Name: Sıcaklık Kullanarak Mikrotübül Bazlı 3D Aktif Sıvıların Akış Hızlarını Kontrol Etme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Öğrenin, mikrotübül bazlı 3D aktif sıvıların akış hızlarını sıcaklık kullanarak yerinde düzenleme ve dinamik ayarlama yöntemini. Bu yaklaşım, aktif madde araştırmalarında yerel kontrol sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Plasmid K401-BCCP-H6 Dr Zvonimir Dogic bir hediye oldu. Bu araştırma Dr Kun-Ta Wu'nun Worcester Politeknik Enstitüsü'ndeki başlangıç fonu tarafından desteklenmiştir. Dr. Zvonimir Dogic'e tubulin'i arındırmak ve etiketlemek ve aktif sıvısentezlemek için protokoller için teşekkür ederiz. Dr. Marc Ridilla'ya protein ekspresyonu ve arınma konusundaki uzmanlığı ndan dolayı minnettarız. Dr. William Benjamin Roger'a sıcaklık kontrollü sahneyi inşa etmemizde bize yardımcı olduğu için teşekkür ederiz. Biyolojik Malzeme Tesisi'nin (BMF) kullanımı için Brandeis MRSEC'i (NSF-MRSEC-1420382) kabul ediyoruz. Biz Soft Matter33üzerinde Bate ve ark rakamları adapte için Royal Society of Chemistry kabul ediyoruz.

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Yerinde aktifmadde kontrol aktif madde4,5,24,28,54yönlendirilmiş öz-organizasyon için kapıyı açar. Bu makalede,sisteminArrhenius karakteristik dayalı, yerinde kinesin tahrikli, MT tabanlı aktif sıvıları kontrol etmek için sıcaklık kullanmak için bir protokol sokulmak,30,31<...

Aktif madde, kimyasal enerjiyi mekanik işe dönüştürme yeteneği nedeniyle geleneksel pasif maddeden ayrılır. Bu yeteneğe sahip bir malzeme bakteriler, böcekler, kolloidler, tahıllar ve sitosiskelet selamanları1,2,3,4,5,6,7,8,9,10gibi canlı veya cansız varlıklardan oluşabilir. Bu maddi varlıklar komşuları ile etkileşim. Daha büyük bir ölçekte, onlar kendi kendine türbülans gibi girdaplar (aktif türbülans) veya malzeme akar11,12,13,14,15,16,17,18,19,20içine organize . Aktif maddenin kendi kendine örgütlenmeanlayışı moleküler mekiklerde, optik cihazlarda ve paralel hesaplamada çeşitli uygulamalara yol açmıştır21,22,23. Uygulamaları bir sonraki seviyeye taşımak için öz-organizasyon ötesinde denetim gerektirir. Örneğin, Palacci ve ark. sadece elle kontrol edilen mavi ışığa maruz kaldığında kendinden tahrikli bir hematit kapsüllü kolloid geliştirdi, bu da yaşayan kristallerin ortaya çıkmasına yol açtı24. Morin ve ark. bir yarış pisti gibi kanal25kolloidal akın sonuçlanan, bir tasmalı dış elektrik alanı kullanarak haddeleme Quincke kolloidlerin kontrolü kurdu. Bu önceki çalışmalar, uygulamalarda yerel kontrolün rolünü göstermekte ve aktif maddenin bilgi tabanını ilerletiyor.
Bu makalede, kinesin güdümlü, mikrotübül (MT) tabanlı 3D aktif sıvıların kontrol edilebilirliğine odaklanıyoruz. Sıvılar üç ana bileşenden oluşur: MTs, kinesin moleküler motorlar, ve depletantlar. Depletantlar, daha sonra motor kümeleri tarafından köprülenir MTs, bohça için bir tükenme kuvveti neden. Bu motorlar artı sonuna doğru MTs boyunca yürümek. Bir çift köprülü MTsis antiparallel, karşılık gelen motorlar zıt yönlere yürümek. Ancak, motorlar bir kümeye bağlanır ve birbirinden ayrılamaz, bu nedenle birlikte mt çiftlerini (interfilament sürgülü, Şekil 1A)ayırırlar. Bu sürgülü dinamikler birikir, MTsto demetleri kendi bükme istikrarsızlık noktasına ulaşana kadar uzatmak ve kırmak neden (ektensilen demetleri, Şekil 1B)26. Kırık demetler, daha sonra tekrar uzayan tükenme kuvveti tarafından annealed edilir ve dinamikleri tekrar. Yinelenen dinamiğin işlemi sırasında, demet hareketleri mikron ölçekli izleyicilerle doping yaparak görüntülenebilen yakındaki sıvıyı karıştırır(Şekil 1C). Sanchez ve ark. ve Henkin ve ark. adenozin trifosfat (ATP), depletants, motor kümeleri ve MTs19,27konsantrasyonları değiştirerek hızları yetersiz olduğunu bularak, izleyicilerin ortalama hızları karakterize var . Ancak, bu tür bir alabilme sadece aktif sıvı sentezinden önce mevcut. Sentezden sonra, ayarı kaybedildi ve sıvılar kendi yollarında kendi kendine organize edildi. Sentezden sonra aktif sıvı aktivitesini kontrol etmek için, Ross.et al. motor proteinlerin ışık-aktive dimerization kullanarak bir yöntem bildirdi, sıvı aktivitesi ışık kullanılarak ayarlanması ve kapalı izin28. Işık kontrolü sıvıların yerel olarak aktive olması açısından kullanışlı olsa da, yöntem motor proteinlerinin yapılarının yeniden tasarlanması ve optik yolların mikroskopiçinde değiştirilmesini gerektirir. Burada, motor yapısını sağlam tutarken mikroskop modifikasyonu olmadan sıvı akışlarını yerel olarak kontrol etmek için kullanımı kolay bir yöntem salıyoruz.
Kinesin-MT reaksiyonu sıcaklık29,30,31,32ile arttığı bildirilmiştir çünkü lokal olarak tuning aktif sıvı akışı yöntemimiz Arrhenius yasasına dayanmaktadır. Önceki çalışmalarımız, aktif bir sıvı akışının ortalama hızının sıcaklık bağımlılığının Arrhenius denklemini takip ettiğini gösterdi: v = A exp(-Ea/RT), A'nın üstel bir faktör olduğu, R gaz sabiti, Ea aktivasyon enerjisi ve T sistem sıcaklığı33' tür. Bu nedenle, sıvı aktivitesi sıcaklık ortamına duyarlıdır ve sistem sıcaklığının motor performansını dengelemek için tutarlı olması gerekir ve sonuç olarak, akışkan akış hızı34. Bu makalede, sistem sıcaklığını ayarlayarak aktif sıvıların akış hızlarını sürekli olarak ayarlamak için motorun sıcaklık bağımlılığının kullanımını gösteriyoruz. Ayrıca aktif bir sıvı numunesinin hazırlanmasını ve ardından numunenin bilgisayar yazılımı ile kontrol edilen bir mikroskop aşamasına monte edilerek kanıtlıyoruz. Sıcaklığın 16 °C'den 36 °C'ye yükseltilen hızları 4'ten 8 μm/s'ye çıkar. Ayrıca, ayarlanabilirlik geri döndürülebilir: sıcaklığın art arda artması ve azalması akışı hızlandırır ve yavaşlar. Gösterilen yöntem, ana reaksiyonların Arrhenius yasalarına uyduğunun geniş bir yelpazede uygulanabilir, örneğin MT süzülen tetkik29,30,31,32.

<table><tbody><tr><td>(&plusmn;)-6-Hidroksi-2,5,7,8-tetrametilroman-2-karboksilik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>238813</td><td>Trolox</td></tr><tr><td>2-Merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>3- (Trimetoksisilil) propil metakrilat, %98, ACROS Organics</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC216550050</td><td></td></tr><tr><td>3.2mm ID Tygon Boru R-3603</td><td>HACH</td><td>2074038</td><td>Su tüpleri</td></tr><tr><td>31,75 mm çapında kaplamasız, safir pencere</td><td>Edmund Optics</td><td>43-637</td><td>Safir disk</td></tr><tr><td>3M 1181 Bakır Bant - 1/2 IN Genişlik x 18 YD Uzunluk - 2.6 MIL Toplam Kalınlık - 27551</td><td>R.S. HUGHES</td><td>054007-27551</td><td>Bakır bant</td></tr><tr><td>Asetik Asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>Akrilamid Çözeltisi (%40/Elektroforez), Fisher BioReagents</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1402-1</td><td></td></tr><tr><td>Adenozin 5'-trifosfat dipotasyum tuzu hidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8937</td><td>ATP</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 NHS Ester (Süksinimidil Ester)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A20006</td><td>Uzak kırmızı floresan boya. Alexa 647, mikrotübüllerle (1.3.3.2.) karıştırılmadan önce dimetilsülfoksit (DMSO) içinde önceden süspanse edilebilir.</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4 Santrifüj Filtre Ünitesi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>UFC801024</td><td>Santrifüj filtre tüpü. Kesme molekül ağırlığı: 10 kDa</td></tr><tr><td>Amonyum Persülfat, 100g, MP Biyomedikal</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN802829</td><td>APS</td></tr><tr><td>Ampisilin Sodyum Tuzu (Kristal Toz), Fisher BioReagents</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760</td><td>Ampisilin Titreşim</td></tr><tr><td>Önleyici Tablo</td><td>Nikon</td><td>63-7590S</td><td></td></tr><tr><td>Avanti JE Santrifüj</td><td>Beckman Coulter</td><td>369001</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar Satış Maddesi, BD Diagnostics</td><td>VWR</td><td>90000-760</td><td>Agar</td></tr><tr><td>Biotin</td><td>Alfa Aesar</td><td>A14207</td><td></td></tr><tr><td>Kova-plastik beyaz - 2 galon</td><td>Bon</td><td>84-715</td><td>Su kovası</td></tr><tr><td>Kalsiyum Klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746495</td><td>CaCl2</td></tr><tr><td>sığır karaciğerinden katalaz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C40</td><td></td></tr><tr><td>CFI Planı Apo Lambda 4x Obj</td><td>Nikon</td><td>MRD00045</td><td>4x hava objektifi</td></tr><tr><td>C-FLLL-FOV GFP HC HC HISN ero Kaydırma</td><td>Nikon</td><td>96372</td><td>GFP filtre küpü</td></tr><tr><td>CH-109-1.4-1.5</td><td>TE Teknolojisi</td><td>CH-109-1.4-1.5</td><td>Termoelektrik Soğutucu (TEC)</td></tr><tr><td>Kloramfenikol, %98, ACROS Organics</td><td>Fisher Scientific</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>Soğutma bloğu</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Özel öğütülmüş alüminyum</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250 #1610400</td><td>Bio-Rad</td><td>1610400</td><td>Trifenilmetan boya</td></tr><tr><td>D-(+)-Glikoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil Sülfoksit (Sertifikalı ACS), Fisher Chemical</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128</td><td>DMSO</td></tr><tr><td>DL-1,4-Dithiothreitol, %99, biyokimya için, ACROS Organics</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC165680050</td><td>DTT</td></tr><tr><td>DOWSIL 340 Isı Emici Bileşik</td><td>Dow</td><td>1446622</td><td>Termal macun</td></tr><tr><td>ETİL ALKOL, 200 PROOF ACS/USP/NF SINIF 5 GAON POLİ KÜP</td><td>Pharmco by Greenfield Global</td><td>111000200CB05</td><td>Etanol</td></tr><tr><td>Etilen glikol-bis (2-aminoetileter) -N, N, N', N'-tetraasetik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td>EGTA</td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>798681</td><td>EDTA</td></tr><tr><td>Fisher BioReaktifler Mikrobiyoloji Medya Katkı Maddeleri: Tripton</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1421</td><td>Tripton</td></tr><tr><td>Fisher BioReaktifler Mikrobiyoloji Medya Katkı Maddeleri: Maya Özü</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422</td><td>Maya özü</td></tr><tr><td>Floresbrite YG Mikroküreler, Kalibrasyon Sınıfı 3.00 ve mikro; m</td><td>Polysciences</td><td>18861</td><td></td></tr><tr><td>Aspergillus niger</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2133</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>GpCpp</td><td>Jena Bioscience'tan</td> izleyici parçacıklar Glikoz Oksidaz <td>NU-405L</td><td>Guanozin-5 '[ (&alfa;,&beta;)-metileno]trifosfat (GMPCPP)</td></tr><tr><td>GS Power'ın 18 Gauge (True American Wire Ga), 100 fit, %99,9 Telli Oksijensiz Bakır OFC, Kırmızı/Siyah 2 İletken Bağlı Zip Kablosu Araba, Ses, Ev Sineması Amazon B07428NBCW için Güç / Hoparlör Elektrik Kablosu</td><td>Bakır</td><td></td><td>tel</td></tr><tr><td>Ganozin 5'-trifosfat sodyum tuzu hidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877</td><td>GTP</td></tr><tr><td>Hellmanex III</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z805939</td><td>Deterjan</td></tr><tr><td>HEPES Sodyum Tuzu (Beyaz Toz), Fisher BioReagents</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP410</td><td>NaHEPES</td></tr><tr><td>Yüksek performanslı blender makinesi</td><td>AIMORES</td><td>AS-UP1250</td><td>Blender</td></tr><tr><td>His GraviTrap</td><td>GE Healthcare</td><td>11003399</td><td>Yerçekimi Kolonu</td></tr><tr><td>İmidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758</td><td>İzopropil ve beta;-D-1-tiyogalaktopiranosid</td></tr><tr><td>İzopropil Alkol %99</td> <td>Pharmco by Greenfield Global</td><td>231000099</td><td>İzopropanol</td></tr><tr><td>JA-10 rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>369687</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamik asit potasyum tuzu monohidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1501</td><td>K-Glutamat</td></tr><tr><td>Lizozim tavuk yumurtası akı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum klorür heksahidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td>MgCl2 ve boğa; 6H2O</td></tr><tr><td>MES sodyum tuzu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5057</td><td>2- (N-Morfolino) etansülfonik asit sodyum tuzu</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1254</td><td>3- (N-Morfolino) propansülfonik asit</td></tr><tr><td>MP-3022</td><td>TE Teknolojisi</td><td>MP-3022</td><td>Termokupl</td></tr><tr><td>N, N, N ', N'-Tetrametiletilendiamin% 99, ACROS Organics</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC138450500</td><td>TEMED</td></tr><tr><td>Nanodrop 2000c UV-VIS Spektrofotometre</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>E112352</td><td>Spektrometresi</td></tr><tr><td>Nikon Ti2-E Nikon Ters Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>MEA54000</td><td></td></tr><tr><td>Norland Optik Yapıştırıcı 81</td><td>Norland Ürünleri</td><td>NOA81</td><td>UV yapıştırıcı</td></tr><tr><td>Novex Sharp Önceden Boyanmış Protein Standardı</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LC5800</td><td>Protein standart merdiven</td></tr><tr><td>NuPAGE %4-12 Bis-Tris Protein Jelleri, 1,5 mm, 10 oyuklu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0335BOX</td><td>SDS jel</td></tr><tr><td>Optima L-90K Ultrasantrifüj</td><td>Beckman Coulter</td><td>365672</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm PM996 sargısı, 4" genişliğinde; 125 ft/rulo</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-06720-40</td><td>Balmumu filmi</td></tr><tr><td>Pe 300 ultra Aydınlatma Sistemi Tek Bant, 3mm Işık Kılavuz kontrolü Pod güç kaynağı</td><td>Nikon</td><td>PE-300-UT-L-SB-40</td><td>Soğuk LED Aydınlatıcı</td></tr><tr><td>Fenilmetansülfonil florür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>78830</td><td>PMSF</td></tr><tr><td>Fosfoenolpirüvik asit monopotasyum tuzu, %99</td> <td>BeanTown Chemical</td><td>129745</td><td>PEP</td></tr><tr><td>Pierce Coomassie (Bradford) Protein Test Kiti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23200</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Proteaz İnhibitörü Mini Tabletler</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A32953</td><td></td></tr><tr><td>BORULAR</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6757</td><td>1,4-Piperazindietansülfonik asit</td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>Poli (etilen glikol)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>81300</td><td>PEG. Ortalama molekül ağırlığı 20.000 Da</td></tr><tr><td>Potasyum Hidroksit (Peletler/Sertifikalı ACS), Fisher Chemical</td><td>Fisher Scientific</td><td>P250-500</td><td>KOH</td></tr><tr><td>PowerEase 300W Güç Kaynağı (115 VAC)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>PS0300</td><td>Jel kutusunun DC güç kaynağı</td></tr><tr><td>PS-12-8.4A</td><td>TE Teknolojisi</td><td>PS-12-8.4A</td><td>Sıcaklık kontrol cihazının</td></tr> <tr><td>DC güç kaynağıTavşan kasından piruvat kinaz / laktik dehidrojenaz enzimleri</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-0294</td><td>PK / LDH</td></tr><tr><td>Sessiz Bir Lifegard Fıskiye Pompası, Saatte 296 Galon</td><td>Amazon</td><td>B005JWA612</td><td>Balık tankı pompası</td></tr><tr><td>Rosetta 2(DE3)pLysS Yetkili Hücreler - Novagen</td><td>Millipore Sigma</td><td>71403</td><td>Yetkili hücreler</td></tr><tr><td>Keskin Mikrodalga ZSMC0912BS Sharp 900W Tezgah Üstü Mikrodalga Fırın, 0.9 Fit Küp, Paslanmaz Çelik</td><td>Amazon</td><td>B01MT6JZMR</td><td>Suyu kaynatmak için mikrodalga</td></tr><tr><td>Sodyum Klorür (Kristal/Sertifikalı ACS), Fisher Chemical</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Sodyum dodesil sülfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td>SDS</td></tr><tr><td>Sodyum fosfat monobazik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8282</td><td>NaH2PO4</td></tr><tr><td>Streptavidin Proteini</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21122</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>TC-720</td><td>TE Teknolojisi</td><td>TC-720</td><td>Sıcaklık kontrolörü</td></tr><tr><td>Tris Base, Moleküler Biyoloji Sınıfı - CAS 77-86-1 - Calbiochem</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>648310</td><td>Tris-HCL</td></tr><tr><td>Tip 45 Ti rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>339160</td><td></td></tr><tr><td>Tip 70 Ti rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td>337922</tr><tr><td>Tip 70.1 Ti rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>342184</td><td></td></tr><tr><td>VWR Genel Amaçlı Laboratuvar Etiketleme Bandı</td><td>VWR</td><td>89097-916</td><td>Kağıt bantlar</td></tr><tr><td>VWR Mikro Kapak Camları, Kare, No. 1 1/2</td><td>VWR</td><td>48366-227</td><td>Cam lameller</td></tr><tr><td>VWR Düz ve Buzlu Mikro Kaydıraklar, Premium</td><td>VWR</td><td>75799-268</td><td>Cam kaydıraklar</td></tr><tr><td>XCell SureLock Mini Hücreli</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EI0001</td><td>Jel kutusu</td></tr><tr><td>ZYLA 5.5 USB3.0 Kamera</td><td>Nikon</td><td>ZYLA5.5-USB3</td><td>Tek renkli CCD kamera</td></tr></tbody></table>

sıcaklık kullanarak mikrotübül bazlı 3d aktif sıvıların akış hızlarını kontrol etme

Controlling Flow Speeds of Microtubule-Based 3D Active Fluids Using Temperature

Biz kinesin tahrikli, mikrotübül tabanlı üç boyutlu (3D) aktif sıvıların akış hızlarını ayarlamak için sıcaklık kullanmak için bir yöntem salıyoruz. Bu yöntem, farklı istenilen hızlara ulaşmak için yeni numuneler üretmek gerek kalmadan yerinde hızları tuning sağlar. Ayrıca, bu yöntem hızın dinamik kontrolünü sağlar. Sıcaklık bisiklet hızlı ve yavaş, periyodik olarak akış sıvıları yol açar. Bu kontrol edilebilirlik, kinesin-mikrotübül reaksiyonunun Arrhenius karakteristik özelliğine dayanarak 4-8 m/s kontrollü bir ortalama akış hızı aralığını gösterir. Sunulan yöntem, kanaldaki akış hızlarının bir vanaya gerek kalmadan yerel olarak ölçülebilir olduğu mikroakışkan cihazların tasarımına kapı açacaktır.

Kinesin güdümlü, MT bazlı aktif sıvıların hazırlanması hem kinesin hem de MT gerektirir. MT'ler sığır beyinlerinden saflaştırılan etiketli tubulinlerden (basamak 1.3 ve 1.4) polimerize edildi (basamak 1.1, Şekil 2A),saflığı artırmak için geri dönüşüm takip edildi (adım 1.2, Şekil 2B). Kinesin motor proteinleri E. coli (basamak 2.1 ve 2.2, Şekil 2B)41...

Bu protokolün amacı, üç boyutlu aktif sıvıların akış hızlarını kontrol etmek için sıcaklığı kullanmaktır. Bu yöntemin avantajı sadece yerinde akış hızlarının düzenlenmesine izin vermez, aynı zamanda akış hızlarını yukarı ve aşağı ayarla gibi dinamik kontrol sağlar.

Sıcaklık Kullanarak Mikrotübül Bazlı 3D Aktif Sıvıların Akış Hızlarını Kontrol Etme

We present a method for using temperature to tune the flow speeds of kinesin-driven, microtubule-based three-dimensional (3D) active fluids. This method ...

Aktif madde moleküler gölgeler gibi çeşitli uygulamalarda kullanılmıştır. Uygulamayı bir sonraki seviyeye taşımak için, aktif maddeyi yerel olarak kontrol etme yeteneğini geliştirmemiz gerekir. Aktif sıvının değiştirilmesini gerektirmeyen kullanımı kolay bir yöntem salıyoruz.Ne de aktif sıvının yerel kontrol elde etmek için mikroskop optik yolu değiştirmek gerekir. Yöntemimiz, ana reaksiyonların mikrotübül süzme test veya enzim bazlı sistemler gibi hatalı yasalara uydukları geniş bir sistem yelpazesine uygulanabilir. Kurulum bir su sirkülasyon sistemi içerir.Sızıntılar meydana gelirse, su mikroskoba zarar verebilir. Bu nedenle, protokolümüzü kabul etmeden önce, sistemin sızdırmaz olmasını sağlamak önemlidir. Protokolümüz cam örneğinin sıcaklık aşamasına monte sini gerektirir.El yazması montaj prosedürünü açıklarken, örneği sahneye çıkarmak gibi mekanik inceliklerden yoksundur. Prosedürü gösteren, Teagan Bate, Edward Jarvis ve Megan Varney olacaktır. Teagan ve Edward yüksek lisans öğrencileri, ve Megan bir laboratuvar dan bir lisans öğrencisidir.Bir Eppendorf tüpünde aktif sıvıları hazırlamak için, mililitre mikrotübbaşına sekiz miligramlık 16 nokta yedi mikrolitreile bir nokta sekiz mikromolar kinesin motor kümelerinin altı nokta yedi mikrolitresini ve yüksek tuzlu M2B'de 500 milimolar DTT'lik bir mikrolitreyi karıştırın. Ağırlık polietilen glikol ile yüzde yedi ağırlık 11 nokta dört mikrolitre ekleyerek paket mikrotübüller. Sonra 50 milimolar ATP iki nokta sekiz mikrolitre ekleyerek kinesin motorları etkinleştirin.Stok pirüuvat kinaz /laktat dehidrogenaz iki nokta sekiz mikrolitre ve 200 milimolar fosfenol pirüuvat 13 nokta üç mikrolitre ekleyerek ATP konsantrasyonları koruyun. 20 milimolar Trolox 10 mikrolitre ekleyerek fotoğraf ağartma etkisini azaltmak, mililitre katalaz başına üç nokta beş miligram bir nokta bir mikrolitre, mililitre glikoz oksidaz başına 20 miligram bir nokta bir mikrolitre, ve mililitre glikoz başına 300 miligram bir mikrolitre. Hacim izleyici parçacıkları tarafından sıfır noktası sıfır iki yüzde beş hacim bir nokta altı mikrolitre ekleyerek sıvının hareketini izleyin.Toplam 100 mikrolitre hacim elde etmek için yüksek tuz Lu M2B ekleyin. Daha sonra, bir poliakrilamid kaplı cam slayt durulayın ve DI su ile kapak kayma. Basınçlı hava ile gözlük kuru.Gözlükleri temiz, düz bir yüzeye yerleştirin. Balmumu filminde üç milimetre genişliğinde bir kanal kes. Toplam genişlik, 20 milimetrelik cam kapak lı kapakla aynı genişliktedir.Sıvı için bir akış hücre kanalı oluşturmak için slayt ve kapak kayma arasında balmumu ekleyin. Balmumu eritmek için 80 derece santigrat sıcak plaka üzerine cam balmumu kompleksi yerleştirerek balmumu film için cam yapıştırın. Erime sırasında, balmumu filmini cam yüzeylere düzgün bir şekilde yapıştırmak için kapağı bir pipet ucuyla hafifçe bastırın.Yapışmadan sonra cam kompleksini oda sıcaklığına kadar soğutun. Hazırlanan aktif sıvıları, pipet ucu yla kanal açılışından uzakta ve cam slayt yüzeyi ile temas halinde bir açıyla akış kanalına derhal yükleyin. Kanalı UV tutkalla kapatın.Bir sıcaklık kontrol kurulumu yaptıktan sonra, aktif sıvı örneğini safir yüzeye yerleştirin ve slayt tarafı yüzeye temas edin. Cam kaydırağı kağıt bantla sabitleyin. Bakır bant kullanarak, ThermoSensor'u kapak kayma yüzeyine takın.Kuruluma mikroskop aşamasına monte etmek için, kapak kaymalı kaydırağı hedeflere bakacak şekilde, mikroskop aşaması iğne kelepçeleri ile kurulumu güvence altına alayın. Sıcaklık kontrol cihazını ve akvaryum pompasını açın. Hedef sıcaklığı ayarlamak için üreticiler kılavuzunu izleyin.Sıcaklık kontrolünü etkinleştirin. Ve ThermoSensor sıcaklık verilerini kaydedin. Aktif karışımdaki Alexa 488 etiketli izleme parçacıklarını izlemek için GFP filtre küpüyle donatılmış bir floresan mikroskopide sabit bir zaman aralığıyla örneği görüntüleyin.Çerçeveler arasındaki izleyici yer değiştirmesinin dokuz piksel içinde olmasını sağlamak için zaman aralığını ayarlayın. Saniyede 10 mikrometre hızla hareket eden görüntüleme izleyicileri için, dört kat nesnel kullanılarak, zaman aralığının bir ila beş saniye olması önerilir. Resimleri TIF dosyaları olarak kaydedin, dosyaları çerçeve numarasına göre adlandırın ve ayrı bir klasörde saklayın.Bu kinesin tahrikli mikrotübül bazlı aktif sıvılar için sıcaklık 10, 20, 30 ve 40 santigrat derecede kontrol edildi. Sıcaklıktaki dalgalanma, bu sıcaklık kontrol kurulumunun kararlılığını ve güvenilirliğini gösteren dört saat boyunca sıfır noktası 1 ila sıfır noktası üç derece santigrat derece içinde ydi. İzleyiciler her iki saniyede bir görüntüleniyor ve sıralı görüntüler izleme yörüngelerini izlemek için izin veriliyor.Ortalama hızları 20-36 santigrat derece olarak ölçülen, neredeyse zaman sıfır iki saat bağımsız olduğu ortaya çıktı. 10 ve 40 santigrat derecede ise, ortalama hızlar mikrotübül depolimerizasyonunun 16 santigrat derecenin altında olması ve kinesin kümelerinin sırasıyla 36 santigrat derecenin üzerinde arızalanması sonucu hızla çürür. Sistem sıcaklıkları her 30 dakikada bir 20 ila 30 derece arasında değiştiğinde, aktif sıvıların ortalama hızları sadece hızlanıp buna göre yavaşlamakla kalmadı, aynı zamanda sıcaklık değişimine 10 saniye içinde yanıt verdi.Aktif sıvılar 16 derecenin altında soğutulduğunda veya 36 derecenin üzerinde ısıtıldığında arızaya başlar. Bu yüzden sıcaklık kontrol cihazını manipüle ederken, sıcaklığın 16 ila 36 derece arasında olduğundan emin olun. Aktif sıvıyı yerel olarak alabilme yeteneği, A noktasından B noktasına kargo lar teslim etmek veya fiziksel bir vana gerektirmeyen bir mikroakışkanlık cihazı geliştirmek gibi akışkan gücünü yönlendirmeye olanak tanır.Cam kaplama için kullanılan akrilamid cilt yoluyla absorbe edebilirsiniz bir nörotoksin olduğunu. Riski en aza indirmek için eldiven, laboratuvar önlüğü ve güvenlik gözlüğü gibi uygun koruyucu donanımları takın.

controlling-flow-speeds-microtubule-based-3d-active-fluids-using

Research

JoVE Journal

Engineering

Mühendislik

Bu videoda, uygun bir tampon varlığında bir lamel yüzeyinde büyüyen mikrotübülleri görselleştirmek için girişim yansıma mikroskobu (IRM) tekniğini açıklıyoruz. Gelen ışıkla aydınlatıldıktan sonra, lamel tampon arayüzü ve tampon-mikrotübül arayüzü ışığı yansıtır, bu da bir girişim deseni oluşturmak için birleşerek mikrotübüllerin parlak bir arka plana karşı yüksek kontrastlı görüntüler olarak görselleştirilmesini sağlar.

Mikrotübül Dinamiğinin Etiketsiz Görselleştirilmesi için Girişim Yansıma Mikroskobu

Mitotik iğin montajı ve konumlandırılması, mikrotübül dinamiği, motor proteinler ve çapraz bağlayıcılar tarafından üretilen birleşik kuvvetlere bağlıdır. Burada, temel mitotik iğciklerin aşağıdan yukarıya yeniden yapılandırılması için küresel emülsiyon damlacıklarının geometrik olarak hapsedilmesinin kullanıldığı yakın zamanda geliştirilen yöntemlerimizi sunuyoruz.

Küresel emülsiyon damlacıkların Temel Mitotik Mil Sulandırma

Burada mikrosıvısal uygulamalarında kullanılmak üzere bir basınç kontrollü şırınga pompa oluşturmak için bir iletişim kuralı mevcut. Bu şırınga pompa bir additively imal edilmiş vücut, kapalı donanım ve açık kaynak elektronik yapılır. Elde edilen sistemdir düşük maliyetli, oluşturmak, basit ve hızlı mikrosıvısal araştırma etkinleştirmek için iyi düzenlenmiş sıvı akışı sunar.

Üç boyutlu termoplastik malzemelerin oluşturmak için yazdırma şırınga pompalar geribildirim denetimiyle mikrosıvısal uygulamalar için otomatik

Bu protokol, etiket içermeyen, yüksek kontrastı, yüksek hızlı görüntüleme için standart bir floresan mikroskop üzerinde girişim yansıma mikroskopisi uygulamak için bir kılavuzdur mikrotubules in vitro yüzeyler kullanarak.

Microtubules etiketi içermeyen, yüksek hızlı görüntüleme için girişim Reflection Microkopi uygulanması

Dinamik mikrotübüllerin ve floresan olarak etiketlenmiş mikrotübülle ilişkili proteinlerin eşzamanlı görüntülenmesi için girişim-yansıma mikroskobu ve toplam-iç-yansıma-floresan mikroskobu uygulamak için bir protokol sunuyoruz.

Dinamik Mikrotübülleri ve İlişkili Proteinleri Görüntülemek için Eşzamanlı Girişim Yansıması ve Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu

Bu çalışma, kinezin-3 ailesinin bir üyesi olan KIF1A'nın (1-393LZ) Sf9-bakülovirüs ekspresyon sistemi kullanılarak saflaştırılmasını detaylandırmaktadır. Bu saflaştırılmış motorların in vitro tek moleküllü ve çok motorlu kayma analizi, memeli hücre lizatından elde edilen motorlarla karşılaştırılabilir sağlam hareketlilik özellikleri sergilemiştir. Bu nedenle, Sf9-bakülovirüs sistemi, ilgilenilen motor proteini ifade etmek ve saflaştırmak için uygundur.

Sf9 Saflaştırılmış Süperprosesif Kinesin-3 Ailesi Motorlarının Tek Moleküllü Analizi

Basit aktin filament mikroakışkan tahlilleri için, floresan mikroskobu ile birlikte, bireysel aktin filamentlerini gerçek zamanlı olarak doğru bir şekilde izlemeyi ve sırayla farklı protein çözeltilerine maruz bırakmayı sağlayan protokoller sunuyoruz.

Tek Aktin Filamentlerin ve Demetlerin Montaj Dinamiğini İncelemek için Mikroakışkanlar ve Floresan Mikroskobu Kullanma

Bu makalede, bitki bazlı bir mikrotübül çapraz bağlayıcısı olan MAP65 ve kalabalıklaştırıcı ajan olarak PEG kullanılarak taktoidler şeklinde mikrotübül montajlarının oluşumu için bir protokol sunulmaktadır.

Mikrotübül taktoidlerinin kendi kendine montajı

Mevcut protokol, mikroakışkan cihazlarda mikroskobik buz kristallerinin ve klatrat hidratların kristalleşmesini tanımlamakta ve oluşan kristallerin etrafında sıvı değişimini sağlamaktadır. Bu, inhibitörlerin kristalleşme sürecini ve bağlanma mekanizmalarını incelemek için eşsiz olanaklar sağlar.

Buz ve Klatrat Hidrat Kristalizasyonunun İncelenmesi için Mikroakışkan Bir Yaklaşım

Burada, protein hazırlama ve yapım ve aktif nematik hapsetme için kuyuların kullanımı da dahil olmak üzere mikrotübüllerden ve kinesin motorlarından aktif nematiklerin hazırlanması için yöntemler sunulmaktadır.

Mikrotübül Tabanlı Aktif Nematiklerin Oluşturulması, Sınırlandırılması ve Gözlemlenmesi

Bu protokol, mikrotübül polimer mekaniğini araştırmak için uygun bir mikroakışkan cihazın tasarımını ve üretimini detaylandırır. Mikrofabrikasyon, otomatik akış kontrolü ve hesaplamalı modelleme tekniklerinin sentezi, hücresel hücre iskeletini in vitro olarak araştırmak için ideal olan esnek bir sistem sağlar.

Mikrotübül Polimer Mekaniğinin İncelenmesi için Mikroakışkan Tabanlı Bir Yaklaşımın Geliştirilmesi

Öğrenin, mikrotübül bazlı 3D aktif sıvıların akış hızlarını sıcaklık kullanarak yerinde düzenleme ve dinamik ayarlama yöntemini. Bu yaklaşım, aktif madde araştırmalarında yerel kontrol sağlar.

Sıcaklık Kullanarak Mikrotübül Bazlı 3D Aktif Sıvıların Akış Hızlarını Kontrol Etme

Daha fazla video keşfet