Name: Gram-negatif Bakteriler için Hücre Zarfının İç ve Dış Membran Fraksiyonlarına Ayrılması Acinetobacter baumannii için Teknik Ayarlamalar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Öğrenin gram-negatif bakterilerin hücre zarfını deterjan kullanmadan iç ve dış membran fraksiyonlarına ayırma tekniğini. Bu yöntem Acinetobacter baumannii gibi patojenlerde antibiyotik direnci ve virülans mekanizmalarını anlamak için değerlidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma P20GM10344 ve R01AI139248 tarafından Z. D. Dalebroux'a verildi.

1. Membran Ekstraksiyonu için Genel Reaktifler ve Ortam Hazırlığı
<ol><li>Bakteriyel büyüme ortamı: Tamamen temizlenmiş ve otoklavlı 2 L şişede 1 L et suyu ortamıhazırlayın ve sterilize edin.</li>
	<li>Genel resuspension arabelleği (1 M Tris Tampon pH 7.5; 50 mL): 6.05 g Tris tabanını H2O'nun 30 mL'sinde çözün.2</li>
	<li>Divalent katyon şelasyon çözeltisinin ana stoku (0.5 M EDTA pH 8; 100 mL): 18.6 g disodyum etilen tetraasetat·2H2O ila 80 mL H2O. Stir ve NaOH ile pH'ı 8.0'a ayarlayın. Ultra saf H2O ile son hacmi 100 mL'ye ayarlayın. NOT: Çözeltinin pH'ı NaOH ilavesi ile ~8.0'a ayarlanana kadar EDTA'nın disodyum tuzu erimez.</li>
	<li>Ozmotik tampon A (0.5 M sakaroz, 10 mM Tris pH 7.5; 1 L): 171.15 g sakaroz ağırlığında ve 1 L silindire aktarın. 1M Tris pH 7.5 10 mL ekleyin. Ultra saf H2O. 4 °C'de 1 L'lik son bir hacme ayarlayın.</li>
	<li>İzozym (10 mg/mL; 5 mL): 50 mg (tavuk yumurtası-beyazı) izozim ağırlığında ve 4 °C'de 5 mL ultrasaf H2O. Deposunda çözünür.</li>
	<li>Seyreltilmiş divalent katyon şelasyon çözeltisi (1,5 mM EDTA; 500 mL): 1,5 mL 0,5 M EDTA (Adım 1,3) ila 497,5 mL ultrasaf H2O. 4 °C'de saklayın.</li>
	<li>Ozmotik tampon B (0.2 M sakaroz, 10 mM Tris pH 7.5; 2 L): 136.8 g sakaroz ağırlığında ve 2 L silindire aktarın. 1 M Tris pH 7.5 20 mL ekleyin. Ultra saf H2O. 4 °C'de depolayarak son hacmi 2 L'ye ayarlayın.</li>
	<li>Nükleaz ko-faktörü (1 M MgCl2; 10 mL): 2,03 g MgCl2·6H2O 8 mL ultrasaf H2O. Hacmi 10 mL'ye ayarlayın. Oda sıcaklığında saklayın.</li>
	<li>RNase ve DNase enzimleri de dahil olmak üzere nükleaz çözeltisi kokteyli: Bkz. Malzeme Tablosu. -20 °C'de saklayın.</li>
	<li>Proteaz inhibitörü kokteyl: Malzemeler Tablosubakınız. 4 °C'de saklayın.</li>
	<li>Düşük yoğunluklu izopiknik sakaroz gradyan çözeltisi (%20 w/v sakaroz, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7.5 Çözelti; 100 mL): 20 g sakaroz tartın ve 200 mL silindire aktarın. 100 μL 1 M Tris Tampon pH 7.5 ve 200 μL 0.5 M EDTA pH 8 ekleyin. Oda sıcaklığında ultra saf H2O. Depoile son hacmi 100 mL'ye ayarlayın.</li>
	<li>Orta yoğunluklu izopiknik sakaroz gradyan çözeltisi (%53 w/v sakaroz, 1 mM EDTA, 1mM Tris pH 7.5 Çözelti; 100 mL): 53 g sakaroz tartın ve 200 mL'lik silindire aktarın. 100 μL 1 M Tris Tampon pH 7.5 ve 200 μL 0.5 M EDTA pH 8 ekleyin. Oda sıcaklığında ultra saf H2O. Depoile son hacmi 100 mL'ye ayarlayın. NOT: Sakaroz yüksek yüzdesi nedeniyle doğruluk sağlamak için mezun silindir bu çözüm hazırlayın. Bir manyetik karıştırma çubuğu ekleyin ve sakaroz tamamen çözelti içinde çözülmüş olana kadar karıştırın. Bu işlem birkaç saat sürebilir.</li>
	<li>Yüksek yoğunluklu izopiknik sakaroz gradyan çözeltisi (%73 w/v sakaroz, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7.5 Çözüm; 100 mL): 73 g sakaroz tartın ve 200 mL'lik silindire aktarın. 100 μL 1 M Tris Tampon pH 7.5 ve 200 μL 0.5 M EDTA pH 8 ekleyin. Oda sıcaklığında ultra saf H2O. Depoile son hacmi 100 mL'ye ayarlayın. NOT: Sakaroz yüksek yüzdesi nedeniyle doğruluk sağlamak için mezun silindir bu çözüm hazırlayın. Bir manyetik karıştırma çubuğu ekleyin ve sakaroz tamamen eriyene kadar karıştırın. Bu işlem birkaç saat sürebilir.</li>
	<li>İzole-membran depolama arabelleği (10 mM Tris Tampon pH 7.5; 1 L): 1 M Tris Tampon pH 7.5 ila 1 L şişeye 1 mL ekleyin ve son hacmi ultrasaf H2O ile 1 L'ye ayarlayın.</li>
	<li>β-Nikotinamid adenin dinükleotid (NADH) (10 mg/mL solüsyon): Ultrasaf H2O.'da 10 mg NADH'yi yeniden askıya alın. -20 °C'de saklayın.</li>
	<li>Fenol çözeltisi 10 mM Tris HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA ile dengelenmiştir: Bkz. Malzeme Tablosu. Çözeltiyi 4 °C'de saklayın.</li>
	<li>Lipopolisakkarit jel işeyz kiti: Bkz. Malzeme Tablosu.</li>
	<li>Bradford reaktifi: Bkz. Malzeme Tablosu. NOT: Tutarlı sonuçlar elde etmek için tüm çözümler ve ortamlar tahkikatın icrası haftasında hazırlanmalıdır.</li>
</ol>2. Membran Ekstraksiyonu için Bakterilerin Hazırlanması
<ol><li>Taze agar plakaları üzerine dondurulmuş gliserol stokları gelen bakterileri streak. Koloniler geliştikten sonra plakaları 4 °C'de saklayın. Tek bir koloniyi, bir gecede istenilen bakteri suyu ve kültürü yle dolu 5 mL'lik bir tüpe dönüştürün.</li>
	<li>İstenilen optik yoğunluk elde edilene kadar bakteri, bir gecede bakteri kültürünü tercih edilen et suyu ve kültürün 1 L'sine geri seyreltin. NOT: Tek bir bakteri kolonisinin 1 L'lik et suyu media'sına aşılanması, büyüme fenotiplerini bastırmaya meyilli mutant genotipler için tavsiye edilir, ancak bazı Gram-negatif bakteriler diğerlerinden daha yavaş büyür. Tek koloni aşısı ile yeterli kültür yoğunluğuelde etmek mümkün değilse, bir gecede bir kültürü 1 L'ye seyreltmek büyümeyi senkronize etmek için bir stratejidir. Bakteriyel-membran bileşimi kültürün büyüme evresine bağlı olarak değişir (logaritmik vs sabit faz)13. Zamanın bir fonksiyonu olarak bakteri kültürleri için optik yoğunluk değişimini ölçen büyüme eğrileri, kültür yoğunluğunu büyüme evresi ile ilişkilendirmek için tüm suşlarla birlikte yapılmalıdır.</li>
	<li>Suyu kültürlerini içeren şişeleri buzüzerine ayarlayın. 600 nm (OD600)optik yoğunluğunu okuyun ve 6.0 ve 8.0 x 1011 bakteri kolonisi oluşturan birimleri (cfu) arasında eşdeğer kültür hacmini hesaplayın. S için. Tiphimurium, bu 0.6-0.8 arasında bir OD600 kültür 1 L karşılık gelir, bir OD600 1.0 kabaca 1.0x109 cfu/mL eşit olduğundan. Bu hacmi bir santrifüj tüpüne ekleyin ve kalan kültürlerin kullanılacak olana kadar buzda kalmasını sağlayın.</li>
	<li>10 dk için sabit açıyüksek hızlı santrifüj 7.000-10.000 x g 4 °C'de santrifüj ile bakteri pelet. NOT: Ön soğutma ve düşük sıcaklıkta santrifüjler korumak. Tüm işlem sırasında buz üzerinde örnekleri koruyun.</li>
	<li>Decant ve dikkatle supernatant atın. NOT: Membran fraksiyonları hemen çıkarılmayacaksa pelet dondurularak yanıp sönebilir ve/veya -80 °C'de saklanabilir. Ancak, hücrelerin hasat edildiği gün plazmoliz ile doğrudan devam edilmesi tavsiye edilir ve özellikle enterobakteriyel olmayan türler için tavsiye edilir.</li>
</ol>3. Dış Membran ve Plazmolyz ayrışması
<ol><li>Daha önce -80 °C'de depolanmışsa hücre peletlerini buz üzerinde eritin ve prosedürün geri kalanı için numuneleri buz üzerinde tutun. Santrifüj tüpü içindeki her hücre peletini 12,5 mL tampon A. Hücrelerin süspansiyonuna manyetik bir karıştırma çubuğu ekleyin.</li>
	<li>Her hücre resuspension'ına 180 μL 10 mg/mL likit (son konsantrasyon 144 g/mL) ekleyin. 2 dakika karıştırArak buz üzerinde örnekleri tutun.</li>
	<li>Her hücre nin süspansiyonuna 12,5 mM EDTA çözeltisi ekleyin ve 7 dakika daha buz üzerinde karıştırmaya devam edin.</li>
	<li>Süspansiyonu 50 mL konik bir tüpe ve santrifüje 9.000-11.000 x g'de 10 dakika 4 °C'de deler.</li>
	<li>Süpernatantları biyolojik tehlike atık kabına atın ve peletleri buzüzerinde tutun.</li>
	<li>Hücre peletine 25 mL arabellek B ekleyin.</li>
	<li>55 μL 1 M MgCl2, 1 μL RNase/DNase nükleaz reaktifi (homojenizasyon dan önce plazmolyz geçiren bakterilerle ilişkili viskozite problemlerini önlemek için) ve hücre peletinin üstünde bulunan tampon B'nin hacmine 1 μL proteaz inhibitörü kokteyli ekleyin</li>
	<li>Tampon B karışımındaki peleti yeniden askıya alın. Homojen bir çözelti gözlemlene kadar boru ve girdap. NOT: Bu protokolün 4. Resuspended hücreleri görünüm ve tutarlılık gibi viskoz kek hamuru olmalıdır.</li>
	<li>15 s. 15 s. Süspansiyonları buz üzerinde koruyun ve Adım 4'e geçin.</li>
</ol>4. Basınçlı Homojenizasyon ve Lysis
NOT: Lysis için çeşitli yöntemler kullanılabilir. Sonication ısı üretimi nedeniyle ideal değildir. Ozmotik lysis elde edilebilir ama genellikle verimsizdir. Bu nedenle yüksek basınçlı sıvı ları öneririz. Yüksek basınçlı lysis çeşitli aletler kullanılarak elde edilebilir. Fransız Basını veya Emusliflex gibi homojenizasyon makinelerini öneriyoruz. Yüksek ozmolar sakaroz çözeltilerine yanıtı değişen birçok Gram-negatif bakteri türüile çalışıyoruz. Yüksek basınçlı homojenizasyon adımı verimliliği, tekrarlanabilirliği ve verimi artırır.
<ol><li>4 °C'de Fransız Press hücresini önceden soğutun veya homogenizer makinesinden metal bobini buzüzerine yerleştirin.</li>
	<li>Numuneyi Fransız basınç hücresine veya homogenizer örnekli silindire dökün ve hücreyi istenilen homojenizasyon basıncı altında getirin (10.000 psi, homogenizer kullanırken Fransız Press'i veya 20.000 psi kullanırken yeterli olmalıdır).</li>
	<li>Bir Fransız Press kullanıyorsanız basıncı korurken çıkış akış hızını saniyede yaklaşık bir damlaya ayarlayın.</li>
	<li>Örnekleri buzda tutarken hücre lisatını 50 mL konik tüpler halinde toplayın.</li>
	<li>4.2-4.4 adımlarını tekrarlayın ve genellikle numunenin saydamlığında kademeli bir artışla belirtilir. NOT: Numune haznesi yıkanmalı ve numuneler arasında Tampon B ile dengelenmelidir.</li>
	<li>Lysed hücreleri buzüzerinde tutun.</li>
</ol>5. Toplam Membran Fraksiyonu
<ol><li>4 °C'de 10 dakika boyunca 6.169 x g'de lized bakteri örneklerini 4 °C'de santrifüj edin ve kalan bozulmamış hücre materyalini peletleyin. (örn. lizisedilmemiş bakteri hücreleri).</li>
	<li>Ultracentrifugation için bir polikarbonat şişe içine homojenize membranlar içeren supernatant, kalan kısmını dağıtın. DİkKAT: Gerekirse, hücre örnekleri tampon B ile seyreltilerek dengelenebilir.</li>
	<li>Ultracentrifuge hücre lysates 184,500 x g için en az 1 saat, 4 °C. Bu adım membranların kalitesini etkilemeden bir gecede yapılabilir.</li>
	<li>Ultracentrifuge tüpünde kalan supernatant mevcut atın ve buz üzerinde membran pelet korumak(Şekil 1).</li>
	<li>Düşük yoğunluklu izopiknik-sakaroz gradyan çözeltisinin 1 mL'lik membran peletlerini cam-dounce homogenizer kullanarak yeniden askıya alın. Numuneyi homojen bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe aktarmak ve buzüzerinde tutmak için cam pasteur pipetkullanın. NOT: Sadece total membran bileşimi analizi isteniyorsa, 1 mL izole membran depolama tamponu için 1 mL düşük yoğunluklu izopiknik-sakaroz gradyan çözeltisi yerine geçilir. Adım 5.5 sadece total-bakteriyel membran örnekleri isteniyorsa izolasyon bitiş noktasıdır. Numuneleri -20 °C'de, daha fazla aşağı analiz gerekli olana kadar saklayın.</li>
</ol>6. Çift Membranları Ayırmak Için Yoğunluk Gradyan Ultracentrifugation
<ol><li>Sallanan kova rotoru ve ultracentrifuge için belirtilen uygun sayıda 13 mL polipropilen veya ultra açık üstü tüplertop.</li>
	<li>
Tüpü hafifçe eğilmiş bir pozisyonda tutun ve sakaroz degradesini yavaş yavaş yüksek yoğunluktan daha düşük yoğunluğa aşağıdaki sırayla ekleyerek hazırlayın: 2 mL %73 w/v sakaroz,1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7,5 4 mL %53 w/v sakaroz, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7,5
	<ol>
<li>Daha sonra% 20 w / v sakaroz çözeltisi (adım 5.5) resuspended olmuştur toplam membran fraksiyonu (1 mL) ekleyin. Altında yatan sakaroz çözeltisi ile membran fraksiyonu karıştırma kaçının. Bölümler bu katmanların her biri arasında görünür olmalıdır.</li>
		<li>Son olarak, tüpü düşük yoğunluklu isopycnic-sucrose gradyan çözeltisi (yaklaşık 6 mL) ile doldurun. Polipropilen ve ultra net üstü tüpler tüp desteği için mümkün olduğunca dolu (tüp üstten 2 veya 3 mm) doldurulmalıdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Acinetobacter baumannii 17978 için ayarlama<ol>
<li>Farklı bakteri örnekleri ile kullanmak için ayarlanmış bir sakaroz gradyanı uyarlayın. A. baumanniiiçin , aşağıdaki sakaroz gradyanı membranların daha eksiksiz ayrılmasını sağladı (Şekil 2). 2 mL %73 w/v sakaroz, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7,5 4 mL %45 w/v sakaroz, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7,5</li>
		<li>Daha sonra% 20 w / v sakaroz çözeltisi (adım 5.5) resuspended olmuştur toplam membran fraksiyonu (1 mL) ekleyin. Altında yatan sakaroz çözeltisi ile membran fraksiyonu karıştırma kaçının. Bölümler bu katmanların her biri arasında görünür olmalıdır.</li>
		<li>Son olarak, tüpü düşük yoğunluklu isopycnic-sucrose gradyan çözeltisi (yaklaşık 6 mL) ile doldurun. Polipropilen ve ultra net üstü tüpler tüp desteği için mümkün olduğunca dolu (tüp üstten 2 veya 3 mm) doldurulmalıdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ultracentrifuge örnekleri bir gecede 288.000 x g ve 4 °C'de sallanan kova rotoru kullanarak. NOT: Önceki adımlarda kullanılan hacimler için 16 saat ile 23 saat arasında santrifüj sürelerini öneririz.</li>
	<li>P1000 pipet ucunun ucunu noktadan yaklaşık 5 mm kesin. Pipetkullanarak üst kahverengi IM tabakasını çıkarın. ULTRAsantrifüj için IM fraksiyonunu polikarbonat şişeye aktarın.</li>
	<li>Alt beyaz OM'nin IM fraksiyonuyla kirlenmediğinden emin olmak için sakaroz çözeltisinin yaklaşık 2 mL'sini %53-73 arabiriminin üzerinde bırakın. OM fraksiyonu için 6.4.Figure 1 NOT: Membranlar da bir iğne kullanarak alt santrifüj tüpleri delerek ve kesirler damla gibi membranlar toplayarak toplanabilir.</li>
	<li>Ultracentrifuge tüpün kalan boşluğunu izole membran depolama tamponuyla doldurun ve ters çevirme veya pipetleme ile karıştırın. Örnekleri buzda sakla.</li>
	<li>1 saat ve 4 °C için 184.500 x g ultracentrifugation tarafından şimdi yıkanmış ve izole membranlar toplayın.</li>
	<li>Supernatant atın ve dounce-homojenizasyon ile membranlar resuspend. 500-1000 μL depolama arabelleği ekleyin. 2 mL mikrosantrifüj tüplerinde numune toplayın.</li>
	<li>Bakteri zarı örneklerini -20 °C'de saklayın.</li>
</ol>7. İki Katmanlı ayrımın onaylanması
NOT: İki katmanlı eksik ayırma teknik hata veya bazı türlerin benzersiz hücre zarf bileşimi nedeniyle oluşabilir. Ayırmayı onaylamak için, iki katmanlar arasındaki çapraz kontaminasyon derecesini ölçmek için iki bağımsız tahlil kullanmanızı tavsiye ederiz. İlk titre, sadece IM'de bulunan NADH dehidrogenazEnzimasının enzimatik aktivitesini algılar. İkinci titre, ağırlıklı olarak OM'de bulunan LOS veya LPS'nin varlığını algılar.
<ol><li>
OSM'lerin IM'lerden izole olduğunu doğrulama
	<ol>
<li>Bradford protein idraki kullanarak her izole membran fraksiyonundaki protein konsantrasyonu ölçün.</li>
		<li>Boş bir 2 mL mikrosantrifüj tüpe 50 ila 500 μg proteine karşılık gelen numune hacmini ekleyin. Konsantrasyon türe bağlı olarak değişir, ancak 50 μg genellikle Enterobacteriaceae için yeterlidir. Toplam 990 μL hacim elde etmek için 10 mM Tris-tampon uygun hacmi ekleyin. İçeriği spektrofotometri için bir cuvette aktarın.</li>
		<li>Numuneye 10 mg/mL NADH çözeltisinin 10 μL'sini ekleyin ve ilk emiciliği 340 nm'de ölçün.</li>
		<li>5 dakika boyunca her 30 s absorbansı ölçmeye devam edin.</li>
		<li>Verileri derle ve emicilik (y ekseni) değişimini, her membran fraksiyonu için zaman (x ekseni) değişimi grafiğiçizin(Şekil 3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
IM'lerin OM'lerden izole olduğunu onaylama
	<ol>
<li>Boş bir 2 mL mikrosantrifüj tüpe 50 ila 500 μg proteine karşılık gelen numune hacmini ekleyin. Konsantrasyon bakteri türlerine bağlı olarak değişir, ancak 50 μg genellikle Enterobacteriaceae için yeterlidir. 100 μL'lik son hacmi fosfat tamponlu tuzlu ile doldurun, bundan böyle sulu faz olarak anılacaktır.</li>
		<li>Sulu faza 5 μL Proteinaz K (stok 800 U/mL) ekleyin ve bir gecede 59 °C'de kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>68 °C'de 10 dakika boyunca 10 mL Tris doymuş Fenol'ü ısıtın.</li>
		<li>Proteinaz K ile tedavi edilen sulu faz örneklerini aşağı doğru çevirin ve sulu faz, girdap ve 10 dakika boyunca 68 °C'de inküble 1:1 oranında "sıcak" Tris-doymuş Fenol ekleyin.</li>
		<li>Şimdi süt-beyaz örnekleri 68 °C'den bir buz-su banyosuna aktarın ve 10 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Numuneleri 4 °C'de 10 dk için 2.100 x g olarak santrifüj edin.</li>
		<li>Üst sulu fazı yeni bir tüpe aktarın ve numune hemen kullanılmaması durumunda tüpü -20 °C'de saklayın.</li>
		<li>Örnekleri SDS yükleme tamponunda seyreltin ve %4-20 Tris-glisin gradyan jelin kuyularını yükleyin.</li>
		<li>Elektrofor 45 dk veya boya-ön jel altında olana kadar.</li>
		<li>Üreticinin talimatlarına uyarak LPS boyama kitini kullanarak jeli lekeleyin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Silhavy, T. J., Kahne, D., Walker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bacterial+cell+envelope%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">The bacterial cell envelope.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 000414(2010).</li>
<li>Egan, A. J., Vollmer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physiology+of+bacterial+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">The physiology of bacterial cell division.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1277, 8-28 (2013).</li>
<li>Pazos, M., Peters, K., Vollmer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+peptidoglycan+growth+by+dynamic+and+variable+multi-protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Robust peptidoglycan growth by dynamic and variable multi-protein complexes.</a> Current Opinion in Microbiology. 36, 55-61 (2017).</li>
<li>Raetz, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymology%2C+genetics%2C+and+regulation+of+membrane+phospholipid+synthesis+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Enzymology, genetics, and regulation of membrane phospholipid synthesis in Escherichia coli.</a> Clinical Microbiology Reviews. 42, 614-659 (1978).</li>
<li>Whitfield, C., Trent, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthesis+and+export+of+bacterial+lipopolysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Biosynthesis and export of bacterial lipopolysaccharides.</a> Annual Review of Biochemistry. 83, 99-128 (2014).</li>
<li>Needham, B. D., Trent, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fortifying+the+barrier%3A+the+impact+of+lipid+A+remodelling+on+bacterial+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Fortifying the barrier: the impact of lipid A remodelling on bacterial pathogenesis.</a> Nature Reviews Microbiology. 11, 467-481 (2013).</li>
<li>Simpson, B. W., Trent, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pushing+the+envelope%3A+LPS+modifications+and+their+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Pushing the envelope: LPS modifications and their consequences.</a> Nature Reviews Microbiology. 17, 403-416 (2019).</li>
<li>Ebbensgaard, A., Mordhorst, H., Aarestrup, F. M., Hansen, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Outer+Membrane+Proteins+and+Lipopolysaccharides+for+the+Sensitivity+of+Escherichia+coli+to+Antimicrobial+Peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The Role of Outer Membrane Proteins and Lipopolysaccharides for the Sensitivity of Escherichia coli to Antimicrobial Peptides.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 2153(2018).</li>
<li>Liu, D., Reeves, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+K12+regains+its+O+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli K12 regains its O antigen.</a> Microbiology. 140 (1), 49-57 (1994).</li>
<li>Kalynych, S., Morona, R., Cygler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+understanding+the+assembly+process+of+bacterial+O-antigen%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Progress in understanding the assembly process of bacterial O-antigen.</a> FEMS Clinical Microbiology Reviews. 38, 1048-1065 (2014).</li>
<li>Osborn, M. J., Gander, J. E., Parisi, E., Carson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+assembly+of+the+outer+membrane+of+Salmonella+typhimurium.+Isolation+and+characterization+of+cytoplasmic+and+outer+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanism of assembly of the outer membrane of Salmonella typhimurium. Isolation and characterization of cytoplasmic and outer membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 247, 3962-3972 (1972).</li>
<li>Osborn, M. J., Munson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+the+inner+%28cytoplasmic%29+and+outer+membranes+of+Gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Separation of the inner (cytoplasmic) and outer membranes of Gram-negative bacteria.</a> Methods in Enzymology. 31, 642-653 (1974).</li>
<li>Cian, M. B., Giordano, N. P., Masilamani, R., Minor, K. E., Dalebroux, Z. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+use+PbgA%2FYejM+to+regulate+lipopolysaccharide+assembly+during+bacteremia%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Salmonella enterica serovar Typhimurium use PbgA/YejM to regulate lipopolysaccharide assembly during bacteremia.</a> Infection and Immunity. , (2019).</li>
<li>Masilamani, R., Cian, M. B., Dalebroux, Z. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+Tol-Pal+Reduces+Outer+Membrane+Glycerophospholipid+Levels+for+Envelope+Homeostasis+and+Survival+during+Bacteremia%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Salmonella Tol-Pal Reduces Outer Membrane Glycerophospholipid Levels for Envelope Homeostasis and Survival during Bacteremia.</a> Infection and Immunity. 86, (2018).</li>
<li>Nikaido, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+Membrane+of+Salmonella-Typhimurium+Transmembrane+Diffusion+of+Some+Hydrophobic+Substances%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Outer Membrane of Salmonella-Typhimurium Transmembrane Diffusion of Some Hydrophobic Substances.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 433, 118-132 (1976).</li>
<li>Dalebroux, Z. D., Matamouros, S., Whittington, D., Bishop, R. E., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PhoPQ+regulates+acidic+glycerophospholipid+content+of+the+Salmonella+Typhimurium+outer+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">PhoPQ regulates acidic glycerophospholipid content of the Salmonella Typhimurium outer membrane.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 1963-1968 (2014).</li>
<li>Castanie-Cornet, M. P., Cam, K., Jacq, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RcsF+is+an+outer+membrane+lipoprotein+involved+in+the+RcsCDB+phosphorelay+signaling+pathway+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">RcsF is an outer membrane lipoprotein involved in the RcsCDB phosphorelay signaling pathway in Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 188, 4264-4270 (2006).</li>
<li>Thorne, K. J., Thornley, M. J., Glauert, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+analysis+of+the+outer+membrane+and+other+layers+of+the+cell+envelope+of+Acinetobacter+sp%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Chemical analysis of the outer membrane and other layers of the cell envelope of Acinetobacter sp.</a> Journal of Bacteriology. 116, 410-417 (1973).</li>
<li>Geisinger, E., Huo, W., Hernandez-Bird, J., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acinetobacter+baumannii%3A+Envelope+Determinants+That+Control+Drug+Resistance%2C+Virulence%2C+and+Surface+Variability%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Acinetobacter baumannii: Envelope Determinants That Control Drug Resistance, Virulence, and Surface Variability.</a> Annual Review of Microbiology. 73, 481-506 (2019).</li>
<li>Kamischke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Acinetobacter+baumannii+Mla+system+and+glycerophospholipid+transport+to+the+outer+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">The Acinetobacter baumannii Mla system and glycerophospholipid transport to the outer membrane.</a> Elife. 8, (2019).</li>
</ol>

Çıkar çatışması bildirilmemiş.

Bu yöntem, bakteri fizyolojisi ve patogenezinde hücre zarfının rolünü anlamada araştırmacılara yardımcı olmaya devam edecektir. Sıralı ultracentrifugation adımları aşağıdaki saflaştırılmış toplam, iç ve OM fraksiyonu elde edilebilir. Bu membranlar, membran protein lokalizasyonu ve fonksiyonu, periplazma boyunca taşınması ve ticareti ve çeşitli çevre koşullarında bireysel iki katmanlı bileşimi ile ilgili hipotezleri test etmek için izole olarak test edilebilir. Los/ LPS ve OM proteinleri gibi bireysel OM bileşenlerinin pa...

Gram-negatif bakteriler periplazmik alan ve peptidoglikan hücre duvarı1ile ayrılan iki membran üretirler. İç membran (IM) sitosol kapsar ve fosfolipidlerin simetrik bir çift katmanlı olduğunu. Peptidoglycan turgor basıncına karşı korur ve bir hücre şekli ile bakteri sağlar, ve dış membranbağlı (OM) lipoproteinler tarafından2,3. OM periplazmayı çevreler ve ağırlıklı olarak asimetriktir. İç broşür fosfolipidler oluşur ve dış broşür lipooligosaccharides olarak bilinen glikolipidler oluşur (LOS) veya lipopolysaccharides (LPS)4,5. Dış broşürdeki LOS/LPS moleküllerinin lipid asimetrisi ve biyokimyası, bakteriyi kendi ortamındaki tehlikelere karşı koruyan hücre yüzeyine bariyer özellikleri verir6,7.
LPS molekülleri üç bileşenden oluşur: lipid A disakkarolipid, çekirdek oligosakkarit, ve O-polisakkarit veya O-antijen. Lipid A, çoğalan bir asilate disakkarolipidtir. Core-oligosakkaritler kaba LPS veya R-LPS olarak bilinen 10-15 şekerden oluşur. Çekirdek iç bölgeye ayrılmıştır, oluşan 2-keto-3-deoksi-D-manno-octulosonic asit (kdo) ve bir veya daha fazla heptozkoz kalıntısı, ve genellikle heksoslar oluşan bir dış bölge (glikoz veya galaktoz) ve heptozlar, veya asetama şekerler5. Dış çekirdek bölgesi bileşenleri ve yapısında iç çekirdekten daha değişkendir. Salmonella spp., sadece bir çekirdek yapısı açıklanmıştır; ancak, Escherichia coli beş farklı çekirdek yapıları (K-12, R1, R2, R3 ve R4)8belirlenmiştir. Bu işlemde kullandığımız E. coli K-12 DH5α, r-LPS9üretimine neden olan bir mutasyon taşır. R-LPS molekülleri O-antijen moiety eksikliği ve LOS molekülleri benzer bir molekül ağırlığına sahip.
R-LPS'ye O-antijen eklenmesi bu molekülü yumuşak LPS veya S-LPS'ye dönüştürür. O-antijenler kısa 3-4 karbonhidrat alt birimlerinden üretilmiştir ve10zincir uzunlukları değişen birden fazla yöntem oluşur. Bazı LPS üreten bakteriler, Salmonella enterica serovar Typhimurium gibi (S. Typhimurium), kendi yüzeyinde LPS moleküllerinin trimodal dağılımını görüntülemek10,11. Çok uzun zincir O-antijenler yüz alt birim içerebilir ve yüz kilodalton üzerinde ağırlığında. O-antijenler antibiyotiklere direnmek, bakteriyofajlar tarafından predation kaçınmak için gerekli olan bakteri yüzey özellikleri sağlar, ve hastalığa neden.
Campylobactertürleri , Bordetella, Acinetobacter, Haemophilus, Neisseria ve diğerleri kendi yüzeyinde LPS molekülleri yerine LOS molekülleri oluşturmak12. LOS molekülleri lipid A ve çekirdek oligosakkaritler oluşur ama O-antijen eksikliği. Gram-negatif bakterilerin Bu tür yüzey özellikleri12değiştirmek için ek şeker ler ve şeker kombinasyonları ile çekirdek oligosakkaritler değiştirmek. Hem LOS hem de LPS üreten mikroplar lipid A ve katyonik moieties7ile çekirdek molekülleri fosfatlar türemiş . Bu eklemeler fosfoetanolamin içerir, galaktosamin ve aminoarabinose ikameler, anyonik yüzey yükü nötralize ederek işlev ve bu nedenle katyonik antimikrobiyal peptidler karşı koruma. Gram-negatif bakteriler de şekerdeğişken olmayan stoiyometrik ikame ile çekirdek oligosakkarit yapısını değiştirmek, ya da ekstra kdo molekülleri, ve lipid-A disaccharolipidler üzerinde asil zincirlerin sayısını değiştirmek7.
Yeteneği Gram-negatif bakterilerin OM im izole etmek için antimikrobiyal direnç ve hastalık patogenezi hücre zarfının rolünü anlamak için etkili olmuştur11,12. Bu yaklaşımın türevleri, OM için protein, fosfolipid ve glikolipid bileşenlerinin montaj, bakım ve yeniden biçimlendirilmesi mekanizmalarını saptamak için kullanılmıştır.
Laboratuvarımız, çeşitli Gram-negatif türlerde protein aracılı lipid regülasyonu ve lipid fonksiyonunu incelemek için rutin olarak bakteriyel lipidomik analizler yapar. Protokolde kullanılan hacimler ince tabaka kromatografisi ve sıvı kromatografi tandem kütle spektrometresi13,14ile radyoetiketli olmayan fosfolipidleri analiz etmek için bu işlemin rutin kullanımını yansıtır.
Protokol, Gram-negatif bakterilerin soğutulmuş süspansiyonunun yüksek ozroz çözeltisine maruz kalmaları ve OM'yi altta yatan peptidoglikan tabakasından ayrıştırmak için lisozyme ekleyerek başlar (Şekil 1)12. EDTA daha sonra lizozim penetrasyon kolaylaştırmak için eklenir, divalent katyon sekestrasyon komşu LOS / LPS molekülleri arasındaki lateral elektrostatik köprü etkileşimleri bozar beri15. Bizimkinin uyarlandığı orijinal protokol, plazma zarı ve sitosoldan oluşan gram-negatif bakteri hücresi formu olan sferoplastların oluşumunu gerektiriyordu, ancak peptidoglikan tabakası ve OM'den yoksun. Spheroplastların uyarlanmış yöntemle üretilmeleri mümkündür; ancak, teknik, başarı için kendi oluşumuna güvenmez veya niyet etmez. Bunun yerine, lysozyme-EDTA tedavi edilen bakteriler santrifüj ile hızla hasat edilir ve basınçlı lysis önce daha az konsantrasyon bir sakaroz çözeltisi yeniden askıya alınır. Spheroplastlar oluşturarak serbest bırakılmış olabilecek OM'ler teorik olarak tedavi edilen hücrelerin süpernatants hasat edilmelidir, ancak bu yaklaşım burada ayrıntılı değildir. Sonuçta, tedavi hücreleri membran ayırma prosedürü16verimliliğini ve tekrarlanabilirliğini artırır konvansiyonel homojenizasyon ve lysis, tabi tutulur.
Lysis'ten sonra, toplam membranlar ultrasantrifüj ile toplanır ve IM'ler ve OM'leri fraksiyonetmek için sürekli sakaroz yoğunluğu gradyan uygulamasına uygulanır. Klasik yaklaşım en az beş farklı sakaroz çözeltisi11,,12oluşur daha sürekli bir degrade kullanır. Protokolümüzdeki kesintili degrade üç sakaroz çözeltisi oluşur ve iki kat iki farklı kesirler17bölümlür. Gram-negatif bakterilerin OM'leri içindeki LOS ve LPS molekülleri zarfı üst kahverengi düşük yoğunluklu BIR IM fraksiyonuna ve daha düşük beyaz yüksek yoğunluklu OM fraksiyonuna bölmeye iter(Şekil 1 ve Şekil 2).
Acinetobacter baumannii kendi OM LOS molekülleri üretmek ve ayırmak zor bir hücre zarfı dik önemli multidrug dirençli insan patojenler vardır18,19. Son çalışmalar, burada sunduğumuz protokolün bir türemiş bu organizmaların iki katmanlı20bölünmesi için kullanılabilir düşündürmektedir. Bu nedenle protokolümüzü A. baumannii 17978'de test ettik. Başlangıçta, prosedür yetersizdi. Ancak orta yoğunluk çözeltisinin sakaroz konsantrasyonu ve büyük ölçüde geliştirilmiş ayırma(Şekil 2)olarak değiştirildi. A. baumannii,yabani tip S. için ayrışmayı doğrulamak için NADH dehidrogenaz tayini ve LOS/LPS ekstraksiyon ve algılama prosedürü kullanılmıştır. Tiphimurium ve iki O-antijen eksikliği enterobakteriyel genotip; yani, galE-mutant S. Tiphimurium ve laboratuvar suşu, E. coli DH5α (Şekil 3 ve Şekil 4).
Bu çalışmanın amacı, Gram-negatif bakterilerin zarlarını tekrarlı bir şekilde izole etmek için düzenli bir yaklaşım sağlamaktır. Protokol bu mikroplar için membran ilişkili moleküllerin birçok türde çalışma için kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>1 L Santrifüj şişeleri, PC/PPCO, süper hızlı, sızdırmazlık kapaklı, Nalgene</td><td>VWR</td><td>525-0466</td><td></td></tr><tr><td>1 L Pyrex Yüksek Sıcaklık Kapaklı Medya Saklama Şişesi</td><td>VWR</td><td>10416-312</td><td></td></tr><tr><td>2.000 mL Erlenmeyer Şişesi, Dar Ağızlı</td><td>VWR</td><td>10545-844</td><td></td></tr><tr><td>%4-20 mini PROTEAN Prekast Protein Jelleri, 12 kuyulu</td><td>BIORAD</td><td>4561095</td><td></td></tr><tr><td>4x Laemmli Numunesi Tampon 10 mL</td><td>BIORAD</td><td>1610747</td><td></td></tr><tr><td>50 mL steril polipropilen santrifüj tüpleri</td><td>VWR</td><td>89049-174</td><td></td></tr><tr><td>7 mL İki Cam Havaneli Dounce Doku Homojenizatörü</td><td>VWR</td><td>71000-518</td><td></td></tr><tr><td>70 mL polikarbonat şişe montajı</td><td>Beckman Coulter Yaşam Bilimleri</td><td>355622</td><td></td></tr><tr><td>Agar Tozu</td><td>VWR</td><td>A10752</td><td></td></tr><tr><td>B10P Tezgah Üstü pH Probu ile pH Metre</td><td>VWR</td><td>89231-664</td><td></td></tr><tr><td>Barnstead GenPure xCAD Plus UV/UF - TOC (tezgah üstü model)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>50136146</td><td></td></tr><tr><td>Benzonaz Nuclease</td><td>MilliporeSigma</td><td>70746-3</td><td></td></tr><tr><td>EDTA disodyum tuzu dihidrat %99,0-101,0, kristaller, ultra saf Biyoreaktif Moleküler biyoloji sınıfı, J.T. Baker</td><td>VWR</td><td>4040-01</td><td></td></tr><tr><td>EmulsiFlex-C3</td><td>Avestin, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiberlite F13-14 x 50cy Sabit Açılı Rotor</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75006526</td><td></td></tr><tr><td>Hidroklorik asit 6.0 N</td><td>VWR</td><td>BDH7204</td><td></td></tr><tr><td>IBI Bilimsel Yörünge Platform Çalkalayıcı</td><td>Fischer Scientific</td><td>15-453-211</td><td></td></tr><tr><td>LB Et Suyu Değirmenci</td><td>VWR</td><td>214906</td><td></td></tr><tr><td>Lizozim, Yumurta Akı, Ultra Saf Sınıf</td><td>VWR</td><td>VWRV0063</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum klorür hekzahidrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>NADH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10107735001</td><td></td></tr><tr><td>Optima XPN-80 - IVD</td><td>Beckman Coulter Yaşam Bilimleri</td><td>A99839</td><td></td></tr><tr><td>Pharmco Ürünleri&nbsp; SAF ALKOL 200 KANIT GL 4/CS&nbsp;</td><td>Fischer Scientific</td><td>NC1624582</td><td></td></tr><tr><td>Fenol Çözeltisi, 10 mM Tris HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, BioReagent ile Dengelenmiş, moleküler biyoloji için</td><td>Sigma - Millipore</td><td>P4557</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Coomassie Plus (Bradford) Test</td><td>Kiti Thermofisher</td><td>23238</td><td></td></tr><tr><td>Pro-Q zümrüt 300 Lipopolisakkarit Jel Leke Kiti</td><td>Thermofisher</td><td>P20495</td><td></td></tr><tr><td>Proteacease -50, EDTA içermez</td><td>G Biosciences</td><td>786-334</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaz K, Moleküler Biyoloji Sınıfı</td><td>New England Biolabs</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit ve ge; %99,99</td> <td>VWR</td><td>AA45780-22</td><td></td></tr><tr><td>Sorval RC 6 Plus Santrifüj</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>36-101-0816</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>MilliporeSigma</td><td>SX1075-3</td><td></td></tr><tr><td>SW 41 Ti Sallanan Kova Rotoru</td><td>Beckman Coulter Yaşam Bilimleri</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hidroksimetil)aminometan (TRIS, Trometamol) &ge; %99,9 (kurutulmuş bazda), ultra saf Biyoreaktif Moleküler biyoloji sınıfı, J.T. Baker</td><td>VWR</td><td>JT4109-6</td><td></td></tr><tr><td>Tip 45 Ti Sabit Açılı Titanyum Rotor</td><td>Beckman Coulter Yaşam Bilimleri</td><td>339160</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Şeffaf Tüp, 14 x 89mm</td><td>Beckman Coulter Yaşam Bilimleri</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>VWR</td><td>102091-234</td><td></td></tr></tbody></table>

gram-negatif bakteriler için hücre zarfının İç ve dış membran fraksiyonlarına ayrılması acinetobacter baumannii için teknik ayarlamalar

Separation of the Cell Envelope for Gram-negative Bacteria into Inner and Outer Membrane Fractions with Technical Adjustments for Acinetobacter baumannii

Bu yöntem, Gram-negatif bakterilerin zarfını total, iç ve dış membran (OM) fraksiyonlarına bölme ile çalışır ve iki katmanlı saflığı değerlendirmek için tahlillerle sonuçlandırır. OM iç membran ile karşılaştırıldığında artan bir genel yoğunluğu vardır, büyük ölçüde lipooligosaccharides varlığı nedeniyle (LOS) ve lipopolisakkaritler (LPS) dış broşür içinde. LOS ve LPS molekülleri benzer bir yapıya sahip amphipatif glikolipidler, bir lipid-A disakkarolipid ve çekirdek-oligosakkarit ikame oluşur. Ancak, sadece LPS molekülleri O-polisakkarit veya O-antijen olarak bilinen üçüncü bir alt birim ile dekore edilmiştir. Mevcut glikolipidlerin türü ve miktarı bir organizmanın OM yoğunluğunu etkileyecektir. Bu nedenle, çeşitli glikolipid içeriğine sahip bakterilerin zarlarının da tekniğimizle benzer şekilde izole edilip edilmeyeceğini test ettik. LPS üreten organizmalar için, Salmonella enterica serovar Typhimurium ve Escherichia coli, membranlar kolayca izole edildi ve LPS O-antijen moiety iki katmanlı bölümleme etkilemedi. Acinetobacter baumannii, O-antijen eksikliği LPS moleküllerine benzer kütleye sahip LOS molekülleri üretir; ancak, bu mikropların membranlar başlangıçta ayrılmış olamazdı. A. baumannii om'unun Enterobacteriaceae'den daha az yoğun olduğunu, bu nedenle sakaroz gradyanının ayarlandığını ve membranların izole edildiğini gerekçe gösterdik. Bu nedenle teknik uyarlanabilir ve diğer organizmalarile kullanılmak üzere değiştirilebilir.

Bu teknik, Gram-negatif bakteriler için IM'leri ve OM'leri izole etmek için etkili bir araç sağlar. Tüm yordamın anahat gösterilmiştir (Şekil 1). Genel olarak, 1 L'de 0.6-0.8'lik bir OD600'e kültürlerin normalleştirilmesi veya 6.0 ile 8.0 x 1011 bakteri hücresi arasında hasat edilmesi, sonraki ayırma için uygun miktarda membran materyalinin toplanmasını sağlayacaktır.
Bakterilerin lysing ve lysate ultracentrifuging üzerine, yapışkan kahvereng...

Gram-negatif bakteriler iki mekansal olarak ayrılmış membran üretirler. Dış zar bir periplazm ve peptidoglikan tabakası ile iç zardan bölümlenir. Bu mikropların çift iki katmanlı izole yeteneği fizyolojisi ve patogenezini anlamak için kritik olmuştur.

Gram-negatif Bakteriler için Hücre Zarfının İç ve Dış Membran Fraksiyonlarına Ayrılması Acinetobacter baumannii için Teknik Ayarlamalar

This method works by partitioning the envelope of Gram-negative bacteria into total, inner, and outer membrane (OM) fractions and concludes with assays to ...

Mikropların bireysel iki katmanlı kimyasal bileşiminasıl düzenlediğini incelemek antibiyotik öldürme mekanizmaları, antimikrobiyal direnç ve hastalık patogenezi hakkındaki bilgimizi bilgilendirecektir. Bu teknik, gram-negatif bakterilerin hücre zarfını deterjan kullanmadan iki tanımlanmış fraksiyona ayırır. Bu nedenle, lipidler, proteinler ve şekerler yarı yerli bir ortamda değerlendirilebilir.Bazı adımlar zamana bağlıdır ve odaklanma ve koordinasyon gerektirir. Başlangıçta, bir veya iki örnek kullanın. Kişinin konfor seviyesi arttığında, daha fazla örnek eklenebilir.Aynı anda en fazla altı örnek ele alınmalıdır. Bu çok günlük bir yordamdır ve görsel kontrol noktaları etkinliğini ve hatayı değerlendirmek için yararlıdır. Bu bazen son adımları gerçekleştirmeden önce.Taze agar plakaları üzerine dondurulmuş gliserol stokları gelen bakterileri streak. Koloniler geliştikten sonra plakaları dört santigrat derecede saklarlar. Bir gecede istenildiği gibi et suyu medya ve kültür bakteri dolu beş mililitrelik tüp aşılamak için tek bir koloni kullanın.Geri tercih edilen et suyu medya bir litre içine bir gecede bakteri kültürü seyreltmek ve şişeleri inkübün. İstenilen optik yoğunluk elde edildiğinde, şişeleri kuvözden çıkarın ve buza yerleştirin. Kültürün optik yoğunluğunu 600 nanometre olarak ölçün ve 10 bakteri kolonisi oluşturan ünitelere altı ila sekiz kat 10'a eşdeğer kültür hacmini hesaplayın.Bir santrifüj tüpüne bu kültür hacmini ekleyin ve kalan kültürlerin kullanılacak olana kadar buzda kalmasını sağlayın. Pelet sabit bir açı, 7, 000-10, 000 kez G ve dört derece santigrat yüksek hızlı santrifüj 10 dakika santrifüj için santrifüj ile bakteri. Dikkatle supernatant decant ve atın.Tampon A.A.12.5 mililitre her hücre pelet resuspend hücre süspansiyon için bir manyetik karıştırma çubuğu ekleyin. Her hücre resuspension için mililitre lysozyme başına 10 miligram 180 mikrolitre ekleyin. Santrifüj ile tedavi edilen lysozyme EDTA bakterisini topladıktan sonra, bakterilere proteaz inhibitörü, magnezyum klorür ve nükleazı hızla ekleyin ve tampon B.Stir'deki hücreleri iki dakika boyunca hızla yeniden askıya alın ve süspansiyonları buzda tutarak tekrar layın.Daha sonra, her hücrenin yeniden süspansiyon 12,5 mililitre 1.5 mililitre EDTA çözeltisi ekleyin ve ek bir yedi dakika boyunca buz üzerinde karıştırmaya devam edin. Süspansiyonları 15 mililitrelik konik tüplere ayırın. Süspansiyonları 9, 000 ila 11, 000 kez G'yi 10 dakika 4 santigrat derecede santrifüj edin.Supernatants bir biyolojik atık konteyner içine atın ve buz üzerinde pelet tutun. Her hücre peletine 25 mililitre arabellek B ekleyin. Daha sonra, bir molar magnezyum klorür 55 mikrolitre, rnase / dnase / nükleaz reaktif bir mikrolitre ve proteaz inhibitörü kokteyl bir mikrolitre ekleyin.Karışımdaki peletleri yeniden askıya alın. Çözeltiler homojen görünene kadar güçlü bir şekilde pipet ve girdap. Süspansiyonları buzda saklayın.Örneği homogenizer örnek silindirine dökün ve hücreyi 20,000 PSI'ya getirin. Patojenlerin aerosolizasyonunu önlemek için, basınçlı cihazı tampon B'de koşullandırmak ve bakteriyel süspansiyon eklemeden önce basınç seviyelerini ayarlayın. Önlem olarak basınç hücresini devreye alın ve 10 mililitre tampon B'yi ima edin.Ayrıca buz üzerinde 50 mililitrekonik tüpler hücre lysate toplamak. Tam bir lisis elde etmek için, bu işlemi 3-5 kez tekrarlayın. Kalan, bozulmamış hücre materyalini, 6, 169 kez G ve 4 santigrat derece 10 dakika lized bakteri örneklerini santrifüj etmek için.Şimdi homojenize membranlar içeren supernatants dağıtın, ultracentrifugation için polikarbonat şişeler halinde. Ultracentrifuge hücre lysates 184, 500 kez G ve dört derece santigrat en az bir saat için. Supernatants atın ve buz üzerinde membran pelet tutun.Bir cam kullanarak, Homogenizer Dounce, düşük yoğunluklu izopiknik sakaroz gradyan çözeltisi bir mililitre membran pelet resuspend. Daha sonra, 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne örnek homojen aktarmak ve buz üzerinde tüp yerleştirmek için bir cam, Pasteur pipet kullanın. Sakaroz gradyanı hazırlamak için polipropilen veya Ultra açık açık bir tüpü hafif çetrene bir pozisyonda tutun.Yavaşça yüksek yoğunluklu sakaroz çözeltisi iki mililitre ekleyin. Sonra düşük yoğunluklu sakaroz çözeltisi dört mililitre ekleyin. Yoğunluk gradyanı hazırlanırken, katmanları karıştırmamak için sakaroz çözeltisini yavaşça ekleyin.Sakaroz tabakaları hafifçe görünür olmalı ve genel olarak tanımlanmış görünmelidir. Daha sonra, daha önce düşük yoğunluklu bir mililitre resuspended oldu toplam membran fraksiyonu ekleyin, izopyknik sakaroz çözeltisi. Son olarak, düşük yoğunluklu yaklaşık altı mililitre ekleyerek tüpün geri kalanını doldurun, isopycnic sucrose gradyan çözeltisi.Ultracentrifuge örnekleri 288, 000 kez G ve dört derece santigrat 16 ila 23 saat için bir sallanan kova rotor kullanarak. Bir P1000 pipet ucu noktadan yaklaşık beş mililitre uç kesti. Santrifüj tamamlandıktan sonra, tüpüst, kahverengi tabaka kaldırmak için pipet kullanın.İç zar fraksiyonu içeren bu katmanı ultra santrifüj için polikarbonat şişeye aktarın. Alt, beyaz, dış membran fraksiyonunun iç zar fraksiyonuna geçmemesini sağlamak için %53 sakaroz ve %73 sakaroz arasındaki arayüz üzerinde yaklaşık iki mililitre sakaroz çözeltisi bırakın. Yine uç kaldırıldı ile bir P1000 pipet ucu kullanarak, dış membran tabakası kaldırmak ve bir polikarbonat şişe aktarın.Polikarbonat şişenin kalan boşluğunu izole membran depolama tamponuyla doldurun ve ters çevirme veya pipepetting ile karıştırın. Örnekleri buzda sakla. Membranları toplamak için, 184, 500 kez G ve dört santigrat derece bir saat için polikarbonat şişeultracentrifuge.Son olarak, supernatants atın ve depolama arabellek 500 ila 1.000 mikrolitre ekleyin. Dounce homojenizasyon ile membranları yeniden askıya alın. Örnekleri iki mililitrelik mikrosantrifüj tüplerinde toplayın.Toplam membran peletleri kazınmış, dounce homojenize edilmiş ve iç ve dış membranları ayırmak için sakaroz yoğunluk gradyanları üzerinde ultracentrifuged. Sakaroz yoğunluğu gradyanı %20 %53%73 bazı bakteri suşlarının bölümlendirilmesi için yeterliydi. Ama başarıyla% 20% 45% 73 gradyan kullanılarak bölümlenmiş A.baumannii bölümleme için değil.Ayırmanın etkinliğini değerlendirmek için membran örnekleri bakteriyel iç zarda bulunan bir enzim olan NADH dehidrogenaz için test edildi. 340 nanometredeki optik yoğunluktaki azalma enzimin varlığını gösteriyordu. Optik yoğunluk, yabani tip S.typhimurium, E.coli K12 DH5a ve galE mutant S.typhimurium'dan alınan iç ve dış membran fraksiyonlarının 50 mikrogramlık örnekleri için ölçüldü.A.baumannii membran fraksiyonlarının saflığını söylerken daha yüksek bir protein konsantrasyonu eklendi, çünkü 50 mikrogram lık bir ilk tetkik, NADH dehidrogenazın göreceli düzeylerinin A.baumannii için diğer bakteri suşlarına göre daha düşük olduğunu gösterdi. Dış membran fraksiyonları ile iç membran fraksiyonlarının çapraz kontaminasyonunu değerlendirmek için LPS ve LOS ayıklandı ve görselleştirildi. Özler bir poliakrilamid jel üzerine yüklendi ve Pro-Q Zümrüt 300 ile lekeli.Acinetobacter baumannii bir öncelik, çok ilaca dirençli, insan patojen. Bu protokol, bu eşsiz ve önemli patojenin direnç ve virülans mekanizmalarında lipooligosakkaritler, fosfolipidler ve lipoproteinlerin rollerini anlamada araştırmacılara yardımcı olmalıdır. Bu yöntem, genellikle gram-negatif bakterilerin çift membraniçinde mevcut fosfolipidler, glikolipidler karbonhidratlar, proteinler ve küçük moleküllerin downstream analizi için idealdir.

separation-cell-envelope-for-gram-negative-bacteria-into-inner-outer

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Yalıtım için Yöntem Francisella tularensis Dış Membranlar

Kaynak: Cian, M. B. et. al., Acinetobacter baumannii için Teknik Ayarlamalarla Gram Negatif Bakteriler için Hücre Zarfının İç ve Dış Zar Fraksiyonlarına Ayrılması. J. Vis. Uzm. (2020)Bu video, sükroz gradyan ultrasantrifüjleme kullanılarak Gram negatif bakterilerin iç ve dış zar fraksiyonlarının ayrılmasını göstermektedir. Membran fraksiyonları, membrana özgü bileşenlerin hedefli analizi için saflaştırılır ve düşük sıcaklıklarda saklanır.

Gram Negatif Bakterilerin İç ve Dış Zar Fraksiyonlarının Ayrılması

Kaynak: Watson, DC, et.al. Escherichia coli ve Diğer Bakterilerden Hücre Dışı Veziküllerin Ölçeklenebilir İzolasyonu ve Saflaştırılması. J. Vis. Uzm. (2021)Bu video, genetiği değiştirilmiş bakterilerin dış zarından türetilen hücre dışı veziküllerin (EV'ler) izolasyonunu ve konsantrasyonunu göstermektedir. İşlem, EV'leri serbest bırakmak için bakterilerin kültürlenmesini, ardından hücreleri ve kalıntıları uzaklaştırmak için sıralı santrifüjleme ve filtreleme adımlarını içerir. Son olarak,...

Dış Zar Kaynaklı Hücre Dışı Veziküllerin Bakterilerden İzolasyonu ve Zenginleştirilmesi

Kaynak: Figueroa, D. ve diğerleri. Antimikrobiyal peptit lokalizasyonunu karakterize etmek için bakteriyel sferoplastlar ve protoplastların üretimi ve görselleştirmesi. J. Vis. Exp. (2018).Bu video, çubuk şeklinde, gram-negatif bakterilerden sferoplastların hazırlanmasını gösteriyor. Bakteriler, bir antibiyotik varlığında yetiştirilerek uzun filamentler oluşturur. Bunlar hipertonik bir çözeltiyle yıkanır ve dış hücre duvarını çıkarmak için liz tamponu ile işlenilir. Hipotonik tedavi, soğutulmuş...

Gram-negatif bakterilerden sferoplastların üretimi

Biz, Pseudomonas aeruginosa'dan akış pompaları in vitro incelenmesi için bir protokol mevcut. Bu protokol, lipozom zarı içinde sağlam, tersinir ve ayarlanabilir proton gradyanının oluşturulması için izin verir ve bu nedenle protomotive güç ile enerji herhangi bir zar proteini için uyarlanabilir olmalıdır.

Pseudomonas aeruginosa itibaren MexAB dışa atım pompa in vitro olarak incelenmesi

Bakteri hücre duvarı peptidoglikan, peptitler tarafından çaprazlanmış şeker iplikçiklerinden oluşan bir makromoleküler ağdır. Ultra Performanslı Sıvı Kromatografi, peptidoglikan kompozisyonunun yeni keşifleri için yüksek çözünürlük ve verim sağlar. Hücre duvarlarının izolasyonu (sakculi) ve daha sonra UPLC aracılığıyla analize hazırlanmaları için bir prosedür sunuyoruz.

Ultra Performanslı Sıvı Kromatografisi ile Bileşimsel Analiz için Bakteriyel Hücre Duvarlarının İzolasyonu ve Hazırlanması

Periplasmic Geçiş metalleri refakatçi yerli bağlama ortakları bağlamında ve x-ışını Floresans ve radiometal alımını sundu tarafından substrat içeriğini biyofiziksel karakterizasyonu çıkarılması için bir protokol.

Ayagin Gram-negatif bakterilerde temel Metal alımı: x-ışını Floresans, Radioisotopes ve hücre ayırma

Burada Ayagin Gram-negatif Escherichia coli (e.coli) üretmek için bir protokol mevcut spheroplasts ve gram-pozitif Bacillus megaterium (B. megaterium) önceki açıkça görselleştirmek ve hızla karakterize peptid-bakteri etkileşimler. Bu yerelleştirme ve peptidler translocating membran tanımlamak için sistematik bir yöntem sağlar.

Üretim ve bakteriyel Spheroplasts ve önceki antimikrobiyal peptid yerelleştirme karakterize etmek için görselleştirme

Gram-negatif bakterilerde doymak üzere transpozon mutant kütüphaneleri oluşturmak ve daha sonra yüksek işlemli sıralama için DNA amplicon kütüphanelerinin hazırlanmasını tanımlayan bir yöntem. Örnek olarak, biz ESKAPE patojen, Acinetobacter baumanniiodaklanmak , ama bu protokol Gram-negatif organizmaların geniş bir yelpazede için münasip olduğunu.

Yüksek İşlem Likör Sıralaması Için Gram-Negatif Bakterilerde Transposon Ekleme Kitaplıkları Oluşturma

Bakteriler, biyoaktif biyolojik moleküller taşıyan nanometre boyutunda hücre dışı veziküller (EV'ler) salgılarlar. EV araştırması, biyogenezlerini, mikrop-mikrop ve konakçı-mikrop etkileşimlerindeki rollerini ve bunların potansiyel terapötik uygulamalarını anlamaya odaklanmaktadır. EV araştırmalarının standardizasyonunu kolaylaştırmak için EV'lerin çeşitli bakterilerden ölçeklenebilir izolasyonu için bir iş akışı sunulmaktadır.

Ölçeklenebilir İzolasyon ve Escherichia coli ve Diğer Bakterilerden Hücre Dışı Veziküllerin Saflaştırılması

Mini-Tn7 tabanlı bir ekspresyon sistemi kullanarak bir akış pompası geninin tek kopyalı kromozomal tamamlayıcısı için tasarlanmış bir akış eksikliği olan Acinetobacter baumannii suşuna kolay bir prosedür tarif ediyoruz. Bu hassas genetik araç, çoklu ilaca dirençli patojenlerde akış pompalarının karakterizasyonu için anahtar olan kontrollü gen ekspresyonuna izin verir.

Acinetobacter baumannii'de Akış Eksikliği Olan Bir Bakteri Suşu ve Tek Kopyalı Gen Ekspresyon Sistemi Kullanılarak Çoklu İlaç Akış Sistemlerinin Karakterize Edilmesi

Öğrenin gram-negatif bakterilerin hücre zarfını deterjan kullanmadan iç ve dış membran fraksiyonlarına ayırma tekniğini. Bu yöntem Acinetobacter baumannii gibi patojenlerde antibiyotik direnci ve virülans mekanizmalarını anlamak için değerlidir.

Gram-negatif Bakteriler için Hücre Zarfının İç ve Dış Membran Fraksiyonlarına Ayrılması Acinetobacter baumannii için Teknik Ayarlamalar (Video) | JoVE Journal

Gram-negatif Bakteriler için Hücre Zarfının İç ve Dış Membran Fraksiyonlarına Ayrılması Acinetobacter baumannii için Teknik Ayarlamalar

Daha fazla video keşfet