Name: Pseudomonas aeruginosa Küçük Koloni Varyant Kültürü ve Aljinat Quantitation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Öğrenin Pseudomonas aeruginosa küçük koloni varyantlarını yetiştirme ve aljinat miktarını ELISA ile hassas ölçme yöntemlerini. Bu teknikler biyofilm araştırmalarında ve kistik fibrozis kronik akciğer enfeksiyonlarının izlenmesinde kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) tarafından desteklenmiştir R44GM113545 ve P20GM103434 hibe.

1. SCV Büyüme Koşulları ve Kurtarma Yolu Fizyolojik Aktivasyonu
<ol><li>SCV tespiti.<ol>
<li>P. aeruginosa suşları PAO1, PAO1ΔpyrD, PAO581 ve PAO581ΔpyrD önceden ısıtılmış Pseudomonas izolasyon agar (PIA) plakaları üzerinde çizgi ve 48 saat için 37 °C'de büyür. Büyüme plakası üzerinde SCV fenotip (normal 3−5 mm koloni boyutu aksine 1−3 mm koloni boyutu) olan tek bir koloni izole tanımlayın.</li>
		<li>SCV'nin saf bir yalıtımını elde etmek için adım 1.1.1'i tekrarlayın. NOT: SCV kolonilerinin yavaş büyüme hızı nedeniyle büyüme 72 saate kadar sürebilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kurtarma yolunun fizyolojik aktivasyonu.<ol>
<li>Steril bir aşılama döngüsü kullanarak, PIA plakasından SCV kolonisini seçin ve 0,1 mM urasil ile takviye edilmiş önceden ısınmış bir PIA üzerinde çizgi. 24−48 saat boyunca 37 °C'de plaka yetiştirin. NOT: Bu protokolde kullanılan tüm PIA plakaları otoklavlamadan önce karışıma eklenen 20 mL/L gliserol içerir. Otoklavlama dan sonra ve karışım sıcaklığı 55 °C'nin altında olduktan sonra plakaları dökmeden önce sıvı ortama 11.21 mg/L urasil (0.1 mM) ekleyin. Bu yöntem P. aeruginosaSCV fenotip neden pirimidin mutasyonları belirlenmesine yardımcı olacaktır. SCV fenotip mutasyonun bir sonucu ise, o zaman normal koloni büyüme ve boyutu (3−5 mm) urasil takviyeLI PIA plakaları üzerinde gözlenir. Suşları aljinat üretmek için yeteneği olsaydı, o zaman mukoid fenotip de urasil takviyesi üzerine dönecektir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Üronik Asit Karbazol Asa
<ol><li>Test edilmesi istenen suş saf bir kültürden, tek bir koloni belirlemek. Steril bir kürdan kullanarak, koloniyi seçin ve kürdanı 5 mL Pseudomonas izolasyon suyu (PIB) içeren bir kültür test tüpüne yerleştirin. 37 °C'de 24 saat boyunca bir çalkalayıcı kuluçka makinesinde büyüyün. NOT: Aşağıdaki suşları PAO581 (PAO1mucA25), PAO581carA, PAO581karb, ve PAO581pyrD PIA plakaları veya PIA plakaları 0.1 mM urasil ile takviye ölçü için aljinat hasat yetiştirilen edildi.</li>
	<li>Önceden ısınmış bir PIA plakasının üzerine 150 μL kültürlü PIB suyu (15 mm x 100 mm plakalar için) veya 450 μL et suyu (15 mm x 150 mm plakalar için) ekleyin. Steril bir hücre dağıtıcıkullanarak, tabağın üzerine et suyu yayıldı. Plakayı 37 °C'de 24 saat uzlayın. NOT: Plakayı bir tarafa devirerek bir pipet kullanarak plakadan herhangi bir fazla sıvıyı aspire edin. Protokolde kullanılan PIB ve PIA plakaları, aljinat üretimine yardımcı olmak için hücreler tarafından karbon kaynağı olarak kullanılmak üzere 20 mL/L gliserol içerir.</li>
	<li>Bir pipet denetleyicisi ve steril 50 mL pipet kullanarak, yetiştirilen çim% 0.85 NaCl ekleyin ve bir hücre dağıtıcı kullanarak plaka hurdaya örnek toplamak. Numuneyi 50 mL'lik bir toplama borusuna taze 50 mL pipet kullanarak aspire edin. Karışımı ve buz üzerinde yer için yüksek üzerinde örnek Girdap. NOT: Eklenen %0,85 NaCl'nin hacmi plakanın boyutuna bağlı olarak değişir. 15 mm x 100 mm plakalar için 10−30 mL, 15 mm x 150 mm plakalar için 20−50 mL kullanın.</li>
	<li>Numunelerin 600 nm 'deki (OD600)optik yoğunluğunu tek kullanımlık bir cuvette numuneye 1 mL ekleyerek ve spektrofotometre kullanarak OD'yi okuyarak ölçün. Her örnek için okuma bir triplicate elde etmek için bu adımı 2x tekrarlayın.</li>
	<li>Kültür tüpleri içine sülfürik asit / borat çözeltisi 3 mL ekleyin ve buz üzerinde oturup sağlar. Toplanan numunenin 350 μL'sini test tüplerinde asit karışımına YAVAŞ çaekleyin ve kısa bir süre için girdap yapın.<ol>
<li>45 mL suya 10.099 g potasyum hidroksit (KOH) tozu ekleyerek borat stokunu hazırlayın. Karışıma 24,74 g borik asit (H3BO3)ekleyin ve hacmi 100 mL'ye getirin.</li>
		<li>Buz ile bir lavaboya 1 L şişe yerleştirin ve konsantre sülfürik asit 500 mL ile şişe doldurun. YAVAŞ YAVAŞ hazırlanan borat stokunun 15 mL ekleyin. Şişenin soğumasını bekleyin.</li>
		<li>Toplam 25 mL için 10 mL daha borat stoğu ekleyin. Şişe soğuduktan sonra, hacmi 1 L'ye getirin. DİkKAT: Bu yöntem yüksek konsantrasyonda sülfürik asit kullanımına dayanır. Numunenin emniyetini sağlamak için uygun kişisel koruyucu ekipman kullanılmalıdır ve numunenin uygun bertaraf protokolüne uyulmalıdır. NOT: Pozitif kontrol için bilinen bir D-mannuronik asit konsantrasyonu ve/veya bilinen bakteriyel aljinat örnekleri p. aeruginosa suşları üreten aljinat yoluyla hasat ve saflaştırılmış (örneğin: PAO581-PAO1mucA25). Negatif kontrol için %0.85 NaCl çözeltisi ve/veya PAO1ΔalgD (bakterileri tamamen aljinat üretemeyen algD geninin çerçeve içi silinmesi) kullanın. İstatistiksel analize yardımcı olmak için teknik tekrar sayısını artırmak için her örnekten birden fazla tüp yapılabilir. Her numuneden 3−5 tüp hazırlayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Asit/numune karışımına etanol çözeltisine 100 μL %0,1 karbazol ekleyin. 5 s. 55 °C'de 30 dk kuru bir banyoda yer için orta ayarda tüp ve girdap kaplayın.</li>
	<li>Kuluçkadan sonra tüpleri ve girdabı kısa bir süre yüksekten çıkarın ve 5 dk soğumaya bırakın. NOT: Görülecek renk mor bir gölge olacaktır. Renk 1−2 saat ölçüm için sabit kalır.</li>
	<li>Her tüpün OD530'unu temiz bir cuvette karışımı1 mL ekleyerek ve numunelerin OD'sini 530 nm'de spektrofotometrede okuyarak okuyun. Tüpü %0,85 NaCl ile spektrofotometreye boş olarak kullanın.</li>
	<li>D-Mannuronik asit (1.024 μg/mL, 512 μg/mL, 256 μg/mL, 128 μg/mL, 64 μg/mL, 32 μg/mL, 16 μg/mL ve 8 g/mL) seri seyreltmelerinin OD530'u ölçerek standart bir eğri hazırlayın. Tekrar 2x. Bu okumalardan doğrusal bir denklem çıkar. NOT: Standart eğrinin yalnızca bir kez yapılması gerekir. Ondan çıkarılan doğrusal denklem daha sonra sınanması için kullanılabilir.<ol>
<li>Standart eğriyi kullanarak her numunedeki aljinat konsantrasyonunu hesaplayın ve OD 600 başına toplam aljinat miktarını elde etmek için aljinat konsantrasyonunu doğrusal denklemden OD600 ilebölün.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Aljinat Quantitation için ELISA
<ol><li>Aljinat ölçümü için numune almak için 2.1−2.4 adımlarını tekrarlayın. NOT: Kullanılan suşlar PAO1, PAO1ΔalgDve PAO1 pHERD20T taşıyan-algU.</li>
	<li>Mikropipet kullanarak, toplanan numunenin 50 μL'sini işlenmemiş 96 kuyuluk bir tabağa ekleyin. Kuyulara 50 μL kaplama tamponu (karbonat/bikarbonat tampon pH 9.6) ekleyin. Plakayı 37 °C'de 2 saat kuluçkaya yatırın. NOT: Pozitif kontrol için bilinen bir D-Mannuronik asit konsantrasyonu ve/veya bilinen stabil aljinat üreten suşu (örneğin: PAO581-PAO1mucA25)kullanılabilir. Negatif kontrol için %0.85 NaCl çözeltisi ve/veya PAO1ΔalgD (algD geninin çerçeve içi silinmesi bakterileri herhangi bir aljinat üretemez hale getirir). İstatistiksel analize yardımcı olmak için teknik tekrar sayısını artırmak için her örnekten birden fazla kuyu yapılabilir. Her numuneden 3−5 kuyu hazırlayın.</li>
	<li>Fışkırtma şişesi kullanarak, kuyuları doldurarak %0,05 Ara 20 (PBS-T) ile 1x fosfat tamponsal salin (PBS) ile 2x plakayı yıkayın ve sonra tabağı ters çevirerek boşaltın.</li>
	<li>Mikropipet kullanarak kuyulara 200 μL bloke tamponu (PBS-T'de %10 yağsız süt) ekleyin. Gece boyunca 4 °C'de kuluçkaya yatırın. NOT: Buzdolabında buharlaşmayı önlemek için plakayı parafin filmine sarın veya küçültün.</li>
	<li>Bir fışkırtma şişesi kullanarak kuyuları doldurarak pbs-T ile plaka kuyuları 2x yıkayın ve daha sonra plaka üzerinde çevirerek onları drenaj.</li>
	<li>Mikropipet kullanarak kuyulara 100 μL seyreltilmiş primer antikor (fare anti-aljinalmonodal antikor) ekleyin ve 37 °C'de 1−2 saat boyunca kuluçkaya yatırın. NOT: Primer antikor (fare anti-aljinat monoklonal antikor) 0.5 g/mL konsantrasyonunda (1 mg/mL stokun 1:2.000 seyreltilmesi) antikor dilüent çözeltisinde (1x PBS'de %1 yağsız süt) sağlandı.</li>
	<li>Bir fışkırtma şişesi kullanarak kuyuları doldurarak pbs-T ile 3x plaka kuyuları yıkayın ve daha sonra plaka üzerinde çevirerek onları drenaj.</li>
	<li>Mikropipet kullanarak kuyulara 100 μL seyreltilmiş ikincil antikor ekleyin ve 37 °C'de 1−2 saat boyunca kuluçkaya yatırın. NOT: Kullanılan sekonder antikor, antikor dilüent çözeltisinde 0.25 μg/mL konsantrasyonuna (0.5 mg/mL stokun 1:2.000 seyreltilmesi) delen keçi anti-fare poli-HRP antikoruydu.</li>
	<li>Bir fışkırtma şişesi kullanarak kuyuları doldurarak pbs-T ile 3x plaka kuyuları yıkayın ve daha sonra plaka üzerinde çevirerek onları drenaj.</li>
	<li>Mikropipet kullanarak, 100 μL TMB-ELISA çözeltisi(Malzeme Tablosu)ekleyin ve karanlıkta 30 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın. NOT: Olumlu bir tepkinin rengi mavinin tonu olacaktır.</li>
	<li>Bir mikropipet kullanarak, 100 μL stop çözeltisi (2 N sülfürik asit) ekleyin. NOT: Durdurma çözeltisi eklendiğinde renk maviden sarıya döner. Reaksiyon durdurulduktan sonra renk 30 dakikaya kadar sabittir.</li>
	<li>Bir plaka okuyucu kullanarak, 450 nm de OD okuyun.</li>
	<li>D-Mannuronik asit (1.024 μg/mL, 512 μg/mL, 256 μg/mL, 128 μg/mL, 64 μg/mL, 32 μg/mL, 16 μg/mL ve 8 g/mL) bilinen seri seyreltmelerin OD450'sini ölçerek standart bir eğri üretin. Tekrar 2x. Bu okumalardan doğrusal bir denklem çıkar. NOT: Standart eğrinin yalnızca bir kez yapılması gerekir. Ondan çıkarılan doğrusal denklem daha sonra sınanması için kullanılabilir.<ol>
<li>Standart eğriyi kullanarak her numunedeki aljinat konsantrasyonunu hesaplayın ve OD 600 başına toplam aljinat miktarını elde etmek için aljinat konsantrasyonunu doğrusal denklemden OD600 ilebölün.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Aljinat Ölçümünün İstatistiksel Analizi
<ol><li>Grafik yazılım sayfasında, standart eğriden türetilen doğrusal denklemi içeren bir sütun ayarlayın. Her numunede aljinat konsantrasyonu elde etmek için elisa için üronik asit tahsini için od530 ve ELISA için OD450 olarak aljinat konsantrasyonu ve x-eksensonuçları olarak y-ekseni sonuçlarını ayarlayın.</li>
	<li>Her numunedeki aljinat miktarını 5,5 x108 CFU/mL (1 OD600)başına göre normalleştirmek için, yukarıda elde edilen her numunenin konsantrasyonunu ilgili OD600 değerine bölün. Her örnek için birden fazla OD600 ölçüldüyse, ortalama OD600'ebölün.</li>
	<li>Tercih edilen istatistiksel yazılımları kullanarak istatistiksel analiz yapın (örneğin, GraphPad Prism 7.02).</li>
	<li>Yazılımı açın. Yeni Tablo & Grafik altında Sütun'u seçin ve tek yönlü ANOVA veri kümesini seçin.</li>
	<li>Zorlanma test ile her sütun adı ve altında aljinat konsantrasyonları ekleyin.</li>
	<li>Tüm verileri girerek üst menüdeki Analyze'a tıklayın. Bu, bir çözümleme ayarları penceresi açar. Sınama için uygun parametreleri seçin ve birden çok karşılaştırmanın çalıştırılması gerekip gerekmediğini belirtin. NOT: Analizden sonra veri kümesi, verilerin istatistiksel önemini belirlemeye yardımcı olacak bir p değeri içerecektir. P değeri α değerinden daha azsa veriler istatistiksel olarak anlamlı kabul edilir (normalde α değeri p < 0.01 için ayarlanır).</li>
	<li>Grafik sekmesinin altında Çubuk Grafiği türünü seçin. Bu, giriş veri sayfasından belirtilen başlıkla verileri otomatik olarak grafikle çizecektir. İlgi çubukları arasındaki bağlantı çizgilerinin üzerindeki * simgesini göstererek verilerin gerektiği gibi istatistiksel önemini belirtin.</li>
</ol>

<ol><li>Govan, J. R., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+pathogenesis+in+cystic+fibrosis%3A+mucoid+Pseudomonas+aeruginosa+and+Burkholderia+cepacia%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Microbial pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia.</a> Microbiological Reviews. 60 (3), 539-574 (1996).</li>
<li>Hogardt, M., Heesemann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+of+Pseudomonas+aeruginosa+during+persistence+in+the+cystic+fibrosis+lung%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Adaptation of Pseudomonas aeruginosa during persistence in the cystic fibrosis lung.</a> International Journal of Medical Microbiology. 300 (8), 557-562 (2010).</li>
<li>Evans, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+colony+variants+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+chronic+bacterial+infection+of+the+lung+in+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Small colony variants of Pseudomonas aeruginosa in chronic bacterial infection of the lung in cystic fibrosis.</a> Future Microbiology. 10 (2), 231-239 (2015).</li>
<li>Johns, B. E., Purdy, K. J., Tucker, N. P., Maddocks, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+Genotypic+Characteristics+of+Small+Colony+Variants+and+Their+Role+in+Chronic+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+Insights%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and Genotypic Characteristics of Small Colony Variants and Their Role in Chronic Infection.</a> Microbiology Insights. 8, 15-23 (2015).</li>
<li>Pestrak, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+rugose+small-colony+variants+evade+host+clearance%2C+are+hyper-inflammatory%2C+and+persist+in+multiple+host+environments%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogones%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa rugose small-colony variants evade host clearance, are hyper-inflammatory, and persist in multiple host environments.</a> PLoS Pathogones. 14 (2), e1006842(2018).</li>
<li>Al Ahmar, R., Kirby, B. D., Yu, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrimidine+Biosynthesis+Regulates+Small+Colony+Variant+and+Mucoidy+in+Pseudomonas+aeruginosa+Through+Sigma+Factor+Competition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Pyrimidine Biosynthesis Regulates Small Colony Variant and Mucoidy in Pseudomonas aeruginosa Through Sigma Factor Competition.</a> Journal of Bacteriology. 201 (1), e00575-e00618 (2019).</li>
<li>Ramsey, D. M., Wozniak, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+control+of+Pseudomonas+aeruginosa+alginate+synthesis+and+the+prospects+for+management+of+chronic+infections+in+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Understanding the control of Pseudomonas aeruginosa alginate synthesis and the prospects for management of chronic infections in cystic fibrosis.</a> Molecular Microbiology. 56 (2), 309-322 (2005).</li>
<li>Mathee, K., McPherson, C. J., Ohman, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranslational+control+of+the+algT+%28algU%29-encoded+sigma22+for+expression+of+the+alginate+regulon+in+Pseudomonas+aeruginosa+and+localization+of+its+antagonist+proteins+MucA+and+MucB+%28AlgN%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Posttranslational control of the algT (algU)-encoded sigma22 for expression of the alginate regulon in Pseudomonas aeruginosa and localization of its antagonist proteins MucA and MucB (AlgN).</a> Journal of Bacteriology. 179 (11), 3711-3720 (1997).</li>
<li>Schurr, M. J., Yu, H., Martinez-Salazar, J. M., Boucher, J. C., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+AlgU%2C+a+member+of+the+sigma+E-like+family+of+stress+sigma+factors%2C+by+the+negative+regulators+MucA+and+MucB+and+Pseudomonas+aeruginosa+conversion+to+mucoidy+in+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Control of AlgU, a member of the sigma E-like family of stress sigma factors, by the negative regulators MucA and MucB and Pseudomonas aeruginosa conversion to mucoidy in cystic fibrosis.</a> Journal of Bacteriology. 178 (16), 4997-5004 (1996).</li>
<li>Rehm, B. H. A. Alginate Production: Precursor Biosynthesis, Polymerization and Secretion. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRehm%2C+BHA+%22Alginates%3A+Biology+and+Applications%22">Alginates: Biology and Applications</a>. Rehm, B. H. A. , Springer Berlin Heidelberg. Berlin, Germany. 55-71 (2009).</li>
<li>Remminghorst, U., Rehm, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+alginates%3A+from+biosynthesis+to+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Letters%22%5BJournal%5D)">Bacterial alginates: from biosynthesis to applications.</a> Biotechnology Letters. 28 (21), 1701-1712 (2006).</li>
<li>Potvin, E., Sanschagrin, F., Levesque, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sigma+factors+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Sigma factors in Pseudomonas aeruginosa.</a> FEMS Microbiology Reviews. 32 (1), 38-55 (2008).</li>
<li>Damron, F. H., Goldberg, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolytic+regulation+of+alginate+overproduction+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Proteolytic regulation of alginate overproduction in Pseudomonas aeruginosa.</a> Molecular Microbiology. 84 (4), 595-607 (2012).</li>
<li>Bowness, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+the+carbazole+reaction+to+the+estimation+of+glucuronic+acid+and+flucose+in+some+acidic+polysaccharides+and+in+urine%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Application of the carbazole reaction to the estimation of glucuronic acid and flucose in some acidic polysaccharides and in urine.</a> The Biochemical Journal. 67 (2), 295-300 (1957).</li>
<li>Fazio, S. A., Uhlinger, D. J., Parker, J. H., White, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimations+of+uronic+acids+as+quantitative+measures+of+extracellular+and+cell+wall+polysaccharide+polymers+from+environmental+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Estimations of uronic acids as quantitative measures of extracellular and cell wall polysaccharide polymers from environmental samples.</a> Applied Environmental Microbiology. 43 (5), 1151-1159 (1982).</li>
<li>Knutson, C. A., Jeanes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+modification+of+the+carbazole+analysis%3A+application+to+heteropolysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A new modification of the carbazole analysis: application to heteropolysaccharides.</a> Analytical Biochemistry. 24 (3), 470-481 (1968).</li>
</ol>

Yazar Hongwei D. Yu Baş Bilim Görevlisi ve Progenesis Technologies, LLC kurucularından biridir.

Hem SCV hem de aljinat çeşitli kronik enfeksiyonlarda bulunan önemli hastalık belirteçleridir. Bu nedenle, SCV büyümek ve P. aeruginosa tarafından aljinat düzenleme ve üretim çalışma yeteneği bu kronik hastalıklar için yeni tedavilerin keşfi ayrılmaz bir parçasıdır.
SCV suşları diğer P. aeruginosa suşları ile karşılaştırıldığında onların yavaş büyüme hızı4 nedeniyle büyümek için kötü üne sahiptir, onların antimikrobiyal direnç yardımcıları<sup class="x...

Pseudomonas aeruginosa ile kronik akciğer enfeksiyonları kistik fibrozis (CF) olan hastalarda morbidite ve mortalitenin önemli bir nedenidir. Erken çocukluk döneminde, hastalar P. aeruginosanonmucoid izole dahil olmak üzere birden fazla bakteriyel patojenler tarafından kolonize edilir1,2. Küçük koloni varyantının (SCV) ortaya çıkması izole yanı sıra mukoid izole kronik enfeksiyonlara başlangıç için bir belirteçtir. SCV izole son derece ilaca dirençli3 yavaş büyüme oranlarınedeniyle 4, hangi onları tedavi alayları ve diğer kronik enfeksiyonlar da ciddi bir caydırıcı hale getirir5 P. aeruginosatarafından . Al Ahmar ve ark.6'nın çalışmaları, de novo pirimidin biyosentezi ile bağlantılı SCV ve mucoidy arasında bir bağlantı olduğunu gösterdi. Pirimidin açlık, pirimidin üretimi ile ilgili genlerde mutasyonlar nedeniyle, nonmucoid referans zorlanma PAO1 ve mukoid türevi SCV fenotip sonuçlandı, PAO581 (PAO1mucA25).
Aljinat overproduction CF kronik akciğer enfeksiyonları için önemli bir hastalık belirteci olmasına rağmen, aljinat ve akciğer patolojisi miktarı arasında doğrudan bir korelasyon olup olmadığı açık değildir, ve aljinat tedavi için bir prognoz belirteci olarak kullanılabilir olup olmadığı belirsizdir7. Aljinat üretimi esas olarak iki operon, düzenleyici operon(algUmucABCD)8,9 ve biyosentetik operon(algD operon)10,11tarafından düzenlenir. Aljinat üretimi sıkıca sigma faktörü AlgU9tarafından düzenlenir9 ,12 (ayrıca AlgT olarak da bilinir) ve anti-sigma faktörü MucA13bozulması . Hastaların balgam örneklerinden aljinat in in in üretimini izleyebilme yeteneği yeni tedavi seçeneklerinin geliştirilmesine yardımcı olabilir.
Burada, pirimidin de novo sentezleyemeyen mutantların neden olduğu SCV varlığını tespit eden bir büyüme durumunu tanımlıyoruz. Urasil ve/veya sitozin takviyesi, pirimidin nükleotitinin azotlu tabanı, kurtarma yolunu aktive eder, böylece mutantlarda normal büyümeyi geri sağlar. Bu spesifik SCV mutantları için bu büyüme yöntemi, hasta örneklerinde pirimidin mutasyonlarını belirlemek için bir tarama yöntemi olarak kullanılabilir. Buna ek olarak, p. aeruginosatarafından üretilen ve salgılanan aljinat tespiti ve ölçümü için iki yöntem tartışmak. İlk geleneksel yöntem14,15,16 asit yüksek konsantrasyon kullanarak polisakkarit aşağılayıcı ve daha sonra örnek konsantrasyonu quantitate için bir kolorimetrik gösterge ekleyerek. Laboratuvarımızda geliştirilen ikinci yöntem, QED Biosciences tarafından geliştirilen anti-aljinat monoklonal antikor (mAb) kullanarak Enzime Bağlı İmmünosorbent Assay (ELISA) kullanılmaktadır. ELISA yöntemi üronik asit tizinden daha spesifik ve hassas olduğunu kanıtlar ve yüksek konsantrasyonlu sülfürik asitten kaçınma nedeniyle daha güvenli kullanım sağlar. ELISA'nın aljinat ölçmek için doğrudan hasta balgam örneklerinde kullanılabilme özelliği ile, enfeksiyonun farklı dönemlerinde akciğerlerde bulunan aljinat miktarını takip etmek için bir izleme tanı aracı olarak geliştirilebilir.

<table><tbody><tr><td>1 Adımlı Ultra TMB-ELISA</td><td>Thermo Scientific</td><td>34028</td><td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Mutlak Etanol (200 Kanıt) aracılığıylaFisher</td> <td>Scientific</td><td>BP2818-4</td><td>Moleküler Biyo-dereceli</td></tr><tr><td>Accu Block Dijital Kuru Banyo</td><td>Labnet</td><td>NC0205808</td><td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Tahlil Plakaları aracılığıyla 96 kuyulu</td><td>CoStar</td><td>2021-12-20</td><td></td></tr><tr><td>Tezgah Üstü Vortex-Genie 2</td><td>Bilimsel Endüstriler</td><td>G560</td><td></td></tr><tr><td>Borik Asit</td><td>Araştırma Ürünleri International Corp.</td><td>10043-35-3</td><td></td></tr><tr><td>Kabin İnkübatörü</td><td>VWR</td><td>1540</td><td></td></tr><tr><td>Karbazol</td><td>Sigma</td><td>C-5132</td><td></td></tr><tr><td>Karbonat-Bikarbonat Tampon</td><td>Sigma</td><td>C3041</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj Tüpleri (50 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-13</td><td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Culture Test Tüpleri</td> aracılığıyla <td>Fisher Scientific</td><td>14-956-6D</td><td>Fisher aracılığıyla Bilimsel</td></tr><tr><td>Küvet Polistiren (1.5 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>14955127</td></tr><tr><td>Sitozin</td><td>Acros Organics</td><td>71-30-7</td><td></td></tr><tr><td>Tek Kullanımlık Aşılama Döngüleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-597</td><td></td></tr><tr><td>D-Mannuronik Asit Sodyum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SMB00280</td><td></td></tr><tr><td>FMC Aljinat</td><td>FMC</td> <td>aracılığıylaMoleküler Biyoloji için 2133</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906-5</td><td>Fare</td></tr><tr><td>Anti-Aljinat Monoklonal Antikor</td><td>QED Biosciences</td><td>N / A</td><td>Lot #: 15725/15726</td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Tuzlu Su Tozu (PBS)</td> <td>Sigma</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Keçi Anti-Fare Anti-Fare Poli-HRP Antikoru</td><td>Thermo Scientific</td><td>32230</td><td>Fisher Scientific aracılığıyla</td></tr><tr><td>Potasyum Hidroksit</td><td>Fisher Scientific</td><td>1310-58-3</td>, <td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Prism 7</td><td>aracılığıyla GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pseudomonas İzolasyon Agar (PIA)</td><td>Difco</td><td>292710</td>, <td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Pseudomonas İzolasyon Suyu (PIB)</td><td>Alpha Biosciences</td><td>P16-115</td>, <td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Yuvarlak Kürdan</td> ile<td>Elmas</td><td></td>: <td>Herhangi bir marka</td></tr><tr><td>Deniz yosunu aljinat (Protanal CR 8133)</td><td>FMC Corporation</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>Yağsız Süt</td>, <td>Difco</td><td>232100</td>, <td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td>SmartSpec Plus Spektrofotometre</td>, <td>BioRad</td><td>170-2525</td><td>veya tercih edilen satıcı</td></tr><tr><td>aracılığıyla, Sodyum Klorür (NaCl)</td><td>Sigma</td><td>S-5886</td><td></td></tr>, <tr><td>SpectraMax i3x, Çok Modlu Mikro Plaka Okuyucu</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>i3x</td><td>veya tercih edilen satıcı</td></tr><tr><td>Steril Petri Kabı 100 mm x 15 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>Scientific Sülfürik</td><td>Asit aracılığıyla</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific FB0875713 Fisher Scientific</td><td>A298-212</td><td>Teknik Sınıf</td></tr><tr><td>Sülfürik Asit (2 Normal -Stop Solüsyonu)</td><td>R& D Sistemleri</td><td>DY994</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>Urasil</td><td>Acros Organics</td><td>66-22-8</td><td></td></tr></tbody></table>

pseudomonas aeruginosa küçük koloni varyant kültürü ve aljinat quantitation

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Pseudomonas aeruginosa, fırsatçı gram-negatif bakteriyel patojen, mucoidy denilen benzersiz bir fenotip sonuçlanan bir eksopolisakkarit aljinat aşırı üretebilir. Aljinat kistik fibrozis (CF) olan hastalarda kötü prognoz ile sonuçlanan kronik akciğer enfeksiyonları ile bağlantılıdır. Aljinat üretimini düzenleyen yolların anlaşılması, aljinat oluşumunu hedefleyen yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesine yardımcı olabilir. Hastalığa bağlı bir diğer fenotip ise küçük koloni varyantıdır (SCV). SCV bakterilerin yavaş büyüme nedeniyle ve genellikle antimikrobiyallere karşı artan direnç ile ilişkilidir. Bu yazıda ilk olarak pimimidin biyosentez mutasyonlarına bağlı olarak genetik olarak tanımlanmış p. aeruginosa SCV formunu niçin bir yöntem gösterdik. Azotlu bazların takviyesi, urasil veya sitozin, bu mutantlar için normal büyüme döner, çevreden serbest üsleri temizler bir kurtarma yolu varlığını gösteren. Daha sonra, bakteriyel aljinat ölçümü için iki yöntem tartışmak. İlk yöntem, polisakkaritin hidrolizine, üronik asit monomerine dayanır ve ardından kromojenik reaktif, karbazol ile türevleştirme yapılır, ikinci yöntem ise ticari olarak kullanılabilir, aljinat özgü mAb'ye dayalı bir ELISA kullanır. Her iki yöntem de nicellik için standart bir eğri gerektirir. Ayrıca immünolojik yöntemin aljinat ölçümü için spesifik olduğunu ve klinik örneklerde aljinat ölçümü için kullanılabileceğini de göstermektedir.

Şekil 1 PID geninde (pirimidin biyosentez yolunda ki bir gen) çerçeve içi deletion olan veya olmayan PAO1 ve PAO581 plakalarını gösterir ve bu plakalar SCV6ile sonuçlanır. PAO1 SCV mutanturasil takviyesi yanıt olarak normal büyüme geri yüklendi (Şekil 1A,B). Ayrıca, PAO581ΔpyrDSCV mutant aynı urasil tedavi ile mucoidy döndü, ebeveyn suşu PAO581 ek bir mucA25 muta...

Burada, pseudomonas aeruginosaküçük koloni varyantı kültüre bir büyüme durumu açıklar. Ayrıca p. aeruginosa tarafından üretilen eksopolisakkarit aljinatının saptanması ve nicelliği için geleneksel üronik asit karbazol testi ve aljinatspesifik monoklonal antikor (mAb) bazlı ELISA kullanılarak iki ayrı yöntem tanımlanmıştır.

Pseudomonas aeruginosa Küçük Koloni Varyant Kültürü ve Aljinat Quantitation

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype ...

Küçük koloni varyantı veya SCV tekniği Pseudomonas aeruginosa küçük koloni varyantları seçimi ve büyüme sağlar. Yöntem çok kesin ve normal yöntemlere göre daha kolay seçim sağlar. Bu protokol aynı zamanda aljinat kantifikasyonu için standart üronik asit karbazol yöntemine kıyasla daha güvenli ve daha hassas bir ELISA yöntemini ayrıntılarıyla anlatarak, numunelerde katutery veya numune manipülasyonu olmaksızın doğrudan aljinat nicelemesini sağlar.Prosedürü gösteren brandon Kirby, bir laboratuvar teknisyeni ve Roy Al Ahmar, benim laboratuvar bir yüksek lisans öğrencisi olacaktır. Küçük koloni varyantını veya SCV'yi tespit etmek için, önceden ısıtılmış PIA plakaları üzerinde p.aeruginosa zorlanma PAO1 delta PYRD ilk çizgi. Suşları 48 saat boyunca 37 derecede büyütün.Büyüme plakası üzerinde, normal üç ila beş milimetre lik koloni boyutuna karşılık bir ila üç milimetrelik bir koloni boyutu ile karakterize SCV fenotip olan tek bir koloni izole tanımlayın. SCV'nin saf bir yalıtımını elde etmek için seçilen kolonileri yeniden çizgileyin. Kurtarma yolunun fizyolojik aktivasyonunu gerçekleştirmek için, PIA plakasından SCV kolonisini seçmek için steril bir aşılama döngüsü kullanın.Seçilen koloniyi 0,1 milimolar urasil ile takviye edilmiş önceden ısıtılmış PIA plakası üzerinde çizgi. 24 ila 48 saat boyunca 37 santigrat derece plaka büyütün. Üronik asit karbazol testine başlamak için, test edilecek istenilen suş saf bir kültürden tek bir koloni belirlemek ve steril bir kürdan kullanarak koloni almak.Kürdanı beş mililitre PIB içeren bir kültür test tüpüne yerleştirin. 24 saat boyunca 37 santigrat derecede bir shaker kuluçka büyütün. Kuluçkadan sonra, önceden ısıtılmış PIA plakasına kültürlü PIB suyu bir aliquot ekleyin.Steril bir hücre yayıcı kullanarak, plaka üzerinde suyu yayıldı ve 24 saat boyunca 37 santigrat derecede büyümek. Bir pipet denetleyicisi ve steril 50 mililitrelik pipet kullanarak, yetişkin çim% 0.85 sodyum klorür ekleyin ve bir hücre dağıtıcı kullanarak plaka kazınarak örnek toplamak. Taze 50 mililitrelik pipet kullanarak numuneyi aspire edin ve 50 mililitrelik toplama tüpüne aktarın.Karışımı ve buz üzerinde yer için yüksek üzerinde örnek Girdap. Örneklerin OD600 ölçmek için, ilk boş spektrofotometre kullanarak bir mililitre kullanarak 0.85% sodyum klorür. Sonra yeni bir tek kullanımlık cuvette için örnek bir mililitre ekleyin ve OD okuyun. Her örnek için bir okuma triplicate elde etmek için bu adımı iki kez tekrarlayın.Şimdi kültür tüpleri içine sülfürik asit borat çözeltisi üç mililitre ekleyin ve buz üzerinde oturup sağlar. Test tüplerinde asit karışımı yavaş yavaş toplanan örnek 350 mikrolitre ekleyin. Kısa bir süre düşük girdap sonra, asit örnek karışımına% 0.1 karbazol ve etanol çözeltisi 100 mikrolitre ekleyin.Tüpü ve girdabı orta ayarda beş saniye boyunca kaplayın. Sonra 30 dakika boyunca 55 santigrat derece kuru bir banyo yerleştirin. Kuluçkadan sonra tüpleri kısa bir süre yüksekte talan edin ve beş dakika soğumaya bırakın.Spektrofotometreye boş olarak %0,85 sodyum klorür içeren tüpü kullanın. Sonra temiz bir cuvette karışımın bir mililitre ekleyin ve bir spektrofotometre üzerinde 530 nanometre de örneklerin OD okuyun. Bilinen d-mannuronik asit konsantrasyonlarının Seri seyreltmelerinin OD530'u ölçerek standart bir eğri hazırlayın.İki kez tekrarlayın ve bu okumalardan doğrusal bir denklem ayıklayın. Standart eğriyi kullanarak her numunedeki aljinat konsantrasyonunu hesaplayın ve OD600 başına toplam aljinat miktarını elde etmek için aljinat konsantrasyonunu doğrusal denklemden OD600 ile bölün. Mikropipet kullanarak, toplanan numunenin 50 mikrolitresini işlenmemiş 96 kuyuluk bir tabağa ekleyin.Daha sonra kuyulara 50 mikrolitre ELISA kaplama tamponu ekleyin. Plakayı 37 derecede iki saat kuluçkaya yatırın. Bir fışkırtma şişesi kullanarak, kuyuları doldurarak ve sonra plakayı ters çevirerek süzerek plaka kuyularını PBS-T ile iki kez yıkayın.Bir mikropipet ile kuyulara tampon engelleme 200 mikrolitre ekleyin ve bir gecede dört derece santigrat inkübat. Ertesi gün, daha önce olduğu gibi PBS-T ile iki kez plaka yıkayın. Sonra kuyulara seyreltilmiş birincil antikor 100 mikrolitre ekleyin ve bir ila iki saat boyunca 37 santigrat derecede kuluçka.Kuluçkadan sonra, plaka kuyularını daha önce olduğu gibi PBS-T ile üç kez yıkayın. Daha sonra, kuyulara 100 mikrolitre seyreltilmiş ikincil antikor ekleyin ve 37 derecede 1-2 saat kuluçkaya yatırın. Plakayı üç kez tekrar yıkadıktan sonra, 100 mikrolitre TMB ELISA çözeltisi eklemek için bir mikropipet kullanın.Tabağı bir çekmeceye yerleştirerek veya folyoya sararak 30 dakika boyunca oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın. Sonra stop çözeltisi 100 mikrolitre ekleyin. 450 nanometre de OD ölçmek için bir plaka okuyucu kullanın.Bilinen d-mannuronik asit konsantrasyonlarının Seri seyreltmelerinin OD450'sini ölçerek standart bir eğri üretin. Ölçümleri iki kez tekrarlayın ve doğrusal bir denklem ayıklayın. Standart eğriyi kullanarak her numunedeki aljinat konsantrasyonunu hesaplayın ve OD600 başına toplam aljinat miktarını elde etmek için aljinat konsantrasyonunu OD600 ile doğrusal denklemden ayırın.Burada gösterilen PAO581 ve PAO581 örnekleri pia ve PIA üzerinde yetiştirilen pimimidin de novo biyosentezdüzenleyen genlerde mutasyonlar ile 0.1 milimolar urasil ile takviye. Veriler, medyada urasil varlığının mutant geriliminin restore edilen aljinat üretiminde görüldüğü gibi mucoidy'e dönüştürülmesiyle sonuçlanmasına yol açtığını göstermektedir. Burada anti-aljinat monoklonal antikor bazlı ELISA için sonuçlar gösterilmiştir.PBAD promotörü ve pHERD-20T plazmidinin indüksiyonu için arabinoselu PIA plakaları üzerinde koloniler yetiştirilir. Gösterilen PAO1, PAO1 ana aljinat spesifik sigma faktörü algU ile ifade plazmid pHERD-20T taşıyan, ve PAO1 anahtar aljinat biyosentetik enzim GSY-mannose dehidrogenaz kodlama algD geninin bir çerçeve silme ile. Bu veriler PAO1 ve PAO1 delta algD için ölçülen aljinat mukoid olmayan aljinat düzeylerini pHERD-20T algU ile PAO1 için ölçülen aljinat mukoid düzeyleri ile karşılaştırılır.Anti-aljinat ELISA da plakalar üzerinde önceden büyüme olmadan hasta balgam örnekleri üzerinde test edildi. Mucoid P.aeruginosa büyümesi olan üç CF balgam örneği, mukoid olmayan P.aeruginosa veya P.aeruginosa büyümesi içermeyen iki hasta balgam örneği ile karşılaştırıldığında saptanabilir aljinat gösterdi. Aljinat ölçümü için standart eğrilerin hazırlanması çok önemlidir, çünkü bu örnek içinde aljinatın kesin ve doğru ölçümü ne olanak sağlayacaktır.Karbazol yönteminde kullanılan asit çözeltisi çok tehlikelidir, bu nedenle uygun kişisel koruyucu ekipman ve güvenlik sağlamak için önlemler kullanılmalıdır. SCV'leri izole ettikten sonra, meydana gelen mutasyonları ve bu mutasyonlarla ilişkili patojeniteyi daha iyi anlamak için daha fazla genetik profilleme yapılabilir. ELISA yöntemi kistik fibrozisli hastalarda kronik akciğer enfeksiyonunu izlemek için uyarlanabilir.Ayrıca, büyüme yöntemimiz spesifik SCV'lerin neden olduğu enfeksiyonların teşhisine yardımcı olabilir.

culture-small-colony-variant-pseudomonas-aeruginosa-quantitation-its

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu kağıt büyüyen farklı yöntemleri açıklar.

Co-kültür Modelleri Pseudomonas aeruginosa</emCanlı İnsan Havayolu Hücreler Yetiştirilen> Biyofilmler

Kaynak: Al Ahmar, R., ve diğerleri. Pseudomonas aeruginosa'nın Küçük Koloni Varyantının Kültürü ve Aljinatının Miktar Tayini. J. Vis. Uzm. (2020)Bu video, asit hidrolizinden sonra üronik asitleri tespit etmek için karbazol kullanılarak Pseudomonas aeruginosa tarafından üretilen aljinatı ölçmek için kolorimetrik bir tahlili göstermektedir. Yöntem, araştırma ve klinik çalışmalarda bakteriyel biyokütleye normalize edilmiş aljinat üretiminin karşılaştırmalı analizini sağlar.

Üronik Asit Karbazol Testi Kullanılarak Bakteriyel Aljinatın Miktar Tayini

Kaynak: Al Ahmar, R., ve diğerleri. Pseudomonas aeruginosa'nın Küçük Koloni Varyantının Kültürü ve Aljinatının Miktar Tayini. J. Vis. Uzm. (2020)Bu video, Pseudomonas aeruginosa tarafından üretilen koruyucu bir ekzopolisakkarit olan aljinatı ölçmek için kolorimetrik bir immünolojik testi göstermektedir. Prosedür, bir mikroplakanın numune ile kaplanmasını, spesifik antikorların uygulanmasını ve ölçülebilir bir renk değişikliği oluşturmak için bir enzim-substrat reaksiyonunun kullanılmasını...

Antikor Bazlı Enzime Bağlı İmmünosorbent Testi Kullanılarak Bakteriyel Aljinatın Miktarının Belirlenmesi

Burada, ekrana yüksek yoğunluklu ekleme mutant kütüphanesi oluşturmak için mini-transpozon himar1 mariner dolayımlı mutagenez kullanılarak bir protokol açıklar izole edilmesi ve prototipik Pseudomonas aeruginosa'nın PAO1 in yeni alginat regülatörleri belirlemek.

Alginat içinde üretimi ile ilişkili yeni genlerin tanımlanması<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</emKullanma&gt; Mini-<em&gt; Himar1</em&gt; Mariner Transposon dolayımlı mutagenez

Mikrobiyal toplulukların gelişimi, çevresel mimari, üye bolluğu, özellikleri ve etkileşimleri de içeren faktörlerin bir kombinasyonuna bağlıdır. Bu protokol, femtolitör kuyularda bulunan binlerce topluluğun eşzamanlı olarak izlenebilmesi için sentetik, mikrofabrik bir ortam tanımlamakta olup niş boyut ve sınırlama gibi anahtar faktörler yaklaşık olarak belirlenebilmektedir.

Bir Mikro Kuyruklu Dizi Platformunda Mikrobik Topluluk Geliştirmenin Montajı ve Takibi

Antibiyotik kalıcılığı, hassas bir izojenik popülasyondaki küçük alt popülasyonların yüksek dozda bakterisidal antibiyotikleri geçici olarak tolere etme yeteneğini tanımlar. Bu protokol, Escherichia coli'yi ölümcül ofloksasin dozlarına maruz bıraktıktan sonra moleküler ve hücresel seviyelerde antibiyotik kalıcılık fenotipini karakterize etmek için yaklaşımları birleştirmektedir.

Escherichia coli'de Antibiyotik Kalıcılığının Popülasyon ve Tek Hücre Analizi

Bu protokol, bakteri türleri arası etkileşimlerin etkisini araştırmak için kullanılabilecek kistik fibroz (KF) akciğerle ilgili dört tür polimikrobiyal biyofilm modelini tanımlar.

Topluluk fenotiplerini araştırmak için kistik fibrozla ilgili bir polimikrobiyal biyofilm yetiştirmek

Bu metodoloji, araştırma ve klinik laboratuvarlarda antimikrobiyal duyarlılık testi için kistik fibrozda bir polimikrobiyal biyofilm modelinin oluşturulmasına izin verir. Bu model, bir dizi çıktıda doğru ve güvenilir sonuçlar sağlar.

Kistik Fibrozisde Antimikrobiyalleri Test Etmek İçin Polimikrobiyal Koloni Biyofilm Modelinin Geliştirilmesi

Bu çalışma, kistik fibroz akciğer ortamını yansıtan Pseudomonas aeruginosa gen ekspresyonunu değerlendirmek için bir agrega polimikrobiyal biyofilm modeli geliştirmek ve bir RNA ekstraksiyon protokolünü optimize etmek için bir çerçeveyi özetlemektedir. Uygulamalar, antimikrobiyal etkilerin değerlendirilmesini ve kistik fibroz ile ilgili koşullar altında antibiyotik alternatiflerinin çalışılmasını içerir.

Enfeksiyonla İlgili Gen Ekspresyonunu İncelemek için Kistik Fibroz Agregat Biyofilm Modeli

Yapışkan-invaziv Escherichia coli suşlarında antibiyotik direnci, geleneksel gentamisin koruma testi kullanılarak bakteriyel invaziyanı değerlendirmede zorluklar yaratmaktadır. Bakteriyel istilayı nicel olarak değerlendirmek için koloni oluşturan birimlerin sayılması ve enfekte hücrelerin immünofluoresans konfokal mikroskopisi ile niteliksel olarak görselleştirilmesi için geliştirilmiş bir yöntem tanımlanmıştır.

Escherichia coli hücre istilasının nicelendirilmesi ve görselleştirilmesi için amikacin koruma testi

Öğrenin Pseudomonas aeruginosa küçük koloni varyantlarını yetiştirme ve aljinat miktarını ELISA ile hassas ölçme yöntemlerini. Bu teknikler biyofilm araştırmalarında ve kistik fibrozis kronik akciğer enfeksiyonlarının izlenmesinde kullanılır.

Pseudomonas aeruginosa Küçük Koloni Varyant Kültürü ve Aljinat Quantitation

Daha fazla video keşfet