Gram-negatif Bakteriler için Hücre Zarfının İç ve Dış Membran Fraksiyonlarına Ayrılması Acinetobacter baumannii için Teknik Ayarlamalar

Mikropların bireysel iki katmanlı kimyasal bileşiminasıl düzenlediğini incelemek antibiyotik öldürme mekanizmaları, antimikrobiyal direnç ve hastalık patogenezi hakkındaki bilgimizi bilgilendirecektir. Bu teknik, gram-negatif bakterilerin hücre zarfını deterjan kullanmadan iki tanımlanmış fraksiyona ayırır. Bu nedenle, lipidler, proteinler ve şekerler yarı yerli bir ortamda değerlendirilebilir.

Bazı adımlar zamana bağlıdır ve odaklanma ve koordinasyon gerektirir. Başlangıçta, bir veya iki örnek kullanın. Kişinin konfor seviyesi arttığında, daha fazla örnek eklenebilir.

Aynı anda en fazla altı örnek ele alınmalıdır. Bu çok günlük bir yordamdır ve görsel kontrol noktaları etkinliğini ve hatayı değerlendirmek için yararlıdır. Bu bazen son adımları gerçekleştirmeden önce.

Taze agar plakaları üzerine dondurulmuş gliserol stokları gelen bakterileri streak. Koloniler geliştikten sonra plakaları dört santigrat derecede saklarlar. Bir gecede istenildiği gibi et suyu medya ve kültür bakteri dolu beş mililitrelik tüp aşılamak için tek bir koloni kullanın.

Geri tercih edilen et suyu medya bir litre içine bir gecede bakteri kültürü seyreltmek ve şişeleri inkübün. İstenilen optik yoğunluk elde edildiğinde, şişeleri kuvözden çıkarın ve buza yerleştirin. Kültürün optik yoğunluğunu 600 nanometre olarak ölçün ve 10 bakteri kolonisi oluşturan ünitelere altı ila sekiz kat 10'a eşdeğer kültür hacmini hesaplayın.

Bir santrifüj tüpüne bu kültür hacmini ekleyin ve kalan kültürlerin kullanılacak olana kadar buzda kalmasını sağlayın. Pelet sabit bir açı, 7, 000-10, 000 kez G ve dört derece santigrat yüksek hızlı santrifüj 10 dakika santrifüj için santrifüj ile bakteri. Dikkatle supernatant decant ve atın.

Tampon A.A.12.5 mililitre her hücre pelet resuspend hücre süspansiyon için bir manyetik karıştırma çubuğu ekleyin. Her hücre resuspension için mililitre lysozyme başına 10 miligram 180 mikrolitre ekleyin. Santrifüj ile tedavi edilen lysozyme EDTA bakterisini topladıktan sonra, bakterilere proteaz inhibitörü, magnezyum klorür ve nükleazı hızla ekleyin ve tampon B.Stir'deki hücreleri iki dakika boyunca hızla yeniden askıya alın ve süspansiyonları buzda tutarak tekrar layın.

Daha sonra, her hücrenin yeniden süspansiyon 12,5 mililitre 1.5 mililitre EDTA çözeltisi ekleyin ve ek bir yedi dakika boyunca buz üzerinde karıştırmaya devam edin. Süspansiyonları 15 mililitrelik konik tüplere ayırın. Süspansiyonları 9, 000 ila 11, 000 kez G'yi 10 dakika 4 santigrat derecede santrifüj edin.

Supernatants bir biyolojik atık konteyner içine atın ve buz üzerinde pelet tutun. Her hücre peletine 25 mililitre arabellek B ekleyin. Daha sonra, bir molar magnezyum klorür 55 mikrolitre, rnase / dnase / nükleaz reaktif bir mikrolitre ve proteaz inhibitörü kokteyl bir mikrolitre ekleyin.

Karışımdaki peletleri yeniden askıya alın. Çözeltiler homojen görünene kadar güçlü bir şekilde pipet ve girdap. Süspansiyonları buzda saklayın.

Örneği homogenizer örnek silindirine dökün ve hücreyi 20,000 PSI'ya getirin. Patojenlerin aerosolizasyonunu önlemek için, basınçlı cihazı tampon B'de koşullandırmak ve bakteriyel süspansiyon eklemeden önce basınç seviyelerini ayarlayın. Önlem olarak basınç hücresini devreye alın ve 10 mililitre tampon B'yi ima edin.

Ayrıca buz üzerinde 50 mililitrekonik tüpler hücre lysate toplamak. Tam bir lisis elde etmek için, bu işlemi 3-5 kez tekrarlayın. Kalan, bozulmamış hücre materyalini, 6, 169 kez G ve 4 santigrat derece 10 dakika lized bakteri örneklerini santrifüj etmek için.

Şimdi homojenize membranlar içeren supernatants dağıtın, ultracentrifugation için polikarbonat şişeler halinde. Ultracentrifuge hücre lysates 184, 500 kez G ve dört derece santigrat en az bir saat için. Supernatants atın ve buz üzerinde membran pelet tutun.

Bir cam kullanarak, Homogenizer Dounce, düşük yoğunluklu izopiknik sakaroz gradyan çözeltisi bir mililitre membran pelet resuspend. Daha sonra, 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne örnek homojen aktarmak ve buz üzerinde tüp yerleştirmek için bir cam, Pasteur pipet kullanın. Sakaroz gradyanı hazırlamak için polipropilen veya Ultra açık açık bir tüpü hafif çetrene bir pozisyonda tutun.

Yavaşça yüksek yoğunluklu sakaroz çözeltisi iki mililitre ekleyin. Sonra düşük yoğunluklu sakaroz çözeltisi dört mililitre ekleyin. Yoğunluk gradyanı hazırlanırken, katmanları karıştırmamak için sakaroz çözeltisini yavaşça ekleyin.

Sakaroz tabakaları hafifçe görünür olmalı ve genel olarak tanımlanmış görünmelidir. Daha sonra, daha önce düşük yoğunluklu bir mililitre resuspended oldu toplam membran fraksiyonu ekleyin, izopyknik sakaroz çözeltisi. Son olarak, düşük yoğunluklu yaklaşık altı mililitre ekleyerek tüpün geri kalanını doldurun, isopycnic sucrose gradyan çözeltisi.

Ultracentrifuge örnekleri 288, 000 kez G ve dört derece santigrat 16 ila 23 saat için bir sallanan kova rotor kullanarak. Bir P1000 pipet ucu noktadan yaklaşık beş mililitre uç kesti. Santrifüj tamamlandıktan sonra, tüpüst, kahverengi tabaka kaldırmak için pipet kullanın.

İç zar fraksiyonu içeren bu katmanı ultra santrifüj için polikarbonat şişeye aktarın. Alt, beyaz, dış membran fraksiyonunun iç zar fraksiyonuna geçmemesini sağlamak için %53 sakaroz ve %73 sakaroz arasındaki arayüz üzerinde yaklaşık iki mililitre sakaroz çözeltisi bırakın. Yine uç kaldırıldı ile bir P1000 pipet ucu kullanarak, dış membran tabakası kaldırmak ve bir polikarbonat şişe aktarın.

Polikarbonat şişenin kalan boşluğunu izole membran depolama tamponuyla doldurun ve ters çevirme veya pipepetting ile karıştırın. Örnekleri buzda sakla. Membranları toplamak için, 184, 500 kez G ve dört santigrat derece bir saat için polikarbonat şişeultracentrifuge.

Son olarak, supernatants atın ve depolama arabellek 500 ila 1.000 mikrolitre ekleyin. Dounce homojenizasyon ile membranları yeniden askıya alın. Örnekleri iki mililitrelik mikrosantrifüj tüplerinde toplayın.

Toplam membran peletleri kazınmış, dounce homojenize edilmiş ve iç ve dış membranları ayırmak için sakaroz yoğunluk gradyanları üzerinde ultracentrifuged. Sakaroz yoğunluğu gradyanı %20 %53%73 bazı bakteri suşlarının bölümlendirilmesi için yeterliydi. Ama başarıyla% 20% 45% 73 gradyan kullanılarak bölümlenmiş A.baumannii bölümleme için değil.

Ayırmanın etkinliğini değerlendirmek için membran örnekleri bakteriyel iç zarda bulunan bir enzim olan NADH dehidrogenaz için test edildi. 340 nanometredeki optik yoğunluktaki azalma enzimin varlığını gösteriyordu. Optik yoğunluk, yabani tip S.typhimurium, E.coli K12 DH5a ve galE mutant S.typhimurium'dan alınan iç ve dış membran fraksiyonlarının 50 mikrogramlık örnekleri için ölçüldü.

A.baumannii membran fraksiyonlarının saflığını söylerken daha yüksek bir protein konsantrasyonu eklendi, çünkü 50 mikrogram lık bir ilk tetkik, NADH dehidrogenazın göreceli düzeylerinin A.baumannii için diğer bakteri suşlarına göre daha düşük olduğunu gösterdi. Dış membran fraksiyonları ile iç membran fraksiyonlarının çapraz kontaminasyonunu değerlendirmek için LPS ve LOS ayıklandı ve görselleştirildi. Özler bir poliakrilamid jel üzerine yüklendi ve Pro-Q Zümrüt 300 ile lekeli.

Acinetobacter baumannii bir öncelik, çok ilaca dirençli, insan patojen. Bu protokol, bu eşsiz ve önemli patojenin direnç ve virülans mekanizmalarında lipooligosakkaritler, fosfolipidler ve lipoproteinlerin rollerini anlamada araştırmacılara yardımcı olmalıdır. Bu yöntem, genellikle gram-negatif bakterilerin çift membraniçinde mevcut fosfolipidler, glikolipidler karbonhidratlar, proteinler ve küçük moleküllerin downstream analizi için idealdir.