Name: Bir İnsan 3D Ekstrasellüler Matrix-Adiposit Kültür Modeli Matrix-Hücre Metabolik Crosstalk Çalışma için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Keşfedin 3D insan ekstraselüler matris-adiposit kültür modelini, matris-hücre metabolik etkileşimlerini incelemek için. Bu yöntem, adipojenik farklılaşma ve tip 2 diyabet bağlamında metabolik düzenlemeyi araştırmada güçlü bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz çalışma koordinasyonu ile yardım için Danielle Berger, Marilyn Woodruff, Simone Correa ve Retha Geiss teşekkür ederiz. SEM Michigan Üniversitesi Mikroskopi ve Görüntü Analiz Laboratuvarı Biyomedikal Araştırma Çekirdek Tesisi tarafından gerçekleştirildi. Bu proje NIH hibe R01DK097449 (RWO), R01DK1115190 (RWO, CNL), R01DK090262 (CNL), Gaziler İşleri Liyakat Hibe I01CX001811 (RWO), Pilot ve Fizibilite Hibe Michigan Diyabet Araştırma Merkezi (NIH Grant30-DK0205772), RWO (RWO) tarafından desteklenmiştir Gaziler İdaresi VISN 10 SPARK Pilot Grant (RWO). Michigan Üniversitesi Mikroskopi ve Görüntü Analiz Laboratuvarı Biyomedikal Araştırma Çekirdek Tesisi tarafından gerçekleştirilen taramalı elektron mikroskobu. Bu makalenin Şekil 4'ü ilk olarak Baker et al., J Clin Endo Metab 2017'de yayınlanmıştır; Mar 1;102 (3), 1032-1043. doi: 10.1210/jc.2016-2915 ve Oxford University Press'in izni ile çoğaltıldı [https://academic.oup.com/jcem/article/102/3/1032/2836329]. Bu materyali yeniden kullanmak için lütfen http://global.oup.com/academic/rights ziyaret edin.

Adipose dokuları, kurumsal inceleme kurulu onayı ile elektif bariatrik cerrahi uygulanan insan deneklerinden temin edilmektedir.
1. Preadipocyte izolasyon ve kültür reaktif hazırlama
<ol><li>1x fosfat tamponlu salin çözeltisi (PBS) %2 büyükbaş serum albumin (BSA) hazırlayın. Filtre sterilize ve 4 ° C'de saklayın.</li>
	<li>Tip II kollajenaz hazırlayın: 1x PBS'de %2 BSA'da 2 mg/mL. Kullanmadan hemen önce hazırlayın.</li>
	<li>Hazırlayın Kırmızı Kan Hücresi (RBC) Lysing Çözeltisi: 1.5 M NH4Cl, 100 mM NaHCO3, 10 mM disodyum EDTA deiyonize suda (DI/H2O). 4 °C'de saklayın. Kullanılmadan hemen önce DI/H2O'daki 10x stok çözeltisinden 1x RBC Lysing Çözeltisi hazırlayın.</li>
	<li>Büyüme Ortamı hazırlayın: fetal büyükbaş serum (FBS), Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta:Besin Karışımı F-12 (DMEM/F12) ntibiyotik-antimikotik solüsyon (ABAM). Filtre sterilize ve 4 ° C'de saklayın.</li>
	<li>Preadipocyte Dondurma Solüsyonu Hazırlayın: DMEM/F12 ortamlarında Dimethyl Sulfoxide, FBS. Filtre sterilize ve 4 ° C'de saklayın.</li>
	<li>Farklılaşma Ortamı Nı Hazırlayın: 10 mg/L transferrin, 33 μM biotin, 0.5 μM insan insülin çözeltisi, 17 μM D-pantotenik asit hemikalsiyum tuzu, 100 nM deksametazon, 2 nM 3,3',5-Triiodo-L-tironin sodyum tuzu (T3), 1 μM silitikiton, 540 μM 3- İzobutyl-1-methylxanthine (IBMX), DMEM/F12'de %1 ABAM. Filtre sterilize ve 4 ° C'de saklayın.</li>
</ol>2. ECM reaktif hazırlama
<ol><li>Dondurucu Tampon Çözeltisi Hazırlayın: 10 mM Tris baz, 5 mM EDTA, %1 ABAM, DI/H2O. Stir çözeltisinde %1 fenilmetilsülfonil florür (PMSF) EDTA'yı eritmek için karıştırın. 4 °C'de HCl veya NaOH.Store ile pH'ı 8,0'a ayarlayın.</li>
	<li>Enzimatik Çözelti #1 hazırlayın: %0,25 tripsin-EDTA%1 ABAM. 4 °C'de 3 aya kadar saklayın.</li>
	<li>Durulama Tampon Çözeltisi Hazırlayın: 137 mM NaCl, 2.68 mM KCl, 7 mM Na2HPO4,1.5 mM KH2PO4,%1 ABAM, %1 PMSF sterildi DI/H2O. Tuzları eritmek için karıştırın. HCl veya NaOH ile pH'ı 8.0'a ayarlayın. 4 °C'de 3 aya kadar saklayın.</li>
	<li>#2 Enzimatik Çözelti Yi Hazırlayın: 55 mM Na2HPO4,17 mM KH2PO4,4,9 mM MgSO4,7H2O, %1 ABAM, DI/H2O. Store 4 °C'de %1 PMSF 3 aya kadar. Tuzları eritmek için karıştırın. Hemen kullanımdan önce, domuz pankreas 80 U / mL lipaz ekleyin, tip VI-S; 160 U/mL deoksiribonuclease I büyükbaş pankreas, tip II-S; ve 100 μg/mL ribonükle a büyükbaş pankreas, tip III-A.</li>
	<li>Polar Solvent Ekstraksiyon Çözeltisi Hazırlayın: 1% ABAM, 1% PMSF izopropanol içinde. DİkKAT: İnopropanol yanıcıdır; 25 °C'de yanıcı bir dolapta saklayın ve yanıcı atıklarda atın.</li>
	<li>Kullanıma hemen önce p etanol, %1 ABAM, %1 PMSF DI/H2O. ABAM ve PMSF ekleyin. DİkKAT: Etanol yanıcıdır; 25 °C'de yanıcı bir dolapta saklayın ve yanıcı atıklarda atın.</li>
	<li>Depolama Çözümü Hazırlayın: 1% ABAM, 1x PBS% 1 PMSF. 4 °C'de 3 aya kadar saklayın.</li>
</ol>3. Metabolik fenotitipre reaktif hazırlama
<ol><li>Glikoz alımı<ol>
<li>Serum Açlık Medya hazırlayın: DMEM/F12, 1% ABAM. Filtre sterilize ve 4 °C'de saklayın</li>
		<li>Kullanmadan hemen önce 1x PBS'de 200 nM insan insülin çözeltisi hazırlayın.</li>
		<li>Hazırlamak 200 nM insan insülin, 0.1 mM 2-Deoksi-D-glukoz, 1 μCi/iyi Deoksi-D-glukoz, 2-[1,2-3H(N)]],, 1x PBS içinde. Kullanmadan hemen önce hazırlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lipoliz<ol>
<li>PBS seyreltilmiş İzoproterenol hazırlayın: 3 mM stok çözeltisi. Çalışma konsantrasyonuna seyreltin 3 μM'lik çalışma konsantrasyonu için.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Yağ Kırmızı-O Boyama<ol>
<li>DI/H2O. Store'da oda sıcaklığında %4 Formalin hazırlayın.</li>
		<li>Hazırlayın Yağ Red-O Çalışma Çözümü. Seyreltik Yağ Kırmızı-O Çözeltisi (ORO) ile DI/H2O 3:2 oranında (ORO:DI/H2O). Kullanmadan hemen önce hazırlayın. Filtre kağıdından filtreleyin (Malzeme Tablosu).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Yağ dokusu temini
NOT: Visseral yağ dokusu (KDV) cerrah tarafından operasyonun başlangıcında büyük omentumdan toplanır ve hemen işlenmesi için buz üzerinde laboratuvara geri taşınır. Tüm insan dokuları ve kostik reaktifleri kullanırken, tüm çalışmaları laminar akış kaputunda, tam laboratuvar güvenlik aşınması kullanarak ve iğnelerin tekrarlanması olmadan gerçekleştirirken evrensel önlemler alınmalıdır.
<ol><li>Doku örneğini batırmak için 50 mL konik tüpe 15-25 mL Dondurucu Tampon Çözeltisi'ne 5-10 g sağlam KDV ekleyin. Numuneleri hücre dışı hale alınana kadar -80 °C'de 1 aya kadar saklayın.</li>
	<li>Bölüm 5'te açıklandığı gibi preadipocyte izolasyonu için ayrı bir taze KDV örneği kullanın.</li>
</ol>5. Preadipocyte izolasyonu
<ol><li>Kollajenaz, tip II, çözeltinin 20 mL'lik kısmını 50 mL konik bir tüpe 2 g sağlam KDV yerleştirin. Daha sonra konik tüp içine steril makas takarak ve tüp içinde doku kıyma iyice kıyma. İnce bir bulamaç için tamamen kıydıktan sonra, kollajenaz çözeltisindeki dokuyu 130 rpm ve 37 °C'de 60 dakika boyunca orbital shaker'da kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Ortaya çıkan digestate'i 100 m'lik naylon kafesten, bir konik tüpten, taze konik bir tüpün üzerine katlanmış bir kafes parçasına dökerek 50 mL'lik yeni bir konik tüpe süzün. Bu noktada digestate orta viskoziteli bir sarı-turuncu sıvı olmalıdır, sindirilmemiş fibröz doku artık iplikçikleri küçük miktarlarda. Mesh sindirilmemiş doku, hangi atılır daha büyük parçalar yakalamak gerekir.</li>
	<li>Numuneyi 10 dk için 270 x g'de santrifüj edin.<ol>
<li>25 °C'de 1 dk kuluçkaya yatın ve sonra 10 mL FBS-DMEM/F12 ekleyin. 10 dk için 270 x g santrifüj.</li>
	</ol></li>
	<li>Supernatant çıkarın ve bir pipet ile% 15 FBS-DMEM/F12 10 mL hücre pelet resuspend. Hücre süspansiyonuna bir pipetle 100 mm Petri kabına aktarın ve 37 °C ve %5 CO2'deinkübat. Her 2-3 günde bir ortamı değiştirin.</li>
	<li>Hücreleri ayırın ve yıkayın.<ol>
<li>Bir pipet ile ortam çıkarın ve yapışık hücrelere% 0,25 tripsin-EDTA 4 mL uygulayın. Hücreleri ayırmak için 37 °C'de 10 dakika boyunca, düzenli olarak plakayı yavaşça döndürerek kuluçkaya yatırın.</li>
		<li> FBS-DMEM/F12'nin 20 mL'sini ekleyin ve bu ortamdaki müstakil hücreleri pipetle yeniden askıya alın. Daha sonra 10 dk için taze 50 mL konik tüp ve santrifüj 270 x g aktarın.</li>
		<li>Supernatant çıkarın ve atın. Hücre peletini 1x PBS'de bir kez yıkayın ve daha sonra hücre peletini 20 mL taze FBS-DMEM/F12'de bir pipetle yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonuna T-150 kültür şişesine aktarın.</li>
	</ol></li>
	<li>Kültür hücreleri 37 °C ve %5 CO2' </li><li><li></li><li><li></li><li><li></li><li></li><li></li></ol><ol><li><ol><li><li></ol></li><li><ol><li><li></ol></li><li><ol><li><li> </li></ol></li><li><ol><li><li><li><li></ol></li></ol><ol><li><li><li><li><ol><li> </li></ol></li><li></li><li><ol><li> </li></ol></li></ol><ol><li><ol><li><li><li></ol></li><li><ol><li><ol><li><li></li><li><li></ol></li><li><ol><li><li></li><li></li><li></ol></li><li> <ol><li><li><li><li><li></li><li></li></ol></li></ol></li><li><ol><li></li><li></li><li></li><li><li></li><li></li><li></li></ol></li><li><ol><li></li><li></li><li><li></li><li><li><li></ol></li></ol><img src="/files/ftp_upload/60486/60486eq1.jpg">

<ol><li>Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix at a glance.</a> Journal of Cell Science. 123, 4195-4200 (2010).</li>
<li>Berrier, A. L., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-matrix+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cell-matrix adhesion.</a> Journal of Cell Physiology. 213 (3), 565-573 (2007).</li>
<li>Trayhurn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+and+adipose+tissue+function+and+dysfunction+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Hypoxia and adipose tissue function and dysfunction in obesity.</a> Physiology Reviews. 93 (1), 1-21 (2014).</li>
<li>O'Rourke, R. W., Lumeng, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+heats+up+adipose+tissue+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Obesity heats up adipose tissue lymphocytes.</a> Gastroenterology. 145 (2), 282-285 (2013).</li>
<li>Engin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Pathogenesis+of+Obesity-Associated+Adipose+Tissue+Inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology.+960%22%5BJournal%5D)">The Pathogenesis of Obesity-Associated Adipose Tissue Inflammation.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 960. 960, 221-245 (2017).</li>
<li>Dankel, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COL6A3+expression+in+adipocytes+associates+with+insulin+resistance+and+depends+on+PPAR%CE%B3+and+adipocyte+size%5BTitle%5D)+AND+%22Obesity+%28Silver+Spring%29%22%5BJournal%5D)">COL6A3 expression in adipocytes associates with insulin resistance and depends on PPARγ and adipocyte size.</a> Obesity (Silver Spring). 22 (8), 1807-1813 (2014).</li>
<li>Divoux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrosis+in+human+adipose+tissue%3A+composition%2C+distribution%2C+and+link+with+lipid+metabolism+and+fat+mass+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Fibrosis in human adipose tissue: composition, distribution, and link with lipid metabolism and fat mass loss.</a> Diabetes. 59, 2817-2825 (2010).</li>
<li>Lackey, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+adipose+tissue+architectural+and+tensile+properties+toward+defining+healthy+and+unhealthy+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%2C+Endocrinology%2C+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Contributions of adipose tissue architectural and tensile properties toward defining healthy and unhealthy obesity.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology, and Metabolism. 306 (3), E233-E246 (2014).</li>
<li>Muir, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+fibrosis%2C+hypertrophy%2C+and+hyperplasia%3A+correlations+with+diabetes+in+human+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Obesity+%28Silver+Spring%29%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue fibrosis, hypertrophy, and hyperplasia: correlations with diabetes in human obesity.</a> Obesity (Silver Spring). 24 (3), 597-605 (2016).</li>
<li>Spencer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+macrophages+in+insulin-resistant+subjects+are+associated+with+collagen+VI+and+fibrosis+and+demonstrate+alternative+activation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%2C+Endocrinology%2C+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue macrophages in insulin-resistant subjects are associated with collagen VI and fibrosis and demonstrate alternative activation.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology, and Metabolism. 299 (6), E1016-E1027 (2010).</li>
<li>Baker, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes-specific+regulation+of+adipocyte+metabolism+by+the+adipose+tissue+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Diabetes-specific regulation of adipocyte metabolism by the adipose tissue extracellular matrix.</a> Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 102 (3), 1-12 (2017).</li>
<li>Pellegrinelli, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+adipocyte+function+is+impacted+by+mechanical+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Patholology%22%5BJournal%5D)">Human adipocyte function is impacted by mechanical cues.</a> Journal of Patholology. 233 (2), 183-195 (2014).</li>
<li>Flynn, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+decellularized+adipose+tissue+to+provide+an+inductive+microenvironment+for+the+adipogenic+differentiation+of+human+adipose-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The use of decellularized adipose tissue to provide an inductive microenvironment for the adipogenic differentiation of human adipose-derived stem cells.</a> Biomaterials. 31 (17), 4715-4724 (2010).</li>
<li>Perea-Gil, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+comparative+study+of+two+decellularization+protocols+in+search+of+an+optimal+myocardial+scaffold+for+recellularization%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">In vitro comparative study of two decellularization protocols in search of an optimal myocardial scaffold for recellularization.</a> American Journal Translational Research. 7 (3), 558-573 (2015).</li>
<li>Porzionato, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+omentum+as+novel+biologic+scaffold+for+reconstructive+surgery+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Decellularized omentum as novel biologic scaffold for reconstructive surgery and regenerative medicine.</a> European Journal of Histochemistry. 57 (1), e4(2013).</li>
<li>Tebyanian, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comparative+Study+of+Rat+Lung+Decellularization+by+Chemical+Detergents+for+Lung+Tissue+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Access+Macedonian+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">A Comparative Study of Rat Lung Decellularization by Chemical Detergents for Lung Tissue Engineering.</a> Open Access Macedonian Journal of Medical Sciences. 5 (7), 859-865 (2017).</li>
<li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li>
<li>Wang, L., Johnson, J. A., Zhang, Q., Beahm, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+decellularized+human+adipose+tissue+extracellular+matrix+and+adipose-derived+stem+cells+for+adipose+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Combining decellularized human adipose tissue extracellular matrix and adipose-derived stem cells for adipose tissue engineering.</a> Acta Biomaterials. 9 (11), 8921-8931 (2013).</li>
<li>Booth, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acellular+normal+and+fibrotic+human+lung+matrices+as+a+culture+system+for+in+vitro+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 186 (9), 866-876 (2012).</li>
<li>Parker, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrotic+extracellular+matrix+activates+a+profibrotic+positive+feedback+loop%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Fibrotic extracellular matrix activates a profibrotic positive feedback loop.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (4), 1622-1635 (2014).</li>
<li>Baker, N. A., Muir, L. A., Lumeng, C. N., O'Rourke, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+Metabolic+Interrogation+of+Human+Adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Differentiation and Metabolic Interrogation of Human Adipocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 1566, 61-76 (2017).</li>
<li>O'Rourke, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hexosamine+biosynthesis+is+a+possible+mechanism+underlying+hypoxia%27s+effects+on+lipid+metabolism+in+human+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Hexosamine biosynthesis is a possible mechanism underlying hypoxia's effects on lipid metabolism in human adipocytes.</a> PLoS One. 8 (8), e71165(2013).</li>
<li>Tchkonia, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fat+depot-specific+characteristics+are+retained+in+strains+derived+from+single+human+preadipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Fat depot-specific characteristics are retained in strains derived from single human preadipocytes.</a> Diabetes. 55 (9), 2571-2578 (2006).</li>
<li>Tchoukalova, Y. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex-+and+depot-dependent+differences+in+adipogenesis+in+normal-weight+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Obesity+%28Silver+Spring%29%22%5BJournal%5D)">Sex- and depot-dependent differences in adipogenesis in normal-weight humans.</a> Obesity (Silver Spring). 18 (10), 1875-1880 (2010).</li>
</ol>

Yazarlar çakışan bir çıkar beyan etmezler.

ECM-adiposit kültür modeli nihai doku fenotip dikte ECM ve hücrelerin bireysel rolleri diseksiyon için değerli bir araç sağlar. ECM izolasyon protokolü oldukça tekrarlanabilir, ancak hücredışılaştırma sürecinde değişkenlik görülebilir. Gün 3 delipidasyon adımı protokolde kritik bir noktadır. Gece çekimi tamamlandığında, matrisin delipidasyonu Polar Solvent Çözeltisi'nin sarıya dönmesiyle kanıtlanmalıdır, matris ise bozulmamış yağ dokusunun sarı-turuncu renk özelliğinden yarı saydam/ beyaz (Şekil 1</s...

Hücre dışı matriks (ECM) sadece dokular için mekanik bir iskele sağlar, ama aynı zamanda içinde bulunan hücreler ile karmaşık bir çapraz meşgul, hücre çoğalması da dahil olmak üzere doku homeostaz için gerekli çeşitli süreçleri düzenleyen, farklılaşma, sinyalizasyon ve metabolizma1. Sağlıklı ECM normal doku fonksiyonunun sürdürülmesinde önemli bir rol oynarken, işlevsiz ECM birden fazla hastalığa bürünmemiştir2.
Adipoz doku metabolik hastalığın patogenezinde önemli bir rol oynar. Obezite aşırı adiposit hipertrofisi ve hücresel hipoksi ile ilişkilidir, adiposit hücre metabolizmasında defektler, ve yağ dokusu endoplazmik retikulum ve oksidatif stres ve inflamasyon. Yanlış anlaşılmış olsa da, bu karmaşık süreçler yağ dokusu besin tamponlama kapasitesini bozmak için komplo, yağ dokusundan besin taşması yol açan, birden fazla dokutoksisite, ve sistemik metabolik hastalık3,4 ,5. Yağ dokusu yetmezliğinin altında yatan olaylar dizisi ve belirli mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır, ancak yağ dokusu ECM'deki değişiklikler ecm'ye dahil edilmiştir. ECM bileşimi insan ve mürin obezitesinde yağ dokusu içinde, insan metabolik hastalığı ile ilişkili yağ dokusu ECM nitel biyokimyasal ve yapısal farklılıklar ile birlikte ECM proteininin artmış birikimi ile değiştirilir, dahil olmak üzere tip 2 diyabet ve hiperlipidemi6,7,8,9,10,11.
Bu gözlemlere rağmen, yağ dokusu ECM'nin yağ dokusu disfonksiyonuna aracılık etmedeki rolü iyi tanımlanmamıştır. Bu kısmen nihai yağ dokusu fonksiyonunun düzenlenmesinde ECM ve adipositlerin belirli rollerinin diseksiyonuna izin veren çekilebilir deneysel modellerin eksikliğinden kaynaklanmaktadır. ECM-adiposit kültürü en az iki açıdan yerli yağ dokusunun in vivo ortamını daha iyi simüle eder. İlk olarak, ECM kültürü, standart 2D kültüründe bulunmayan yerli kollajenler, elastinler ve diğer matris proteinleri de dahil olmak üzere yerli yağ dokusuna benzer moleküler bir ortam sağlar. İkinci olarak, 2D plastik kültürü plastik substrat azaltılmış elastikiyeti nedeniyle mekanik etkileri ile adiposit metabolizmasını değiştirmek için gösterilmiştir12, Hangi ECM-kültür ortadan kaldırır.
ECM'nin hücreli yağ ve diğer dokulardan izole edilerek biyolojik iskelelerin tasarlanma yöntemleri rejeneratif ve rekonstrüktif tıp ve doku mühendisliği bağlamında incelenmiştir13,14, 15,16,17,18. Daha önce insan ecm-adiposit kültürünün bir in vitro 3D modeli geliştirmek için bu yöntemleri uyarlanmış metodoloji yayınladık, ECM ve adiposit kök hücreleri kullanarak (preadipocytes) insan visseral yağ dokuları türetilmiştir11. Bu makalede, bu yöntemleri ayrıntılı olarak açıklıyoruz. İnsan yağ dokusu için decellularization prosedürü, türetildiği dokunun özelliklerini koruyan biyolojik bir iskele bırakarak, hücreleri ve lipid kaldırmak için mekanik ve enzimatik tedaviler içeren dört günlük bir süreçtir. Desellülerce ECM insan pizpositlerinin adipojenik farklılaşmasını destekler ve adipositlerle yeniden oluşturulduğunda, mikromimarisi ve biyokimyasal ve hastalığa özgü sağlam yağ dokusu özelliklerini korur ve metabolik yerli yağ dokusunun karakteristik fonksiyonları. Bu matris tek başına çalışılabilir veya hücrelerle yeniden tohumlanabilir, adipoz dokusunun hücresel ve hücre dışı bileşenleri arasındaki etkileşimlerin ve çapraz konuşmaların incelenmesine izin verilir.

<table><tbody><tr><td>% 0.25 tripsin-EDTA</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, ABD</td><td>Kedi # 25200056</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL kriyoviyal tüp</td><td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA ABD</td><td>Kedi # 02-682-557</td><td></td></tr><tr><td>% 10 Nötr Tamponlu Formalin</td><td>VWR International LLC., Radnor, PA, ABD</td><td>Kedi # 89370-094</td><td></td></tr><tr><td>100 & m naylon örgü filtre</td><td>Corning Inc., Corning, NY, ABD</td><td>Kedi # 352360</td><td></td></tr><tr><td>2-Deoksi-D-glikoz</td><td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, ABD</td><td>Kedi # D8375</td><td></td></tr><tr><td>2 nM 3,3 ', 5-Triiyodo-L-tironin sodyum tuzu (T3)</td> <td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, ABD</td><td>Kedi # T6397</td><td></td></tr><tr><td>24 oyuklu doku kültürü plakaları</td><td>VWR International LLC., Radnor, PA, ABD</td><td>Kedi # 10861-700</td><td></td></tr><tr><td>3-İzobutil-1-metilksantin (IBMX)</td> <td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, ABD</td><td>Kedi # I5879</td><td></td></tr><tr><td>96 oyuklu doku kültürü plakaları</td><td>VWR International LLC., Radnor, PA, ABD</td><td>Kedi # 10861-666</td><td></td></tr><tr><td>Antibiyotik-Antimikotik Çözelti (ABAM)</td> <td>Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, ABD</td><td>Kedi # 15240062</td><td></td></tr><tr><td>Biotin</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, ABD</td><td>Kedi # B4639</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümini (BSA)</td> <td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, ABD</td><td>Kedi # A8806</td><td></td></tr><tr><td>Tampon RLT</td><td>Qiagen, Hilden, Almanya</td><td>Kedi # 79216</td><td></td></tr><tr><td>Siglitizone</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, ABD</td><td>Kedi # C3974</td><td></td></tr><tr><td>Deoksi-D-glikoz, 2 - [1,2-3H (N) ] -</td><td>PerkinElmer Inc., Waltham, MA, ABD</td><td>Kedi # NET328A250UC</td><td></td></tr><tr><td>Sığır pankreasından deoksiribonükleaz I, tip II-S</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, ABD</td><td>Kedi # D4513</td><td></td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, ABD</td><td>Kedi # D4902</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil Sülfoksit</td><td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA ABD</td><td>Kedi # BP231</td><td>Yanıcı, kostik</td></tr><tr><td>Disodyum EDTA</td><td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA ABD</td><td>Kedisi # BP118</td><td></td></tr><tr><td>D-pantotenik asit hemikalsiyum tuzu</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, ABD</td><td>Kedisi # 21210</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modifiye Eagle Ortamı: Besin Karışımı F-12 (DMEM / F12</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA ABD</td><td>Kedi # 11320033</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Decon Labs, Inc., Prusya Kralı, PA, ABD</td><td>Kedi # DSP-MD.43</td><td>Yanıcı</td></tr><tr><td>EVE Hücre Sayma Slaytları, NanoEnTek</td><td>VWR International LLC., Radnor, PA, ABD</td><td>Kedi # 10027-446</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu (FBS)</td> <td>Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, Amerika Birleşik Devletleri</td><td>Kedi # 10437028</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehit</td><td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, ABD</td><td>Kedi # G5882</td><td>Kostik</td></tr><tr><td>Heksametildisalizane</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, Amerika Birleşik Devletleri</td><td>Kedi # 440191</td><td>Yanıcı, yakıcı</td></tr><tr><td>İnsan insülin çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, ABD</td><td>Kedi # I9278</td><td></td></tr><tr><td>İzopropanol</td><td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA ABD</td><td>Kedi#A415</td><td>Yanıcı</td></tr><tr><td>İzoproterenol</td><td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, ABD</td><td>Kedi#I5627</td><td>Yanıcı</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, ABD</td><td>Kedi#S25484</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, Amerika Birleşik Devletleri</td><td>Kedi#P5655</td><td></td></tr><tr><td>Domuz pankreasından lipaz, tip VI-S</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, ABD</td><td>Kedi # L0382</td><td></td></tr><tr><td>MgSO< alt > 4< / alt > * 7H < alt > 2O</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, ABD</td><td>Kedi # 230391</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, ABD</td><td>Kedi # S5136</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, ABD</td><td>Kedi # S3014</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td> <td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA ABD</td><td>Kedi # S233</td><td></td></tr><tr><td>NH < > 4Cl</td><td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA ABD</td><td>Kedi # A661</td><td></td></tr><tr><td>Optimum kesim sıcaklık (OCT) bileşiği</td><td>Agar Scientific, Ltd., Stansted, Essex, Birleşik Krallık</td><td>Kedi # AGR1180</td><td></td></tr><tr><td>Yağ Kırmızı-O Çözeltisi (ORO)</td> <td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, ABD</td><td>Kedi # O1391</td><td></td></tr><tr><td>Yağ Kırmızı-O Leke Kiti</td><td>American Master Tech Scientific Inc., Lodi, CA, ABD</td><td>Kedi # KTORO-G</td><td></td></tr><tr><td>Osmiyum tetroksit</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, ABD</td><td>Kedi # 201030</td><td>Kostik</td></tr><tr><td>Fenilmetilsülfonil florür (PMSF)</td> <td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, ABD Kedi</td><td># 93482</td><td>Kostik</td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Tuzlu Su Çözeltisi (PBS)</td> <td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA ABD</td><td>Kedi # SH3025601</td><td></td></tr><tr><td>Sığır pankreasından Ribonükleaz A, tip III-A</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, ABD</td><td>Kedi # R5125</td><td></td></tr><tr><td>RNAEasy Fibröz Doku MiniKit</td><td>Qiagen, Hilden, Almanya</td><td>Kedi # 74704</td><td></td></tr><tr><td>Sintilasyon Sıvısı</td><td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA ABD</td><td>Kedi # SX18</td><td></td></tr><tr><td>Sintilasyon Sayacı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Makas, forseps, steril</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorensen'in fosfat tamponu</td><td>Thomas Scientific, Inc., Swedesboro, NJ</td><td>CAS #: 10049-21-5</td><td></td></tr><tr><td>T-150 kültür şişesi</td><td>VWR International LLC., Radnor, PA, ABD</td><td>Kedi # 10062-864</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gen İfadesi Master Mix</td><td>ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA ABD</td><td>Kedi # 4369016</td><td></td></tr><tr><td>Sıcaklık kontrollü orbital çalkalayıcı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Doku Homojenizatör, BeadBug Mikrotüp Homojenizatör</td><td>Benchmark Bilimsel</td><td>Kedi # D1030</td><td></td></tr><tr><td>Transferrin</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, ABD</td><td>Kedi # T3309</td><td></td></tr><tr><td>Trigliserit Belirleme Kiti</td><td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, ABD</td><td>Kedi # TR0100</td><td></td></tr><tr><td>Tripan mavisi leke,% 0.4</td> <td>VWR International LLC., Radnor, PA, ABD</td><td>Kedi # 10027-446</td><td></td></tr><tr><td>Tip II kollajenaz</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, ABD</td><td>Kedi # 17101015</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Reeve Angel filtre kağıdı, Sınıf 201, 150mm</td><td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, ABD</td><td>Kedi # WHA5201150</td><td></td></tr></tbody></table>

bir İnsan 3d ekstrasellüler matrix-adiposit kültür modeli matrix-hücre metabolik crosstalk Çalışma için

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

Hücre dışı matriks (ECM) doku homeostazının düzenlenmesinde, hücrelerle çapraz konuşma yapmada ve hücresel fonksiyonun birden fazla yönünü düzenlemede merkezi bir rol oynar. ECM obezite yağ dokusu fonksiyonu özellikle önemli bir rol oynar, ve yağ dokusu ECM birikimi ve bileşimideğişiklikleri fareler ve insanlarda metabolik hastalık ile ilişkilidir. Küresel doku fenotipkatkıda ECM ve hücrelerin rollerinin diseksiyon izin in vitro modeller seyrek. Biz insan ECM-adiposit kültürünün yeni bir 3D in vitro modeli, adipoz doku metabolik fenotip düzenleyen ECM ve adipositlerin belirli rolleri çalışma izin açıklar. İnsan yağ dokusu ECM izole etmek için desellize edilir, daha sonra olgun adipositler içine ECM içinde ayırt edilir preadipocytes ile yeniden doldurulur. Bu yöntem metabolik olarak aktif olan ve türetildiği doku ve hastaların özelliklerini koruyan ECM-adiposit yapıları oluşturur. Bu sistemi, insan yağ dokusunda hastalığa özgü ECM-adiposit çapraz sapı göstermek için kullandık. Bu kültür modeli küresel yağ dokusu metabolik fenotip katkıda ECM ve adipositlerin rollerini incelemek için bir araç sağlar ve yağ dokusu homeostaz düzenleyen ECM rolünün çalışma izin verir.

Yağ dokusu ECM hazırlanması, preadipocytes ile tohumlama, ve olgun adipositler içine in vitro farklılaşma protokol boyunca ilerleme görsel değerlendirme izin dokuaçık sıralı morfolojik değişiklikler ile sonuçlanır (Şekil 1) . ECM tohumlamak için kullanılan preadipocytes ayrı KDV örneklerinden kollajenaz sindirim kullanılarak izole edilir(Şekil 2). ECM-adiposit yapılarının her aşamasında taramalı elektron mikroskobu, ECM'nin hücre...

Biz adipoz doku metabolik fenotip katkıda matris ve adiposit lerin rollerinin diseksiyon sağlayan bir 3D insan ekstrasellüler matriks-adiposit in vitro kültür sistemi açıklar.

Bir İnsan 3D Ekstrasellüler Matrix-Adiposit Kültür Modeli Matrix-Hücre Metabolik Crosstalk Çalışma için

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

Protokolümüz, ECM'nin klasik adipojenik arabulucuların yokluğunda adipojenik farklılaşmayı teşvik edebileceğini ve ECM ile hücre metabolizmasının hastalığa özgü düzenlenmesini gösteren ilk protokol olduğunu göstermektedir. Tekniğimiz, ecm ve adipositlerin yağ dokusu metabolizmasındaki rollerini incelemek için bir araç sağlar ve yağ dokusu homeostazının düzenlenmesinde ECM'nin rolünün incelenmesine izin verir. Standart 2D hücre kültürü ile karşılaştırıldığında, bizim 3D modeli daha sağlam muayene ve tip 2 diyabet bağlamında adipositler ve yağ dokusu ECM arasında çapraz konuşma diseksiyon sağlar.Hücreselhale ne kadar iyi olduğunu ölçmek için daha küçük örneklerle başlamanızı öneririz. Hücrelerin ne kadar iyi büyüdüğü ve dokunun ne kadar iyi hücreyi yitireceği konusunda hastalar arası değişkenlik olduğunu unutmayın. Dokunun hücreleşmeden emin olmak ve örnekler arasındaki potansiyel farklılıkları anlamak için her adımdan önce ve sonra dokuyu gözlemlemek önemlidir.Ameliyattan visseral yağ dokusu veya KDV aldıktan sonra, 50 mililitrelik konik bir tüpte 15-25 mililitre dondurucu tampon çözeltisine 5-10 gram doku ekleyerek depolamaya hazırlayın. Numuneyi tamamen batırın ve hücreyi decellularization kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın. Preadipocyte izolasyoniçin, kollajenaz tip II çözeltisi 20 mililitre bozulmamış KDV taze bir örnek iki gram yerleştirin, sonra tüp içine steril makas eklemek ve iyice doku kıyma.Bir kez ince bir bulamaç için kıyılmış, 60 dakika boyunca bir orbital shaker üzerinde 37 santigrat derece kollajenaz çözeltisi içinde kuluçka. Kuluçkadan sonra, 100 mikrometrelik naylon kafesten sindirilen sindirilen suyu 50 mililitrelik konik bir tüpe süzün. Sindirilmiş orta viskoziteli sarı-turuncu bir sıvı ve sindirilmemiş doku artık iplikçikleri küçük bir miktar olmalıdır.Numuneyi 270 kez g'de 10 dakika santrifüj edin, süpernatantı çıkarın ve hücre peletini bir pipetle 1X RBC lysing çözeltisinin iki mililitresinde yeniden askıya alın. 25 santigrat derece bir dakika için çözüm kuluçka, sonra 10 mililitre ekleyin 15% FBS DMEM F12 ve 10 dakika boyunca 270 kez g santrifüj. ECM'yi hazırlamak için, önceden dondurulmuş KDV örneğini önceden ısıtılmış bir su banyosunda 20 dakika boyunca periyodik olarak hafif manuel ajitasyonla kuluçkaya yatırarak 37 santigrat dereceye kadar dondurun/eritin.Çözüldükten sonra, 20 dakika boyunca eksi 80 santigrat dereceye geri doku aktarın ve erime ile biten üç kez dondurma/ çözülme işlemini tekrarlayın. KDV örneğini 15-25 mililitre enzimatik çözelti 1 içeren yeni bir 50 mililitrekonik tüpe aktarmak için steril forsepsler kullanın ve numunenin tamamen batırDığından emin olun. Sonra 130 RPM sallayarak 37 santigrat derece gecede kuluçka.Ertesi gün, her yıkamadan sonra çözeltiyi dökerek 15-25 mililitre durulama tampon çözeltisi ile numuneyi üç kez yıkayın. Numuneyi 15-25 mililitre enzimatik solüsyon 2 ile yeni bir 50 mililitrelik tüpe aktarın ve bir gecede kuluçkaya yatırın. Durulama tampon çözeltisi ile yıkAyılmaz ve numuneyi 15-25 mililitre polar solvent ekstraksiyon çözeltisi içeren yeni bir tüpe aktarın.Sallayarak bir gecede örnek kuluçka. Polar solvent çözeltisi ile kuluçkadan sonra lipid giderme numunesinin incelenmesi önemlidir. Lipid çoğu kaldırılmazsa, bu adımı tekrarlamak gerekebilir.Daha kısa kuluçka süresi kullanılabilir. Kuluçkadan sonra, numuneyi 15-25 mililitre durulama tampon çözeltisi içeren yeni bir tüpe aktarın ve numuneyi üç kez çalkalayıcı üzerinde yıkayın. Daha sonra her yıkamadan sonra etanol dökülen, % 70 etanol çözeltisi ile örnek üç kez yıkayın.Numuneyi depolama solüsyonuyla bir kez yıkayın, ardından 15-25 mililitre depolama çözeltisi içeren taze bir tüpe aktarmak için steril forsepsler kullanın ve tam olarak batırın. Örnek daha sonra bir aya kadar dört santigrat derecede saklanabilir. Isopropanol ve etanol yanıcıdır ve oda sıcaklığında olmalı ve yanıcı atıklarda bertaraf edilmelidir.Herhangi bir insan atıkları her zamanki biyolojik tehlike atıklarından ayrı olarak bertaraf edilmelidir. Depolanan ECM parçalarını steril forsepsli 24 kuyuluk bir plakanın tek tek kuyularına aktarın ve planlanan aşağı tahliller için gerektiği kadar parça ekleyerek. Orbital shaker üzerinde% 70 etanol 500 mikrolitre ile üç kez yıkayın, sonra PBS ile üç kez yıkayarak onları rehydrate.ECM'yi 100 miligramlık parçalara dönüştürmek için steril makas kullanın. Her parçayı 24 kuyuluk bir kuyuya yerleştirin ve fazla PBS'nin parçalardan dışarı çıkması için plakayı 15 dakika boyunca 25 derecede kuluçkaya yatırın. Daha sonra bir pipet ile kuyulardan kalan PBS'yi dikkatlice çıkarın.Hücreleri doğrudan ECM'ye boruhaline getirerek her parçayı 20 mikrolitre preadipocyit hücre süspansiyonu ile tohumlayın. Pipet ucunu ECM'ye yerleştirin ve yavaşça matrisin ortasına atarak hücre süspansiyonunun taşmayıp kuyunun dibine inmediğinden emin olun. Hücre süspansiyonu ECM'den taşarsa, pipet ucunu o konumdan çıkarın ve ECM'nin başka bir yerine takın.Hücre tohumlama sonra, 37 santigrat derece 40 dakika boyunca ECM kuluçka. Tohumlu ECM parçalarını kapsayacak şekilde her kuyuyu 500 mikrolitre büyüme ortamıyla doldurun. Kültür hücreleri 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit 72 saat.72 saat sonra, ECM parçasını rahatsız etmeden büyüme ortamını dikkatlice aspire edin. Her iki veya üç günde bir medya değişen 14 gün boyunca farklılaşma medya ve kültür hücreleri 500 mikrolitre ekleyin. Işık mikroskobu kullanarak farklılaşma olup olup yok.Hücreler lipidler birikir, renk kahverengi-sarı açmak ve onlar ayırt olarak daha küresel hale gelir. Yağ dokusu ECM'nin hazırlanması, preadipocytes ile tohumlama ve olgun adiposiitlere in vitro farklılaşma, ECM'nin hücredışılaştırılması ve reseeding ve farklılaşma üzerine adiposit içeren lipidin daha sonra recapitülasyonu nu ortaya çıkaran taramalı elektron mikroskobu ile izlendi. Kollajen 1 hücreli ECM spesifik immünohistokimyakolajen mikro mimarisinin bakım gösterdi canlı ve sabit 3D ECM-adiposit yapılar Yağ Red-O boyama adipositler içeren lipid gösterdi.ECM'de farklılaşan adipositler, ecm'de kültürlenen farklılaşmamış preadipocyte'lere göre farklılaşmış hücrelerde bu genlerin upregulated olduğunu gösteren kantitatif gerçek zamanlı PCR kullanılarak adipojenik genler için tarandı. Transkript düzeylerindeki tam fark gösterilir. Diyabetik ve nondiyabetik deneklerin dört ecm ve adiposit kombinasyonu metabolik fenotitiplemeye tabi tutuldu.Diyabetik dokularda lipolitik fonksiyonda bozulmuş glikoz alımı keşfedildi. Daha da önemlisi, diyabetik adipositlerde insülin uyarılmış glikoz alımı ve lipolitik kapasiteyi diyabetik olmayan ECM'nin kurtardığı bulunmuştur. İzole preadipocytes kontaminasyonu, hücreli doku, ve reseeded ECM nadir değildir.Kısırlık protokol boyunca özenle muhafaza edilmelidir.

a-human-3d-extracellular-matrix-adipocyte-culture-model-for-studying

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Standart yöntemlerle olarak hücreler, fizyolojik bir ortam üzerinden alınır ve bir çanak plastik yüzeyi üzerinde büyütülür. Birincil insan kemik iliği hücrelerinin davranışını incelemek için biz hücreler doku yerel mikro yansıtan koşullar altında yetiştirilen bir 3-D kültür sistemi oluşturulur.

İlköğretim İnsan Kemik İliği ve Maligniteleri Eğitim Bir Üç boyutlu Doku Kültürü Modeli

Olgun adipositler, homojen bir fibroblast benzeri hücre popülasyonuna yol açan farklılaşma yoluyla bol miktarda kök hücre kaynağını temsil edebilir. Kollajenaz sindirimi, olgun adipositleri insan yağından izole etmek için kullanılır. Protokolümüzün amacı, insan olgun adipositlerinden multipotent, farklılaşmış yağ hücreleri elde etmektir.

Tavan Kültürlerde Olgun adipositlerinde ve dediferansiyonunu ile İnsan adipoz Kök Hücre Üretimi

Beyaz Yağ dokusundan (WAT) farmakolojik geliştirme ve metabolik çalışmalar engelleyen onun geçerli birincil kültür modelleri içinde önemli eksiklikleri vardır. Burada, bir yağ microphysiological sistem tarafından sandviç WAT levha stromal hücreler arasında üretmek için bir protokol mevcut. Bu yapıyı birincil WAT kültür için istikrarlı ve uyarlanabilir bir platform sağlar.

İnsan yağı için bir Microphysiologic Platform: beyaz yağ dokusu sandviç

Bu yöntemin amacı sonraki hücresel tahliller için doğal bir iskele olarak fibroblast türetilmiş 3D matris elde etmektir. Fibroblastlar önceden işlenmiş bir kültür plakası içinde tohumlanır ve matris üretimi için askorbik asit ile uyarılır. Matrisler hücreden arındırılır ve kültürle ilgili hücrelere (örn. endotel hücreleri) bloke edilir.

Endotel Tüp Oluşumu Namına Uygulanan Fibroblast Türetilmiş 3D Matris Sistemi

Membran olgun adiposit agrega kültürü (MAAC) kültür olgun insan adipositler için yeni bir yöntemdir. Burada insan yağlarından adipositleri nasıl izole edebileceğimizi ve MAAC'ı nasıl kurabileceğimizi ayrıntılarıyla anlatıyoruz.

Membran Olgun Adiposit Agrega Kültürleri (MAAC) Kullanarak İnsan Olgun Adipositlerin İzolasyon ve Kültürü

Burada sunulan, protein ve mikro-RNA ekspresyonunun modüle etmek için küçük müdahaleci RNA (siRNA), mikro-RNA mimikleri (miRs) veya anti-mikro-RNA (anti-miR) gibi oligonükleotidleri olgun adipositlere ulaştırmak için bir protokoldür.

Protein ve Mikro-RNA Modülasyonunun Adipozit İşlevi Üzerindeki Etkisini Incelemek için Bir Adiposit Hücre Kültürü Modeli

Burada, insan deri altı yağ dokusundan (hSATMVEC'ler) mikrovasküler endotel hücrelerinin izole edilmesi, kültürlenmesi ve fenotiplendirilmesi için bir protokol tanımlanmıştır. Ek olarak, deneysel bir hSATMVEC-adiposit çapraz konuşma modelini açıklıyoruz.

İnsan Subkutan Yağ Dokusunda Adipoz Endotel Hücresi/Adiposit Çapraz Konuşmasının İncelenmesi

Bu protokol, metakrilatlenmiş jelatin (GelMA) hidrojellerine gömülü insan osteositleri kullanılarak 3D kemik yapılarının üretilmesini ve decellularize ekstrasellüler matriks ile desteklenmesini açıklar. Yöntem düşük maliyetli, ölçeklenebilir ve temel laboratuvar ekipmanlarıyla uyumludur; bu da kas-iskelet hastalıkları süreçlerini incelemek için translasyonel bir platform sağlar.

Kas-iskelet hastalıklarının modellenmesi için insan osteositleri ve hücresizleştirilmiş ekstrasellüler matriks kullanan 3D kemik kültürü platformu

Ex vivo explant modeli kullanılarak, yağsız farelerden alınan visseral beyaz yağ dokusunun rostral kısmının küçük parçaları 7–10 gün boyunca kültürlenir; bu da yüksek yağlı diyet sırasında meydana gelen yağ dokusu iltihabının indüksiyonu ve incelenmesini mümkün kılar.

Yüksek Yağlı Diyet Benzeri Yağ Dokusu İltihaplanması için Deneyimli Fare Modeli

Biz 3D doku parçacıklarının ve potansiyel uygulama üreten hücre-hücre etkileşimleri farklılıkları ölçmek için basit ve hızlı bir yöntem açıklanmaktadır.

3D parçacıklarının Üretimi için Basit Asma Bırak Hücre Kültürü Protokolü

Keşfedin 3D insan ekstraselüler matris-adiposit kültür modelini, matris-hücre metabolik etkileşimlerini incelemek için. Bu yöntem, adipojenik farklılaşma ve tip 2 diyabet bağlamında metabolik düzenlemeyi araştırmada güçlü bir araç sunar.

Bir İnsan 3D Ekstrasellüler Matrix-Adiposit Kültür Modeli Matrix-Hücre Metabolik Crosstalk Çalışma için

Daha fazla video keşfet