Name: Enteroidlerde Proliferatif ve Ölü Hücrelerin Sayısallaştırılması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: Öğrenin fare ileumundan enteroid izolasyonu ve akış sitometrisi ile hücre proliferasyonu ve sağkalım analizi yöntemini. Bu teknik, ilaç ve sitokin etkilerini incelemek için güvenilir bir yaklaşım sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (31971062, 31900326 ve 31601022), Jiangsu Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (BK20190043, BK20180838), Devlet Anahtar Biyoteknoloji Laboratuvarı Araştırma Fonu tarafından desteklenmiştir. Nanjing Üniversitesi (KF-GN-202004). Çin Jiangsu Yüksek Öğretim Kurumları (19KJB320003), Suzhou City Geçim ve Teknoloji Programı (SYS2019030) ve Jiangsu Eyaleti Koleji Mezunları için Araştırma İnovasyon Programı (KYCX19-1981) Doğa Bilimleri Vakfı . Bu çalışma aynı zamanda Soochow Üniversitesi'nden Tang Scholar tarafından da desteklenmiştir.

Bu protokol Soochow Üniversitesi Cambridge-Suda Genomik Kaynak Merkezi (CAM-SU) Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Bağırsak Organoid İzolasyon ve Kültür
<ol><li>Bağırsak mahzenlerinin ve enteroid kültürün izole edilmesi<ol>
<li>CO2 soluma ile 8 haftalık vahşi fare ötenazi. Ileum yaklaşık 8 cm incelemek için doku forceps ve ince iris makas kullanın.</li>
		<li>Yaklaşık 40 mL buz gibi soğuk Dulbecco'nun fosfat tamponlu salini (DPBS) ile gavaj besleme iğnesi ile bir şırınga kullanarak dışarı floş, sonra makas ile uzunlamasına kesilmiş ve ileum açın.</li>
		<li>Ileum küçük (0,5−1,0 cm) parçalar halinde kesin. 15 mL konik bir tüp içinde steril buz gibi DPBS 5 mL parçaları yerleştirin, sonra buz üzerinde 5 dakika kaya.</li>
		<li>DPBS'yi aspire etmek ve 10 mL soğuk tampon 1 (DPBS'de 2 mM EDTA) ile değiştirmek için bir pipet denetleyicisi kullanın. Buz üzerinde 30 dakika kaya.</li>
		<li>Tampon 1'i aspire etmek için pipet denetleyicisini kullanın ve 10 mL soğuk tampon 2 (DPBS'de 54,9 mM D-sorbitol, 43,4 mM sakaroz) ile değiştirin. Elle 2−3 dk çalkalayın (~80 sallar/dk).</li>
		<li>Salladıktan sonra 20 μL'lik tampon 2 damlacıkalın ve mikroskop altında inceleyin.</li>
		<li>Filtre tampon 2 içeriği 70 μm steril hücreli süzgeç ile, sonra 50 mL konik tüp ile filtretampon toplamak.</li>
		<li>Pipet 20 μL'lik filtrat, şifreleri saymak için slaytüzerine açılır. ~500 crypts/well olduğundan emin olmak için adım 1.1.7'den yeterli miktarda arabellek 2 aktarın.</li>
		<li>4 °C'de 10 dk için 150 x g'de aşağı doğru dön. İplik bittikten sonra, supernatant'ı dikkatlice aspire edin.</li>
		<li>500 crypts başına 50 μL bodrum membran matris (örneğin, Matrigel) crypts askıya, pipet yukarı ve aşağı (kabarcıklar önlemek için dikkatli olmak), sonra bir kuyunun ortasına 50 μL bodrum membran matris / crypt karışımı bir 24 kuyu plaka içinde bir damlacık yerleştirin. 37 °C'de 30 dakika kuluçka ya da bazal membran matrisini polimerize edin.</li>
		<li>30 dk polimerizasyondan sonra, 600 μL minigut media (gelişmiş Dulbecco'nun modifiye kartal ortamı [DMEM]/F12, 2 mM L-alanin-L-glutamin, kalem/strep [100 adet/mL], 10 mM Hepes, N2 takviyesi [1:100], B27 ek [1:50] epidermal büyüme faktörü ile [EGF; 50 ng / mL], Noggin [100 ng / mL], R-spondin [500 ng /mL], ve Y27632 [10 μM]) her kuyuya plaka dönmek, sonra 37 ° C incubartorr. Her gün mikroskop altında gözlemleyin ve her 2−3 günde bir ortamı değiştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Enteroid geçiş NOT: Uzun kültürler için enteroidler yaklaşık her hafta bölünmelidir.<ol>
<li>Enteroidleri geçiş için doku kültür plakasını buzüzerine yerleştirin. Ortamı aspire edin ve her kuyuya 1 mL soğuk DPBS ekleyin. Katı bir bodrum membran matris parçaları kalana kadar pipet yukarı ve aşağı bir P1000 ucu kullanın.</li>
		<li>1 mL'lik insülin şırıngasından (27 G) bir kez yukarı ve aşağı bir şekilde 15 mL konik tüpe geçirin. 4 °C'de 150 x g'de 5 dk aşağı doğru dön.</li>
		<li>DPBS kaldırmak için pipet kullanın. 50 μL'lik bazal membran matris/kuyuda resuspend.</li>
		<li>Taban membran matrisinin polimerize olmasını sağlamak için plakayı 30 dakika boyunca 37 °C'lik bir kuluçka makinesine yerleştirin. Her kuyuyu 600 μL ENR ortam (minigut media, 50 ng/mL EGF, 100 ng/mL Noggin, 500 ng/mL R-spondin) ile yerleştirin ve tabağı kuvöze geri döndürün.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Enteroidlerde EdU-pozitif Hücrelerin Akış Sitometri Analizi
NOT: Şekil 1 enteroidlerde EdU-pozitif hücrelerin akış sitometri analizi için iş akışını gösterir.
<ol><li>EdU ile enteroidlerin kuluçka<ol>
<li>5-7 gün boyunca adım 1.2.4 gelen enteroids büyümek. Geçit 1:2 bir bölme oranı yeni bir 24 kuyu plaka içine girer. Her kuyuya 600 μL ENR orta ekleyin. 37 °C'lik bir kuluçka makinesinde 4−5 gün kuluçkaya yayılın.</li>
		<li>Kontrol grubunu (işlenmemiş enteroidler) ve deney grubunu (5 ng/mL interlökin 22 [IL-22] ile tedavi edilen enteroidler) ayarlayın. Her grup için en az üç çoğaltma hazırlayın.</li>
		<li>50 μM konsantrasyonu ile EdU ortamı hazırlamak için ENR ortamına EdU ekleyin. Her kuyuya 600°L EdU orta ekleyin ve 37 °C'lik bir kuluçka makinesinde 2 saat kuluçkaya yatırın. Arka plan çıkarma için olumsuz bir kontrol olarak EdU tedavisi olmadan enteroids bir kuyu ayarlayın.</li>
	</ol></li>
	<li>İnatçı ların bazal membran matrisinden hasadı<ol>
<li>EdU orta aspire ve DPBS ile 1x yıkamak için bir pipet denetleyicisi kullanın. 1 mL DPBS ekleyin.</li>
		<li>Katı bir bodrum membran matris parçaları kalana kadar P1000 pipet ucu ve pipet yukarı ve aşağı kullanın. 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve 300 x g'de 5 dk. Supernatant'ı atın.</li>
		<li>Hücre ayrıştırma enzimlerinin 500 μL'sini(Malzeme Tablosu)ekleyin ve 37 °C'de 15 dakika kuluçkaya yatırın. Tek hücrelere enteroids kırmak için Yukarı ve aşağı P200 pipet ucu ve pipet kullanın.</li>
		<li>%10 fetal sığır serumu (FBS) içeren 3 mL DMEM ortamı ve p1000 pipet ucu ile tekrar tekrar pipet ekleyin.</li>
		<li>5 dk için 300 x g aşağı spin ve supernatant orta aspire. 1 mL DPBS ile hücreleri yeniden askıya alın.</li>
	</ol></li>
	<li>Hücrelerin fiksasyonu ve permeabilizasyonu<ol>
<li>Hücre süspansiyonuna 1,5 mL'lik bir tüp aktarın, 5 dk boyunca 300 x g'de aşağı doğru döndürün ve süpernatant'ı atın.</li>
		<li>1 mL%4 paraformaldehit (PFA) ile hücreleri yeniden askıya alın, oda sıcaklığında 15 dakika (RT) için düzeltin ve 5 dk. bir pipet ucu ile supernatant aspire 300 x g aşağı spin, DPBS ile 1x yıkayın ve supernatant kaldırmak için aşağı spin.</li>
		<li>1 mL%0.5 noniyonik yüzey aktif maddeli hücreleri resuspend. RT'de 10 dakika kuluçka.</li>
		<li>5 dk için 300 x g aşağı spin ve supernatant aspire. DPBS ile 1x yıkayın ve supernatant kaldırmak için aşağı spin.</li>
	</ol></li>
	<li>EdU tespiti<ol>
<li>Önceden her bileşen için stok çözümleri hazırlayın: 1) Alexa Fluor azide çalışma çözümü, 2) 1x EdU reaksiyon tampon çalışma çözümü, ve 3) EdU tampon katkı 10x stok çözeltisi.</li>
		<li>10x çözeltisini deiyonize suda 1:10 seyrelterek 1x EdU tampon katkı maddesi hazırlayın. Bu çözümü taze hazırlayın.</li>
		<li>Tablo 1'egöre reaksiyon kokteyli hazırlayın. NOT: Malzemeyi tabloda listelenen sıraya ekleyin. Reaksiyon kokteylini hazırlıktan sonraki 15 dakika içinde kullanın.</li>
		<li>Her 1,5 mL tüpe 100 μL reaksiyon kokteyli ekleyin. Hücreleri yeniden askıya alın, ışıktan koruyun, RT'de 30 dakika kuluçkaya yatın.</li>
		<li>5 dk için 300 x g santrifüj ve pipet ucu ile reaksiyon çözeltisi hafifçe aspire.</li>
		<li>RT. Centrifuge 5 dakika için 300 x g 1x yıkamak için her tüp% 0.5 niyonik yüzey aktif penetrant ekleyin, yavaşça pipet ucu ile supernatant aspire, ve DPBS 1 mL hücreleri yeniden askıya.</li>
	</ol></li>
	<li>Akış sitometrisi ile hücrelerin analizi<ol>
<li>Resuspended hücreleri 40 μm süzgeçle filtreleyin, ardından filtrelenmiş hücreleri 15 mL konik tüple toplayın. FACS makine de en kısa sürede algılama gerçekleştirin. NOT: Koşullar sınırlı ise, hücre lekeli numuneler 4 °C'de karanlıkta saklanmalı ve 3 gün içinde akış testi yapılmalıdır.</li>
		<li>Akış sitometri sitometrisi analizi için uygun kanalı (EdU kitindeki Alexa Fluor azide türüne göre; burada, kırmızı kanal) ve voltajı (burada ~ 150-350 V) seçin.</li>
		<li>Gating stratejisi<ol>
<li>Bir FSC-A (x ekseni) ile SSC-A (y ekseni) psödorenk çizimi çizin ve gerilimi ayarlayarak hücrelerin çoğunu nokta haritasının görünür aralığına dağıtın. Hücre popülasyonu (R1) seçin ve sol alt köşedeki hücre enkazını hariç tut.</li>
			<li>R1 hücre popülasyonundan, bir FSC-A (x-ekseni) ve. FSC-H (y ekseni) psödorenk çizimve hücre kümelerini dışlamak için tek hücre (R2) seçmek için kapıyı ayarlayın.</li>
			<li>R2 hücre popülasyonundan floresan yoğunluğunu (x-ekseni) vs. hücre numarası (y ekseni) çizimi ve negatif denetimi kullanarak geçidi ayarlayın. Floresan sinyalin bölgesi pozitif hücre bölgesidir (R3). EdU-pozitif hücrelerin (R3) deney ve kontrol grupları arasındaki oranını karşılaştırın.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>3. Enteroidlerde PI-pozitif Hücrelerin Akış Sitometri Analizi
NOT: Şekil 2 enteroidlerde PI-pozitif hücrelerin akış sitometri analizi için iş akışını göstermektedir.
<ol><li>PI ile enteroid hücrelerin kuluçka<ol>
<li>5-7 gün boyunca adım 1.2.4 gelen enteroids büyümek. Geçit 1:2 bir bölme oranı yeni bir 24 kuyu plaka içine girer. Her kuyuya 600 μL ENR orta ekleyin. 37 °C'lik bir kuluçka makinesinde 4−5 gün kuluçkaya yayılın.</li>
		<li>Her grup için en az üç çoğaltma kullanarak kontrol grubunu (işlenmemiş) ve deney grubunu (IL-22 tedavi) ayarlayın.</li>
		<li>3 μM konsantrasyonu ile PI ortamı hazırlamak için ENR ortamına PI ekleyin.</li>
		<li>Her kuyuya 600°L PI orta ekleyin ve 37 °C'lik bir kuluçka makinesinde 30 dakika kuluçkaya yatırın. Arka plan çıkarma için olumsuz bir kontrol olarak PI tedavisi olmadan enteroidler bir kuyu ayarlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>2.2.1−2.2.5 adımlarını takiben bazal membran matrisinden enteroidler hasat.</li>
	<li>Akış sitometrisi ile hücrelerin analizi<ol>
<li>Resuspended hücreleri 40 μm süzgeçle filtreleyin ve filtrelenmiş hücreleri 15 mL konik tüple toplayın.</li>
		<li>FACS makine de en kısa sürede algılama gerçekleştirin. NOT: Koşullar sınırlı ise, hücre lekeli numuneler 4 °C'de karanlıkta saklanmalı ve 3 gün içinde akış testi yapılmalıdır.</li>
		<li>Akış sitometri analizi için uygun kanalı (burada, kırmızı kanal) ve gerilimi (burada~ 150-350 V) seçin.</li>
		<li>Bölüm 2.5.3'te açıklandığı gibi aynı gating stratejisini kullanın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Odenwald, M. A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intestinal+epithelial+barrier%3A+a+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target.</a> Nature reviews. Gastroenterology & Hepatology. 14 (1), 9-21 (2017).</li>
<li>Buckley, A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Biology+of+Tight+Junction+Barrier+Regulation+and+Mucosal+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell Biology of Tight Junction Barrier Regulation and Mucosal Disease.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (1), (2018).</li>
<li>Gehart, H., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tales+from+the+crypt%3A+new+insights+into+intestinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Tales from the crypt: new insights into intestinal stem cells.</a> Nature reviews. Gastroenterology & Hepatology. 16 (1), 19-34 (2019).</li>
<li>Vancamelbeke, M., Vermeire, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intestinal+barrier%3A+a+fundamental+role+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">The intestinal barrier: a fundamental role in health and disease.</a> Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 11 (9), 821-834 (2017).</li>
<li>Garcia-Carbonell, R., Yao, S. J., Das, S., Guma, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+Intestinal+Epithelial+Cell+RIPK+Pathways+Promotes+Chronic+Inflammation+in+the+IBD+Gut%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of Intestinal Epithelial Cell RIPK Pathways Promotes Chronic Inflammation in the IBD Gut.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1094(2019).</li>
<li>Li, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+and+In+Vivo+Approaches+to+Determine+Intestinal+Epithelial+Cell+Permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e57032(2018).</li>
<li>Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+mucosal+barrier+function+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Intestinal mucosal barrier function in health and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 9 (11), 799-809 (2009).</li>
<li>Graham, W. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+MLCK1+diversion+reverses+barrier+loss+to+restore+mucosal+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Intracellular MLCK1 diversion reverses barrier loss to restore mucosal homeostasis.</a> Nature Medicine. 25 (4), 690-700 (2019).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell%3A+mechanism+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).</li>
<li>Friedrich, M., Pohin, M., Powrie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+Networks+in+the+Pathophysiology+of+Inflammatory+Bowel+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Cytokine Networks in the Pathophysiology of Inflammatory Bowel Disease.</a> Immunity. 50 (4), 992-1006 (2019).</li>
<li>Zha, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+22+Expands+Transit-Amplifying+Cells+While+Depleting+Lgr5+Stem+Cells+via+Inhibition+of+Wnt+and+Notch+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Interleukin 22 Expands Transit-Amplifying Cells While Depleting Lgr5 Stem Cells via Inhibition of Wnt and Notch Signaling.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 7 (2), 255-274 (2019).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu protokol, enteroidlerin in vitro kültürü için gerekli adımları ve akış sitometrisi ile enteroidlerde EdU ve PI-pozitif hücrelerin sayısallaştırılmasını ayrıntılarıyla anlatır. Bu stratejinin çeşitli avantajları vardır. İlk olarak, EdU etiketleme enteroidler çoğalan hücreleri algılamak için kullanılır. Geleneksel BrdU çıktısı ile karşılaştırıldığında, EdU etiketleme yöntemi daha hızlı, daha hassas ve daha doğrudur. EdU, hücre bölünmesi sırasında DNA sentezinde timinin yerini alan timin (T) çok benzer. BrdU antikor ile ...

Bağırsak epitel hücrelerinin temel bir işlevi patojenik bakteri ve toksinler 1 gibi luminal içeriğin girişini korumaktır1 ,2. Böyle bir işlevi gerçekleştirmek için, bağırsak kök hücreleri sürekli çoğalır ve epitel hücrelerinin çeşitli farklılaştırmak, enterositler ve salgı hücreleri de dahil olmak üzere, hangi sıkı bağlantılar oluşturarak bir bariyer oluşturan3. Bağırsak epitel hücrelerinin hızlı yenilenmesi hücre çoğalması sıkı koordinasyon gerektirir, hücre farklılaşması, ve hücre ölümü4,5. Azaltılmış hücre çoğalması veya aşırı hücre ölümü epitel hasarına ve tehlikeye bariyer fonksiyonu1yol açar,6. Bağırsak bariyerinin disfonksiyonu inflamatuar barsak hastalıkları ile ilişkili olmuştur7,8.
Bağırsak mahzenlerini kültüre kazandıracak bir yöntem daha önce geliştirilmiştir. Bu tekniği kullanarak, izole fare crypts bağırsak organoidler (enteroidler), yapıları gibi crypt-villus ve tüm bağırsak epitel hücre soy9içeren içine büyür9 ,10. 5-Ethynyl-2'-deoksiürin (EdU), hücre çoğalması sırasında replikasyon alabilen DNA'da timin (T) yerine geçen bir timin analogudur. Proliferatif hücreler EdU boyama ile hızlı ve doğru bir şekilde etiketlenebilir. Propidium iyodür (PI), çift iplikçikli DNA'ya yerleştirildiğinde kırmızı floresan salan ethidyum bromür analogudur. PI özellikle ölü hücreleri algılar, çünkü sadece hasarlı hücre zarından geçer.
Bu protokolde, önce minürikten mahzenlerin nasıl izole edilebildiğini sonra onları in vitro enteroid olarak kültürlediğimizi anlatıyoruz. Daha sonra EdU ve PI birleşme ve akış sitometrisi tarafından enteroidlerde proliferatif ve ölü hücrelerin nasıl analiz edilebildiğini açıklarız.

<table><tbody><tr><td>15 ml santrifüj tüpü</td><td>Corning</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>22 G gavaj iğnesi</td><td>VWR</td><td>20068-608</td><td></td></tr><tr><td>24 oyuklu plaka</td><td>Nunc</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>40 mm steril hücre süzgeci</td><td>BD</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>50 ml santrifüj tüpü</td><td>Corning</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>70 mm steril hücre süzgeci</td><td>BD</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Gelişmiş DMEM/F-12</td><td>GIBCO</td><td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>Attune NxT Akustik Odaklama Sitometresi</td><td>Invitrogen</td><td>A24863</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Takviyesi</td> DPBS Tamponunda <td>GIBCO</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Tamponu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> 1 2 mM EDTA DPBS C57/B6 <td>farelerde 54.9 mM D-sorbitol, 43.4 mM sükroz</td></tr><tr><td></td><td>Nanjing Üniversitesi Nanjing Biyomedikal Araştırma Enstitüsü Hücre</td> ayrışma enzimleri (TrypLE)Yaşam teknolojileri 12605-010 Santrifüj Eppendorf 5424 Santrifüj Eppendorf 5424R Santrifüj Eppendorf 5810R Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Görüntüleme Kiti Ömrü <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> teknolojiler</td><td>C10639</td><td></td></tr><tr><td>CO2 inkübatörü</td><td>Panasonic</td><td>MCO-18AC</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>GIBCO</td><td></td><td></td></tr> 14190144 <tr><td>D-sorbitol</td><td>BBI</td><td>SB0491</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>BBI</td><td>EB0185</td><td></td></tr><tr><td>ENR ortamı</td><td></td><td></td><td>Minigut ortamı, 50 ng/ml EGF, 100 ng/ml Noggin, 500 ng/ml R-spondin</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>İnce İris Makas</td><td>Tansoole</td><td>2037454</td><td></td></tr><tr><td>Floresan mikroskobu</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Takviyesi</td><td>GIBCO</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Keçi Serumu</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>16210-064</td><td></td></tr><tr><td>HDMEM</td><td>Hidroklon</td><td>SH30243.01B</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Minigut media</td><td></td><td></td><td>Gelişmiş DMEM/F12, 2 mM Glutamax, Penn/Strep (100 birim/ml), 10 mM Hepes, N2 takviyesi (1:100), B27 takviyesi (1:50)</td></tr><tr><td>N2 takviyesi</td><td>R& D</td><td>AR009</td><td></td></tr><tr><td>Noniyonik yüzey aktif madde (Triton X)</td><td>BBI</td><td>TB0198-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Çalıştırma Makası (12,5 cm)</td><td>Tansoole</td><td>2025785</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit (PFA)</td><td>sigma</td><td>158127-500g</td><td></td></tr><tr><td>Penn/Strep</td><td>Invitrogen</td><td>15140-148</td><td></td></tr><tr><td>Faz kontrast mikroskobu</td><td>Nikon</td><td>TS1000</td><td></td></tr><tr><td>Propidyum iyodür</td><td>Sigma</td><td>P4170-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant EGF</td><td>PeproTech</td><td>315-09</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant Fare Noggin</td><td>PeproTech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant Fare R-Spondin 1</td><td>R& D</td><td>3474-RS-050</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant Murin IL-22</td><td>PeproTech</td><td>210-22-10</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>BBI</td><td>SB0498</td><td></td></tr><tr><td>Doku Forseps</td><td>Tansool</td><td>2026704</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 2HC1</td><td>Selleck</td><td>S1049</td><td></td></tr></tbody></table>

enteroidlerde proliferatif ve Ölü hücrelerin sayısallaştırılması

Quantification of Proliferative and Dead Cells in Enteroids

Bağırsak epiteli, patojenik mikrobiyota ve toksinler gibi luminal içeriğin vücudun geri kalanına girmesini engelleyen bir bariyer görevi görür. Epitel bariyer fonksiyonu bağırsak epitel hücrelerinin bütünlüğünü gerektirir. Epitel hücre çoğalması bir bariyer oluşturan hücrelerin sürekli bir tabaka korurken, epitel hasarı bariyer disfonksiyon yol açar. Sonuç olarak, luminal içeriği sınırsız bir yol ile bağırsak bariyerini geçebilirsiniz. Bağırsak bariyerinin disfonksiyonu inflamatuar barsak hastalığı gibi birçok bağırsak hastalığı ile ilişkili olmuştur. İzole fare bağırsak mahzenleri kültürlenebilir ve bağırsak organoidleri veya "enteroidler" olarak adlandırılan crypt-villus benzeri yapılar olarak korunabilir. Enteroidler in vitro bağırsak epitel hücrelerinin proliferasyonu ve hücre ölümünü incelemek için idealdir. Bu protokolde, kültürlü enteroidlerde proliferatif ve ölü hücrelerin sayısını ölçmek için basit bir yöntem açıklıyoruz. 5-ethynyl-2'-deoksiürin (EdU) ve propidium iyodür enteroidlerde çoğalan ve ölü hücreleri etiketlemek için kullanılır ve çoğalan ve ölü hücrelerin oranı daha sonra akış sitometrisi tarafından analiz edilir. Bu bağırsak epitel hücre proliferasyonu ve hücre sağkalım üzerinde ilaç tedavisinin etkilerini test etmek için yararlı bir araçtır.

İnce bağırsak mezarları izole edildi ve bazal membran matrisinde enteroid olarak kültürlendi. Enteroidler izolasyondan 2 gün sonra tomurcuk oluşturmaya başladılar. 6. günde, enteroidlerin lümeninde çok sayıda enkaz (ölü hücre) olan birçok tomurcukları vardı. Enteroidler bu aşamada geçilmeye hazırdı (Şekil 3).
Çok sayıda çalışma inflamatuar sitokinler bağırsak epitel homeostaz bakımı için gerekli olduğunu göstermiştir. İnflamatuar sitokinlerin anormal ekspresyonu i...

Sunulan protokol, kültürlü fare enteroidlerinde çoğalan ve ölü hücrelerin sayısını ölçmek için akış sitometrisini kullanır. Bu yöntem, ilaç tedavisinin organoid proliferasyon ve sağkalım üzerindeki etkilerini değerlendirmek için yararlıdır.

Enteroidlerde Proliferatif ve Ölü Hücrelerin Sayısallaştırılması

The intestinal epithelium acts as a barrier that prevents luminal contents, such as pathogenic microbiota and toxins, from entering the rest of the body. ...

Bu protokol, hücre çoğalmasını ve enteroidlerde sağkalımı araştırmanın yanı sıra bir kültürde enteroid izolasyon için de yararlıdır. Bilim adamları kültür enteroidler için bu tekniği uygulayabilirsiniz ve in vitro bağırsak epitel hücreleri üzerinde ilaç ve inflamatuar sitokinlerin etkisini incelemek için. Bu tekniğin etkileri inflamatuar barsak hastalığının su tedavisine kadar uzanır.Biz bazı terapötik sitokinler bulmak için bu yöntemi uygulayın. Bu yöntem bağırsak epitel proliferasyonu ve sağkalım içine anlayışlar sağlar;ayrıca organoidler kullanılabilir, bağırsak dışındaki dokular etrafında kültürlü. Bağırsak mahzenlerini izole etmek ve enteroid kültürü gerçekleştirmek için doku kasları kullanın ve ötanazi edilmiş sekiz haftalık vahşi bir fareden yaklaşık sekiz santimetre ileum çıkarmak için iris makasını bulun.Buz soğuk Dulbecco Fosfat-Tamponlu Salin yaklaşık 40 mililitre ile ileum floş için bir gavaj besleme iğnesi ile bir şırınga kullanın, sonra makas ile uzunlamasına kesilmiş ve ileum açın. Ileum küçük parçalar halinde kesin ve 15 mililitrekonik tüp içinde steril buz gibi DPBS beş mililitre içine yerleştirin. Sonra buz üzerinde beş dakika boyunca örnek kaya.DPBS aspire etmek

quantification-of-proliferative-and-dead-cells-in-enteroids

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

İnce bağırsak kriptlerinden insan enteroidlerini ve hem cerrahi dokudan hem de biyopsilerden toplanan kolon kriptlerinden kolonoidleri oluşturmak için bir yöntem tarif ediyoruz. Bu metodolojik makalede, insan enteroidlerinin ve kolonoidlerinin başarılı bir şekilde büyümesi ve sürdürülmesi için gerekli olan kültür modalitelerini sunuyoruz.

Tüm Doku ve Biyopsi İnsan Epitelyal Enteroids ve Colonoids kurulması

Enteroids insan hastalık insan yeni bir model olarak ortaya çıkıyor. Protokol insan nekrotizan enterokolit yenidoğan dokusundan üretilen enteroids tedavisinde lipopolysaccharide (LPS) kullanarak bir enteroid modeli benzetimi açıklar. Toplanan enteroids benzer-e doğru o insan nekrotizan enterokolit görülen iltihabi yapılan değişiklikleri göstermektedir.

Bir roman insan epitel Enteroid nekrotizan enterokolit modeli

Bu protokol, ilacın belirlenmesi için, hastanın türetildiği kürlerin oluşumunu, proliferasyonun ölçülmesi, sitotoksisite testi, akış sitometri, immünofluoresesans boyama ve konfoksel görüntüleme gibi aşağı akış analizini açıklar. anti-neoplastik terapötik olarak adayların potansiyeli. Bu protokol her hasta ve hastalığın aşaması için spesifik ilaçların tanımlanması ile hassas ilacı destekler.

Fizyolojik hasta, kanser kök hücrelerini hedef alan anti-neoplastik Ilaç taraması için 3B kürler türetilmiştir

Bu protokol, apikal yüzeye erişime izin veren, ters polariteye sahip ince bağırsak enteroidlerini kullanan apikal-dışarı nekrotizan enterokolit (NEC) bir çanak içi modelini tanımlar. NEC ile ilişkili epitel bozulmasını tespit etmek için bir immünofloresan boyama protokolü ve NEC-in-a-dish protokolüne tabi tutulan apikal-out enteroidlerin yaşayabilirliğini belirlemek için bir yöntem sunuyoruz.

İn Vitro Nekrotizan Enterokolitin Apikal-Out Enteroid Modeli

Bu protokol, fetal bağırsak dokusundan üç boyutlu bir bağırsak modeli olan enteroidlerin kurulmasını detaylandırır. Model karakterizasyonunda epitel biyobelirteçlerinin immünofloresan görüntülemesi kullanıldı. Bakteriyel bir endotoksin olan lipopolisakkaritlerin apikal maruziyeti, mikroenjeksiyon tekniği kullanılarak, floresan dekstranın sızıntısı ile ölçülen doza bağımlı bir şekilde epitel geçirgenliğine neden olmuştur.

Fetal Doku Kaynaklı Enteroidlerde Epitel Geçirgenliğinin Test Edilmesi

Bu protokol, hastalık patogenezine yönelik mekanik çalışmalar için kullanılabilen bir in vitro nekrotizan enterokolit (NEC) modelini açıklar. İnsan yenidoğan bağırsağından, endotel hücrelerinden ve şiddetli NEC'li bir yenidoğanın bağırsak mikrobiyomundan türetilen bağırsak enteroidleri ile tohumlanmış bir mikroakışkan çipe sahiptir.

İnsan Yenidoğan Bağırsak Enteroidlerini ve Disbiyotik Mikrobiyomu İçeren Nekrotizan Enterokolitin Mikroakışkan Modeli

Enteroidler, doku fizyolojisi ve patofizyolojisi, ilaç geliştirme ve rejeneratif tıp çalışmaları için yeni bir model olarak ortaya çıkmaktadır. Burada, ilgili doku hücresi tipleriyle ko-kültüre izin veren bir sığır birincil hücre 2D enteroid türevi kültür sistemini tanımlıyoruz. Bu model, gastrointestinal araştırma modellemesi için translasyonel bir avantaj sunar.

Translasyonel Biyomedikal Araştırma Uygulamaları için Sığır Primer Enteroid Türevli İki Boyutlu Tek Katmanlı Kültür Sisteminin Oluşturulması

Bu protokol, sitokinler gibi sitotoksik pertürbagenlere yanıt olarak insan kolonik organoidlerinde hücre ölümünü araştırmak ve ölçmek için basit ve uygun maliyetli bir yöntemi tanımlar. Yaklaşım, sitotoksik uyaranlara tek organoid tepkileri ölçmek için bir floresan hücre ölüm boyası (SYTOX Yeşil Nükleik Asit Boyası), canlı floresan mikroskobu ve açık kaynaklı görüntü analiz yazılımı kullanır.

Canlı Floresan Mikroskobu Kullanılarak İnsan Kolonik Organoidlerinde Sitokin ile İndüklenen Hücre Ölümünün Miktar Tayini

Bu çalışma, ince ve kalın bağırsaklardan türetilen 2D tek katmanlı domuz organoidleri oluşturmak için bir protokolün ana hatlarını çizmektedir. Bu tek tabakaların büyümesi, sağlam epitel bütünlüğünü gösteren artan TEER değerleri ile işaretlenir. Ek olarak, bu tek tabakalar, forskolin uygulamasını takiben Ussing odası deneylerinde fizyolojik salgı tepkileri sergiler.

Doğal Bağırsağın Fizyolojik Özelliklerini Yansıtan İki Boyutlu Domuz Bağırsak Organoidleri

Burada, standart matris gömülü organoid kültürlerinden apikal bağırsak organoidleri oluşturmak için bir protokol açıklıyoruz. Ayrıca, EdU'nun daha sonra aktif olarak çoğalan hücrelere dahil edilmesini ve EdU-pozitif hücrelerin yarı otomatik olarak nicelleştirilmesini ana hatlarıyla belirtir.

Apikal Out İntestinal Organoidlerin Oluşumu ve EdU-Etiketleme Kullanılarak Organoid Proliferasyon Hızının Değerlendirilmesi

Öğrenin fare ileumundan enteroid izolasyonu ve akış sitometrisi ile hücre proliferasyonu ve sağkalım analizi yöntemini. Bu teknik, ilaç ve sitokin etkilerini incelemek için güvenilir bir yaklaşım sunar.

Enteroidlerde Proliferatif ve Ölü Hücrelerin Sayısallaştırılması

Daha fazla video keşfet