Farelerde İntrathecally Sentezlenmiş Proteinlerin Kantitatif Ölçümü

Bu protokol, BOS protein düzeylerinin kantitatif düzeltmesinde BOS ve kan toplamanın, nörolojik bozuklukların fare modellerinde bir tekal protein sentezini ölçmesine olanak sağlar. Bu prosedür, BOS proteinlerinin patofizyolojik kökeninin ve kan BOS'un bütünlüğünün stabilitesi ve fonksiyonel öneminin değerlendirilebileceği bir temel sağlar. İnterthecal protein sentezi ve bariyer bütünlüğünün analizi diğer hayvan modellerine ve insan çalışmalarına uygulanabilir.

Örneğin, merkezi sinir sistemi hastalıkları kontrol etmek için. Farelerde önemli hacimlerde temiz BOS toplamak teknik olarak zor olabilir, bu nedenle büyük hacimlerde kirlenmemiş numune elde edilene kadar tekniğin pratik edilmesi tavsiye edilir. Prosedürleri gösteren Micheal Linzey, Dartmouth deneysel ve moleküler tıp programı yüksek lisans öğrencisi, bizim yeni immünoloji araştırma grubunda olacaktır.

Retro orbital kanama ile serum toplanması için. 15 gramdan daha büyük bir anestezili farede pedal refleksine yanıt eksikliğini doğruladıktan sonra, baskın olmayan elin başparmak ve işaret parmağıyla kulakların arkasındaki gevşek deriyi tutun ve gözün üzerindeki deriyi geri çekmek için işaret parmağını kullanın. Gözün altındaki deriyi geri çekmek için başparmağı kullanarak, yaklaşık 45 derecelik açıda tutulan Pasteur pipetin ucunu göz küresinin altındaki göz çukurunun altına yerleştirin ve pipeti parmaklar arasında döndürün.

Daha sonra kısa, hafif basınç uygulayın ve kan pipet girmek için izin bırakın. Kan örneği toplandığında, gözü yaralamadan kılcal damarı hafifçe çıkarın ve kanı 1,5 mililitrelik santrifüj tüpüne aktarın. Göz kapağını kapattıktan sonra, daha fazla kanamayı önlemek için gazlı bez ile hafif basınç uygulayın.

Santrifüj ile örnek aşağı dönmeden önce oda sıcaklığında 30 ila 60 dakika pıhtılaşmak için kan bekleyin. Temiz bir pipet tekniği kullanarak, ayrılmış serumu 500 mikrolitrelik yeni bir şişeye alın ve serumu hemen 80 derecede dondurun. Pedal refleks yanıt eksikliği doğruladıktan sonra, anestezili farekafatasının kaudal ucunda hemen beyin omurilik sıvısı toplanması sağlamak için saç yeterince büyük bir alan kaldırmak.

Fareyi steril koşullar altında stereotaksik bir cihaza yatkın bir konuma yerleştirin ve başı kulak çubuklarıyla sabitle. % 30 klorheksidin diasetat ile cerrahi site swab, ve sargı bezi occiput aşağı bir sagittal deri kesi yapmak cisterna magna örten kasları ortaya çıkarmak için. Forceps kullanarak, künt deri altı doku ve kasları incelemek, ve cisterna magna üzerinde dura mater meningeal tabakası ortaya çıkarmak için ayrı kasları tutmak için mikro retraktörler kullanın.

Herhangi bir olası kan kontaminasyonunu gidermek için dokuyu steril PBS ile hafifçe yıkayın ve dura mater kurulekelemek için steril pamuklu bir bez kullanın. İlk delinmenin sarnıktan magna'ya yerlemesi, bol miktarda kontamine olmayan BOS elde etmek için gereklidir. 30 gauge iğne kullanarak, sarnıç magna kapsayan membran hafifçe delinve hızlı ve yavaşça delinme içine küçük bir cam kılcal tüp takın.

BOS beş ila 12 mikrolitre toplandığında, dikkatle membran tüp kaldırmak ve üç mililitreşile şırınga tüp bağlamak için polietilen tüp bir parça kullanın. Toplanan BOS'u buz üzerinde 500 mikrolitrelik etiketli bir tüpe enjekte edin ve kesiyi kapatmak için tek kullanımlık bir iğne ve çeşitli polidioksanon dikişleri kullanın. Herhangi bir kurutulmuş kan veya doku alanı temizleyin ve tam recumbency kadar izleme ile temiz, sıcak bir kafesiçinde fare yerleştirin.

BOS'u santrifüj le toplayın ve peleti görsel olarak inceleyin ve herhangi bir kan kontaminasyon uması için üstte arayın. Daha sonra temiz pipet tekniğini kullanarak, BOS içeren supernate'i yeni bir 200 mikrolitrelik tüpe aktarın ve 80 santigrat derecede anında depolama için Bos'u PBS ile bir veya üç oranında seyreltin. Kardiyak delinme ile serum toplama için, BOS toplama hemen sonra, sadece gösterildiği gibi, supine pozisyonda fare yerleştirin.

Karın derisini %70 alkolle temizler. Göğüs boşluğu açmak için makas kullanın, kalp açığa, ve sol ventrikül içine 3 mililitreşöyyür şırınga bağlı bir 25 gauge iğne takın. Daha sonra şırınga pistonuna hafifçe negatif basınç uygulayın, kan toplandıktan sonra iğneyi geri çekin.

Toplanan kanı 1.5 mililitrelik bir şişeye fırlatmak için pistonu bastırın. Şimdi, santrifüj ile serum ayırmadan önce oda sıcaklığında 30 ila 60 dakika pıhtılaşmak için kan sağlar. Daha sonra, temiz bir pipet tekniği kullanarak, 80 santigrat derece hemen depolama için yeni etiketli 500 mikrolitre lik şişe içine serum aktarın.

Eşleşen serum ve BOS örneklerinde hedef proteinleri ve albumenleri ölçmek için, her bir ilgi proteini için standart bir eğri hazırlamak için referanslı standart proteinler kullanarak standart bir protein nicel testi kullanın. Analizden sonra ham verileri uygun bir yazılım grafik programına aktarın ve her bir ilgi proteini için standart bir eğri oluşturmak için algılama sinyali floresan yoğunluğunu standart protein konsantrasyonlarına göre grafiklendirin. Daha sonra, numuneler ilgi her analiz konsantrasyonları hesaplamak için standart eğrileri kullanın.

Son olarak, Q değerlerini ve intratekal indeksini hesaplamak için albumen ve hedef analit konsantrasyonlarını kullanın. Total IgG gerçek düzeyleri multipl skleroz iki test kemirgen modellerinin BOS önemli ölçüde artar, karşılık gelen yaş eşleşen sham kontrolleri ile karşılaştırıldığında. R-EAE fareler önemli ölçüde gelişmiş albumen katidik değerleri göstermek, Bu farelerde kan beyin bariyerinin artan geçirgenlik gösteren.

TMEV-IDD ve sahte fareler arasında albumen katsayısı nda herhangi bir fark yoktur ve TMEV-IDD farelerde sağlam bir bariyerin önceki bulgularını doğrular. Ayrıca TMEV-IDD hayvanlarda igg indeks değerleri ve dolayısıyla intratekal IgG üretimi gözlenmektedir. Protein indeksi hesaplanması, hem nöroinflamatuar hem de nörodejeneratif hastalıklar için erken tanı, sonuç tahmini ve hastalık dersi takibinde yararlı olan yeni protein biyobelirteçlerinin belirlenmesini kolaylaştırır.