Sıcaklık Kullanarak Mikrotübül Bazlı 3D Aktif Sıvıların Akış Hızlarını Kontrol Etme
November 26th, 2019
Bu protokolün amacı, üç boyutlu aktif sıvıların akış hızlarını kontrol etmek için sıcaklığı kullanmaktır. Bu yöntemin avantajı sadece yerinde akış hızlarının düzenlenmesine izin vermez, aynı zamanda akış hızlarını yukarı ve aşağı ayarla gibi dinamik kontrol sağlar.
Aktif madde moleküler gölgeler gibi çeşitli uygulamalarda kullanılmıştır. Uygulamayı bir sonraki seviyeye taşımak için, aktif maddeyi yerel olarak kontrol etme yeteneğini geliştirmemiz gerekir. Aktif sıvının değiştirilmesini gerektirmeyen kullanımı kolay bir yöntem salıyoruz.
Ne de aktif sıvının yerel kontrol elde etmek için mikroskop optik yolu değiştirmek gerekir. Yöntemimiz, ana reaksiyonların mikrotübül süzme test veya enzim bazlı sistemler gibi hatalı yasalara uydukları geniş bir sistem yelpazesine uygulanabilir. Kurulum bir su sirkülasyon sistemi içerir.
Sızıntılar meydana gelirse, su mikroskoba zarar verebilir. Bu nedenle, protokolümüzü kabul etmeden önce, sistemin sızdırmaz olmasını sağlamak önemlidir. Protokolümüz cam örneğinin sıcaklık aşamasına monte sini gerektirir.
El yazması montaj prosedürünü açıklarken, örneği sahneye çıkarmak gibi mekanik inceliklerden yoksundur. Prosedürü gösteren, Teagan Bate, Edward Jarvis ve Megan Varney olacaktır. Teagan ve Edward yüksek lisans öğrencileri, ve Megan bir laboratuvar dan bir lisans öğrencisidir.
Bir Eppendorf tüpünde aktif sıvıları hazırlamak için, mililitre mikrotübbaşına sekiz miligramlık 16 nokta yedi mikrolitreile bir nokta sekiz mikromolar kinesin motor kümelerinin altı nokta yedi mikrolitresini ve yüksek tuzlu M2B'de 500 milimolar DTT'lik bir mikrolitreyi karıştırın. Ağırlık polietilen glikol ile yüzde yedi ağırlık 11 nokta dört mikrolitre ekleyerek paket mikrotübüller. Sonra 50 milimolar ATP iki nokta sekiz mikrolitre ekleyerek kinesin motorları etkinleştirin.
Stok pirüuvat kinaz /laktat dehidrogenaz iki nokta sekiz mikrolitre ve 200 milimolar fosfenol pirüuvat 13 nokta üç mikrolitre ekleyerek ATP konsantrasyonları koruyun. 20 milimolar Trolox 10 mikrolitre ekleyerek fotoğraf ağartma etkisini azaltmak, mililitre katalaz başına üç nokta beş miligram bir nokta bir mikrolitre, mililitre glikoz oksidaz başına 20 miligram bir nokta bir mikrolitre, ve mililitre glikoz başına 300 miligram bir mikrolitre. Hacim izleyici parçacıkları tarafından sıfır noktası sıfır iki yüzde beş hacim bir nokta altı mikrolitre ekleyerek sıvının hareketini izleyin.
Toplam 100 mikrolitre hacim elde etmek için yüksek tuz Lu M2B ekleyin. Daha sonra, bir poliakrilamid kaplı cam slayt durulayın ve DI su ile kapak kayma. Basınçlı hava ile gözlük kuru.
Gözlükleri temiz, düz bir yüzeye yerleştirin. Balmumu filminde üç milimetre genişliğinde bir kanal kes. Toplam genişlik, 20 milimetrelik cam kapak lı kapakla aynı genişliktedir.
Sıvı için bir akış hücre kanalı oluşturmak için slayt ve kapak kayma arasında balmumu ekleyin. Balmumu eritmek için 80 derece santigrat sıcak plaka üzerine cam balmumu kompleksi yerleştirerek balmumu film için cam yapıştırın. Erime sırasında, balmumu filmini cam yüzeylere düzgün bir şekilde yapıştırmak için kapağı bir pipet ucuyla hafifçe bastırın.
Yapışmadan sonra cam kompleksini oda sıcaklığına kadar soğutun. Hazırlanan aktif sıvıları, pipet ucu yla kanal açılışından uzakta ve cam slayt yüzeyi ile temas halinde bir açıyla akış kanalına derhal yükleyin. Kanalı UV tutkalla kapatın.
Bir sıcaklık kontrol kurulumu yaptıktan sonra, aktif sıvı örneğini safir yüzeye yerleştirin ve slayt tarafı yüzeye temas edin. Cam kaydırağı kağıt bantla sabitleyin. Bakır bant kullanarak, ThermoSensor'u kapak kayma yüzeyine takın.
Kuruluma mikroskop aşamasına monte etmek için, kapak kaymalı kaydırağı hedeflere bakacak şekilde, mikroskop aşaması iğne kelepçeleri ile kurulumu güvence altına alayın. Sıcaklık kontrol cihazını ve akvaryum pompasını açın. Hedef sıcaklığı ayarlamak için üreticiler kılavuzunu izleyin.
Sıcaklık kontrolünü etkinleştirin. Ve ThermoSensor sıcaklık verilerini kaydedin. Aktif karışımdaki Alexa 488 etiketli izleme parçacıklarını izlemek için GFP filtre küpüyle donatılmış bir floresan mikroskopide sabit bir zaman aralığıyla örneği görüntüleyin.
Çerçeveler arasındaki izleyici yer değiştirmesinin dokuz piksel içinde olmasını sağlamak için zaman aralığını ayarlayın. Saniyede 10 mikrometre hızla hareket eden görüntüleme izleyicileri için, dört kat nesnel kullanılarak, zaman aralığının bir ila beş saniye olması önerilir. Resimleri TIF dosyaları olarak kaydedin, dosyaları çerçeve numarasına göre adlandırın ve ayrı bir klasörde saklayın.
Bu kinesin tahrikli mikrotübül bazlı aktif sıvılar için sıcaklık 10, 20, 30 ve 40 santigrat derecede kontrol edildi. Sıcaklıktaki dalgalanma, bu sıcaklık kontrol kurulumunun kararlılığını ve güvenilirliğini gösteren dört saat boyunca sıfır noktası 1 ila sıfır noktası üç derece santigrat derece içinde ydi. İzleyiciler her iki saniyede bir görüntüleniyor ve sıralı görüntüler izleme yörüngelerini izlemek için izin veriliyor.
Ortalama hızları 20-36 santigrat derece olarak ölçülen, neredeyse zaman sıfır iki saat bağımsız olduğu ortaya çıktı. 10 ve 40 santigrat derecede ise, ortalama hızlar mikrotübül depolimerizasyonunun 16 santigrat derecenin altında olması ve kinesin kümelerinin sırasıyla 36 santigrat derecenin üzerinde arızalanması sonucu hızla çürür. Sistem sıcaklıkları her 30 dakikada bir 20 ila 30 derece arasında değiştiğinde, aktif sıvıların ortalama hızları sadece hızlanıp buna göre yavaşlamakla kalmadı, aynı zamanda sıcaklık değişimine 10 saniye içinde yanıt verdi.
Aktif sıvılar 16 derecenin altında soğutulduğunda veya 36 derecenin üzerinde ısıtıldığında arızaya başlar. Bu yüzden sıcaklık kontrol cihazını manipüle ederken, sıcaklığın 16 ila 36 derece arasında olduğundan emin olun. Aktif sıvıyı yerel olarak alabilme yeteneği, A noktasından B noktasına kargo lar teslim etmek veya fiziksel bir vana gerektirmeyen bir mikroakışkanlık cihazı geliştirmek gibi akışkan gücünü yönlendirmeye olanak tanır.
Cam kaplama için kullanılan akrilamid cilt yoluyla absorbe edebilirsiniz bir nörotoksin olduğunu. Riski en aza indirmek için eldiven, laboratuvar önlüğü ve güvenlik gözlüğü gibi uygun koruyucu donanımları takın.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu protokol, sıcaklık kullanarak üç boyutlu aktif sıvıların akış hızlarını kontrol etmek için bir yöntem gösterir. Bu yaklaşım, yerinde düzenleme ve akış hızlarının dinamik ayarlanmasını sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Aktif madde
- Akışkanlar dinamiği
- Mikroskopi teknikleri
Arka Plan
- Aktif maddenin moleküler gölgeler dahil olmak üzere çeşitli alanlarda uygulamaları vardır.
- Aktif sıvıların yerinde kontrolü, bu uygulamaları ilerletmek için gereklidir.
- Yöntem, aktif sıvının değiştirilmesini gerektirmez.
- Ayrıca mikroskopun optik yolunu değiştirmekten kaçınır.
Çalışmanın Amacı
- Aktif sıvıların yerinde kontrolü için basit bir yöntem geliştirmek.
- Aktif maddenin bilimsel uygulamalarda kullanılabilirliğini artırmak.
- Çeşitli sistemlere uygulanabilen esnek bir yaklaşım sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Bir su sirkülasyon sisteminin uygulanması.
- Akış hızlarını kontrol etmek için sıcaklık manipülasyonu.
- Yöntemin hatalı yasaya uyan sistemlere uygulanması.
- Mikrotübüller kayma testlerinde ve enzim tabanlı sistemlerde kullanılması.
Ana Sonuçlar
- Yerinde akış hızlarının başarılı şekilde düzenlenmesi.
- Sıcaklık ayarlarıyla sağlanan akış hızlarının dinamik kontrolü.
- Yöntemin geniş bir aktif madde sistemleri yelpazesine uygulanabilir olması.
- Aktif sıvı veya mikroskop kurulumunda değişiklik gerektirmemesi.
Sonuçlar
- Protokol, aktif sıvıları kontrol etmek için basit bir yaklaşım sunar.
- Araştırmada aktif maddenin potansiyel uygulamalarını artırır.
- Bu yöntem çeşitli bilimsel alanlarda ilerlemelere yol açabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Temperature-dependent control of microtubule-based active fluids enables tunable flow rates without physical valves, supporting dynamic microfluidic device design. This approach enhances predictive confidence in active matter systems by leveraging Arrhenius kinetics for reproducible speed modulation. The method reduces experimental variability and supports scalable assay development for target validation and phenotypic screening workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of motor protein function under controlled thermal conditions to validate kinesin-microtubule interactions as therapeutic targets.
- Operational Value: Provides a tunable, reagent-free system for assessing target engagement and pathway modulation in real time.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by correlating temperature-dependent flow changes with motor protein activity, informing lead identification decisions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, temperature-dependent flow speed readouts (4–8 µm/s) suitable for high-content screening of compound libraries.
- Operational Value: Enables assay standardization through precise thermal control, improving reproducibility across replicates and laboratories.
- Scalability: Supports microfluidic integration for parallel compound testing without valve-based flow regulation, reducing device complexity.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains physiological relevance by operating within 16–36°C range, aligning with mammalian thermal stability for target proteins.
- Preclinical Modeling: Facilitates disease-relevant system evaluation by simulating thermal stress conditions on cytoskeletal dynamics.
- Risk-Adjusted Advancement: Allows dynamic perturbation studies to assess compound effects on motor protein function under varying thermal profiles.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing a tunable biophysical readout that complements biochemical and imaging-based assays for target validation and lead optimization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of motor protein inhibitors or activators through real-time flow speed modulation.
- Screening: Delivers quantitative, temperature-dependent outputs that enable dose-response analysis and hit confirmation in active matter-based assays.
- Analytics: Provides continuous, trackable tracer displacement data enabling statistical comparison of conditions and compound effects.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling thermal sensitivity of cytoskeletal systems relevant to neurodegenerative and cancer targets.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for active matter characterization across multiple projects, reducing redevelopment costs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence through direct, real-time measurement of motor protein-driven dynamics.
- Operational Value: Enhances reproducibility via precise thermal control, minimizing batch-to-batch variability in active fluid preparations.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by enabling rapid, reversible perturbation of target systems without sample remake.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by quantifying target engagement under physiologically relevant thermal fluctuations.
Implementation Considerations
- Requires expertise in active matter preparation, microscopy, and thermal control systems.
- Needs a stable temperature stage with water circulation and leak-proof sealing to prevent microscope damage.
- Demands standardization of sample loading and sealing protocols across users for consistent results.
- Requires adaptation considerations for different tracer particles or surface coatings when scaling to other active matter systems.
- Limited by the 16–36°C operational window due to microtubule depolymerization and motor protein denaturation outside this range.
