Name: İntravital Mikroskopi Ile Değerlendirilen Farelerde Cremaster Kasın Lökosit İnfiltrasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Öğrenin farelerde kremaster kasında intravital mikroskopi ile lökosit-endotel etkileşimlerini görselleştirme yöntemini. Bu teknik enflamasyon ve sepsis modellerinde lökosit infiltrasyonunu in vivo izlemek için güçlü bir araçtır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Almanya Federal Eğitim ve Araştırma Bakanlığı (BMBF) 01GL1746E tarafından PRIMAL Konsorsiyumu'nun bir parçası olarak desteklenmiştir. Yazarlar britta Heckmann ve Silvia Pezer usta teknik yardım için kabul.

Hayvanlar IBF (Interfakultäre Biomedizinische Forschungseinrichtung), Heidelberg'de kontrollü ve spesifik patojensiz koşullar altında barındırıldı. Burada açıklanan tüm prosedürler yerel IRB ve Regierungspraesidium Karlsruhe, Baden-Wuerttemberg, Almanya tarafından onaylanmıştır.
1. Anestezi uygulaması
<ol><li>125 mg/kg ketamin ve 12.5 mg/kg ksilazin intraperitoneal (i.p.) bolus enjeksiyonu ile fareyi anestezi edin.</li>
	<li>Farenin vücut Sıcaklığını korumak için fareyi ısıtma yastığına dorsal recumbent pozisyonunda yerleştirin ve düzeltin (36.5-38 °C). Ön dişlerin etrafında basit bir döngü yüzevetmek ve sütürün birleştirme uçlarını ısıtma yastığına bantlamak için emilmeyen bir steril dikiş (6/0) kullanın. Bu fiksasyon, solunumda rahatsızlık lanmaması için ağzı açık tutmayı amaçlar.</li>
	<li>Interdigital parmak ucutu ile uygun anestezi derinliği için fareyi kontrol edin (çekilme görülmemelidir).</li>
	<li>Yeterli anesteziye ulaşıldıktan sonra cerrahi hazırlık için devam edin. Devam eden deney boyunca anesteziyi tekrar tekrar onaylayın her 30 dk. Gerekirse yukarıda açıklandığı gibi ilaçları yeniden uygulayın.</li>
	<li>Fizyolojik tuz çözeltisini (PSS, bileşim: 132 mmol/L NaCl, 4,7 mmol/L KCl, 1,2 mmol/L MgS04, 2,0 mmol/L CaCl2, 18 mmol/L NaHCO3)%5 CO2/95% N2 ile 15 dakika boyunca dengeleyin. Deney boyunca PSS'yi %5 CO2/95 N2 ile sürekli kabarcıklayın ve 37 °C'de tutun.</li>
</ol>2. Trakea ve karotis arterin cerrahi hazırlanması (isteğe bağlı)
<ol><li>Orta hattacıcılarla deriyi hafifçe çekerek boyun bölgesinden deriyi inceleyin. Cerrahi hazırlık için yeterli alan vermek için çapı 1-2 cm dairesel bir kesim uygulamak için makas kullanın.</li>
	<li>Dikkatle cımbız kullanarak çevreleyen kas, yağ ve bağ dokuları incelemek.</li>
	<li>Küçük cerrahi makas kullanarak trakeaiçine enine bir kesim (~ 1,3 mm) yapın ve üst hava yollarını güvenli hale getirmek için trakeanın kaudal ucunda ki polietilen tüpü (I.D x O.D. 0.034 x 0.050") takın.</li>
	<li>Trakeada bulunan tüpü tek bir dairesel düğüm sütürle (6/0 USP) sabitler.</li>
	<li>Trakeanın sağ tarafı boyunca karotis arteri bulun ve karotis arter duvarından çevredeki dokuyu inceleyin. Alternatif olarak, juguler veya aynı zamanda kuyruk damarı i.v. erişim için kullanılabilir. Yakından bulunduğu gibi vagal sinir yaralanmasını önlemek için deneyin.</li>
	<li>Karotis arterin altında iki parça sütür (6/0) geçirin. İlk kraniyal sütür proksimal yerleştirin, karotis arterlerin bifurkasyon yakın ve kalıcı olarak kravat. İkinci dikiş ilkinden yaklaşık 5-8 mm distal bulunacak ve daha sonra karotis arter tüp güvenli kullanılacaktır. Henüz bağlama.</li>
	<li>Uç kısmı tuzlu (%0,9 NaCl) dolu 1 mL şırınga iğnesine bükerek 30 cm uzunluğunda polietilen bir tüp (I.D x O.D. 0.011" x 0.024") hazırlayın. Titiz yıkama hazırlık sırasında hava embolizasyonu önlemek için önemlidir.</li>
	<li>İkinci sütürşah arter distal kelepçe için 7 mm damar klipsi kullanın.</li>
	<li>Karotis arterde küçük bir enine kesim (~0,5 mm) yapın ve steril polietilen tüpü tanıtılın. Daha önce hazırlanan ikinci sütür kullanarak arter tüp güvenli.</li>
	<li>Damar klibini çıkarın ve polietilen tüpe bağlı şırıngaya hafifçe biraz gerginlik uygulayın. Bu karotis kateter artık ilaç vermek veya gerekirse kan örneği almak için kullanılabilir, hatta ilgili cihazlar ile kan basıncı veya nabız oranının izlenmesi mümkündür.</li>
</ol>3. Cremaster kas cerrahi hazırlık
<ol><li>Isıtma yastığıüzerindeki fareyi (ısıtma yastığı ile birlikte) daha sonra mikroskopi için sahneyi tutan özel yapım plastik çerçeveye aktarın. Mikroskop aşamasına bakan testis torbası ile fareyi yönlendirin.<ol>
<li>Devam etmeden önce anesteziderinliğini yeniden değerlendirin; gerekirse dörtte bir ila yarım doz anestezi uygulayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Skrotum lokalize, cımbız kullanarak en distal kısmında tutarak, yavaşça çekin ve çapı yaklaşık 5 mm ile skrotal deri dairesel bir bölümünü kesti. Cremaster kas gibi altta yatan yapılara zarar vermemeye özen Açık dokuyu tuzlu çözelti ile iyice sulu tuttuğundan emin olun.</li>
	<li>İki cımbız kullanarak gevşek bağ dokusunu inceleyin ve her iki testisi de yerelleştirin.</li>
	<li>Bir testis distally tutun ve yavaşça dışarı çekerek başlamak, adım adım çevreleyen bağ dokusu kaldırarak.</li>
	<li>Testis dışa doğru çıktıktan sonra distal ucunu sahneyi çevreleyen kauçuk halkaya sabitle. Dışlaştırma üzerine, tüm süreç boyunca tuzlu çözelti ile doku nemlendirin.</li>
	<li>
Kritik adım: Dikkatle altta yatan cremaster kas zarar vermeden bağ dokusu kaldırın. Aşırı bağ dokusu daha sonra mikroskopi de görme engelleyebilir ve bulanık görüntüler üretebilir.</li>
	<li>Testisin distal kısmını aşağı sabitle ve cremaster kasını küçük bir enine kesim (yaklaşık 1 mm) ile açın, ardından çok distalden proksimal uca kadar uzunlamasına kesi. Sonuç olarak cremaster kas sherically açılmalıdır. Makroskopik olarak görülebilen damar kesilmemelidir, çünkü bu hemodinamik etkileyebilir.</li>
	<li>Dikkatle cam sahne üzerinde kas yayıldı ve kauçuk halka ya pin. Mikroskopi burada yapılacağı için merkezi bölgeye dokunmamaya veya zarar vermemeye özen göstermektedir. Dikkat: Aşırı esneme kan akışını engelleyebilir.</li>
	<li>İlgi çekici bölgeye erişim sağlamak için kalan testis'i bir kenara sabitle. Kurutmayı önlemek için PSS ile tekrar tekrar nemlendirin. Monte edilen kas şimdi mikroskopi için hazırdır.</li>
</ol>4. İntravital mikroskopi
<ol><li>Dik mikroskop monte cremaster kas yerleştirin ve 40x amacı kullanarak mikroskopi gerçekleştirin.</li>
	<li>Yüksek iş çıkışlı görüntüleme spektrografisi kullanarak veri edinin ve dışa aktarın.</li>
	<li>Önceden ısıtılmış (35-37 °C) PSS17ile sürekli süperfüzyon altında kayıt gerçekleştirin. PsS'nin kas dokusuna sürekli damlama sını sağlamak için mikroskobun dik hedefine bantlanmış küçük bir tüple süperfüzyon uygulayın.</li>
	<li>Post-kılcal venülleri (iki küçük damarın birleşmesi) belirleyin ve 20-40 μm çapında venüller üzerindeki mikro sirkülasyonu ölçün.</li>
	<li>30 s bir zaman aralığında cremaster kas mikrosirkülasyon yüksek çözünürlüklü görüntüleri kaydedin. Kayıt sırasında kas dokusunda hafif bir kasılma ve gevşeme olabileceğinden, odağı sürekli olarak ayarladıklarından emin olun. Genellikle, fare yaklaşık 2 saat boyunca kararlı sirkülasyon sergileme eğilimindedir. Farklı bölgelerden farklı gemilerin çeşitli kayıtlarını elde etmek mümkündür. Bir veya her iki testis daha sonra kullanılabilir. NOT: Bu inflamasyon bir model olduğu gibi, indüksiyon ortak yolları şunlardır: sistemik uygulama veya pro inflamatuar mediatörler inskrotal enjeksiyon yanı sıra örneğin N-Formylmethionyl-lucyl-fenillalanine (fMLP) ile superfüzyon. Lokal TNF-α stimülasyon genellikle lökosit işe tetiklemek için kullanılır; LPS'ye bağlı endotoksemi SIRS şiddetli sistemik inflamasyon modelidir.</li>
</ol>5. Lökosit görselleştirme
NOT: Yapışık ve haddeleme lökositleri daha fazla görselleştirme olmadan kolayca görülebilir. Serbestçe hareket eden lökositlerin merkez hat hızını belirlemek için diferansiyel boyama yapın.
<ol><li>EGFP etiketli fareler kullanılıyorsa, bunları doğrudan floresan mikroskobu ile analiz edin.</li>
	<li>EGFP etiketli olmayan fare suşları için rodamin boyama kullanın.<ol>
<li>Rhodamine 6G'yi 0.2 mg/kg vücut ağırlığında uygulayın. Yeterli boyama yoğunlukları elde etmek için tekrarlanan dozlarda gerekebilir. Daha büyük hacimler hemodinamik parametreleri etkileyebileceğinden, küçük hacimleri sakladığından emin olun.</li>
		<li>Lökositlerin anında boyanışı için, karotis arter üzerinden leke uygulayın. Karotis arter diseksiyonu yapılmamışsa, aynı doz18kullanılarak i.p. uygulaması ile yeterli boyama sağlanabilir. Karotis arter kateterizasyonuna alternatif olarak başka bir venöz kateterizasyon yapılabilir. </li><li></ol></li></ol><ol><li><li></ol><ol><li><ol><li><li></li></ol></li><li><ol><li><li><li><img alt="Bilimsel denklemlerde hız ölçümü için saniyede mikrometre sembolü [μm/s]." src="/files/ftp_upload/60509/60509eq1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 1"></li></ol></li><li><ol><li></li><li><img alt="Statik denge analizi; ΣFx=0 sembolü; konsept çizimi; fizik eğitimi." src="/files/ftp_upload/60509/60509eq2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 2"><img alt="Bilimsel denklemlerde hız ölçümü için saniyede mikrometre sembolü [μm/s]." src="/files/ftp_upload/60509/60509eq1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 1"></li><li><img alt="Bilimsel denklemlerde hız ölçümü için saniyede mikrometre sembolü [μm/s]." src="/files/ftp_upload/60509/60509eq1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 1"><img alt="Bilimsel denklemlerde hız ölçümü için saniyede mikrometre sembolü [μm/s]." src="/files/ftp_upload/60509/60509eq1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 1"></li><li><img alt="Deneysel veri analizi için dakika başına sayı birimi cinsinden hız ölçümünü gösteren denklem." src="/files/ftp_upload/60509/60509eq4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 4"><img alt="Laboratuvar hesaplamalarında kullanılan mikrolitre başına sayı [sayı/μL] cinsinden konsantrasyon ölçümü." src="/files/ftp_upload/60509/60509eq5.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 5"><img alt="Bilimsel denklemlerde hız ölçümü için saniyede mikrometre sembolü [μm/s]." src="/files/ftp_upload/60509/60509eq1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 1"><img alt="Vasküler çap hesaplama formülü, mikrovasküler ölçüm ve analiz diyagramı." src="/files/ftp_upload/60509/60509eq6.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 6"></li><li></ol></li></ol>

<ol><li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+to+the+site+of+inflammation%3A+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).</li>
<li>Zanardo, R. C. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+down-regulatable+E-selectin+ligand+is+functionally+important+for+PSGL-1-independent+leukocyte-endothelial+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A down-regulatable E-selectin ligand is functionally important for PSGL-1-independent leukocyte-endothelial cell interactions.</a> Blood. 104 (12), 3766-3773 (2004).</li>
<li>Woodfin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ICAM-1-expressing+neutrophils+exhibit+enhanced+effector+functions+in+murine+models+of+endotoxemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">ICAM-1-expressing neutrophils exhibit enhanced effector functions in murine models of endotoxemia.</a> Blood. 127 (7), 898-907 (2016).</li>
<li>Frommhold, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAGE+and+ICAM-1+cooperate+in+mediating+leukocyte+recruitment+during+acute+inflammation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">RAGE and ICAM-1 cooperate in mediating leukocyte recruitment during acute inflammation in vivo.</a> Blood. 116 (5), 841-849 (2010).</li>
<li>Braach, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAGE+controls+activation+and+anti-inflammatory+signalling+of+protein+C%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">RAGE controls activation and anti-inflammatory signalling of protein C.</a> PloS One. 9 (2), 89422(2014).</li>
<li>Frommhold, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAGE+and+ICAM-1+differentially+control+leukocyte+recruitment+during+acute+inflammation+in+a+stimulus-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunology%22%5BJournal%5D)">RAGE and ICAM-1 differentially control leukocyte recruitment during acute inflammation in a stimulus-dependent manner.</a> BMC Immunology. 12 (1), 56(2011).</li>
<li>Braach, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-inflammatory+functions+of+protein+C+require+RAGE+and+ICAM-1+in+a+stimulus-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Mediators+of+Inflammation%22%5BJournal%5D)">Anti-inflammatory functions of protein C require RAGE and ICAM-1 in a stimulus-dependent manner.</a> Mediators of Inflammation. 2014, 743678(2014).</li>
<li>Girbl, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+Compartmentalization+of+the+Chemokines+CXCL1+and+CXCL2+and+the+Atypical+Receptor+ACKR1+Determine+Discrete+Stages+of+Neutrophil+Diapedesis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Distinct Compartmentalization of the Chemokines CXCL1 and CXCL2 and the Atypical Receptor ACKR1 Determine Discrete Stages of Neutrophil Diapedesis.</a> Immunity. 49 (6), 1062-1076 (2018).</li>
<li>Smith, M. L., Olson, T. S., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXCR2-+and+E-selectin-induced+neutrophil+arrest+during+inflammation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">CXCR2- and E-selectin-induced neutrophil arrest during inflammation in vivo.</a> The Journal of Experimental Medicine. 200 (7), 935-939 (2004).</li>
<li>Emre, Y., Jemelin, S., Imhof, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Neutrophils+and+Monocytes+in+Mesenteric+Veins+by+Intravital+Microscopy+on+Anaesthetized+Mice+in+Real+Time%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), (2015).</li>
<li>Eriksson, E., Boykin, J. V., Pittman, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+in+vivo+microscopy+of+the+cutaneous+microcirculation+of+the+hairless+mouse+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">Method for in vivo microscopy of the cutaneous microcirculation of the hairless mouse ear.</a> Microvascular Research. 19 (3), 374-379 (1980).</li>
<li>von Andrian, U. H. Intravital microscopy of the peripheral lymph node microcirculation in mice. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3avon+Andrian%2C+UH+%22Microcirculation%22">Microcirculation</a>. 3 (3), New York, N.Y. 287-300 (1996).</li>
<li>Hudalla, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LPS-induced+maternal+inflammation+promotes+fetal+leukocyte+recruitment+and+prenatal+organ+infiltration+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">LPS-induced maternal inflammation promotes fetal leukocyte recruitment and prenatal organ infiltration in mice.</a> Pediatric Research. 84 (5), 757-764 (2018).</li>
<li>Grant, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+ok+skeletal+muscle+blood+vessels+%28rat+cremaster%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Direct observation ok skeletal muscle blood vessels (rat cremaster).</a> The Journal of Physiology. 172 (1), 123-137 (1964).</li>
<li>Thiele, J. R., Goerendt, K., Stark, G. B., Eisenhardt, S. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+digital+imaging+of+leukocyte-endothelial+interaction+in+ischemia-reperfusion+injury+%28IRI%29+of+the+rat+cremaster+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Real-time digital imaging of leukocyte-endothelial interaction in ischemia-reperfusion injury (IRI) of the rat cremaster muscle.</a> Journal of Visualized Experiments. (66), e3973(2012).</li>
<li>Kranig, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystrophin+deficiency+promotes+leukocyte+recruitment+in+mdx+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">Dystrophin deficiency promotes leukocyte recruitment in mdx mice.</a> Pediatric Research. 11, 4457(2019).</li>
<li>Bagher, P., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+cremaster+muscle+preparation+for+intravital+imaging+of+the+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The mouse cremaster muscle preparation for intravital imaging of the microcirculation.</a> Journal of Visualized Experiments. (52), e2874(2011).</li>
<li>Reichenbach, Z. W., Li, H., Gaughan, J. P., Elliott, M., Tuma, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IV+and+IP+administration+of+rhodamine+in+visualization+of+WBC-BBB+interactions+in+cerebral+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">IV and IP administration of rhodamine in visualization of WBC-BBB interactions in cerebral vessels.</a> Microscopy Research and Technique. 78 (10), 894-899 (2015).</li>
<li>Secklehner, J., Lo Celso, C., Carlin, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+in+historic+and+contemporary+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy in historic and contemporary immunology.</a> Immunology and Cell Biology. 95 (6), 506-513 (2017).</li>
<li>Nussbaum, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+and+endothelial+adhesive+function+during+human+fetal+ontogeny%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil and endothelial adhesive function during human fetal ontogeny.</a> Journal of Leukocyte Biology. 93 (2), 175-184 (2013).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

IvM bir yöntem olarak yaygın olarak farklı organlarda farklı hücre tipleri çalışma için kullanılan ve yaygın olarak tarif edilmiş ve tartışıldı19. Bu çalışmanın temel amacı, cremaster kas ivm kurmak ve gerçekleştirmek için etkili bir yaklaşım sağlamaktır. Yöntemin pratik güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar üretecektir. Bu nedenle, planlama ve standardizasyon tekniği ana için önemli faktörlerdir. Her şeyden önce, teknik çok yakından izlenmesi ve kontrol edilmesi gereken hemodinamik ve mikrovaskül...

İntravital mikroskopi (IVM) lökosit biyolojisi alanında yaygın olarak uygulanan bir araçtır. Lökosit işe lökosit yakalama tarafından başlatılan iyi tanımlanmış olayların bir çağlayan izler, haddeleme ve endotel duvarına yapışma, ve son olarak transmigration ve inflamasyon gerçek siteye lökosit ekstravazasyon1. Her adım çeşitli kemokinler (örneğin, IL-8/CXCL8), reseptörler (örneğin, LFA-1, Mac-1) ve ilgili endotel hücre adezyon molekülleri (örneğin, ICAM-1, VCAM-1 ve E-Selectin)2,3tarafından aracılık ve kontrol edilir. Farklı düzenleyici sitelerin etkileşimi, kontrol faktörleri ve lökosit işe mediatörleri ileri glisasyon sonu ürünleri (RAGE), hücreler arası adezyon molekülü 1 (ICAM-1), C-X-C motif ligand (CXCL)1/2 ve reseptör CXCR2 ivm4,kullanılarak ortaya çıkarıldı,5,6,7,8,9.
IVM yöntemi bağırsak10gibi birçok farklı organ ve dokular için tarif edilmiştir 10 , deri11, lenf düğümleri12, embriyonik sarısı çuval13 ve diğerleri. Ancak, IVM en yaygın olarak çalışılan yöntem cremaster modeli, ilk sıçanlaraçıklanan 14. Hala sıçanlarda kullanılırken15, yöntem günümüzde ağırlıklı olarak farklı transgenik çizgilerin yüksek bolluğu nedeniyle farelerde uygulanmaktadır. Grubumuz son zamanlarda duchenne Musküler Distrofi (DMD) distrofin eksikliği mdx fareler16çalışma gibi inflamatuar muskolopatiler alanında cremaster IVM potansiyel rolü vurgulamıştır. İnce iç içe geçmiş ve kolayca erişilebilen lif bileşimi sayesinde, cremaster kas ışık veya floresan mikroskopi kullanılarak bir bütün montaj olarak çalışılması için ideal aday kas temsil eder. Lökosit işe alma ve ekstravazasyon esas olarak post-kılcal venüller yer alır, hangi kolayca cremaster kas sürekli bir kas tabakası üzerinde tespit edilebilir.
In vivo görüntülemenin diğer in vitro tahlillere göre avantajı, canlı bir organizmadaki biyolojik bağlamıdır. Aynı zamanda, değiştirilmiş lökosit işe hücre özel katkıları delineating akış odaları veya endotel tahlilleri gibi ek in vitro modeller gerektirebilir. Birden çok yöntemin birleşimi en ikna edici veri verecektir. Herhangi bir cerrahi manipülasyon artmış lökosit ticareti ve işe yol açacaktır gibi bilim adamları cremaster modelinin sınırlamaları farkında olmalıdır. Bu nedenle, temel işe bu yöntem ile tahmin etmek zordur. Geniş uygulamasına rağmen, cremaster IVM zor olabilir ve yeni bir kurulum kurmak için zaman ve kaynak alabilir. Şimdi IVM bazı yaygın hataları önlemek için yardımcı olacak kolay bir protokol sağlar. Ayrıca, sınırlamalar tartışılacak ve uygun olduğu durumlarda ücretsiz yöntemler vurgulanacaktır.
Kremaster IVM inflamatuar ve enfeksiyöz çalışmalar alanında uygulanacak ideal bir yaklaşım temsil eder. Daha spesifik olarak, cremaster modeli inflamatuar hastalık bağlamında iskelet kas biyolojisi okuyan bilim adamları için yüksek ilgi olabilir.

<table><tbody><tr><td><güçlü>Malzeme</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketanest S</td><td>Pfizer Pharma GmbH</td><td>PZN: 08509909</td><td>anestezi. Jenerik / IUPAC Adı: ketamin</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>CP-Pharma GmbH</td><td>Ürün no: 1205&nbsp;</td><td>Anestezi. Jenerik / IUPAC Adı: ksilazin (hidroklorür olarak)</td></tr> <tr><td>Salin Çözeltisi</td><td>B. Braun Melsungen & nbsp;</td><td>PZN 02737756</td><td>cerrahi hazırlıktır. Jenerik / IUPAC Adı: sodyum klorür</td></tr><tr><td>Şırınga iğnesi Omnican FB</td><td>Braun Melsungen & nbsp;</td><td>REF 9161502</td><td>cerrahi hazırlık&nbsp;</td></tr><tr><td>Sütür 6/0 USP</td><td>Resorba</td><td>REF 4217</td><td>cerrahi hazırlık&nbsp;</td></tr><tr><td>Polietilen tüp # 10 & nbsp;</td><td>BD GmbH</td><td>Tedarikçi No. 427401</td><td>cerrahi hazırlık&nbsp;</td></tr><tr><td>Polietilen tüp # 90 & nbsp;</td><td>BD GmbH</td><td>Tedarikçi No. 427421</td><td>cerrahi hazırlık&nbsp;</td></tr><tr><td>Rhodamine 6G</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH</td><td>CAS Numarası 989-38-8&nbsp;</td><td>lökosit boyama. Jenerik / IUPAC Adı: etil 2 - [3- (etilamino) -6-etilimino-2,7-dimetilksanten-9-il] benzoat</td></tr> <tr><td>< güçlü > Kurulum Ekipmanı< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>dik mikroskop & nbsp;</td><td>Olimpos&nbsp;</td><td>BX51W1</td><td>mikroskobu</td></tr><tr><td>40 katlı objektif&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>Achroplan 40 & /0,80 W</td><td>mikroskopi</td></tr><tr><td>ImSpector yazılımı</td><td>Lavision Biotec GmbH</td><td>sürüm 4.0.469</td><td>yazılım</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Ulusal Sağlık Enstitüsü, ABD</td><td>sürüm 1.51j8</td><td>yazılım</td></tr></tbody></table>

İntravital mikroskopi ile değerlendirilen farelerde cremaster kasın lökosit İnfiltrasyonu

Leukocyte Infiltration of Cremaster Muscle in Mice Assessed by Intravital Microscopy

İntravital mikroskopi (IVM) yaygın olarak lökosit işe kaskad in vivo içinde fizyolojik ve patofizyolojik süreçleri izlemek için kullanılır. Mevcut protokol, farenin bozulmamış organizması içinde elde edilen iskelet kası dokuda lökosit alımına yol açan lökosit endotel etkileşimini görselleştirmek için pratik ve tekrarlanabilir bir yöntemi temsil eder. Bu model, granülosit aktivasyonuna ve hastalıktaki rollerine odaklanan tüm araştırma alanlarına uygulanabilir.
Yöntemde rehberlik etmek ve olası tuzakları ve teknik zorlukları vurgulamak için adım adım protokol sağlıyoruz. Protokol aşağıdaki hususları kapsamaktadır: deneysel ayarlar ve gerekli malzeme, farenin anestezisi, cremaster kasının diseksiyonu, trakeal ve karotis kanülasyonu, IVM kayıtları ve çevrimdışı analiz. Yapışık lökositler, yuvarlanma akısı (RF) ve yuvarlanma akı fraksiyonu (RFF) gibi veri biçimleri ayrıntılı olarak açıklanmış ve uygun uygulamalar tartışılmıştır. Sonuç bölümünde distrofin eksikliği mdx farelerin indeks sonuçları verilmektedir.
IVM bir in vivo ortamda lökosit işe değerlendirmek için güçlü bir araçtır; ancak, örneğin endotel ve lökosit fonksiyonu için delineating akış odası deneyleri gibi ex vivo kurulumları ile bir kombinasyon gerektirebilir. Ayrıca, ilgi hayvanların genetik arka plan büyük ölçüde sağlanan protokol bireysel ince ayar gerektiren, temel işe etkileyebilir. Sınırlamalarına rağmen, IVM in vitro bulguları yaşayan bir omurgalı organizmaya kolayca çevirmek için bir platform olarak hizmet verebilir.

IVM sağlanan protokol uyarınca iskelet kası lökosit işe çağlayan içine benzersiz anlayışlar verecektir. Sonuçlar bölümünde IVM tarafından elde edilen tipik sonuçlar üzerinde durulacak ve karşılaşılabilecek olası sorunları vurgulayacaktır.
İntravital mikroskopi için deneysel kurulum Şekil 1'deözetlenmiştir. Cremaster kas hazırlanması ve bağ dokusunun çıkarılması tek tip bir yüzey ile odaklanmış mikroskobik görüntüler elde etmek için çok önemlidir. Aşırı bağ dokusu ...

Burada, fare cremaster kasının post-kılcal venüzlerinde intravital mikroskopinin nasıl yapılacağını gösteriyoruz. Yaygın olarak farklı inflamasyon ve sepsis modellerine, özellikle kemokinler ve sitokinler tarafından indüklenenlere uygulanan, abartılı kas lökosit infiltrasyonu içeren muscolopatilerin çalışmasında önemini vurguluyoruz.

İntravital Mikroskopi Ile Değerlendirilen Farelerde Cremaster Kasın Lökosit İnfiltrasyonu

Intravital microscopy (IVM) is widely used to monitor physiological and pathophysiological processes within the leukocyte recruitment cascade in vivo. The ...

Bu pratik ve tekrarlanabilir yöntem, sağlam bir fare içinde lökosit işe yol endotel lökosit etkileşimleri görselleştirmek için kullanılabilir. Bu teknik aynı zamanda lökosit işe in vivo içinde fizyolojik ve patofizyolojik süreçlerin izlenmesi için güçlü bir araç sunuyor. Yöntem farklı inflamatuar ve septik modellerde uygulanabilir.Örneğin, son zamanlarda abartılı kas lökosit infiltrasyonu içeren kas çalışmaları alaka vurgulamıştır. Bu tekniği kullanmayı düşünen bilim adamlarına önerimiz, yöntemin küçük sapmalara karşı çok hassas olduğu kadar mümkün olduğunca çok pratik deneyim elde etmektir. Prosedürü gösteren Simon Kranig, benim laboratuarımdan bir klinisyen ve kıdemli bilim adamı olacak.Anesteziye tabi deneysel hayvanayak tutam yanıt eksikliği doğruladıktan sonra, bir 37 derece Santigrat ısıtma yastığı üzerinde bir dorsal recumbent pozisyonda fare düzeltmek ve ön dişler etrafında basit bir döngü rüzgar için bir absorbe edilemez steril 6-0 dikiş kullanın. Sütürün birleştirme uçlarını ısıtma yastığına bantlayın ve orta hattaki deriyi hafifçe kaldırmak için cımbız kullanın. Daha sonra, boyun ve üst toraks üzerinde dairesel bir 1-2 santimetre çapında kesi yapmak ve dikkatle çevreleyen kas, yağ ve bağ dokuları incelemek için cımbız kullanın.Nefes borusuna bir dikiş koy. Trakea içine yaklaşık 1,3 milimetre enine kesim yapmak ve üst hava yollarını güvenli hale getirmek için trakea kaudal ucuna bir polietilen tüp tanıtmak için küçük cerrahi makas kullanın. Tek bir dairesel düğüm sütür ile bulunan tüp düzeltmek ve trakea sağ tarafında karotis arter bulmak.Karotis arter duvarından çevredeki dokuyu inceleyin ve arterin altına iki parça dikiş geçirin. İlk kranial sütür proksimalini karotis arterlerin çatallanmasına bağlayın ve ikinci sütürü ilk dikişten yaklaşık 5-8 milimetre distal olarak bağlamadan yerleştirin. Daha sonra, tuzlu su ile dolu bir mililitreşökum iğnesine 30 santimetrelik polietilen tüp takın ve karotis arteri ikinci dikişe distal olarak bağlamak için yedi milimetrelik bir damar klipsi kullanın.Karotis arterde yaklaşık 0,5 milimetrelik enine kesim yapın ve steril polietilen tüpü artere tanıtılın. Tüpü ikinci dikişle sabitle ve damar klibini çıkarın. Sonra yavaşça damar içine salin floş şırınga piston bastırmak.Cremaster kas hazırlamak için, mikroskop aşamasına bakan skrotum ile özel yapılmış plastik mikroskop çerçeve için fare transfer ve dikkatle cımbız ile en distal ucunda testis torbası kavramak. Skrotumyavaşça çekerek, skrotal deri tuzlu ile iyi sulu açık doku tutarak skrotal deri yaklaşık beş milimetre çapında bir dairesel bölümü kaldırın. Gevşek bağ dokusu incelemek ve her iki testis bulmak için iki cımbız kullanın.Bir testis distal kavramak ve yavaşça adım adım çevreleyen bağ dokuları kaldırarak üreme dokusu çekerek başlar. Testis dışlandıktan sonra, dokunun distal ucunu sahneyi çevreleyen kauçuk halkaya sabitle ve dokuyu tuzlu su ile nemlendirin. Daha sonra, dikkatle altta yatan cremaster kas zarar vermeden bağ dokusu kaldırın.Bu altta yatan cremaster kas zarar vermeden bulanık görüntüler neden olur bağ dokusunun tüm kaldırmak için önemlidir. Tüm doku çıkarıldığında, doku proksimal sonuna kadar çok distal bir longitudinal kesi yapmadan önce cremaster kas açmak için bir milimetre lik enine kesi yapmak. Kas larbirer gibi açılmalı.Dikkatle cam sahne üzerinde kas yayıldı ve dokunmak veya dokunun merkezi bölgeye zarar değil dikkat ederek kauçuk halka kas pin. Daha sonra kalan testisleri yan tarafa sabitleyip ilgi bölgesine erişim sağlamak ve pss ile dokuyu nemlendirin. Kas vaskülatür intravital görüntüleme için, dik mikroskop monte cremaster kas yerleştirin ve 40X hedefi seçin.35-37 derece Santigrat PSS ile sürekli superfüzyon altında kayıtları gerçekleştirmek kas ve doku aşağı objektif aşağı objektif yanında PSS sürekli damlama izin mikroskop dik hedefine bantlanmış olan küçük bir boru parçası ile. Post-kılcal damarları tanımlayın. 20 ila 40 mikrometre çapında venüller üzerinde mikrosirkülasyon ölçün.Daha sonra 30 saniyelik bir süre boyunca cremaster kas mikrosirkülasyon yüksek çözünürlüklü görüntüleri kayıt sürekli kas dokusunun daralma ve gevşeme hafif değişiklikler nedeniyle odak ayarlayarak. Aşırı bağ dokusu bulanık mikroskobik görüntülere yol açabilir. Bu temsili mikroskobik görüntüde, çapı 20 ila 40 mikrometre arasında olması gereken post-kılcal venüler iki küçük damarın birleşmesi ile tespit edilebilir.Yapışık ve yuvarlanan lökositler sirkülasyon yaparken görüntülenebilir, ancak kaydedilen videoların yavaş çekim tekrarında izlenebilir. Çok sayıda parametre kardiyak çıkış, damar çapı, merkez çizgisi hızı, duvar kesme hızı ve sirkülasyon lökosit sayısı da dahil olmak üzere in vivo lökosit alımını etkileyebilir. Merkez hattı hızının kardiyak çıkış, periferik vasküler direnç ve intravasal hacimden etkilendiğini unutmayın.Örneğin, karotis kateter ile verilen rhodamine veya diğer deneysel madde büyük bir hacim post-kapiller merkez hattı hızını artırır ve lökosit yakalama ve haddeleme inhibe. Aksine, kardiyak yetmezlik, derin anestezi veya hipotermi post-kılcal akışı azaltabilir. Merkez hattı nın hızını belirlemek için serbestçe dolaşan floresan lökositler kullanılabilir veya lökositler Rhodamine gibi floresan reaktiflerle boyalanmalıdır.Yabani tip suşların fizyolojik farklılık gösterebileceğini unutmayın. Örneğin, C57BL/6 fareleri C57BL/10ScSn hayvanlarına kıyasla açıkça gelişmiş lökosit haddeleme, yapışma ve transmigration göstermektedir. Planlama ve standardizasyon aşamaları özellikle mikroskopi için cremaster kas hazırlanması sırasında tekniği mastering için önemlidir.Lökosit alımını görselleştirmek için diğer yöntemler ek bilgi sağlamak ve lökositlerin ve endotel hücrelerinin işe alım basamaklarına bireysel katkısının incelenmesine yardımcı olmak için yapılabilir. Bu teknik farmakolojik meditasyoncular ve yeni immün modülatör maddelerin klinik öncesi değerlendirilmesi için bir platform sağlar.

leukocyte-infiltration-cremaster-muscle-mice-assessed-intravital

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bir doku hazırlanması, görselleştirme ve yaşam mikrosirkülasyon deneysel manipülasyon için tarif edilir. Anestezi erkek farelerde, ince, yüksek vaskülarize Cremaster'ın kas arteriol, kapiller ve venüllerde mikrovasküler ağları da dahil olmak üzere çalışma intravital mikroskopi için hazırlanmıştır. Bu preparat, sıçan ve hamster için kolayca adapte.

Mikrosirkülasyon intravital Görüntüleme Fare Cremaster&#39;ın kas Hazırlık

Biz aydınlık intravital mikroskopi, in vivo olarak nötrofil kemoatraktan kaynak yanıt nötrofil göçünü sırasında dinamik nötrofil-endotel hücre etkileşimleri ölçmek için bir protokol tanımlamaktadır. Nötrofil intraluminal tarama, fare Cremaster'ın kas dokusu transendoteliyal göç ve kemotaksis zaman lapsed video ImageJ ile fotoğraf ve takip ile görüntülendi.

Takip Nötrofil Lumen Crawling, intravital video Mikroskopi Doku transendoteliyal Göç ve Kemotaksis

Kremasterik mikrosirkülasyonda postkapiller venüllerde Dijital intravital Epifloresans mikroskopi lökosit-endotel etkileşimi içgörü kazanmak için uygun bir...

Sıçan Cremaster&#39;ın kas iskemi-reperfüzyon Hasarı içinde Lökosit-endotelyal Etkileşim Gerçek zamanlı Dijital Görüntüleme (IRI)

Burada vasküler inflamasyon ve canlı farelerde trombüs oluşumu sırasında aktive endotel üzerindeki heterotipik trombosit-nötrofil etkileşimleri görselleştirmek için floresan intravital mikroskobu deneysel bir tekniktir rapor. Bu mikroskobik teknoloji vasküler hastalığın moleküler mekanizmasını incelemek ve patofizyolojik durumlardaki farmakolojik ajanları test için değerli olacaktır.

Canlı Fare Damar İltihabı ve trombüs oluşumu sırasında Activated Endotel üzerinde heterotypic Trombosit nötrofil Etkileşimleri Gerçek zamanlı Görüntüleme

Fare M. Cremaster'ın mikro intravital mikroskopi eşsiz ve çevresel kemik iliği kök hücre göçü analizi için in vivo model yanı sıra standart sunmaktadır.

Periferik Kök Hücre Göç Analizi Fare Cremaster Muscle Mikrosirkülasyon Intravital Mikroskopi

Farelerde mezenter damarlarının intravital mikroskopisinin bu basitleştirilmiş uygulaması, lökosit-endotel ve trombosit-lökosit etkileşimlerini gözlemlemek için farklı inflamasyon modellerinde kullanılabilir.

Farelerde mesenteriumda Damarlardaki intravital Mikroskopi Lökosit-endotelyal ve Trombosit-lökosit Etkileşimleri

Anestezi uygulanmış farelerde intravital konfokal mikroskopi kullanarak kararlı durum ve enflamatuar koşullar altında mezenterik venlerdeki nötrofillerin ve monositlerin davranışını izlemek için bir protokolü detaylandırıyoruz.

Real Time Anestetize Farelerde Intravital Mikroskopi Mezenterik Damarlardaki nötrofiller ve monositler Görüntüleme

Burada, CD11c.DTR farelerinin intratrakeal difteri toksini tedavisi ile indüklenen, bir aseptik fulminan miyokardit modelinde kardiyak CD45 + lökosit infiltrasyonunu görselleştirmek için bir ışık-tabakalı mikroskopik yaklaşım anlatılmaktadır.

Bir Fulminan Miyokardit Modelinde Işık Yeri Mikroskopisi İle Lökosit İnfiltrasyonunun Nicel Görselleştirilmesi

Biz GFP etiketli γδ IELS görselleştirmek için bir yöntem açıklamak, ters dönen disk konfoksel mikroskobu tarafından murine ince bağırsak intravital görüntüleme kullanarak. Bu teknik, 4 h 'ye kadar mukoza içindeki canlı hücrelerin takibini sağlar ve çeşitli bağırsak immün-epitelyal etkileşimleri araştırmak için kullanılabilir.

Murine Ince bağırsak INTRAEPİTELYAL lenfosit intravital görüntüleme

Lökosit ve trombositlerin işe alınması, arteriyogenez sırasında kollateral arterlerin etkili büyümesi için gerekli olan önemli bir bileşeni oluşturur. Multifoton mikroskopisi, arteriyogenez sırasında lökosit alımını ve ekstravazasyonunu incelemek için in vivo yüksek uzay-zamansal çözünürlüğe ve daha az foto-toksisiteye sahip hücre dinamiklerini izlemek için etkili bir araçtır.

Bir Murin Arka Bacak Modelinde Arteriyogenez Sırasında Lökosit Alımını İzlemek için Multifoton İntravital Görüntüleme

Eklemlerin in vivo görüntülemesi, iltihaplı eklemler içindeki lökositlerin göç davranışını ve moleküler dinamiklerini ortaya çıkarmak için değerli bir tekniktir. Burada, tip II kollajen kaynaklı artritin (CIA) fare modeli kullanılarak eklemlerin in vivo görüntülemesi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

In Vivo'da Görüntüleme, eklemlerdeki lökositlerin göç davranışını ortaya çıkarıyor

Öğrenin farelerde kremaster kasında intravital mikroskopi ile lökosit-endotel etkileşimlerini görselleştirme yöntemini. Bu teknik enflamasyon ve sepsis modellerinde lökosit infiltrasyonunu in vivo izlemek için güçlü bir araçtır.

İntravital Mikroskopi Ile Değerlendirilen Farelerde Cremaster Kasın Lökosit İnfiltrasyonu

Daha fazla video keşfet