Silikon Nitrür Membranları ve Synchrotron X-ışını Floresan Nano-Analizi için Kriyopreyeüzerine Hücre Kültürü
December 10th, 2019
Burada silikon nitrür membranlar ve dalma-donma bir senkrotron kriyojenik X-ışını nanoprobun ile X-ışını floresan görüntüleme öncesinde hücre kültürü için bir protokoldür. Sadece oda sıcaklığında nano-analiz yapıldığında, dondurulmuş numuneler daha da dondurularak kurutulabilir. Bunlar hücre içi element bileşimi hakkında bilgi edinmek için kritik adımlardır.
Yeni tasarlanmış senkrotron x-ışını floresannano-probları, bir numunenin elementel dağılımının görselleştirilmesine izin verir. X-ışını radyasyon hasarlarını yavaşlatmak için kriyojenik yaklaşımların kullanılması zorunludur. Bu nedenle, hızlı bir cryofixation hücre yapısı ve kimyasal bütünlüğünün korunmasını optimize etmek için dondurulmuş sulu hücreleri elde etmek için gereklidir.
Senkrotron çalışmaları için hücresel preparatların özgüllüğü dondurulmuş sulu hücre monokatmanları elde etmek için bu protokolün optimizasyonuna yol açar. Görsel gösteri, ince bir buz tabakası nın içine gömülü tekrarcı kriyosabitlenmiş hücreler elde etmek için hücre monokatmanlı örneklerinin nasıl manipüle edilebildiğini anlamak için önemlidir. Silikon nitrür membran desteği hazırlamak için, membran desteğini içeren kapsülü açın ve desteği hafifçe gevşetmek için kapsülü hafifçe sıkın.
Silikon çerçevenin bir köşesini kavramak için ince cımbız kullanın ve çerçevenin ortasındaki silikon nitrür membranına dokunmamaya özen takın ve çerçeveyi laminar akış dolabında açığa çıkarılmış bir Petri kabına yerleştirin. Sonra UV 25-30 dakika membran sterilize. Sterilizasyon sonunda, poli-L-lizin gibi ek faktörü 10 mikrolitre ekleyin.
37 santigrat derecede 25 dakika ve nem oranı %5 karbondioksitte kuluçkaya yat. Daha sonra steril 48 kuyulu bir plakanın kuyularını, her kuyu da filtrelenmiş 0,22 mikrometrelik 200 ila 250 mikrolitre ile doldurun. Bir kuyuda art arda üç adet 10 saniyelik durulama ile membranı dikey olarak dikkatlice batırmak için ince cımbız kullanın.
Duruladıktan sonra membranı laminar akış kaputunun altında steril 96 kuyulu bir tabağın boş bir kuyuya dikey olarak yerleştirin ve kuruyana kadar bir gecede bırakın. İlgi çeken hücrelerin tohumlanması için, düz tarafı steril dört kuyulu bir plakanın bir kuyuya bakacak şekilde kaplanmış membranı yerleştirin. Membrandokunmadan silikon nitrür membran yüzeyine uygun bir kültür ortamı 10 mikrolitre dört hücre beş kez 10 ekleyin.
Damla tüm membranı kaplayacak. Sonra 37 santigrat derece ve nem ile% 5 karbondioksit hücreleri kültür. Hücreler substrat eklemeye başladığında, yavaş yavaş her kuyu nun her membran kapsayan duvaraşağı tam kültür orta bir mililitre ekleyin.
Sonra 37 santigrat derece ve nem ile% 5 karbondioksit hücreleri kültür. Hücresel preparatKrasyon kriyommobilizasyonu için, ilk otomatik bir dalma dondurucu açmak ve 37 derece santigrat amonyum asetat tampon ile 12-kuyu plastik plaka kuyuların uygun sayıda doldurun. Membranı durulamadan ve donmadan hemen önce, numuneyi kuvözden çıkarın ve cımbızları açmak için bir çift hızlı serbest cımbızın siyah kelepçe halkasını kullanın.
Membran desteğini kavramak ve membranı amonyum asetat tampon çözeltisi içinde dikey olarak yaklaşık beş saniye boyunca batırmak için kilitli olmayan cımbızları kullanın. Fazla arabelleği kaldırmak için, membran desteğinin alt kısmını filtre kağıdına bastırın ve membranın kağıda dokunmasına izin vermeden çerçevenin her iki tarafını filtre kağıdına yerleştirin. Fazla tampon kaldırıldığında, çevre odası nın kapısını açın, cımbızları hızlıca çerkezliğe kaydırın ve odanın kapısını kapatın.
Basın blot A dalma. Silikon nitrür membranını tutan cımbız lar hızla kriyojene daldırılır. Dalma donduktan sonra, önceden soğutulmuş forceps ve basın transferi ile transfer kabının kapağını çıkarın.
Silikon nitrür membran kriyojen biraz üzerinde hareket ettirilecektir. Hızlı bir tek hareketle, cımbızları terliklerin iç içe geçmesiyle, cımbızları doğrudan azot sıvısı ile dolu transfer kabındaki kriyometrenin boş yuvasına getirin. Sonra membran serbest bırakmak için siyah kelepçe halkası bırakın.
Dondurulan hücrelerin dondurulması için, donma kurutma aletinin arka panelinde bulunan rocker anahtarını kullanarak aletin üzerine güç verir. Ekran, numune yüklemeye hazır olduğunda enter tuşuna basmasını gösterir. İlk pirinç parçanın üst kenarının yaklaşık bir ila iki milimetre altında sıvı azot seviyesini tutarak polistiren depolama konteyner tedarikçi tarafından sağlanan örnek transfer tutucu üstüne silikon nitrür membran pirinç tutucu monte.
Hücre numunesi tarafını pirinç tutucu numaralı kaviteye bakacak şekilde yerleştirin ve transfer çubuğunu sıvı nitrojen dolu polistiren köpük kutusuna önceden soğutun. Tam montaj kilitlemek için çubuk kullanın, donma kurutma odasının kapağını serbest bırakmak için vakum kırmak için girin, hemen dondurucu odasında örnek aktarmak ve dondurucu kurutucu odası kapağını kapatın. Sonra hemen bastırmaya başlayın donma kurutma döngüsü ile devam etmeye başlayın.
Dondurma kurutma döngüsünün sonunda, odayı havalandırmak için dur tuşuna basın ve dondurulmuş kurutulmuş numunelere erişmek için tam montajı çıkarın. Burada tipik bir optik video mikroskop görünümü olarak gösterildiği gibi bir poli-L-lizin kaplı silikon nitrür membran desteği üzerine alt kültürlü dondurulmuş sulu meme kanseri hücre hattı hücreleri gösterilmiştir. Dondurulmuş sulu hücrelerin X-ışını floresan elementer haritalama potasyum, kükürt ve çinko gibi fizyolojik elementlerin dağılımlarını ortaya koymaktadır.
Bu temsili örnekte, sıkıca bağlanmış kükürt elementi potasyum için gözlenene benzer bir modelde hücre içinde eşit olarak dağıtılmış ve hücresel kitle profilinin iyi bir tahminini temsil eder. Ancak çinko dağılımı, sitosol ile çekirdek arasında açıkça tanımlanmış bir ayrım ile çekirdek içinde sitosoldan daha yüksek sinyal sergiledi. Dondurularak kurutulmuş birincil fare hipokampal nöronların bu tipik Brightfield mikroskobu görünümünde doğrudan gösterildiği gibi bir silikon nitrür membran kültürlü, hücreler kendi kültür veya koruma yöntemi etkilenmez tipik bir nöral morfoloji sergiler.
Dalma-dondurulmuş hücrelerin X-ışını floresan görüntüleme de 50 ila 100 nanometre uzamsal çözünürlükte bu temsili dondurulmuş kurutulmuş hücreler tarafından sergilenen tipik element dağılımları ortaya koymaktadır. Silikon nitrür penceresinin çizilmesi, dalma donduktan sonra mümkün olan en ince buz tabakasını elde etmek için çok önemlidir. Hücrelerin hücre altı düzeyindeki kimyasal bütünlüğünün korunması, hücrelerin metallomunun senkrotron nano-probların yanı sıra diğer mikroanalitik tekniklerle de araştırılmasını sağlar.
Tüm senkrotron nano-sonda analizleri kriyojenik sıcaklıkta yapılamayabileceğinden, dondurulmuş sulu hücreler oda sıcaklığında analizlerini kolaylaştırmak için daha da dondurularak kurutulabilir. Sıvı nitrojenle çalışırken uygun kişisel koruyucu ekipman kullanmayı ve her zaman alevlerden uzak bir duman kaputunda etan gazı kullanmayı unutmayın.
Genel Bakış
Bu makale, silikon nitrür membranları üzerinde hücre kültürü ve ardından X-ışını floresan görüntüleme için daldırma dondurma protokolü sunmaktadır. Yöntem, kriyojenik tekniklerle hücre yapısının korunmasını ve elementel analizi optimize etmeyi amaçlamaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Hücre Biyolojisi
- Görüntüleme Teknikleri
Arka Plan
- Senkrotron X-ışını floresan nano probları, elementel dağılımların detaylı görselleştirilmesini sağlar.
- Görüntüleme sırasında radyasyon hasarını en aza indirgemek için kriyojenik yöntemler gereklidir.
- Hücresel bütünlüğün korunması için hızlı kriyofiksasyon kritiktir.
- Spesifik protokoller, senkrotron çalışmaları için örneklerin hazırlanmasını artırır.
Çalışmanın Amacı
- Silikon nitrür membranları üzerinde hücre kültürü ve hazırlama için güvenilir bir yöntem geliştirmek.
- Hücre yapısının korunmasında daldırma dondurmanın etkinliğini göstermek.
- Hücrelerin elementel analizi için X-ışını floresan görüntülemeyi kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Yapışma faktörleri ile silikon nitrür membranlarının hazırlanması.
- Kontrollü koşullar altında hücre ekim ve kültürü.
- Numunelerin amonyum asetat tamponunda daldırma dondurulması.
- Görüntüleme analizi için daldırma dondurulmuş hücrelerin dondurma kurutması.
Ana Sonuçlar
- X-ışını floresan görüntüleme, hücrelerde potasyum, kükürt ve çinko elementel dağılımlarını ortaya çıkardı.
- Hücre morfolojisi kültür ve korunma sonrasında bozulmadan kaldı.
- Özellikle çekirdekte çinko için belirgin elementel lokalizasyon gözlendi.
- Görsel gösterimler, hücre örneklerinin manipülasyonunu anlamada yardımcı oldu.
Sonuçlar
- Protokol, elementel analiz için hücre yapısının korunmasını etkili bir şekilde sağlar.
- Daldırma dondurma, yüksek kaliteli görüntüleme sonuçları elde etmek için kritik bir adımdır.
- Yöntemin daha fazla optimizasyonu, çalışmalarda tekrarlanabilirliği artırabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This protocol enables high-fidelity preservation of cellular elemental content for synchrotron X-ray fluorescence nano-analysis, addressing a critical gap in metallomics and subcellular metal ion mapping. By providing a stepwise method for cryopreparation of adherent cells on silicon nitride membranes, it supports target validation and mechanistic de-risking in disease-relevant systems where metal homeostasis is disrupted. The approach enhances predictive confidence in preclinical models by enabling quantitative, spatially resolved metallome analysis at organelle resolution.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of metal ion distribution patterns linked to pathophysiological states in disease models.
- Operational Value: Provides a reproducible platform for validating targets involved in metalloregulatory pathways.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative 2D and 3D elemental maps that serve as functional readouts for compound screening.
- Operational Value: Standardizes sample preparation for consistent, high-resolution X-ray fluorescence detection across experiments.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant systems by preserving native metallome states in primary and cancer cell models.
- Operational Value: Enables longitudinal tracking of elemental changes from discovery through preclinical validation stages.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target hypothesis testing to preclinical mechanistic studies, particularly where metal dysregulation is a biomarker or therapeutic mechanism.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by revealing subcellular localization of metals like zinc in nucleus versus cytosol.
- Screening: Delivers assay-ready, cryopreserved samples with preserved elemental integrity for compound response evaluation.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements (elemental concentration and distribution) essential for comparing treatment conditions.
- Translational Research: Maintains continuity from cultured cells to preclinical analysis by preserving chemical integrity at subcellular resolution.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable sample preparation platform for metallomics studies across multiple projects and cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in metallobiology by enabling direct visualization of ion fluxes and storage.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized cryofixation and optional freeze-drying workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, mechanism-based metallome data that de-risks target engagement hypotheses.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of compounds based on their effects on elemental homeostasis in relevant cellular compartments.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, cryogenic handling, and synchrotron-based X-ray fluorescence operation.
- Depends on access to plunge freezers, liquid nitrogen systems, and synchrotron beamlines with nanoprobe capabilities.
- Necessitates cross-team standardization between cell biology, imaging, and analytical science groups for consistent sample handling.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to different cell lines or tissue models while maintaining membrane compatibility.
- Includes practical limitations such as the need for immediate transfer under cryogenic conditions and sensitivity to ice crystal formation if plunge freezing is delayed.
