Otomatik Enzimbağlantılı İmmünosorbent Assay için Elektrowetting tabanlı Dijital Mikroakışkanplatformu

Tek tek damlacıkların aktivasyonunun otomatikleştirilmesi, laboratuvar ünitesi çalışmasının karmaşık dizilerinin tek bir yongada yer almasına olanak tanır. Dijital mikroakışkan platformumuz virüs patojenlerinin hızlı spesifik alan içi tespitiile uğraşır. Bu yöntem, manyetik immünoprepitasyon ile birlikte EWOD tabanlı dijital mikroakışkanlar kullanılarak spesifik antijenlerin kantitatif tespitine dayanmaktadır.

Bu katkıda yöntem, çeşitli bakteri, spor, virüs ve protein konsantrasyonları içeren örneklere göre değerlendirilir. Bu işlem tam otomatik, sıralı, ölçeklenebilir ve çok yönlüdür. Dizi ve damlacık hacmi belirli bir protokolün gereksinimlerine uyacak şekilde değiştirilebilir.

Antikor bazlı algılamayı tamamen kenara atan dijital mikroakışkan platformu, manyetik boncukların nükleotit dizilerinin yakalanması ve tespiti için spesifik aptamerler taşıdığı aptamer biosensing'e dayalı potansiyel bir uygulamaya neden olabilir. Bu tekniği ilk kez denerken, yüzey aktif madde türünü ve biyokimya ve hidrofobik polimer kaplama seçiminiz ile nasıl etkileştiğini göz önünde bulundurmak önemlidir. Mıknatısı dijital mikroakışkanlardan veya DMF platformundan çıkarıp tezgaha yerleştirerek başlayın.

Krom yukarı bakacak şekilde döner sahneye temiz bir aktüasyon plakası yerleştirin, girintili sahnenin sol üst köşesi ile plaka hizalayın. Plakayı yerine sabitleyecek ve kontak pimleriyle hizalamayı kolaylaştıracak 47 kontak pimi ile paneli kullanarak aktüasyon plakasını üstten kıskaca layın. Daha sonra, aktüasyon ve kapak plakaları arasında kontrollü bir boşluk sağlamak için 0,5 milimetrelik şim ve iki milimetrepmma ayırıcısını döndürme aşamasına plakalayın.

Damlacıkları önerilen yükleme pedlerine yüklemek için, çalışan arabellekten B, A, R ve E'ye dört adet 2,5 mikrolitrelik damlacık yükleyin ve ped başına bir damlacık kullanarak pedleri belirtin. Sonra aliquot 2.5 mikrolitre luminol hidrojen peroksit çözeltisi Üzerine E belirtilen ped. Daha sonra, Aliquot 2.5 mikrolitre Neutravidin HRP biyotinylated ikincil antikor ve mikroboncuklar üzerine F, G konjuge ve ben sırasıyla pedleri ifade.

Son olarak, C'nin üzerine bilinmeyen numunenin 2,5 mikrolitresi ifade pedi. Kapak plakasını yuvarlak girinti alanının yanına teçhizatın yüzeyine yerleştirin ve yanal olarak girintiye ve aktüasyon plakasının üstüne kaydırın. Kapak plakasının üstüne kalıcı mıknatıs koyun ve iki mandal kaydırarak güvenli, sonra 180 derece sahne döndürün ve yüklü damlacıkları hala yerinde olduğundan emin olmak için görsel olarak inceleyin.

Her damlacık için yükleme konumunun yazılımdaki programlanmış aktüasyon sırasıyla eşleşin. Ekranlı fotodedektörü döndürme aşamasının yuvasına yerleştirin ve kabloyu bağlayın. Kapağı DMF platformunun üzerine yerleştirin ve yazılım arabirimini kullanarak program sırasını başlatın.

Damlacık konumu kapasitif algılama ile kaydedilir ve daha sonra kullanıcı arabiriminde gözlemlenebilir. Program sırası, luminol damlacık ayıklanan manyetik boncukları toplamaya hazır olduğunu veya algılama damlacığının algılama bölgesine taşınmaya hazır olduğunu operatöre bildirmek için arabirimde görünen iletileri ister. Her iki durumda da, operatörden onay alınması gerekir.

Kemilüminesans reaksiyonu ile üretilen ışık yoğunluğu fotodedektör tarafından okunur ve gerçek zamanlı olarak kaydedilir. Protokollerin optimizasyonu için görsel modda çalışmak için, yazılım arabirimini kullanarak program sırasını başlatın. Otomatik damlacık aktüasyonu, boncukların manyetik olarak çıkarılması, boncukların yeniden süspansiyonu ve karıştırılması gibi kritik doğrulama adımlarının her biri için çipüzerinde görselleştirilebilir.

İstendiğinde, ekranlı fotodedektör kanaatini dönen sahnenin yarıklarına monte edin. Pimleri sokete takarak fotodedektör ün kablolarını bağlayın. Kapağı DMF platformunun üzerine yerleştirin ve tayın devam ına devam edin.

Damlacıklar kapasitif algılama ile izlenir ve kullanıcı arabiriminde gözlemlenebilir. Ekipmanı temizlemek için DMF platform kapağını açın ve sahneyi 180 derece döndürün. Mıknatıs kılıfını boşaltın ve mıknatısı dönen sahneden çıkarın.

Bir çift cımbızla silikon gofretçıkarın ve distile su ile durulayın. Sonra basınçlı hava ile kurulayın ve gofret saklanabilir ve yeniden bir Petri kabına yerleştirin. Yüzeye dokunmadan sıvı atıkları pedden çıkarmak için bir mikropipet kullanın ve emici kağıt kullanarak sıvıyı aktüasyon plakasından sökerek yüzeyi temizleyin.

Aktüasyon gerilimi etkisini araştırmak için tampondan gelen bir damlacık çeşitli tahrik gerilimlerinde sürüldü ve hareketi kaydedildi. Vrm'lar ile ortalama hız arasında bir korelasyon gösterilmiştir ve belirli bir Vrms değerinden sonra bir hız platosu gözlenmiştir. Vrm'ler için yüksek değerler kullanıldığında aktüasyon plakasının uzun ömürlülüğü azaltıldı.

Çıkarma laboratuarı ünitesi çalışması için, askıda boncukları içeren damlacık karıştırma bölgesinin ortasındaki ayırma alanına sürüldü. Sonra mıknatıs çipe yaklaşmak ve boncukları odaklamak için otomatik olarak etkinleştirildi. Daha sonra, damlacık boncuklar bırakarak, atık ped doğru taşındı.

EWOD çipinin çıkarılması ve karıştırılması ile patojenlerin ardışık olarak 6 ila 10 dakika içinde algılanması ile minyatürleştirilmiş hızlı ve tekrarlanabilir numune işlemesi kolaylaştırıldı. Kuluçka süreleri ve eşlekap konsantrasyonları, teşpiçin en uygun koşulları bulmak için çeşitliydi. 160 saniyelik kuluçka süresi ve mililitre başına iki mikrogram lık birleşer konsantrasyonunen iyi sinyal-gürültü oranına ulaşabilen olduğu bulunmuştur.

İstenilen otomasyon seviyelerine ulaşmak için protokoldeki varyasyonlar getirilebilir. Sekiz aşamalı ELISA Bacillus atrophaeus sporları ve MS2 bakteriyofajgibi farklı antijenleri tespit etmek için kullanıldı. Bu arada, 10 adımlık protokol E.coli ölçmek için kullanıldı.

Uygulanan gerilimlerin, analit ve reaktif konsantrasyonlarının damlacıkların aktivasyonu ve çip üzerinde başarılı manyetik ayırma için en uygun olduğundan emin olmak önemlidir. Kesin ölçüm elde etmek için boncuk bağlama kapasitesi göz önünde bulundurulmalı ve analitlerin seri seyreltmeleri gerekebilir. Antikor türü değiş tokuş ederek, bir sonuç bölümünde bildirilen farklı patojenler tespit edilebilebilir.

Yöntem aynı zamanda biyomarker algılama veya bakım noktası tanı için örneğin uygulanabilir. Daha önce sunulan uygulamalara ek olarak, sistem havapatojeninin alan içi tespiti göz önünde bulundurularak geliştirilmiştir. DMF bu uygulama için ideal bir platformdur, çünkü damlacık hacmi son zamanlarda geliştirdiğimiz diğer örnekleyicinin çıktısı ile eşleşir.