Kümelenme Sonucu Desorpsiyon/İyonlaşma Kütle Spektrometresi Yoluyla Karmaşık Moleküllerin ve Yüzeylerdeki Reaksiyonlarının Analizi
1 Mart 2020
Nötr SO2 kümeleri düşük kinetik enerji (< 0.8 eV/constituent) bir iyon kapanı kütle spektrometresi kullanılarak kütle spektrometresi ile daha fazla analiz için peptidler veya lipidler gibi karmaşık yüzey moleküllerini desorb için kullanılır. Özel bir numune hazırlama gerekli değildir ve reaksiyonların gerçek zamanlı gözlemi mümkündür.
Kısa DINeC olarak adlandırdığımız nötr SO2 kümelerinin indüklediği desorpsiyon iyonizasyonu yumuşak ve verimli bir desorpsiyon iyonizasyon yöntemidir. Biz peptidler ve proteinler gibi biyomoleküllerin kütle spektrometresi için diğerleri arasında kullanabilirsiniz. DINeC olarak, örnek yüzeylerinden bozulmamış desorpsiyon molekülleri, bu moleküllerdeki ince kimyasal değişiklikler kütle spektrumlarında kolayca tespit edilir.
İşlem aşağıdaki simülasyonda gösterilmiştir. Gelen kümeler küme-yüzey etkisi ile paramparça olur. Yüzey izotop dipeptid küme parçalarından birinde çözülür ve bu işlem tarafından desorpted.
Deneyde, SO2 kümelerinin ışını darbeli bir memeden süpersonik genişleme ile üretilir. Küme yüzeyi etkisi sırasında çözünmüş ve iyonize olan moleküller kütle spektrometresi için iyon tuzağına aktarılır. Tipik kütle spektrumları sadece bozulmamış molekülün MO kümesi değerlerinde zirveleri gösterir.
Prosedürü gösteren Karolin Bomhardt ve Pascal Schneider, benim laboratuvarda iki doktora öğrencisi olacaktır. Standart numuneler için, yaklaşık 0,5 ila bir milimetre kalınlığında silikon gofretlerden yüzeyleri bir santimetre kare lik parçalar halinde kesin. Silikon yüzeyleri her biri 15 dakika boyunca etanol ve aseton dan oluşan bir ultrason banyosunda temizleyin.
Kuru azot gazı akışında yüzeyleri kurutun. Daha sonra, substrat üzerinde örnek çözeltinin 5 ila 30 mikrolitre döküm bırakın. Çözücünün buhar basıncına bağlı olarak, numunenin ortam koşullarında veya kurutucuda kurumasına izin verin, tüm çözücü buharlaşana ve kuru bir film oluşana kadar.
En basit hazırlık planını düşünün. Örnek olarak, vurgulayıcı mürekkesinin araştırılması için, alt tabaka yüzeyine bir nokta çizmemem. Numuneleri yapışkan bant veya vidalarla sıkılmış kelepçelerle numune tutucuya monte edin.
Ayrıca numune tutucuya anjiyotensin II'nin mikrometre kalınlığındaki filmi gibi bir referans numunesi monte edin. Ardından, yük kilidi sistemini havalandırmak için Vent yük kilidine basın. Beş dakika bekleyin, ya da atmosfer basıncına ulaşılana kadar.
Yük kilidini açın ve numune tutucuyu monte edin. Yük kilidini kapatın ve yük kilidi odasını negatif beş milibar'a iki kez 10'un altındaki bir basınca pompalayın. Vanayı DINeC odasına açın ve transfer çubuğu yla numune tutucuyu ana manipülatöre aktarın.
Örnek tutucuyu manipülatöre takın. Transfer çubuğunu geri alın ve yük kilidi ile DINeC haznesi arasındaki vanayı kapatın. Gaz silindiri ve meme arasındaki vanayı açın.
Gaz karıştırma sisteminin ana hatlarında sülfür dioksit ve helyum gazı karışımının basıncını 15 bar'a ayarlayın. Manipülatörün konumunu referans örneğinin konumuna ayarlayın. Katyonik kütle spektrumlarını ölçmek için, numune yi ve ızgara önyargısını artı 40 volta ve artı yedi volta ayarlayın.
Darbeli nozulu ve iyon kapanı kütle spektrometresini sürmek için harici fonksiyon jeneratörü iki Hertz'e ayarlayın. Gecikme jeneratörü ile iyon kapanından gelen açık tuzak sinyali ile darbeli meme için tetikleme sinyali arasındaki zaman gecikmesini beş milisaniyeye ayarlayın. Bruker kontrol yazılımında, ana diyalog penceresinin Mod sayfasında, Tetkik modu için Gelişmiş Çözünürlük'ü seçin.
Aralık için Z 50 ile 3000 arasında M yazın, birikim süresi için 0,1 milisaniye yazın, ortalama 10 döngü yazın ve polarite için katyonik kütle spektrumlarının ölçümü için pozitif ve anyonik spektrumların ölçümü için negatif'i seçin. DINeC haznesinde negatif altı milibar için üç kez 10 altında bir basınç ulaşıldı ktan sonra, ölçüm e başlayın. Zamana bağımlı kromatogram sinyalini takip etmek için M üzerinde Z değerini ilgili kütleye ayarlayın.
Denetim yazılımında Çalıştır'a basın. Kaydet düğmesine basarak ölçümleri kaydetmeye başlayın. Test spektrumu, Anjiyotensin II gibi bir referans örneğinden yaklaşık 300 saniye ölçün.
Net tuzak sinyali ile darbeli nozülü tetikleyen sinyal arasındaki zaman gecikmesini ayarlayarak sinyal yoğunluğunu optimize edin. Gecikme en iyi duruma getirilmişken, manipülatörü ölçülecek numunenin konumuna taşıyın. İlgi süresi içinde kütle spektrumları elde etmek için Kayıt düğmesine tıklayın.
Ölçüm tamamlandıktan sonra, referans ölçümü için burada gösterildiği gibi Veri Analizi programındailgili veri kümesini yükleyin. Farenin sağ tuşu ile kromatogramdaki ilgi süresini seçin. Ortalama spektrum ayrı bir pencerede görüntülenir.
Spektrumu tercih edilen bir programda daha fazla işleme için veri dosyası olarak dışa aktarmak için ASCII dosyası olarak Dışa Aktar'ı tıklatın. Anjiyotensin II örneğinden DINeC kütle spektrumu zamanla değişti ve numune yaklaşık 140 santigrat dereceye ısıtıldı. Sıcaklık son değere ulaştığında, Z'nin üzerinde bulunan M'de saldırıya uğrayan protinated molekülün zirvesi 1047'ye denk geldi ve yeni zirveler gözlendi.
İşlem bu üç grafikte özetlenmiştir. M'de Z'nin 932, 1012 ve 1029'a eşit ek zirveleri iyi gözlemlenmiştir. Reaksiyon kinetiğinin analizi, 1029'a eşit olan M'li varlığın, yoğunluk arttıkça ve daha sonra azaldıkça daha küçük parçalara ayrıştırılan bir ara olduğunu göstermektedir.
DINeC'in en önemli özellikleri desorpsiyon sürecinin yumuşak yapısı, verimliliği ve yüksek yüzey hassasiyetidir. Hepsi numune hazırlama ile ilgili düşük gereksinimleri ile bir araya gelir. DiNeC böylece organik kabuk malzemelerinden alt-monolayer bölgesindeki karmaşık yüzey adsorbatlarına kadar çok çeşitli numunelere uygulanabilir.
Her durumda, tam kimyasal bilgi gerçek zamanlı olarak elde edilebilir.
Genel Bakış
Bu çalışma, biyomoleküllerin kütle spektrometri analizi için nötr SO2 kümeleri kullanarak yeni bir desorpsiyon iyonlaşma yöntemi, DINeC'yi sunar. Teknik, peptitler ve proteinlerde kimyasal değişikliklerin gerçek zamanlı gözlemlenmesine, kapsamlı numune hazırlaması gerektirmeden izin verir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Kütle Spektrometresi
- Biyomoleküler Analiz
- Yüzey Kimyası
Arka Plan
- DINeC, yumuşak bir desorpsiyon iyonlaşma yöntemidir.
- Karmaşık yüzey moleküllerinin analizini sağlar.
- Reaksiyonların gerçek zamanlı izlenmesi mümkündür.
- Minimum numune hazırlama gerektirir.
Çalışmanın Amacı
- Kütle spektrometrisi için DINeC'nin etkinliğini göstermek.
- Biyomoleküllerdeki ince kimyasal değişiklikleri analiz etmek.
- Numune hazırlama ve ölçüm için ayrıntılı bir protokol sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Süpersonik genişleme yoluyla SO2 kümelerinin üretimi.
- Küme yüzey çarpışması yoluyla moleküllerin desorpsiyonu.
- İyonize moleküllerin bir iyon tuzağı kütle spektrometerine aktarımı.
- Gerçek zamanlı veri toplama ve kütle spektrumlarının analizi.
Ana Sonuçlar
- Kütle spektrumları tam moleküler tepeleri gösterir.
- Analizin sırasında sıcaklık arttıkça yeni tepeler ortaya çıkar.
- Reaksiyon kinetiği, ara türlerin oluşumunu ortaya koyar.
- DINeC, yüksek yüzey hassasiyeti ve verimliliği gösterir.
Sonuçlar
- DINeC, çeşitli örneklere uygulanabilen çok yönlü bir yöntemdir.
- Gerçek zamanlı kapsamlı kimyasal bilgi sağlar.
- Yöntemin düşük numune hazırlama gereksinimleri, kullanışlılığını artırır.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
DINeC enables soft, matrix-free desorption/ionization of complex biomolecules from surfaces, supporting real-time monitoring of chemical modifications without extensive sample preparation. This capability enhances target validation and mechanistic de-risking in early discovery by providing quantitative, fragmentation-free mass spectra of peptides and proteins at sub-monolayer sensitivity. The method’s compatibility with ion trap MSn allows for detailed structural elucidation, improving predictive confidence in lead identification and preclinical workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by detecting intact molecular ions and subtle chemical changes in peptides and proteins.
- Operational Value: Supports biological de-risking through soft desorption that preserves labile modifications, reducing false negatives in target engagement studies.
- Predictive Value: Provides quantitative surface coverage data down to 0.1% of a monolayer, aiding in portfolio triage based on target abundance and modification status.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers matrix-free, quantitative mass spectra that enable reliable detection of surface-bound analytes without ionization suppression.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility via consistent cluster beam generation and ion trap transfer, minimizing run-to-run variability.
- Scalability: Facilitates platform reuse across diverse sample types, from organic extracts to engineered surfaces, supporting high-throughput screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables real-time observation of surface reactions such as H/D exchange or thermal decomposition, allowing kinetic analysis of biomolecular stability.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical workflows by providing continuous chemical information from surface adsorbates to bulk molecules under identical analytical conditions.
- Risk-Adjusted Decisions: Supports go/no-go criteria by identifying degradation intermediates and reaction pathways that may impact drug candidate stability or efficacy.
Pipeline & Workflow Integration
DINeC integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical assessment, particularly for studies requiring surface-sensitive, real-time monitoring of biomolecular interactions or modifications.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by detecting post-translational modifications and ligand-induced conformational changes on surfaces.
- Screening: Enables assay readiness through reproducible desorption of intact molecules, providing quantitative outputs for hit confirmation and structure-activity relationship mapping.
- Analytics: Delivers high-resolution mass spectra and MSn capabilities that allow teams to compare molecular states, modification sites, and fragmentation patterns across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical validation by monitoring time-dependent chemical changes in peptides and proteins under controlled thermal or chemical stress.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable analytical capability across departments, reducing redundant method development and enabling cross-project data consistency.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by preserving molecular integrity and enabling detection of labile species that may be lost in harsher ionization methods.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability via standardized cluster beam parameters and minimal sample handling, reducing technical variance.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by eliminating matrix requirements and enabling direct analysis of native samples, lowering consumable costs and preparation time.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted advancement decisions through real-time kinetic data on surface reactions, supporting early identification of liabilities.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cluster beam generation, ion trap operation, and surface science principles for optimal setup and data interpretation.
- Needs access to a pulsed nozzle system, sulfur dioxide and helium gas handling infrastructure, and a compatible ion trap mass spectrometer with MSn capabilities.
- Demands cross-team standardization of sample mounting, substrate cleaning, and drying protocols to ensure surface homogeneity and reproducible desorption efficiency.
- Involves adaptation considerations when transitioning from model peptides to complex native samples or heterogeneous surfaces, necessitating surface coverage optimization.
- Includes practical limitations such as the need for ultra-high vacuum conditions and potential cluster fragmentation effects at higher impact energies, which must be controlled to maintain soft desorption.
