Name: Monopolar Mitotik İğlerde Dönen Disk Mikroskobu ile Mikrotübül Dinamiğinin Ölçülmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Öğrenin, HeLa hücrelerinde prometafaz senkronizasyonu ve dönen disk konfokal mikroskobu kullanarak mikrotübül dinamiğini analiz etme yöntemini. MATLAB tabanlı görüntü işleme ile hücre bölünmesi sırasında mikrotübül davranışlarını inceleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Max-Planck Deneysel Tıp Enstitüsü Hafif Mikroskobu Tesisi üyelerine uzman tavsiye ve desteklerinden dolayı teşekkür ederiz.

1. HeLa Hücrelerinin Tohumlanması
<ol><li>Fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 2 mL 5 μg/mL fibronectin çözeltisi hazırlayın ve 4 iyi odalı coverslip 'in her kuyuya 450 μL ekleyin (#1.5). 37 °C ve %5 CO2'de15 dakika boyunca kaydırağı kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salini (DPBS) ile eş zamanlı olarak büyüyen HeLa hücrelerini durulayın ve tripsin-EDTA ile inkübün (%0.05: 0.02; w:v) 5 dakika boyunca 37 °C'de. Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 orta 3:1 (v:v) eklenen trypsin-EDTA oranı% 10 ısı-inaktive fetal buzağı serum (FCS) ile takviye eklenmesi ile enzimatik reaksiyonu durdurun. NOT: HeLa hücreleri RPMI 1640'ta 37 °C'de ısı yalıtımlı FCS ve %5 CO2</li><li> <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60478/60478eq1.jpg"></li><li></li><li><li></li></ol><ol><li></li><li><li><li><li> </li></ol><ol><li><li></li><li> </li><li> <ol><li> </li><li></ol></li></ol><ol><li> </li><li></li><li><li> </li><li></li><li> </li><li></li><li><ol><li></li></ol></li><li><ol><li></li></ol></li><li></li><li></li><li></li><li></ol><ol><li> </li><li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Burada, ilk ertych ve ark.44tarafından kurulan bir yöntemin bir değişiklik açıklar. Diğer bazı modifikasyonlarla birlikte, bu MT dinamiği analizi tekniğini çift dönen disk konfokal görüntüleme ile birleştiriyoruz. Çift eğirme diskinin kullanımı fototoksisiteyi azaltırken mt'ler büyüyen çözünürlüğü artırır36. Daha uzun bir dalga boyu floresan muhabirine geçerek hücrelerin fotobeyaztma ve lazer ışık kaynaklı hasarını daha da azaltıyoruz. TdDomates floresan proteini, EGFP<sup ...

Mikrotübüller (MTs) hemen hemen tüm ökaryotik hücrelerde ve bazı bakterilerde bulunan son derece dinamik yapılardır1. Aktin ve ara filamentlerle birlikte sitoiskelet2,3'ün yonttürün. Hücre bölünmesi4, molekül taşıma5, flagellar dayak6, birincil cilium7ile çevrenin hissi , işitme (kinocilium)8,9, embriyogenez10,11,12, invazyon ve metastaz13,14, ve hatta bellek oluşumu15,16,17,18, ve diğer pek çok süreç öncelikle MTs güveniyor. Tüm bu olaylara MTs katılımı hızla büyüme (polimerizasyon) ve büzülme (depolimerizasyon) arasında geçiş olağanüstü yeteneği olmadan imkansız olacaktır. Bu özellik dinamik kararsızlık19olarak tanımlanır. MT dinamikliği birçok patolojik koşullarda değiştirilir20,21,22. Bu nedenle, bu özelliğin doğasını belirleme hastalık mekanizmaları ve daha sonra tedavi anlamak için yardımcı olabilir.
MT dinamiği analizi için uzun bir yöntem listesi geliştirilmiştir ve bunların çoğu görüntüleme tekniklerine dayanmaktadır23. Başlangıçta, geniş alan ışık mikroskoplar in vitro24tubulin polimerlerin oluşumunu gözlemlemek için kullanılmıştır. MT artı uçlarında toplanan son bağlayıcı (EB)-proteinlerin keşfi ve floresan etiket proteinleri için yöntemlerin geliştirilmesi, geniş alan ve konfokal floresan mikroskoplar25,26,27ile canlı hücrelerde doğrudan MT'lerin davranışını gözlemlemek mümkün kılmaktadır. Bir EB-protein ilerler bağlayıcı protein 3 (EB3)28; bir floresan protein erimiş EB3 aşırı ekspresyon ve izleme ile, MT artı uç montaj oranlarıbelirlenebilir 29,30.
Konfokal lazer tarama floresan mikroskopisi (CLSM) sıklıkla MT dinamiklerini takip etmek için kullanılır. Ancak, bu görüntüleme tekniği fototoksisite ve fotobeyazrlama, canlı hücre ve loş örnek görüntüleme için iki istenmeyen süreçler yüksek bir risk teşkil31. Daha iyi bir sinyal-gürültü oranı elde etmek için, lazer gücü ve maruz kalma süresi numunelere zarar vermezken yeterince yüksek olmalıdır ve bu da hız karşılığında çözünürlükten ödün vermelidir. CLSM'ye uygun bir alternatif, dönen disk mikroskobu32'dir. Bu görüntüleme yöntemi bir Nipkow disk33kullanımına dayanmaktadır , hangi iğne delikleri bir dizi taşıyan hareketli bir disk oluşur, ve aynı anda aynı örneği görüntüleme birçok CLS mikroskoplar eşdeğer çalışır34. Bu nedenle, lazerden gelen ışık aynı anda örnekteki çeşitli bölgeleri aydınlatır ancak konfokal tabiatı korur. Nipkow disk, bu nedenle, CLSM benzer ama daha hızlı ve daha az lazer gücü kullanarak görüntüleri elde sağlar. Nipkow disk daha yokogawa Electric tarafından geliştirilmiştir, hangi mikrolensler bir dizi ile ikinci bir disk tanıttı bu ayrı ayrı bir iğne deliği içine ışık doğrudan, daha fazla fototoksisite ve fotobleaching azaltarak35. Böylece, dönen disk lazer tarama mikroskopisi canlı hücre görüntüleme için tercih edilen bir yöntem haline geldi, ve mümkün yüksek hızda yüksek sinyal-gürültü oranı ile görüntü elde etmek için yapar31,36, bu hızlı büyüyen MT biter gibi sinyalleri çözmek için çok önemlidir.
MT dinamiği geçici olarak farklılık gösterir. Örneğin, mitotik MTs interfaz olanlar37,38daha dinamiktir. Benzer şekilde, büyüme hızı ve büzülme farklılıkları aynı hücre döngüsü fazı içinde bile gözlenmiştir, mitoz gibi39,40. Bu nedenle, yanlış veri toplamayı önlemek için, MT dinamiğinin ölçümü hücre döngüsü sırasında dar bir zaman penceresi ile sınırlandırılmalıdır. Örneğin, prometafazda MT dinamiğinin ölçümü, motor kinsin Eg541'i inhibe eden ve bipolar mitotik mil oluşumunu engelleyen bir monastrol analogu olan dimethylenastron (DME) hücreleri tedavi ederek elde edilebilir42. Eg5 inhibitörü DME ve diğer monastrol türevleri ile prometafazda hücrelerin inhibisyonu MT dinamikleri etkilemez43,44,45, Hangi DME sabit ve canlı hücrelerde hem de MT dinamikleri incelemek için yararlı bir araç yapar44.
Burada Ertych ve ark.44 tarafından tanımlanan prometafaz hücrelerinde MT dinamiği analizi yöntemini çift dönen disk görüntüleme ile birleştiriyoruz. Bu yöntem, fotobeyaztma ve minimum fototoksisite olmaksızın, daha yüksek görüntüleme hızına sahip tek bir odak düzleminden toplanan prometafaz hücrelerinde MT dinamiğinin ölçülmesine olanak sağlar. Ayrıca, floresan muhabiri olarak, yeşil floresan protein (EGFP) ile karşılaştırıldığında parlaklık ve fotostabilite geliştirilmiş ve daha düşük enerjiLi ışık ile heyecanlı tandem dimer Domates floresan protein (tdTomato) kullanın46. Bu nedenle, tdTomato uyarma için daha az lazer gücü gerektirir ve daha az fototoksik. Toplamda, fototoksisiteyi azaltarak ve MT dinamikanalizi için gerekli olan çözünürlüğü ve postprocessingi iyileştirerek yöntemi daha da geliştiriyoruz. Ayrıca, diğer senkronizasyon teknikleri ile birleştirerek yöntemin gelecekteki değişiklikler için bir temel oluşturmak.

<table><tbody><tr><td>Dimetilenastron</td><td>Merck</td><td>324622</td><td></td></tr><tr><td>fenol kırmızısı olmayan DMEM</td><td>Gibco</td><td>31053-28</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Biochrom</td><td>S0415</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektin Sığır</td><td>Plazması Merck</td><td>F4759</td><td>Steril toz</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050-038</td><td>Kararlı glutamin ikame edici</td></tr><tr><td>jetPRIME</td><td>Polyplus</td><td>114-15</td><td></td></tr><tr><td>EB3-TdDomates</td><td>Addgene</td><td>plazmid # 50708</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>Tripan Mavisi</td><td>Merck</td><td>T8154-20ML</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin / EDTA çözeltisi</td><td>Biochrom</td><td>L2143</td>% <td>0.05 /% 0.02 kalsiyum ve magnezyum</td></tr> <tr><td>ve mikro; slayt</td><td>Ibidi</td><td>80426</td><td>#1.5 lamel ile 4 kuyulu slayt</td></tr><tr><td>Eclipse Ti Ters mikroskop</td><td>Nikon</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Objektif</td><td>Nikon</td><td>MRD01991</td><td>CFI Apo TIRF 100xC Yağ</td></tr><tr><td>ACAL Lazer Excahnger</td><td>Nikon</td><td></td><td>Lazer kutusu. 405, 458, 488, 514, 561 ve 647 nm</td></tr><tr><td>Dönen disk modülü</td><td></td><td>Andor CSU-W</td><td></td></tr><tr><td>Kamera</td><td>Andor</td><td>iXon Ultra 888</td><td></td></tr><tr><td>Çevre Odası</td><td>CO2 kaynağı, sıcaklık kontrolü ve nemlendirici ile donatılmış</td><td>Okolab</td><td></td> Karanlık oda</tr><tr><td>HeLa Hücreleri</td><td>DSMZ</td><td>ACC-57</td><td></td></tr><tr><td>NIS Elemanları v4</td><td>Nikon</td><td></td><td>Eğirme disk mikroskobu. Edinim Yazılımı</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td></td><td>Bilgi İşlem ortamı</td></tr><tr><td>Prism 8</td><td>GraphPad</td><td></td><td>İstatistiksel analiz ve görüntüleme yazılımı</td></tr></tbody></table>

monopolar mitotik İğlerde dönen disk mikroskobu ile mikrotübül dinamiğinin Ölçülmesi

Measurement of Microtubule Dynamics by Spinning Disk Microscopy in Monopolar Mitotic Spindles

Canlı hücrelerdeki mikrotübül dinamiklerini belirlemek için kurulmuş bir yöntemin modifikasyonunu tanımlıyoruz. Protokol, mikrotübüllerin pozitif uçları (tdTomato floresan proteini ile etiketlenmiş EB3) ve dönen disk konfokal mikroskopisi kullanılarak yüksek hızlı, yüksek çözünürlüklü, canlı hücre görüntülemesi için genetik olarak kodlanmış bir belirteç ifadesine dayanmaktadır. Hücre döngüsü senkronizasyonu ve mikrotübüllerin artan yoğunluğu mitotik hücrelerde sentozomal ayırma inhibe ederek elde edilir ve büyüme analizi açık kaynak U-Track yazılımı kullanılarak gerçekleştirilir. Parlak ve kırmızı yayılılmış floresan proteinin kullanımı, düşük lazer gücü ve iplik disk mikroskobu için gerekli azaltılmış maruz kalma süresi ile birlikte fototoksisiteyi ve ışığa bağlı objelerin olasılığını azaltır. Bu standart kültür koşulları altında bir büyüme ortamda hücreleri korurken aynı hazırlık hücrelerin daha fazla sayıda görüntüleme sağlar. Analiz denetlenen otomatik bir şekilde yapıldığından, sonuçlar istatistiksel olarak sağlam ve tekrarlanabilir.

Şekil 1A'daözetlenen protokolütaki pEB3-tdTomato plazmid, eş zamanlı olarak büyüyen HeLa hücrelerinde geçici olarak ifade edildi. DME tedavisi ile prometafazda transfeksiyon dan sonra hücreler 48 saat senkronize edildi(Şekil 1B). Bu adım, MT dinamiğinin ölçümünün her zaman hücre döngüsünün aynı aşamasında yapılmasını sağlamıştır. Zaman atlamalı filmler daha fazla işlenmiş ve U-Track v2.2.0 ile analiz olarak ek belgelerde açıklandığıgibi 50</sup...

Burada canlı hücre dönen disk konfokal mikroskopisi ve MATLAB tabanlı görüntü işleme kullanarak prometafazda senkronize hücrelerde mikrotübül dinamiği analizinin sağlam ve ayrıntılı bir yöntemini sıyoruz.

Monopolar Mitotik İğlerde Dönen Disk Mikroskobu ile Mikrotübül Dinamiğinin Ölçülmesi

We describe a modification of an established method to determine microtubule dynamics in living cells. The protocol is based on the expression of a ...

Burada sunduğumuz şey, prometafazda senkronize edilmiş hücrelerde canlı hücre dönen disk konfokal görüntülemekullanarak mikrotübül dinamiklerini analiz etmek için sağlam ve basit bir yöntemdir ve görüntüler daha sonra MATLAB tabanlı bir platformda analiz edilir. Dönen disk mikroskobu ile birlikte kırmızı-shifted floresan protein kullanımı fototoksisiteyi azaltır. Bu nedenle, daha fazla sayıda hücre aynı hazırlık içinde görüntülenebilir.Mikrotübül dinamiği çok sayıda patolojik koşullarda değiştirilir. Bu nedenle, bu süreçlerde mikrotübül dinamiğinin düzenlenmesini ve davranışını anlamak, hastalığın mekanizmasını anlamamıza ve sonunda bunları telafi edecek tedaviler geliştirmemize yardımcı olabilir. Ve yöntem de ölçeklenebilir, bu yüzden potansiyel bir ilaç keşif çabası uygulanabilir.Yöntem floresan desynchronization protokolü değiştirerek ve hücre döngüsünün farklı aşamalarından hücreleri elde değiştirerek değiştirilebilir. Bu mikrotübüller karşı ilaç tarama ve bölen ve bölünmeyen hücreler üzerinde kusur tespit yararlı olabilir. Her hücre tipi için transfeksiyon protokolünü ve tohumlama yoğunluğunu optimize etmek gerekir.EB3 ifade düzeyi, tek büyüyen mikrotübülleri tespit etmek için

measurement-microtubule-dynamics-spinning-disk-microscopy-monopolar

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu videoda, uygun bir tampon varlığında bir lamel yüzeyinde büyüyen mikrotübülleri görselleştirmek için girişim yansıma mikroskobu (IRM) tekniğini açıklıyoruz. Gelen ışıkla aydınlatıldıktan sonra, lamel tampon arayüzü ve tampon-mikrotübül arayüzü ışığı yansıtır, bu da bir girişim deseni oluşturmak için birleşerek mikrotübüllerin parlak bir arka plana karşı yüksek kontrastlı görüntüler olarak görselleştirilmesini sağlar.

Mikrotübül Dinamiğinin Etiketsiz Görselleştirilmesi için Girişim Yansıma Mikroskobu

Mikrotübüller doğal kararsız polimerler, büyüme ve kısalması arasında kendi anahtarlama stokastik ve kontrol etmek zordur. Burada photoablatable stabilize kapaklar ile segmentli mikrotübülleri kullanarak protokolleri açıklar. Parçalara Mikrotübüllerin depolimerizasyonu böylece sökmeden mikrotübül uçları ile hareketleri analizi yardımcı, yüksek zamansal ve mekansal çözünürlük ile tetiklenebilir.

Sökme Mikrotubul saplı tarafından Driven Hareketleri Eğitim için Segment Mikrotübüller hazırlanması

İnsan Umbilikal Ven Endotel Hücresi (HUVEC) kültürü için protokoller, mikrotübül büyümesinin floresan işaretli belirteçlerinin geçici transfeksiyonu, canlı hücre görüntüleme ve interfaz mikrotübül büyüme dinamiklerinin otomatik analizi detaylandırılmıştır.

Yüksek çözünürlüklü Time-lapse Görüntüleme ve Yaşayan İnsan Umbilikal Ven Endotelyal Hücrelerinde Mikrotubul Dinamiği Otomatik Analizi

Mitotik iğin montajı ve konumlandırılması, mikrotübül dinamiği, motor proteinler ve çapraz bağlayıcılar tarafından üretilen birleşik kuvvetlere bağlıdır. Burada, temel mitotik iğciklerin aşağıdan yukarıya yeniden yapılandırılması için küresel emülsiyon damlacıklarının geometrik olarak hapsedilmesinin kullanıldığı yakın zamanda geliştirilen yöntemlerimizi sunuyoruz.

Küresel emülsiyon damlacıkların Temel Mitotik Mil Sulandırma

Bu yazıda, dosetaksele dirençli meme kanseri hücrelerinde (MCF-7TXT) mikrotübül dinamik kararsızlığını ölçmek için in vivo bir yöntemi tanımlayan bir protokol sunuyoruz. Bu yöntemde, hedef hücrelerde GFP-tubulin ekspresyonunu tespit etmek için bir dekonvolüsyon mikroskobu görüntüleme sistemi kullanılır.

Canlı Görüntüleme taksan dirençli Meme Kanserlerinde Mikrotubul dinamik dengesizlik Eğitim için

Maya tomurcuklanan nedeniyle güçlü genetik ve mikrotübül hücre iskeletinin basitliği için in vivo olarak mikrotübül dinamiklerinin çalışmak için avantajlı bir modeldir. Aşağıdaki protokol dönüşümü ve kültür maya hücreleri eş odaklı mikroskopi görüntü elde ve kantitatif maya hücrelerini canlı mikrotübül dinamiklerini analiz etmek açıklamaktadır.

Yüksek çözünürlüklü görüntüleme ve Bireysel Astral Mikrotubul Dynamics Analizi Budding Maya

Burada mil oluşumu ve mitotik progresyon dinamiklerini değerlendirmek için bir protokol sıyoruz. Hızlandırılmış görüntüleme uygulamamız, kullanıcının mitozbölünmenin çeşitli aşamalarındaki hücreleri belirlemesini, mitotik defektleri izlemesini ve tanımlamasını ve anti-mitotik ilaçlara maruz kalındığında mil dinamiği ve mitotik hücre kaderini analiz etmesini sağlar.

Mitotik Mil Pertürbasyonları Sonrası Metafaz Zamanlaması ve Hücre KaderiniN Dinamiği Nin Dinamiği Nin Dinamitini Değerlendirmek Için Canlı Hücre Görüntülemesi

Bu protokol, birincil hücre kültüründeki dinamik özelliklerini incelemek için EB3 protein transfeksiyonu ile mikrotübül artı-uç görselleştirmesine adanmıştır. Protokol, Huntington hastalığı hastalarından elde edilen insan primer deri fibroblastları üzerinde uygulandı.

İnsan Primer Cilt Fibroblastlarına Dayalı Huntington Hastalık Modelinde Mikrotübül Artı-Uç Dinamikleri Görselleştirmesi

Burada, iki mikrotübül popülasyonunun dinamiklerini aynı anda ölçmek ve karşılaştırmak için TIRF mikroskopi tabanlı in vitro resusyon testi sunulmaktadır. Çapraz bağlı mikrotübül demetleri ve tek mikrotübüller üzerindeki çoklu mikrotübül ile ilişkili proteinlerin kolektif aktivitesini eşzamanlı olarak görüntülemek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Çapraz Bağlı ve Tek Mikrotübüllerin Dinamiğinin In Vitro TIRF Mikroskobu ile Eşzamanlı Görselleştirilmesi

Burada, mikrotübül demetlerini in vitro olarak yeniden yapılandırmak ve eşzamanlı optik yakalama ve toplam iç yansıma floresan mikroskobu kullanarak içlerinde uygulanan kuvvetleri doğrudan ölçmek için bir protokol sunuyoruz. Bu tahlil, aktif mikrotübül ağları içindeki protein toplulukları tarafından üretilen kuvvetlerin ve yer değiştirmelerin nano ölçekte ölçülmesine izin verir.

Yeniden yapılandırılmış aktif mikrotübül demetleri içindeki kuvvetleri doğrudan ölçme

Diferansiyel dinamik mikroskopi (DDM), dinamik ışık saçılması ve mikroskopi özelliklerini birleştirir. Burada, vimentin ağlarındaki parçacıkların subdifüzyon ve kafesli dinamiklerini ve aktif miyozin güdümlü aktin-mikrotübül kompozitlerinin balistik hareketini ölçerek yeniden yapılandırılmış sitoiskelet ağlarını karakterize etmek için DDM'yi kullanma süreci sunulmaktadır.

Diferansiyel Dinamik Mikroskopi Kullanarak Sitoiskelet Dinamiğinin Ölçülmesi

Öğrenin, HeLa hücrelerinde prometafaz senkronizasyonu ve dönen disk konfokal mikroskobu kullanarak mikrotübül dinamiğini analiz etme yöntemini. MATLAB tabanlı görüntü işleme ile hücre bölünmesi sırasında mikrotübül davranışlarını inceleyin.

Monopolar Mitotik İğlerde Dönen Disk Mikroskobu ile Mikrotübül Dinamiğinin Ölçülmesi

Daha fazla video keşfet