız RNA ekstresini buzdolabında saklayın.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Ters Transkriptaz qPCR
<ol><li>Bilinmeyen numuneler için, rna içermeyen suda 1:10 oranında kullanılmak üzere tüm RNA ekstrelerini seyreltin. 5 s için girdap tarafından iyice karıştırın ve kısaca herhangi bir damlacık veya hava kabarcıkları kaldırmak için aşağı spin.</li>
	<li>Standart bir eğri için standart numuneler için -80 °C'lik dondurucudan Mtb ve EC RNA standartlarını alın ve oda sıcaklığında çözülün. Mtb ve EC standart numunelerinin sırasıyla yedi ve altı 10 kat seyreltmesini yapın. Karışımı bir tüpten diğerine aktarmadan önce ipuçlarını değiştirin. NOT: Standart numuneler TB-MBLA kiti ile birlikte verilir.</li>
	<li>
Master karışım hazırlama NOT: Ana karışım (MM), hiçbir şablon denetimi (NTC) için tüm numuneleri, standartları ve suyu yükseltmek için yeterli PCR reaktiflerinin bir çözümüdür. NTC olarak kullanılan su, ekstraksiyonda ve MM'nin hazırlanmasında kullanılan suyla aynı olmalıdır. RT- reaksiyonu DNA çıkarma etkinliğini belirlemek için bir kontroldür (Tablo 1).<ol>
<li>Her PCR reaksiyon tüpüne 16 μL MM aktarın.</li>
		<li>Her RT+ ve RT- reaksiyon tüpüne 4 μL RNA ekstresi ve NTC reaksiyon tüplerine su ekleyin.</li>
		<li>Reaksiyon tüplerini gerçek zamanlı bir PCR makinesine yükleyin ve PCR koşullarını şu şekilde ayarlayın: 30 dakika için 50 °C, 15 dakika için 95 °C, 45 s için 94 °C'de 40x döngüler ve yeşil ve sarı kanallarda emilen floroforlarla 1 dk için 60 °C. NOT: Yeşil kanal Mtb algılama florofor ve sarı ekstraksiyon kontrol algılama florofor olduğunu.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sonuç yorumu NOT: Aynı örneğin yinelenen reaksiyonlarının 1'den fazla standart sapma ile farklılık sağlamadığından emin olun. Mtb ve 30'dan büyük EC Cq değerleri negatif olarak kabul edilir. Tablo 2'dekidiğer yorumlama ayrıntılarına bakın.<ol>
<li>Tedavi yanıtını yorumlamak için, standart eğriyi kullanarak Cq değerlerini bakteriyel yüke (eCFU/mL) dönüştürün. Tedavi takip süresi boyunca bakteriyel yükteki değişim olarak tedavi yanıtını okuyun. NOT: Tedaviden sonra bakteriyel yükteki düşüş olumlu bir yanıtı (yani, anti-TB ilaçların Tüberküloz bakterisini öldürmesi) gösterirken, bakteriyel yükte herhangi bir değişiklik veya artış olumsuz bir yanıt anlamına gelmez, bu da Tüberküloz lu bakterilerin anti-Tüberküloz ilaçlarına veya hastanın tedavi dozuna uygun şekilde bağlı kalarak direnç anlamına gelebilir. TB-MBLA ile ölçülen bakteriyel yükteki düşüş, MGIT zamanının artmasıyla kültür pozitifliği (TTP) ile ilişkilidir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. İletim Elektron Mikroskobu
<ol><li>2 mL ısı aliquots ısı inaktive kültürler ve kontrolleri 2 mL mikrosantrifüj tüpler içine aktarın. 20.000 x g10 dakika santrifüj .</li>
	<li>Supernatant atın ve hücre fiksasyon tampon 700 μL pelet askıya ve hücreleri düzeltmek için 5 dakika oda sıcaklığında kuluçka.</li>
	<li>Sert bir pelet elde etmek için 16.000 x g 30 dk için süspansiyon santrifüj. Supernatant atın ve fosfat tamponlu salin % 1 sakaroz ile değiştirin (PBS). Elektron mikroskobu için kesit edinene kadar peletleri 4 °C'de saklayın.</li>
	<li>
Kesit ve TEM NOT: Aşağıdaki protokol Griffiths ve ark.28'denuyarlanmıştır.<ol>
<li>Hücre peletini 4 °C'de bir gecede PBS'de 2,1 M sakaroza katıştırarak kriyokoruma. 3 x buz gibi suyla yıkayın.</li>
		<li>Sıvı nitrojen dondurucu korumalı hücre peletleri serin ve onları kriyomikrotomi saplama monte. Kriyomikrotomu kullanarak, ultra ince bölümleri 90 nm'de kesin.</li>
		<li>PBS'de %2 metil selüloz ve 2,1 M sakaroz karışımının 1:1 karışımıtungsten tel döngüleri kullanarak kesme kesitlerini alın.</li>
		<li>Bölümleri pioloform kaplamalı 150 örgü altıgen bakır TEM desteklerine (ızgaralara) aktarın ve 4 °C'de saklayın veya 5.4.5 adıma geçin.</li>
		<li>Metil asetat bir film uranyl asetat ve hava-kuru ızgaraları kontrast. Izgaraları buz gibi suyla yıkayın ve ardından 5 dk üzerinden iki damla PBS ve 15−30 dk kurulayın. NOT: Tüm etiketleme adımları ortam sıcaklığında yapılan yıkama adımları dışında buz sıcaklığında (sıvı sıcaklık) gerçekleştirildi.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((END+TB+Global+Tuberculosis+Report+2017%5BTitle%5D)+AND+%22World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">END TB Global Tuberculosis Report 2017.</a> World Health Organization. , (2017).</li>
<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+tuberculosis+report+2018%5BTitle%5D)+AND+%22World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">Global tuberculosis report 2018.</a> World Health Organization. , (2018).</li>
<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TB+Elimination+in+Low-Incidence+Countries%5BTitle%5D)+AND+%22World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">TB Elimination in Low-Incidence Countries.</a> World Health Organization. , (2014).</li>
<li>Boehme, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((diagnostic+accuracy%2C+and+effectiveness+of+decentralised+use+of+the+Xpert+MTB%2FRIF+test+for+diagnosis+of+tuberculosis+and+multidrug+resistance%3A+a+multicentre+implementation+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">diagnostic accuracy, and effectiveness of decentralised use of the Xpert MTB/RIF test for diagnosis of tuberculosis and multidrug resistance: a multicentre implementation study.</a> The Lancet. 377, 1495-1505 (2011).</li>
<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xpert+MTB%2FRIF+assay+for+the+diagnosis+of+pulmonary+and+extrapulmonary+TB+in+adults+and+children%5BTitle%5D)+AND+%22World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">Xpert MTB/RIF assay for the diagnosis of pulmonary and extrapulmonary TB in adults and children.</a> World Health Organization. , (2010).</li>
<li>Friedrich, S. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+sensitivity+and+specificity+of+Xpert+MTB%2FRIF+assay+as+an+early+sputum+biomarker+of+response+to+tuberculosis+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Respiratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Assessment of the sensitivity and specificity of Xpert MTB/RIF assay as an early sputum biomarker of response to tuberculosis treatment.</a> The Lancet Respiratory Medicine. 1, 462-470 (2013).</li>
<li>Desjardin, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+Sputum+Mycobacterium+tuberculosis+Messenger+RNA+as+a+Surrogate+for+Response+to+Chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Measurement of Sputum Mycobacterium tuberculosis Messenger RNA as a Surrogate for Response to Chemotherapy.</a> American Journal of Respiratory Critical Care Medicine. 160, 203-210 (1999).</li>
<li>Hellyer, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Viable+Mycobacterium+tuberculosis+by+Reverse+Transcriptase-Strand+Displacement+Amplification+of+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Detection of Viable Mycobacterium tuberculosis by Reverse Transcriptase-Strand Displacement Amplification of mRNA.</a> Journal of Clinical Microbiology. 37, 518-523 (1999).</li>
<li>Honeyborne, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Bacterial+Load+Assay+%2C+a+Culture-Free+Biomarker+for+Rapid+and+Accurate+Quantification+of+Sputum+Mycobacterium+tuberculosis+Bacillary+Load+during+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Molecular Bacterial Load Assay , a Culture-Free Biomarker for Rapid and Accurate Quantification of Sputum Mycobacterium tuberculosis Bacillary Load during Treatment.</a> Journal of Clinical Microbiology. 49, 3905-3911 (2011).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sputum+Mycobacterium+tuberculosis+mRNA+as+a+Marker+of+Bacteriologic+Clearance+in+Response+to+Antituberculosis+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Sputum Mycobacterium tuberculosis mRNA as a Marker of Bacteriologic Clearance in Response to Antituberculosis Therapy.</a> Journal of Clinical Microbiology. 48, 46-51 (2010).</li>
<li>Honeyborne, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Molecular+Bacterial+Load+Assay+Replaces+Solid+Culture+for+Measuring+Early+Bactericidal+Response+to+Antituberculosis+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The Molecular Bacterial Load Assay Replaces Solid Culture for Measuring Early Bactericidal Response to Antituberculosis Treatment.</a> Journal of Clinical Microbiology. 52, 3064-3067 (2014).</li>
<li>Hellyer, T. J., Jardin, L. E. D. E. S., Hehman, G. L., Cave, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Analysis+of+mRNA+as+a+Marker+for+Viability+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Quantitative Analysis of mRNA as a Marker for Viability of Mycobacterium tuberculosis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 37, 290-295 (1999).</li>
<li>Aellen, S., Que, Y., Guignard, B., Haenni, M., Moreillon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Live+and+Antibiotic-Killed+Bacteria+by+Quantitative+Real-Time+PCR+of+Specific+Fragments+of+rRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+agents+chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Detection of Live and Antibiotic-Killed Bacteria by Quantitative Real-Time PCR of Specific Fragments of rRNA.</a> Antimicrobial agents chemotherapy. 50, 1913-1920 (2006).</li>
<li>Deutscher, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradation+of+RNA+in+bacteria%3A+Comparison+of+mRNA+and+stable+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Degradation of RNA in bacteria: Comparison of mRNA and stable RNA.</a> Nucleic Acids Research. 34, 659-666 (2006).</li>
<li>Gupta, R. K., Srivastava, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resuscitation+Promoting+Factors%3A+A+Family+of+Microbial+Proteins+in+Survival+and+Resuscitation+of+Dormant+Mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Resuscitation Promoting Factors: A Family of Microbial Proteins in Survival and Resuscitation of Dormant Mycobacteria.</a> Indian Journal of Microbiology. 52, 114-121 (2012).</li>
<li>Mukamolova, G. V., Turapov, O., Malkin, J., Woltmann, G., Barer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resuscitation-promoting+factors+reveal+an+occult+population+of+tubercle+bacilli+in+sputum%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Resuscitation-promoting factors reveal an occult population of tubercle bacilli in sputum.</a> American Journal of Respiratory Critical Care Medicine. 181, 174-180 (2010).</li>
<li>Sheridan, G. E. C., Masters, C. I., Shallcross, J. A., Mackey, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+mRNA+by+Reverse+Transcription-PCR+as+an+Indicator+of+Viability+in+Escherichia+coliCells+Detection+of+mRNA+by+Reverse+Transcription-PCR+as+an+Indicator+of+Viability+in+Escherichia+coli+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Environment+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Detection of mRNA by Reverse Transcription-PCR as an Indicator of Viability in Escherichia coliCells Detection of mRNA by Reverse Transcription-PCR as an Indicator of Viability in Escherichia coli Cells.</a> Applied Environment Microbiology. 64, 1313-1318 (1998).</li>
<li>Honeyborne, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+bacterial+load+assay%2C+a+culture-free+biomarker+for+rapid+and+accurate+quantification+of+sputum+Mycobacterium+tuberculosis+bacillary+load+during+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Molecular bacterial load assay, a culture-free biomarker for rapid and accurate quantification of sputum Mycobacterium tuberculosis bacillary load during treatment.</a> Journal of Clinical Microbiology. 49, 3905-3911 (2011).</li>
<li>Sabiiti, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Bacterial+Load+Assay%3A+a+Fast+and+Accurate+Means+for+Monitoring+Tuberculosis+Treatment+Response%5BTitle%5D)+AND+%22BMJ+Global+Health%22%5BJournal%5D)">Molecular Bacterial Load Assay: a Fast and Accurate Means for Monitoring Tuberculosis Treatment Response.</a> BMJ Global Health. 2, 1-8 (2017).</li>
<li>Gillespie, H., Stephen, S. W., Oravcova, K. Mybacterial Load Assay. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGillespie%2C+H+%22Diagnostic+Bacteriology.+Methods+and+Protocols%22">Diagnostic Bacteriology. Methods and Protocols</a>. Bishop, A. K. , Humana Press. Totowa, NJ. 89-105 (2017).</li>
<li>Juffs, H., Deeth, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scientific+Evaluation+of+Pasteurisation+for+Pathogen+Reduction+in+Milk+and+Milk+Products%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Standards+Australia+New+Zealand%22%5BJournal%5D)">Scientific Evaluation of Pasteurisation for Pathogen Reduction in Milk and Milk Products.</a> Food Standards Australia New Zealand. , Wellington, New Zealand. (2007).</li>
<li>Holmes, C. J., Degremont, A., Kubey, W. Effectiveness of Various Chemical Disinfectants versus Cleaning Combined with Heat Disinfection on Pseudomonas Biofi lm. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHolmes%2C+CJ+%22Blood+Purification%22">Blood Purification</a>. 22, 461-468 (2004).</li>
<li>Chedore, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+inactivating+and+fixing+unstained+smear+preparations+of+Mycobacterium+tuberculosis+for+improved+laboratory+safety%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Method for inactivating and fixing unstained smear preparations of Mycobacterium tuberculosis for improved laboratory safety.</a> Journal of Clinical Microbiology. 40, 4077-4080 (2002).</li>
<li>Cardoso, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+of+Tubercle+Bacilli+in+Heat-fixed+and+Stained+Sputum+Smears%5BTitle%5D)+AND+%22Mem%C3%B3rias+do+Instituto+Oswaldo+Cruz%22%5BJournal%5D)">Survival of Tubercle Bacilli in Heat-fixed and Stained Sputum Smears.</a> Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 96, 277-280 (2001).</li>
<li>Doig, C., Seagar, A. L., Watt, B., Forbes, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficacy+of+the+heat+killing+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">The efficacy of the heat killing of Mycobacterium tuberculosis.</a> Journal of Clinical Pathology. 55, 778-779 (2002).</li>
<li>Honeyborne, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+bacterial+load+assay+replaces+solid+culture+for+measuring+early+bactericidal+response+to+antituberculosis+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The molecular bacterial load assay replaces solid culture for measuring early bactericidal response to antituberculosis treatment.</a> Journal of Clinical Microbiology. 52, 3064-3067 (2014).</li>
<li>Sabiiti, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+Inactivation+Renders+Sputum+Safe+and+Preserves+Mycobacterium+tuberculosis+RNA+for+Downstream+Molecular+tests%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Heat Inactivation Renders Sputum Safe and Preserves Mycobacterium tuberculosis RNA for Downstream Molecular tests.</a> Journal of Clinical Microbiology. , 1-8 (2019).</li>
<li>Griffiths, G., McDowall, A., Back, R., Dubochet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+preparation+of+cryosections+for+immunocytochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ultrasructure+Research%22%5BJournal%5D)">On the preparation of cryosections for immunocytochemistry.</a> Journal of Ultrasructure Research. 89, 65-78 (1984).</li>
<li>Kumar, V. G., Urs, T. A., Ranganath, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MPT+64+Antigen+detection+for+Rapid+confirmation+of+M.+tuberculosis+isolates%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">MPT 64 Antigen detection for Rapid confirmation of M. tuberculosis isolates.</a> BMC Research Notes. 4, 79(2011).</li>
<li>Zwadyk, P., Down, J. A., Myers, N., Dey, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rendering+of+mycobacteria+safe+for+molecular+diagnostic+studies+and+development+of+a+lysis+method+for+strand+displacement+amplification+and+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rendering of mycobacteria safe for molecular diagnostic studies and development of a lysis method for strand displacement amplification and PCR.</a> Journal of Clinical Microbiology. 32, 2140-2146 (1994).</li>
<li>Blackwood, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viability+testing+of+material+derived+from+Mycobacterium+tuberculosis+prior+to+removal+from+a+Containment+Level-III+Laboratory+as+part+of+a+Laboratory+Risk+Assessment+Program%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Viability testing of material derived from Mycobacterium tuberculosis prior to removal from a Containment Level-III Laboratory as part of a Laboratory Risk Assessment Program.</a> BMC Infectious Diseases. 5, 3-9 (2005).</li>
<li>Somerville, W., Thibert, L., Schwartzman, K., Behr, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+Mycobacterium+tuberculosis+DNA%3A+a+Question+of+Contaiment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Extraction of Mycobacterium tuberculosis DNA: a Question of Contaiment.</a> Journal of Clinical Microbiology. 43, 2996-2997 (2005).</li>
<li>Bemer-Melchior, P., Drugeon, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+Mycobacterium+tuberculosis+for+DNA+typing+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Inactivation of Mycobacterium tuberculosis for DNA typing analysis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 37, 2350-2351 (1999).</li>
<li>McKillip, J. L., Jaykus, L. A., Drake, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((rRNA+stability+in+heat+killed+and+UV-irradiated+enterotoxigenic+Staphylococcus+aureus+and+Escherichia+coli+O157%3AH7%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Appied+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">rRNA stability in heat killed and UV-irradiated enterotoxigenic Staphylococcus aureus and Escherichia coli O157:H7.</a> Journal of Appied Environmental Microbiology. 64, 4264-4268 (1998).</li>
<li>Blank, A., Dekker, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribonucleases+of+Human+Serum%2C+Urine%2C+Cerebrospinal+Fluid%2C+and+Leukocytes.+Activity+Staining+following+Electrophoresis+in+Sodium+Dodecyl+Sulfate-Polyacrylamide+Gels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Ribonucleases of Human Serum, Urine, Cerebrospinal Fluid, and Leukocytes. Activity Staining following Electrophoresis in Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gels.</a> Biochemistry. 20, 2261-2267 (1981).</li>
<li>O'Leary, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+the+impact+of+endogenous+ribonucleases+on+reverse+transcription-PCR+assay+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reducing the impact of endogenous ribonucleases on reverse transcription-PCR assay systems.</a> Clinical Chemistry. 45, 449-450 (1999).</li>
<li>Yamada, H., Yamaguchi, M., Chikamatsu, K., Aono, A., Mitarai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structome+analysis+of+virulent+Mycobacterium+tuberculosis%2C+which+survives+with+only+700+ribosomes+per+0.1+fl+of+cytoplasm%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Structome analysis of virulent Mycobacterium tuberculosis, which survives with only 700 ribosomes per 0.1 fl of cytoplasm.</a> PLoS One. 10, 1-14 (2015).</li>
<li>Yang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+species-specific+features+of+the+ribosome+from+the+human+pathogen+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Structural insights into species-specific features of the ribosome from the human pathogen Mycobacterium tuberculosis.</a> Nucleic Acids Research. 45, 10884-10894 (2017).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu makale, tüberküloz örneklerini 80 °C, 85 °C ve 95 °C'de 20 dk ısıl işlemin etkili bir şekilde inaktive ettiğini ve tb-MBLA'nın laboratuvar çalışanlarına enfeksiyon riski olmadan CL3 dışı bir tesiste yapılmasını mümkün kılabilir. Bulgular mtb25,,30ısı inaktivasyonu etkinliği bazı tezat ise önceki çalışmalarda yapılan gözlemler ilerler. Örneğin, bazı raporlar 80 °C'deısıtmanınyüksek basil yük örnekleri 25,31,3232,33'teetkili olmadığını göstermektedir. Çalışmamızda tüm balgam ve saf kültürlerin 15 mL santrifüj tüp başına 1 mL hacimde ısıtılmasını sağlayarak numunenin her bir parçasını kaynamaya maruz bırakmak için yeterli alan sağlanarak yüksek yoğunluklu inokül etkisi önlenmiştir27.
Isı inaktivasyonu ndan sonra RNA'nın korunması, TB-MBLA'nın yapılmasını mümkün kılar. Bu bulgu ısı inaktivasyonu12,,34sonra RNA korunması gösterdi iki çalışma ile aynı fikirde . Isı yalıtımlı numunelerde RNA'nın 37 °C'de 4 gün boyunca stabil olduğunu gösterdik, bu da laboratuvarların bir hafta oda sıcaklığında inaktive numuneler tutarak toplu testler yapabileceğini ima etti. Soğutma veya donma gerektiren RNA ekstraksiyon kitleri uygulayarak, oda sıcaklığında ısı inaktive numuneleri muhafaza yeteneği, hem soğuk zincir hem de Kategori 3 laboratuvarlarının kaynak sınırlı ayarlarında TB-MBLA'yı gerçekleştirmesi gereğini ortadan kaldırabilir.
1log'dan daha az bakteriyel yük, işaretleyici olarak 16S rRNA kullanılarak kaybedildi. Canlı ve ısı inaktive numunesi arasında fark olmasına rağmen, ısı inaktivasyonunda kaybedilen miktar akış aşağı sonuçlarını tehlikeye atamayacak kadar küçüktür. Artan sıcaklık, gözlenen kaybın ısıl işlemden bağımsız olduğunu ima ederek kaybedilen RNA miktarını artırmadı. Yüksek sıcaklıklarda ısıl işlem büyük olasılıkla hücre lysis neden olur, RNA RNas tarafından bozulmasına maruz. Gerçekten de, ısı inaktive fraksiyonu RNa A eksojen eklenmesi RNA bozulma oranını artırdı. Kaynama, çok esnek bir protein olduğunu ima, RNase aktivitesini azaltmadı.
Bu 1.5 günlük10 eCFU / mL ortalama RNA bozulması büyük bir kayıp olmadığını unutmayın. Bu amaçla, ısıtmanın Mtb basilinin küçük bir kısmını eşitleyerek az miktarda RNA'yı RNa'ya maruz bıraktığı varsayımında bulunmaktadır. TEM ile Mtb hücre morfolojisi ve hücre duvarlarının bütünlüğünün 95 °C'de ısıtıldıktan etkilenmediğini gösterdik. Bu önemli ölçüde RNA,35,36düşürmek için ev sahibi gibi çeşitli fizyolojik faktörler ve RNases yeterli kaynağı gerektirebilir anlamına gelir. Ayrıca, yapısal bir ribozom olmak, 16S rRNA potansiyel olarak daha az RNaseduyarlıdır 37,38. Tek bir Mtb hücresi ~ 700 ribozom/0.1 mm3 sitoplazma37içerir , hücre başına rRNA yüksek miktarlarda olduğunu ima. Böylece, RNase küçük miktarlarda daha küçük bir etkisiolabilir 38. Ribozomların yüksek sayıda varlığı duyarlılık ve düşük yük Tüberküloz hastaları tespit yeteneği açısından TB-MBLA için bir avantaj sağlar.
Tüberküloz-MBLA ile ölçülen bakteriyel yük ile MGIT kültürü TTP arasında güçlü bir korelasyon vardı. Bu bir ölçüde kültür pozitifliği sürücüsü olarak bakteriyel yük doğrular. Ancak, TB-MBLA'nın avantajı, numunede bulunan basil yükünü doğrudan ölçmesi ve tespit edilmeden önce Mtb hücre çoğalmasını gerektirmemesidir. Bu, pozitifliğe olan zamanı bakteriyel yük seviyesine ve Mtb hücre çoğalma hızına bağlı olan kültürle tezat oluşturuyor. Gelecekteki çalışmalar, ısı inaktivasyonu da dahil olmak üzere TB-MBLA iş akışını rutin klinik ortamlarda değerlendirecektir. Çalışma da pozitif negatif (yani, ısı inaktivasyonu aşağıdaki daha az bakteri olanlar) değişebilir sayısını anlamak için bakteri yükleri bir dizi örnekleri araştıracaktır.
Bakteriyel yükün moleküler olarak ölçülmesi için TB-MBLA protokolü bakteriyolojide türünün ilk türünün ilk günüdür. Bu yöntem hasta balgamından mtb basil yükünü doğrudan ölçer ve bunu yapmak için kültür gerektirmez. Bu daha hızlı yapar ve hastanın ilerleme hakkında bir klinik karar bilgilendirmek için potansiyelini artırır. Isı inaktivasyon adımı enfeksiyon riskini azaltır ve kategori 3 laboratuarı olmayan ortamlarda TB-MBLA'nın uygulanabilirliğini artırır. Numunenin ısı inaktivasyonundan sonra, TB-MBLA sonuçlarını elde etmek için üç protokol adımı vardır: RNA ekstraksiyonu, ters transkriptaz (RT)-qPCR ve qPCR sonuç analizi.
Mtb RNA'yı hasta örneğinden yalıtma etkinliği ne kadar yüksekse, sonuçların kalitesi de o kadar yüksek olur. Balgam numunesinin kalitesinin izole edilen RNA miktarını etkilediğini belirtmek önemlidir. Örneğin, tükürük balgam düşük kaliteli olarak kabul edilir ve düşük basil yükü ile ilişkili olmuştur. Bu da hastanın kaliteli balgam beklentisi için eğitilmesinin önemli olduğu anlamına gelir. Çıkarma işleminin verimliliğini değerlendirmek için, rna ekstraksiyonundan önce numuneye bir ekstraksiyon kontrolü (yani Mtb dışı hücrelerin bilinen sayısı) ekilir. Çıkarma kontrolünün alınması RNA çıkarma işleminin verimliliğini doğrular. Çıkarma denetimi alınmadıkça RNA yalıtım işlemi geçerli olamaz. Mtb'nin dirençli bir organizma olduğu göz önüne alındığında mekanik bir lisis ilerletmek sürecin önemli bir parçasıdır. Numunenin yüksek hızda homojenleştirilmesi (600 rpm) boncuk varlığında (yani, lysing matrisi) hücreleri etkili bir şekilde doğrular. Lysate saflaştırma rna ve DNA hem de içeren bir ekstre verir. DNA'nın çıkarılması RNA çıkarmanın son adımıdır. TB-MBLA, RNA'yı ölçerek uygulanabilir basilleri ölçmeyi amaçlamaktadır. Böylece, genomik DNA'nın çıkarılamaması, sonuçların DNA'dan bir sinyal alacağı anlamına gelir, bu da hücre canlılığı için iyi bir belirteç değildir6.
RT-qPCR, Mtb ve ekstraksiyon kontrolü için çift etiketli problar çalıştıran bir dublekstir. Üç adım içerir: 50 °C'de ters transkripsiyon ile 30 dk ters transkripsiyon, 95 °C'de 15 dk denatürasyon ve 94 °C ve 60 °C'de 40 döngü amplifikasyon. Problardan floresan elde edilmesi 60 °C'de (yani parça uzama aşamasında) gerçekleşir. TB-MBLA'nın belirli bir qPCR makinesi kullanılarak optimize edildiğini, bu nedenle diğer qPCR platformlarını kullanan operatörlerin ekipmanlarının koşullarını optimize etmesi gerektiğini unutmayın. DNA çıkarma nın etkinliği, RT yokluğunda numune başına tek bir reaksiyon çalıştırılarak kontrol edilir. Bu reaksiyondan elde edilen olumlu sonuç DNA'nın eksik çıkarılmasıanlamına geliyor. Yüksek miktarda DNA'ya sahip yüksek yük örnekleri, DNA'yı tamamen çıkarmak için iki kat DNase enzimi gerektirebilir. Neyse ki, yüksek basilleryük örneklerinde, az miktarda DNA'nın varlığı RNA'dan kaynaklanan sonucu etkileme olasılığı daha düşüktür. Ribozomal RNA, TB-MBLA hedef, doğal dna37iki katı miktarda oluşur. PCR'de, PCR reaktiflerini eritmek için kullanılan su olan bir şablon kontrolü (NTC), eksojen DNA veya RNA ile çapraz kontaminasyon için kontrol eder. NTC'deki olumlu bir sinyal çapraz kontaminasyon ve geçersiz kabul edilen sonucu ima eder. Bu, bu su kullanılarak oluşturulan tüm çözeltilerin atılması ve taze bir su şişesi kullanılarak yenilerinin üretilmesi gerektiği anlamına gelir. Tüm suyun kirlenmesini önlemek için PCR suyunu niçin ayrı ayrı tutmanı tavsiye edilir. PCR'nin genel verimliliğini kontrol etmek için pozitif kontrol (Mtb RNA) kullanılır.
Sonuç analizi, STANDART eğriyi kullanarak PCR Cq'ların bakteriyel yüke (yani mL başına tahmini koloni şekillendirme ünitelerine) dönüştürülmesini içerir. Standart eğrinin ayarlanması ve optimize edilmesi bu adım için çok önemlidir. Standart eğri verimliliği 0.95-1 önerilir. MTb ve ekstraksiyon kontrolü için standart eğriler, hastalar veya diğer test numuneleri makinede çalıştırılmadan önce kurulmalı ve optimize edilmelidir. Standart numuneler TB-MBLA kiti ile birlikte verilir. PCR için RNA ekstresinin on kat seyreltilmesi önerilir. Bu, mL başına nihai bakteriyel yük sonucunu elde etmek için bakteriyel yük sonucunun 10 faktörle çarpılması gerektiği anlamına gelir. 30'un üzerindeki Cq'ların TB-MBLA için negatif kabul edilir. Tedavi yanıtı üzerinde bir çıkarım yapmak için farklı zaman noktalarında ölçülen en az iki prospektif bakteriyel yük sonuçları gereklidir. Tedaviye başlamadan önce iki sonuçtan birinin temel olması kuvvetle tavsiye edilir. Ancak, hasta ya da tedavinin ortasında bakteriyel yük değerlendirmesi başlatılırsa, tedavi yanıtını değerlendirmek için ikinci bir zaman noktası bakteriyel yük ölçümü yapılmalıdır. TB-MBLA tedavi de 3 günlük bir alanda bakteriyel yük ayırt edebilirsiniz ama ideal iki bakteriyel yük ölçümleri 7 gün arayla alınan.
Protokol tedavi yanıtı için bilgilendirici kantitatif sonuçlar üretirken, hala büyük ölçüde manuel dir ve RNA ekstraksiyonu için zamanında önemli eller talep eder. Meşgul laboratuvarlarda Teknisyenler bu kez olmayabilir. RNA çıkarma ve PCR işlemlerini otomatikleştirmek için düzenlemeler devam etmektedir.

Mycobacterium tuberculosis (Mtb) neden, 7 x 106 yeni tüberküloz vakası (TB) üzerinde yılda 1 x 106 ölmek küresel rapor edilir1,2. Eğilimi tersine çevirmek için, Dünya Sağlık Örgütü (WHO) etkili tanı ve tedavi araçları geliştirme dahil olmak üzere üç ayaklı bir yaklaşım başlattı3. BM tarafından tehlikeli bir biyolojik madde olarak sınıflandırılan B, Mtb için pozitif olduğu sanılan numunelerle çalışmak için 3'lük bir çevreleme düzeyi (CL) gerekir. CL3 laboratuvarlarının inşası ve bakımı pahalıdır. Sonuç olarak, çoğu ülke bölgesel veya ulusal düzeyde tüberküloz kültür hizmetlerini merkezileştirmiş. Bu, yayma mikroskobunun çevre sağlık tesislerinde en uygun tanı aracı olduğu anlamına gelir.
Düzey 4 sağlık tesislerinde Xpert MTB / RIF gibi hızlı moleküler testler uygulamak için DSÖ onayı vardır, çoğunlukla ilçe düzeylerinde yer4,5. Bazı ilçeler oldukça büyük ve bazı insanlar için daha az erişilebilir. Yararlı olmakla birlikte, Xpert MTB/RIF Mtb DNA'sını tespit ederek çalışır. DNA hücreleri öldükten sonra uzun süre hayatta kalır ve böylece tedavi yanıtı izlemek için kritik canlı hücreleri ölçmek için iyi bir standart değildir istikrarlı bir moleküldür5,6. RNA tabanlı tahliller canlı hücrelerin doğru ölçümü için bir alternatif sunuyoruz7,8,9,10,11,12,13. RNA farklı stabilite türlerinde bulunur: ribozomal RNA (rRNA), transfer RNA (tRNA) ve haberci RNA (mRNA). Messenger RNA gen ekspresyonu ile ilişkilidir ve böylece en yakından hücre aktivitesi ve canlılık ile ilişkili14. Mtb gibi patojenlerin inaktif (atıl) ama yaşanabilir devletlerde var olduğu bilindiği için gen ekspresyonunun yokluğunun hücre ölümüyle eşdeğer olmadığını belirtmek önemlidir15,16. RRNA gibi kararlı RNA türleri bu nedenle canlı hücrelerin hem aktif hem de inaktif durumlarının daha iyi belirteçleridir.
Escherichia colikullanarak, Sheridan 16S rRNA orantılı koloni oluşturan birimleri (CFU) sayıları ile ölçülen bakteri üreme sayar17arttı gösterdi. E. coli bakterisi antibiyotiklere maruz kaldığında CFU sayılarında ve 16S rRNA'da eşzamanlı bir düşüş yaşandı. Hücre ölümünün ardından rRNA'daki düşüş, hücre canlılığı için bir belirteç olarak kullanılabileceğinin bir göstergesiydi13,17. Bu ilkeden yola çıkarak, Anti-TB tedavisi olan hastalar için tedavi yanıtının bir göstergesi olarak m. tüberküloz 16S rRNA'yı hedeflemek için Tüberküloz moleküler bakteri yükü (TB-MBLA),18,19geliştirilmiştir. Biz daha da geliştirdik ve M. tüberküloz basili lysis yansıtan bir hücresel ekstraksiyon kontrolü dahil etmek için TB-MBLA optimize ve farklı çevre ortamlarında sağlam20. TB-MBLA prosedürü, Mtb hücrelerinin işçilerin güvenliğini sağlamak için tamamen lysed kadar Mtb'den RNA izolasyonunun ilk adımlarının CL3 laboratuvarında yapılmasını gerektirir. Ayrıca guanidin tiyosiyanat, bir seviye 4 toksik madde -80 °C'de muhafaza edilecek retrospektif toplu analiz için örnek koruma içerir. Bu amaçla, Mtb'yi inaktive etmek ve örnekleri kobi mikroskop seviyesi laboratuvarlarında yapılacak Tüberküloz-MBLA için güvenli hale getirmek için ısı kullandık.
Laboratuvar ve klinik uygulamalarda ısı kullanımı yüzyıllardır21,22civarında olmuştur. Ancak, Mtb gibi bazı mikroorganizmalar öldürmek zordur, ve ısı ya daha kısa maruz kalma tüm hücreleri öldürmek için yetersizdir23,24. Yapılan bir çalışmada, 80 °C'de Tüberküloz kültürlerinin 20 dk ısıtmapcr25için gerekli DNA'yı yok etmeden tüm Mtb basillerini öldürdüğü ortaya konmıştır. Daha sonra, laboratuvar DNA çıkarma teknikleri bir dizi şu anda 95 °C ısı. Aynı prensibi, 80 °C, 85 °C veya 95 °C'de kaynayan Tüberküloz örneklerinin MTB'yi inaktive ettiğini ve TB-MBLA için yeterli RNA'yı koruduğunu göstermek için uyguladık. Inaktive kültür veya balgam oda sıcaklığında sıkıca kapalı kaplarda muhafaza edilebilir veya ölçülebilir rRNA miktarını azaltmadan 7 gün buzdolabında.
TB-MBLA, şu anda sadece bir araştırma kullanımı olarak kullanılan (RUO) testi uyarlanabilir ve balgam, akciğer dokusu ve serebral spinal sıvı dahil olmak üzere farklı örnek tipleri uygulanmıştır. Bronşiyal alveoler sıvı, kan ve diğer örnek tiplerine henüz uygulanmamıştır. Örnek olarak balgam kullanılması, Afrika'da çok siteli değerlendirme (yayınlanmamış veriler) ve önceki yayınlar18,26 sonuçları MBLA duyarlılığı nın mikobacterium büyüme göstergesi tüpü (MGIT) sıvı kültürü ile tutarlı olduğunu göstermektedir. Ancak, TB-MBLA daha hızlıdır, kültür gün veya hafta aksine saat sonuçları veren, özel, örnekte olmayan Tüberküloz mikroorganizmalar etkilenmez, ve hastalığın şiddetini nicel bir ölçü verir. DSÖ son zamanlarda tb tedavisi2izlenmesi için smear mikroskobu ve kültür yerine aday olarak TB-MBLA tanıdı.
Bu yazıda Sabiiti ve ark.27'deyayınlanan ısı inaktivasyonu ve TB-MBLA protokolünü ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Bu ayrıntılı protokol, dünya genelinde KiRemit kullanıcıları için tek noktadan görsel bir kaynak sağlayacaktır.

<table><tbody><tr><td>< güçlü > Isı inaktivasyonu: < / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>15 mL Santrifüj tüpleri</td><td>Fisher-Scientific</td><td>10136120</td><td>Daha büyük numune hacimleri söz konusuysa 50 mL tüpler kullanılabilir</td></tr><tr><td>15 mL Tel Tüp rafı</td><td>Fisher-Scientific</td><td>11749128</td><td>Benzer markaya sahip diğer markalar kullanılabilir</td></tr><tr><td>Su banyosu</td><td>Fisher-Scientific</td><td>15700619</td><td>Benzer markaya sahip diğer markalar kullanılabilir</td></tr><tr><td><güçlü>RNA ekstraksiyonu: < / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Kloroform</td><td>Sigma</td><td>372978-1L</td><td>Diğer RNA ekstraksiyon kiti markalarında gerekli değildir</td></tr><tr><td>Etanol, mutlak% 99-100</td> <td>Sigma</td><td>51976-500ML-F</td><td>Daha büyük hacim mevcuttur</td></tr><tr><td>Ekstraksiyon kontrolü</td><td>SOI grubu St Andrews</td><td>VitalbacteriaEC</td><td>ile birlikte verilir TB-MBLA Vitalbacteria kiti</td></tr><tr><td>FASTRNA Pro mavi Kit</td><td>MP Biyomedikal</td><td>116025050</td><td>Lizling matris tüpleri ile birlikte verilir</td></tr><tr><td>Moleküler dereceli su (RNaz içermez)</td> <td>Sigma</td><td>W4502-1L</td><td>Qiagen, Fisherscientific aynı ürünü de tedarik edebilir</td></tr><tr><td>Precellys 24 homojenizatör</td><td>VWR</td><td>432-3750</td><td>FastPrep MP Biyomedikaller de kullanılabilir</td></tr><tr><td>Soğutmalı mikro santrifüj, Fresco 21, Heraeus</td><td>Fisher-Scientific</td><td>15352117</td><td>Benzer kapasiteye sahip diğer markalar da kullanılabilir</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>BLD-455-010C</td><td>1-2 mL tüplerle çalışır</td></tr><tr><td>TURBO DNA içermez</td><td>Fisher-Scientific</td><td>AM1907M</td><td>Daha kısa DNA çıkarma prosedürlerinden daha uzun sürer ancak daha etkilidir.</td></tr><tr><td>RT-qPCR:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primerler ve Taqman probları</td><td>SOI grubu St Andrews</td><td>VitalbacteriaPP</td><td>TB-MBLA Vitalbacteria kiti ile birlikte verilir. Prob floroforları, Mtb için FAM (yeşil) ve Ekstraksiyon kontrolü (EC) için HEX'tir (sarı). Applied Biosystems qPCR platformları HEX yerine VIC kullanır.</td></tr><tr><td>QuantiTect Multipleks RT-PCR NR Kiti</td><td>Qiagen</td><td>204845</td><td>PCR karışımı artı RT enzimi</td></tr><tr><td>RotorGene Q 5plex makinesi</td><td>Qiagen</td><td>9001580</td><td>Diğer qPCR makineleri: Vii7, Quantistudio, Steponelus vb.</td></tr><tr><td>Kullanılabilir Şerit Tüpler ve Kapaklar, 0.1 mL</td><td>Qiagen</td><td>981103</td><td>Rotor boyutuna bağlı olarak diğer tüp boyutları mevcuttur. Diğer PCR platformları için 96 kuyulu PCR plakasına ihtiyaç vardır.</td></tr><tr><td>< güçlü > Olmayan ısı inaktivasyonu Numune koruma malzemeleri< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl pH 7.5</td><td>Sigma</td><td>93313</td><td>Kullanıma hazır olarak tedarik edilen</td></tr><tr><td>2-Merkaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>63689</td><td>Birçok yetkili tedarikçi</td></tr><tr><td>Guanidin tiyosiyanat (GTC)</td> <td>Promega</td><td>V2791</td><td>Promega markası kalite için önerilir</td></tr><tr><td>Moleküler dereceli su ( RNaz içermez)</td><td>Sigma</td><td>W4502-1L</td><td>GTC çözeltisinin nükleaz içermemesini sağlar</td></tr><tr><td><güçlü>Genel malzemeler (kullanılmış ancak TB-MBLA'ya özgü değil)</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>500 mL plastik kaplar</td><td></td><td>734-5087</td><td>Nalgene markası tavsiye edildi</td></tr><tr><td>Biyolojik atık atma kavanozları</td><td></td><td></td><td>Birçok yetkili tedarikçi</td></tr><tr><td>Kimyasal atık atma kavanozları</td><td></td><td></td><td>Birçok yetkili tedarikçi</td></tr><tr><td>Tek kullanımlık eldivenler, kimyasallara dayanıklı</td><td></td><td></td><td>Birçok yetkili tedarikçi</td></tr><tr><td>Dondurucu (-20 °C; C)</td><td></td><td></td> <td>Birçok yetkili tedarikçi</td></tr><tr><td>Dondurucu (-80 &°; C)</td><td></td><td></td> <td>Birçok yetkili tedarikçi</td></tr><tr><td>Buzdolabı (0-8 derece & C)</td><td></td><td></td> <td>Birçok yetkili tedarikçi</td></tr><tr><td>Çeker ocak</td><td></td><td></td><td>Toksik reaktiflerin güvenli kullanımı için</td></tr><tr><td>Laboratuvar terazileri Reaktiflerin</td><td></td><td></td><td>doğru ölçümü için</td></tr><tr><td>Ölçüm silindirleri, plastik</td><td></td><td></td><td>Reaktiflerin doğru ölçümünü sağlamak için</td></tr><tr><td>PCR reaksiyon tüpleri</td><td></td><td></td><td>Kullanılan</td></tr> <tr><td>PCR cihazına uygun olmalıdırPipetler ve uygun steril filtreli pipet uçları,</td><td></td><td></td> <td>DNAse ve RNAse içermez, aralık: P1000, P200, P10, P2 önerilir</td></tr><tr><td>Qiagility yükleme plakaları</td><td>Qiagen</td><td></td><td>5 kuyulu ana karışım plakası, 16 oyuklu reaktif plakası, 32 oyuklu numune plakası, 72 oyuklu ve 96 oyuklu reaksiyon plakaları</td></tr><tr><td>QIAgility Pipetleme Robotu</td><td>Qiagen</td><td></td><td>Yüksek verimli pipetleme</td></tr> <tr><td>için önemli1,5 mL ve 2 mL mikrotüpler ve 15 mL ve 50 mL Falcon tüpleri için raflar</td><td></td><td></td><td>Kimyasallara dayanıklı ve otoklavlanabilir önerilir</td></tr><tr><td>RNase Away (RNaz enzimlerini çalışma alanından uzaklaştırır)</td><td>Fisher Scientific</td><td>10666421</td><td>Hizmetlerin ve cihazların RNase enziminden arınmış olduğundan emin olmak önemlidir</td></tr><tr><td>Güvenlik gözlükleri, kimyasallara dayanıklı</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Sigma'dan da alınabilir. Gözleri toksik reaktiflerden koruyun.</td></tr><tr><td>Steril Pasteur pipetleri, 1,5-3 mL</td><td></td><td></td><td>Birçok yetkili tedarikçi</td></tr><tr><td>Steril RNAse-free mikrotüpler</td><td></td><td></td><td>-80 ° C'de dondurmaya uygun 1,5 mL tüpler; C önerilen</td></tr><tr><td>TB dezenfektanı, örneğin Tristel Sigorta</td><td></td><td></td><td>Taze hazırlandığından veya bir hafta içinde hazırlandığından emin olun</td></tr><tr><td>Vortex</td><td></td><td></td><td>Genie 2 markası önerilir</td></tr><tr><td><güçlü>Transmisyon elektron mikroskobu</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glutaldehit (%8)</td><td>Sigma</td><td>G7526-10ML</td><td>Hücre fiksasyon tamponunun bir parçası (HEPES tamponu)</td></tr><tr><td>HEPES ( pH 7.4, 100 mM)</td><td>Sigma</td><td>H4034-25G</td><td>Hücre fiksasyon tamponunun bir parçası (HEPES tamponu)</td></tr><tr><td>Leica FCS ultrakriyo</td><td>Doku kesitleme için</td><td>Leica Kriyomikrotom</td><td></td></tr><tr><td>Metil selüloz</td><td>Agar Scientific</td><td>AGG6425</td><td>Soğuk montaj reçinesi</td></tr><tr><td>Paraformaldehit (PBS'de %4)</td><td>Sigma</td><td>P6148-500G</td><td>Hücre fiksasyon tamponunun bir parçası (HEPES tamponu)</td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Sigma</td><td>84097-250G</td><td>Koruma ve montaj ortamı</td></tr><tr><td>Uranil asetat</td><td>Agar Scientific</td><td>AGR1260A</td><td>Evrensel Elektron mikroskobu boyası</td></tr></tbody></table>

tüberküloz moleküler bakteriyel yük analizi (tb-mbla)

A Tuberculosis Molecular Bacterial Load Assay (TB-MBLA)

Tüberküloz, Birleşmiş Milletler (BM) tarafından tehlikeli bir Kategori B biyolojik maddesi olarak sınıflandırılan bir patojen olan Mycobacterium tuberculosis (Mtb) neden olur. İşçilerin güvenliği için, Mtb taşıdığı sanılan tüm numunelerin işlenmesi bir koruma seviyesi (CL) 3 laboratuarında yapılmalıdır. Tüberküloz moleküler bakteri yük testi (TB-MBLA) testi, 16S rRNA için astar ve çift etiketli problar kullanarak Mtb basil yükünü ölçen ters transkriptaz nicel polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) testidir. TB-MBLA için RNA'yı korurken Tüberküloz örneklerini bulaşıcı hale getirmek için ısı inaktivasyonu nun kullanımını açıklıyoruz. Sıkıca kapatmış 15 mL santrifüj tüpteki balgam numunesinin 1 mL aliquot'u, Mtb basilini inaktive etmek için 80 °C, 85 °C veya 95 °C'de 20 dakika kaynatılır. 42 gün boyunca ısı inaktive ve kontrol (canlı) örnekleri ekimi Tüberküloz ölümü doğruladı. İnaktive numune daha sonra ekstraksiyon kontrolünün 100 μL'si ile çivilenir ve standart RNA izolasyon prosedürü nden sonra RNA ayıklanır. Isıl işlem görmüş numune kültürlerinde büyüme gözlenmedi. İzole RNA, Mtb 16S rRNA genindeki belirli bir hedefi yükselten ve niceleme döngüleri (Cq) şeklinde sonuçlar veren gerçek zamanlı RT-qPCR'ye maruz kalır. Standart bir eğri bakteriyel yük veya mL başına tahmini koloni şekillendirme birimleri (eCFU / mL) içine Cq çevirmek için kullanılır. Cq ile numunenin bakteriyel yükü arasında ters bir ilişki vardır. Sınırlama, ısı inaktivasyonunun bazı hücreleri etkisiz hale getirmesi ve RNA'yı <1 log10eCFU/mL (yani<10 CFU/mL) kaybına neden olan RNA'lara maruz bırakmasıdır. Daha ileri çalışmalar ısı inaktivasyonu nedeniyle yanlış negatif sonuçlara neden çok düşük yük hastaların oranını belirleyecektir.

Isı tüm M. tüberküloz basilini inaktive eder Kontrollerin (canlı hücrelerin) optik yoğunluğu(OD)zamanla artmış, (0.04 OD –0.85OD)ve ısı inaktive numunelerinde OD değişimi gözlenmedi, bu da büyümeyi ve büyümeyi işaret eder(Şekil 1)27. Benzer şekilde, MGIT'de kontrol klinik balgam 3. MGIT Mtb büyüme Ziehl-Neelsen yayma mikroskopisi ve antijen MPT6429tarafından doğrulandı.
İnaktive numunelerde RNA 37 °C'de 4 gün stabil Isı inaktive örnekleri 37 °C'de, Hücrelerin ısı inaktivasyonu sonrasında RNA'nın bozulup bozulmadığını belirlemek için inkünot edildi. Her iki BCG kültüründe(Şekil 2A-C)ve TB pozitif balgamda(Şekil 2D)ısı inaktivasyonundan hemen sonra 0.gün hasat edilen RNA ile D1, 2, 3 ve 4'te izole edilen RNA arasında fark saptanmadı.
Eksojen RNase ısı inaktive fraksiyonları RNA bozulma oranını artırır RNA'nın neden bozulmadığını belirlemek için, RNase A enzimi ısı inaktivasyonundan önce ve/veya sonra 1.000 U/mL'ye ekolarak eklenmiştir. Bu durum, 4 günlük kuluçka süresi boyunca sırasıyla 1,5 ± 0,3 - 1,8 ± 0,2 ve 1,3 ± 0,1 -log10 eCFU/mL 80 °C, 85 °C ve 95 °C'ye eşdeğer RNA kaybına neden oldu. RNa'nın ısı inaktivasyonundan önce ve/veya sonra eklendiği örneklerde rna'da bir fark vardı (Şekil 3A-C).
Referans işaretçisi olarak 16S rRNA kullanılarak TB-MBLA için yeterli RNA korunur Isı inaktivasyonunun rRNA üzerindeki etkisi BCG kültürlerinde ve balgamda Tüberküloz pozitif hastalarda ölçüldü. Ölçülen bakteriyel kontrol yükü BCG kültürü, 5.3 ± 0.2 log10 eCFU/mL, 0.2 ± 0.1 log10 eCFU/mL,5.1 ± 0.3 log10 eCFU/mL ısı inaktive kültür (ANOVA p &lt; 0.0001) 80 °C, 85 C ve 95 °C (4AŞekil2 )daha yüksektir . Benzer şekilde, kontrol hasta balgam, 7.1 log10 eCFU/mL bakteriyel yük, 0.8 ± 0.1 log10 eCFU / mL kombine 6.3 ± 0.41 log10eCFU/mL 80 °C, 85 °C ve 95 °C(Şekil 4B)27daha yüksek . Bakteriyel yük azaltma test edilen iki tip numunede &lt;1log idi.
Sidak'ın çoklu karşılaştırma testi, 95 °C'deki bakteri yükü ile 80 °C ile 85 °C (p = 0.001) arasındaki önemli farkı ortaya koymuştur. Tüm sıcaklıklarda Tüberküloz örneklerinde p = 0.8'de fark saptamamaz.
Hücre duvar bütünlüğü Mtb hücrelerinin çoğunda ısı tarafından tahrip edilmez İletim elektron mikroskobu (TEM) kullanarak hücrelerin ısı inaktivasyonu ile lysed olup olmadığını araştırdık. TEM tarafından incelenmeden önce paraformaldehit sabit hücre peletlerinin ince bölümleri yapılmış ve elektron bakımından zengin bir ortama gömülmüştür. Alt ve yüksek büyütme hücrelerinin incelenmesi bozulmamış hücre duvarı ve görünür hücre içi lipid organları ortaya. Hücreler morfolojik olarak uzamış olarak ortaya çıktılar ama düzgün değil. Şekil 5 farklı büyütmelerde mikobacterium hücrelerinin morfolojisini göstermektedir. Üst iki paneller hücre içi lipid organları ve engellenmemiş halat benzeri kablolama ortaya, micobacterium türlerintipik bir morfolojik karakteristik. Alt iki panel lipid organlarının görünümünü genişleten ve bazı mikro-hücre içi yapıları ortaya yüksek büyütme vardır.
TB-MBLA ile ölçülen bakteriyel yük, MGIT kültür zamanı ile pozitiflik ile ters orantılıdır Tedaviye yanıt veren hastalar için, bakteriyel yük tedavi süresince haftada ortalama 1 günlük10 eCFU/mL'ye düşer. Hızlı yanıt layıcılar daha hızlı temizler ve 2 haftalık tedavi ile negatife (sıfır bakteriyel yük) dönüşür. TB-MBLA ile ölçülen bakteriyel yükteki düşüş, MGIT kültür süresinin pozitifliğe (TTP) yükselmesine karşılık gelmektedir. Şekil 6 bakteriyel yük ile MGIT TTP arasında bulunan ters korelasyon göstermektedir. Ancak aradaki fark, TB-MBLA sonuçlarının 4 saat içinde mevcut olması ve sonuç lanma süresinin bakteriyel yük seviyesinden bağımsız olmasıdır. Bu mgit kültür testleri için 5-25 gün aksine. Tüberküloz olmayan bakterilerle kontaminasyon, kültür testlerinin sonuçlarını daha da tehlikeye atabilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60460/60460fig1v3.jpg"> Şekil 1: BCG inaktivasyonunun 80 °C (nokta desen eğrisi), 85 °C (nokta-çizgi desen eğrisi) ve 95 °C (çizgi desen eğrisi) olarak doğrulanması. Kontrol (siyah eğri) canlı (ısıtılmamış) BCG kültürü aynı büyüme ortamına aşılanmış oldu. Kontroldeki büyüme, kuluçka döneminde kültürün OD'sindeki artışla doğrulandı. Bu rakam Sabiiti ve ark.27'dendeğiştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60460/60460fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60460/60460fig2v3.jpg"> Şekil 2: 37 °C'de 4 gün (D0-D4) kuluçkaya yatırılabilen ısı inaktive numunesinde ölçülebilir RNA stabilitesi. (A), (B), ve (C) BCG kültürlerini sırasıyla 80 °C, 85 °C ve 95 °C'de inaktive gösterirler. (D) 80 °C'de inaktive edilmiş Tüberküloz balgamını gösterir. Denetim, aynı örneğin işlenmemiş (canlı) fraksiyonudur. Hata çubukları = standart sapma. Üç tekrar, dokuz kopya her koşu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60460/60460fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60460/60460fig3v2.jpg"> Şekil 3: RNase A enziminin eksojen eklenmesinden sonra yüksek RNA yıkımı. (A) Isı inaktivasyonu (HI) 80 °C' de, (B) HI 85 °C' de ve (C) HI 95 °C. Hata çubukları = ortalamastandart hata. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60460/60460fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60460/60460fig4v2.jpg"> Şekil 4: Marker olarak 16S rRNA kullanılarak TB-MBLA bakteriyel yük ölçümü için yeterli RNA'nın korunması. (A) In vitro BCG kültürlerinden bakteriyel yük tahmini. (B) Tüberküloz pozitif balgamdan bakteriyel yük olarak tahmin edilmektedir. Hata çubukları = ortalamanın standart hatası (sırasıyla A ve B için n = 18 ve 20 çoğalır). Bu rakam Sabiiti ve ark.27'dendeğiştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60460/60460fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60460/60460fig5.jpg"> Şekil 5: 95 °C'de 20 dk.'da inaktivasyon dan sonra bozulmamış Mtb basilinin elektron mikrografları. TEM ile berrak sağlam hücre duvarı ve sayısal lipid cisimleri gözlendi. Üst: engellenmemiş mikobakteriyel halat benzeri kordon morfolojisi ve hücre içi lipid organları ortaya koyan bir grup hücrenin düşük büyütme görüntüleri. Alt: lipid organlarının görünümünü genişletmek ve bazı mikro-hücre içi yapıları ortaya çıkarmak için üst panellerin yüksek büyütme. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60460/60460fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60460/60460fig6.jpg"> Şekil 6: Anti-TB tedavisi gören bir hastanın 12 haftalık tedavi yanıt eğrisi, Ölçülen TB-MBLA bakteriyel yük ve MGIT TTP'nin ters korelasyonunu gösterir. Hasta tedaviye yanıt verirken TTP yükselirken bakteri yükü (mavi eğri) düşer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60460/60460fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td rowspan="2">Ana karışım</td>
			<td>RT pozitif reaksiyon</td>
			<td>RT negatif reaksiyon</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reaksiyon başına hacim x no. reaksiyonların + 5</td>
			<td>Reaksiyon başına hacim x no. reaksiyonların + 5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Quantitect karışımı</td>
			<td>10.0 μL</td>
			<td>10.0 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mtb16S astar karışımı (F + R)</td>
			<td>0,4 μL</td>
			<td>0,4 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mtb16S sondası</td>
			<td>0,2 μL</td>
			<td>0,2 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>EC astar karışımı (F + R)</td>
			<td>0,4 μL</td>
			<td>0,4 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>AK soruşturması</td>
			<td>0,2 μL</td>
			<td>0,2 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>RT enzimi</td>
			<td>0,2 μL</td>
			<td>-------</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNase ücretsiz su</td>
			<td>4.6 μL</td>
			<td>4.8 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Toplam hacim</td>
			<td>16 μL</td>
			<td>16 μL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: TB-MBLA qPCR için master karışım hazırlama kılavuzu.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Türü</td>
			<td>MTB kanalı</td>
			<td>AK kanalı</td>
			<td>Yorumu</td>
		</tr>
<tr>
<td>Örnek</td>
			<td>Pozitif</td>
			<td>Pozitif</td>
			<td>Geçerli</td>
		</tr>
<tr>
<td>Örnek</td>
			<td>Pozitif</td>
			<td>Negatif</td>
			<td>Belirsiz</td>
		</tr>
<tr>
<td>Örnek</td>
			<td>Negatif</td>
			<td>Pozitif</td>
			<td>Geçerli</td>
		</tr>
<tr>
<td>Örnek</td>
			<td>Negatif</td>
			<td>Negatif</td>
			<td>Geçersiz</td>
		</tr>
<tr>
<td>MTB + Kontrol</td>
			<td>Pozitif</td>
			<td>Negatif</td>
			<td>Geçerli</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ekstraksiyon Kontrolü (EC)</td>
			<td>Negatif</td>
			<td>Pozitif</td>
			<td>Geçerli</td>
		</tr>
<tr>
<td>DNA kontrolü</td>
			<td>Negatif</td>
			<td>Negatif</td>
			<td>Geçerli</td>
		</tr>
<tr>
<td>Negatif Kontrol (NTC)</td>
			<td>Negatif</td>
			<td>Negatif</td>
			<td>Geçerli</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2: TB-MBLA sonuçları yorumlama kılavuzu.

Balgamın ısı inaktivasyonundan sonra yapılan tüberküloz moleküler bakteriyel yük testini tanımladık. Isı inaktivasyonu balgam örneklerini enfeksiyöz olmayan hale getirir ve tüberküloz moleküler testleri için 3 laboratuvarları kapsama ihtiyacını ortadan kılmaktadır.

Tüberküloz Moleküler Bakteriyel Yük Analizi (TB-MBLA)

Tuberculosis is caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb), a pathogen classified by the United Nations (UN) as a dangerous category B biological ...

Bu Tüberküloz Moleküler Bakteriyel Test, üç anahtar soruyu cevaplıyor. Bir: Hastanın hastalık yükünün büyüklüğü nedir? İki: Hasta hastalığı yükü anti-tüberküloz ilaçlarına nasıl tepki verir?Ve üç:Hastalık yükü ile tedavi yanıtı arasındaki ilişki nedir? Bu titre, hastanın tüberküloz yükünün nicel bir sonucunu ortaya çıkarır ve bu yükün kısa sürede tedavi ile nasıl değiştiğini ölçer. Modifikasyon ile bu metodoloji diğer bakteriyel patojenlere uygulanabilir.Tüberküloz olmayan mikobakterilerin ve kronik obstrüktif akciğer hastalığı ile ilişkili bakterilerin tanısı için benzer bir teknoloji geliştirdik. Bu tekniği ilk kez uygularken videoyu izleyin ve adımları uygulayın. Hasta tanı sonuçları için gerekli olmayan örneklerle pratik yapmak çok önemlidir.Görsel gösterim, özellikle metnin metinde açıklanması zor olan adımları öğrenmeyi ve ustalaşmayı basitleştirdiği için önemlidir. Hücre kültürlerini hazırlayarak başlayın. Temiz bir laboratuvar bankında veya birinci sınıf kabinde, 15 mililitrelik plastik tüplere bir mililitre lik üstel faz Bacille Calmette-Guerin veya BCG kültürünü hasat edin ve sıkıca kapatın.Hastanın balgam örneklerini hazırlarken, iyi havalandırılan bir alanda çalışın ve GL One Stop TB el kitabındaki yönergeleri izleyin. Dikkatle 15 mililitre plastik santrifüj tüpler içine numune fincan ve pipet bir mililitre aliquots açın. Sonra, tüpleri sıkıca kapatın.Numune tüplerini, her tüpün 3/4'ünün batırıldığından emin olmak için, önceden ısıtılmış 95 dereceye kadar önceden ısıtılmış bir su banyosuna daldırılmış bir tutucu rafa aktarın. Örnekleri 20 dakika kaynatın. Daha sonra tüpleri oda sıcaklığında beş dakika soğuması için tezgaha aktarın.Fenol kloroform veya tümör sermayee etanol ile bir kit kullanıyorsanız bir duman kaputunda RNA ekstraksiyon gerçekleştirin. Burada gösterilen RNA prosedürü fenol kloroform ekstraksiyon prosedürüdür. Ancak, RNA ekstraksiyonu için alternatif yöntemler de kullanılabilir.Isı inaktive örnek bir mililitre aliquots aktarın 1.5 mililitre tüpler ve her örnek içine ekstraksiyon kontrolü başak 100 mikrolitre. Tüpleri kapatın ve üç kez ters çevirerek karıştırın. Tüpleri 20,000 kez 10 dakika santrifüj edin.Sonra, süpernatant aspire, tortu 50 mikrolitre bırakarak. 950 mikrolitre likit tampondaki tortuyu borular halinde tutarak askıya alıyoruz ve tüm süspansiyonu RNA ekstraksiyon kiti ile birlikte verilen lysing matris tüplere aktarıyoruz. Tüpleri sıkıca kapatın ve hem kapakta hem de yan tarafta etiketlendiklerinden emin olun.Daha sonra, 6, 000 rpm 40 saniye boyunca örnekleri homojenize. Oda sıcaklığında beş dakika boyunca 12, 000 kez g lysate santrifüj. Bu arada, taze bir mililitre tüpler hazırlamak ve kloroform 300 mikrolitre ekleyin.Lysing matrisine dokunmadan süpernatantı dikkatlice aspire etmek ve kloroform ile tüpe aktarmak için bir mililitrelik pipet kullanın. Girdap tüpler beş saniye için ve beş dakika ya da üç aşamaları açıkça görülebilir kadar yerleşmek için bırakın. Tüpleri 12,000 kez g beş dakika santrifüj edin.Daha sonra, dikkatle üst faz pipet ve 1.5 mililitrelik bir tüp aktarın. Numuneye 500 mikrolitre buz soğuksu %100 etanol ekleyin, tüpü kapatın ve karıştırmak için üç kez ters çevirin. Tüpleri eksi 80 derecede 15 dakika veya eksi 20 derecede 30 dakika kuluçkaya yatırın.Daha sonra tüpleri önceden soğutulmuş mikro santrifüj ve santrifüje 13, 000 kez g ve 4 santigrat derecede 20 dakika yükleyin. Supernatant atın, 13, 000 kez g başka bir 10 dakika için% 70 buz soğuk etanol ve santrifüj 500 mikrolitre ekleyin. Tüm supernatant atın.Ve tüpleri 50 derecede 20 dakika boyunca kuluçkaya yatırArak nükleik asit peletini kurutun, tüpleri kısmen açık tutarak etanolün buharlaşmasını sağlar. Daha sonra, pelet çekirdeksiz su 100 mikrolitre ekleyin ve beş dakika oda sıcaklığında kuluçka. Üç saniye boyunca örnek girdap ve DNA kaldırma ile devam edin veya eksi 80 santigrat derece kullanmaya hazır olana kadar saklayın.Hazırlanan DNA'nın bir karışımı, el yazması yönlere ve pipetlere göre RNA ekstresi içeren her tüpe 11 mikrolitre. Üç saniye boyunca girdap ve tüp duvarından herhangi bir damlacıkları kaldırmak için kısa bir süre aşağı spin. Daha sonra tüpü sıcak blokta veya kuluçka makinesinde 30 dakika boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın.Kuluçkadan sonra, doğrudan tüpe DNA'nın bir enziminin bir mikrolitresini ekleyin ve girdap yaparak iyice karıştırın. Sonra tüpleri 37 derecede 30 dakika daha kuluçkaya yatırın. Çözülme ve girdap DNA'nın inaktivasyon reaktifi.Daha sonra, her RNA ekstresi için 10 mikrolitre ekleyin. Ve tüpleri oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçka adımı sırasında tüpleri üç kez girdap.Daha sonra karışımı 13,000 kez g'de iki dakika santrifüj edin ve süpernatant'ı 1,5 mililitrelik RNA'nın serbest tüpüne dikkatlice aktarın ve inaktivasyon matrisinin hiçbirine dokunmadığından emin olun. Tüm bilinmeyen RNA örneklerini RNA'nın serbest suyunda 1'den 10'a kadar seyreltin, beş saniye girdap yaparak karıştırın ve kısa bir süre için aşağı doğru döndürün. MTB ve EC-RNA örneklerini eritin ve standart bir eğri için sırasıyla yedi ve altı on kat seyreltme yapın.RT plus ve RT eksi PCR ana karışımlarını el yazması yönlere göre hazırlayın. Vortex RT artı karışımı ve her RT artı PCR tüp içine 16 mikrolitre aktarın. Sonra, girdap RT eksi karışımı ve her RT eksi PCR tüp içine 16 mikrolitre ekleyin.Rt artı tüplere dört mikrolitre RNA ekstresi veya su ekleyin ve çoğaltın. Su şablon olmayan kontrol veya NTC'dir. RT eksi tüplere dört mikrolitre RNA ekstresi veya su ekleyin.Reaksiyon tüplerini gerçek zamanlı PCR makinesine yükleyin, el yazmasında açıklandığı gibi reaksiyonu programlayın ve reaksiyonu çalıştırın. Tedavi yanıtını yorumlamak için, CQ değerlerini bakteriyel yüke dönüştürmek için standart eğriyi kullanın ve tedavi takip süresi boyunca bakteriyel yükteki değişim olarak yanıtı hesaplayın. Tedavi sonrası bakteriyel yükteki düşüş olumlu bir tepki yitirmezken, bakteriyel yükte herhangi bir değişiklik veya artış olumsuz yanıt anlamına gelir.Tüm M.tüberküloz basillerinin ısı inaktive edildiğini doğrulamak için hücrelerin optik yoğunluğu ölçüldü ve canlı hücrelerle karşılaştırıldı. Büyüme olmadığını gösteren ısı inaktive örnekleriiçin zaman içinde OD'de bir değişiklik gözlenmedi. Isı inaktive örnekleri 37 santigrat derecede, Hücrelerin ısı inaktivasyonu sonrasında RNA'nın bozulup bozulmadığını belirlemek için kuluçkaya yatırıldı.Isı inaktivasyonundan hemen sonra hasat edilen RNA ile RNA'nın hem BCG kültüründe hem de Tüberküloz pozitif balgamda bir, iki, üç ve dört gün sonra izole edilmesi arasında fark saptanmadı. RNA'nın A enzimi numunelere ekolarak, ısı inaktivasyonundan önce ve sonra ekolarak eklendiğinde, dört günlük kuluçka dönemi boyunca tüm ısı inaktive örneklerinde RNA kaybı meydana geldi. Isı inaktivasyonunun ribozomal RNA üzerindeki etkisi BCG kültürlerinde ve balgamda Tüberküloz pozitif hastalarda ölçüldü.Kontrol kültürünün ölçülen bakteriyel yükü, hem BCG hem de balgam örnekleri için 80 santigrat derece, 85 santigrat derece ve 95 santigrat derece sıcaklık la aktive edilmiş kültürün toplam bakteriyel yükünden daha yüksekti. Örneklerin ısı inaktivasyonu rna en az kaybına neden olur, downstream TB-MBLA ve diğer downstream moleküler testler için yeterli RNA bırakarak. İletim Elektron Mikroskobu, hücrelerin ısı inaktivasyonu ile lysed olup olmadığını araştırmak için kullanılmıştır.Alt ve yüksek büyütme hücrelerinin incelenmesi bozulmamış hücre duvarları ve görünür hücre içi lipid organları ortaya koymuştur. Hücreler uzamış görünüyordu, ama lysed değil. Bu yordamı denerken, kötü RNA çıkarma nedeniyle herhangi bir yanlış negatif sonuç için kontrol çıkarma denetimi eklemek için hatırlamak önemlidir.Bu yaklaşım kronik obstrüktif akciğer hastalığı, tüberküloz olmayan mikobakteri enfeksiyonu ve diğer solunum patojenleri ile ilişkili bakterilere uygulanabilir. TB-MBLA'nın kantitatif sonuçları, hastaların tüberküloz tedavisine nasıl tepki veremrilik lerinin matematiksel ve farmako-modellemesini sağlamıştır. Tüberküloz hastalarının tedavi edildiği rutin bakımda bu tekniği uygulamayı dört gözle bekliyoruz.

a-tuberculosis-molecular-bacterial-load-assay-tb-mbla

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Mikobakterilerin numaralandırma için alternatif bir yaklaşım...

Mikobakteriler canlılık Tedbir Fonksiyonel Tam Kan Testi, Reporter Gen BCG veya M. Tb (BCG Takip edilen konu kullanarak Lüks / M. Tb Lüks)

Xpert MTB / RIF testi aynı anda tespiti için numune dekontaminasyon, eller serbest kullanım, on-board örnek işleme ve ultra-hassas hemi-nested PCR...

Xpert MTB / RIF Testi ile Akciğer Tüberkülozu Tanısı

Burada, küçük müdahale eden sentetik RNA (siRNA), kimyasal bileşik ve Mycobacterium tuberculosis mutant kütüphanelerinin Yüksek verimli / Yüksek içerikli ekranları için geçerli olan fenotipik bir test açıklıyoruz. Bu yöntem, otomatik konfokal mikroskopi kullanılarak floresan etiketli konak hücre içinde floresan etiketli Mycobacterium tuberculosis'in tespitine dayanır.

Yüksek Verimli/Yüksek İçerikli Taramaya Uyarlanmış Hücre İçi Mikobakterilerin Nicelleştirilmesi için Mikroskobik Fenotipik Bir Tahlil

Bir amplifikasyon mikrodizi önemli ölçüde son kullanıcı için mikro-dizi iş akışını tek bir oda içine asimetrik PCR amplifikasyonu ve mikrodizi hibridizasyon birleştirir. Mikrodizi iş akışı basitleştirilmesi rutin alt-kaynak ortamlarda kullanılabilir mikroarray tabanlı tanı oluşturmak için gerekli bir ilk adımdır.

Çok ilaca dirençli Demonstrating<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Amplifikasyon Microarray

Diseksiyon yaygın doku içindeki DNA, RNA ve protein incelenmesi için kullanılmıştır. Lazer yakalama mikroskobu (LCM) en sık kullanılan yöntem, ancak, yeni bir freze tekniği, mesodissection, son zamanlarda kullanılabilir. Biz mesodissected formalin sabit parafin Mycobacterium tuberculosis granülomlarının gömülü doku slaytlar RNA çıkarma göstermektedir.

Kurtarma Bir Roman Mikrodiseksiyon Yaklaşımı<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</emAkciğer granülomlara Gömülü Formalinle Sabit Parafin dan&gt; Özel Transkript

Bu hücre içi, Mycobacterium tuberculosis karşısında roman bileşiklerin bulunması hedefleme için ve in suyu memeli konakçı hücreye karşı bakteri hem de sitotoksisite büyüyen modüler yüksek verimli bir tarama sistemini geliştirdik.

Hücre içi Hedefleme İnhibitörleri Etkinliği ve Sitotoksisite Taraması için sistem<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Yeni nesil anti-tüberküloz ilaçlar için erken ilaç geliştirme sürecini iyileştirecek yeni modeller ve testler oldukça arzu edilmektedir. Burada, Mycobacterium tuberculosis'e karşı ilaç etkinliğini değerlendirmek için yüksek verimli tarama için kolayca uyarlanabilen hızlı, ucuz ve BSL-2 uyumlu bir testi açıklıyoruz.

Bir Yüksek verim Uyumlu Deneyi Makrofaj, pasajlamaya karşı ilaç etkinliğini değerlendirmektir<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Hücre içi M. tuberculosis büyümesinin hızlı ve etkili bir şekilde ölçülmesi, tüberküloza (TB) karşı gelişmiş tedavilerin sürdürülmesi için çok önemlidir. Bu protokol, aday konakçı tarafından yönlendirilen tedavilerle tedavi edilen makrofajlarda Mtb büyümesini ölçmek için otomatik bir sıvı kültür sistemi kullanan et suyu bazlı bir kolorimetrik tespit testini tanımlar.

Tüberküloz için Ev Sahibi Tarafından Yönlendirilen Tedavilerin Preklinik Testlerinde Kullanılmak Üzere Otomatik Bir Kültür Sistemi

Koloni oluşturan birimlerin (CFU) belirlenmesi, görünür koloniler oluşturması haftalar sürebilen Mycobacterium tuberculosis de dahil olmak üzere bakterilerin miktarını belirlemek için altın standart tekniktir. Burada, artan zaman verimliliği, azaltılmış laboratuvar alanı ve reaktif maliyeti ve orta ve yüksek verimli deneylere ölçeklenebilirlik ile CFU belirleme için bir mikro-CFU'yu açıklıyoruz.

Tüberküloza Karşı Aşıların Etkinlik Değerlendirmesi için Mikro Koloni Oluşturan Birim Testi

Yaşayan hayvanların bakteriyel enfeksiyonlar biyoparlaklık görüntüleme yöntemleri açıklanmıştır. Patojenler, canlı hayvanlarda enfeksiyon optik tüm vücut görüntüleme sağlayan lusiferaz ifade etmek için modifiye edilmiştir. Hayvan modelleri lusiferaz ifade patojenler ile enfekte olan ve hastalık ortaya çıkan ders biyoparlaklık görüntüleme ile gerçek zamanlı olarak görüntülenebilmekte.

Farelerde Görüntü Bakteriyel Enfeksiyonlar Lusiferaz Kullanımı

Öğrenin, tüberküloz bakteri yükünü güvenli ölçmek için ısı inaktivasyonu ve gerçek zamanlı PCR kullanarak moleküler analiz yöntemini. Bu teknik, tedavi yanıtını izlemeye ve bulaşıcı hastalık teşhisine uygulanabilir.

Tüberküloz Moleküler Bakteriyel Yük Analizi (TB-MBLA)

Daha fazla video keşfet