Name: Farelerde grip A Virüs Enfeksiyonu Sırasında T Foliküler Yardımcı Hücrelerin ve Germinal Merkez Yanıtının Değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Öğrenin, farelerde influenza A virüsü enfeksiyonu sırasında T foliküler yardımcı hücre ve germinal merkez yanıtlarını değerlendirme yöntemlerini. Bu protokoller, immunoloji araştırmalarında yüksek afiniteli antikor üretimini anlamak için kritik öneme sahiptir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Debi sitometri tesisi, ABSL2 tesisi ve Şanghay Institut Pasteur SPF hayvan tesisi personeline teknik yardımları ve tavsiyeleri için teşekkür ederiz. Bu çalışma aşağıdaki hibelerle desteklendi: Çin Bilimler Akademisi Stratejik Öncelikli Araştırma Programı (XDB29030103), Çin Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı (2016YFA0502202), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (31570886).

<ol><li>Johnston, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl6+and+Blimp-1+are+reciprocal+and+antagonistic+regulators+of+T+follicular+helper+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bcl6 and Blimp-1 are reciprocal and antagonistic regulators of T follicular helper cell differentiation.</a> Science. 325 (5943), 1006-1010 (2009).</li>
<li>Nurieva, R. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl6+mediates+the+development+of+T+follicular+helper+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bcl6 mediates the development of T follicular helper cells.</a> Science. 325 (5943), 1001-1005 (2009).</li>
<li>Yu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+repressor+Bcl-6+directs+T+follicular+helper+cell+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The transcriptional repressor Bcl-6 directs T follicular helper cell lineage commitment.</a> Immunity. 31 (3), 457-468 (2009).</li>
<li>Pedros, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+TRAF-like+motif+of+the+inducible+costimulator+ICOS+controls+development+of+germinal+center+TFH+cells+via+the+kinase+TBK1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">A TRAF-like motif of the inducible costimulator ICOS controls development of germinal center TFH cells via the kinase TBK1.</a> Nature Immunology. 17 (7), 825-833 (2016).</li>
<li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+T-helper+cell+recruitment+governed+by+bystander+B+cells+and+ICOS-driven+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Follicular T-helper cell recruitment governed by bystander B cells and ICOS-driven motility.</a> Nature. 496 (7446), 523-527 (2013).</li>
<li>Lee, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cell+priming+for+extrafollicular+antibody+responses+requires+Bcl-6+expression+by+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">B cell priming for extrafollicular antibody responses requires Bcl-6 expression by T cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 208 (7), 1377-1388 (2011).</li>
<li>Zotos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-21+regulates+germinal+center+B+cell+differentiation+and+proliferation+through+a+B+cell-intrinsic+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">IL-21 regulates germinal center B cell differentiation and proliferation through a B cell-intrinsic mechanism.</a> The Journal of Experimental Medicine. 207 (2), 365-378 (2010).</li>
<li>Vogelzang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fundamental+role+for+interleukin-21+in+the+generation+of+T+follicular+helper+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">A fundamental role for interleukin-21 in the generation of T follicular helper cells.</a> Immunity. 29 (1), 127-137 (2008).</li>
<li>Ansel, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemokine-driven+positive+feedback+loop+organizes+lymphoid+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A chemokine-driven positive feedback loop organizes lymphoid follicles.</a> Nature. 406 (6793), 309-314 (2000).</li>
<li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1+Controls+Follicular+T+Helper+Cell+Positioning+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">PD-1 Controls Follicular T Helper Cell Positioning and Function.</a> Immunity. 49 (2), 264-274 (2018).</li>
<li>Methot, S. P., Di Noia, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Mechanisms+of+Somatic+Hypermutation+and+Class+Switch+Recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+ImmunoChemical%22%5BJournal%5D)">Molecular Mechanisms of Somatic Hypermutation and Class Switch Recombination.</a> Advanced ImmunoChemical. 133, 37-87 (2017).</li>
<li>Crotty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+helper+CD4+T+cells+%28TFH%29%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Follicular helper CD4 T cells (TFH).</a> Annual Review of Immunology. 29, 621-663 (2011).</li>
<li>Calame, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+cells%3A+finding+new+light+at+the+end+of+B+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Plasma cells: finding new light at the end of B cell development.</a> Nature Immunology. 2 (12), 1103-1108 (2001).</li>
<li>Yoo, J. K., Fish, E. N., Braciale, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LAPCs+promote+follicular+helper+T+cell+differentiation+of+Ag-primed+CD4%2B+T+cells+during+respiratory+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">LAPCs promote follicular helper T cell differentiation of Ag-primed CD4+ T cells during respiratory virus infection.</a> The Journal of Experimental Medicine. 209 (10), 1853-1867 (2012).</li>
<li>Leon, B., Bradley, J. E., Lund, F. E., Randall, T. D., Ballesteros-Tato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxP3%2B+regulatory+T+cells+promote+influenza-specific+Tfh+responses+by+controlling+IL-2+availability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">FoxP3+ regulatory T cells promote influenza-specific Tfh responses by controlling IL-2 availability.</a> Nature Communications. 5, 3495(2014).</li>
<li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+protein+1+promotes+follicular+helper+T+cell+differentiation+and+antibody+production%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix protein 1 promotes follicular helper T cell differentiation and antibody production.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (34), 8621-8626 (2018).</li>
<li>León, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+TH2+development+by+CXCR5%2B+dendritic+cells+and+lymphotoxin-expressing+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Regulation of TH2 development by CXCR5+ dendritic cells and lymphotoxin-expressing B cells.</a> Nature Immunology. 13 (7), 681-690 (2012).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+Foxp1+is+a+critical+negative+regulator+of+the+differentiation+of+follicular+helper+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">The transcription factor Foxp1 is a critical negative regulator of the differentiation of follicular helper T cells.</a> Nature Immunology. 15 (7), 667-675 (2014).</li>
<li>Bouvier, N. M., Lowen, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+Models+for+Influenza+Virus+Pathogenesis+and+Transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Animal Models for Influenza Virus Pathogenesis and Transmission.</a> Viruses. 2 (8), 1530-1563 (2010).</li>
<li>Miyauchi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+neutralizing+influenza+antibody+response+in+the+absence+of+T+follicular+helper+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Protective neutralizing influenza antibody response in the absence of T follicular helper cells.</a> Nature Immunology. 17 (12), 1447-1458 (2016).</li>
<li>Rodriguez, L., Nogales, A., Martinez-Sobrido, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+A+Virus+Studies+in+a+Mouse+Model+of+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection.</a> Journal of Visualized Experiments. (127), (2017).</li>
<li>Kitano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl6+protein+expression+shapes+pre-germinal+center+B+cell+dynamics+and+follicular+helper+T+cell+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Bcl6 protein expression shapes pre-germinal center B cell dynamics and follicular helper T cell heterogeneity.</a> Immunity. 34 (6), 961-972 (2011).</li>
<li>Yusuf, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germinal+center+T+follicular+helper+cell+IL-4+production+is+dependent+on+signaling+lymphocytic+activation+molecule+receptor+%28CD150%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Germinal center T follicular helper cell IL-4 production is dependent on signaling lymphocytic activation molecule receptor (CD150).</a> The Journal of Immunology. 185 (1), 190-202 (2010).</li>
<li>Sun, J., Dodd, H., Moser, E. K., Sharma, R., Braciale, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+T+cell+help+and+innate-derived+IL-27+induce+Blimp-1-dependent+IL-10+production+by+antiviral+CTLs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">CD4+ T cell help and innate-derived IL-27 induce Blimp-1-dependent IL-10 production by antiviral CTLs.</a> Nature Immunology. 12 (4), 327-334 (2011).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Yüksek benzeşimli antikorlar üretmek için B hücre yardımı sağlamada özel roller nedeniyle, Tfh hücreleri aşı tasarımı için yeni stratejiler sağlamak için farklılaşma ve manipülasyon mekanizmalarında kapsamlı bir şekilde incelenmiştir. İnfluenza virüsü enfeksiyonu güçlü Tfh ve GC B hücreleri yanıtlarına neden olarak bu araştırma alanı için uygun bir modeldir. Bu yazıda influenza virüsü enfeksiyonunun intranazal aşılama, Tfh ilişkili yanıtın akış sitometrisi, immünoresans ve ELISA ile değerlendirilmesi ile ilgili protokoll...

Son on yılda, germinal center (GC) B gelişimindeki temel rolleri için yeni tanımlanan CD4+ T hücre alt kümesi olan Tfh hücre alt kümesi üzerinde çok sayıda çalışma odaklanmıştır. Esas olarak bir gen represörü olarak kabul edilen B hücreli lenfoma 6 (Bcl6), Bcl6'nın ektopik ekspresyonunun Tfh farklılaşmasına yol açmanın yeterli olduğu ve Bcl6'nın eksikliğinin kaybolan Tfh farklılaşması 1 ,2,3ile sonuçladığı kanıtı için Tfh hücrelerinin soyu belirleyici faktörüdür. Diğer CD4+ T yardımcı alt kümelerinin aksine, iltihap bölgelerine göç ederek efektör işlevlerini yerine getirirken, Tfh hücreleri B hücresi yardımını esas olarak dalak ve lenf düğümünün B hücre foliküler bölgesinde sağlar. Ortak uyarıcı moleküller ICOS ve CD40L, Tfh ve GC B hücreleri arasındaki etkileşimde önemli roller oynar. Tfh farklılaşması sırasında, ICOS konyak B hücrelerinden gerekli sinyalleri iletir ve ayrıca B hücre bölgesi lokalizasyonu4,5için seyirci B hücrelerinden geçiş sinyalleri alan bir reseptör görevi görür. CD40L, B hücrelerinin çoğalması ve sağkalım için Tfh hücrelerinden gelen sinyallerin arabulucusudur6. CD40L ile benzer rolü oynayan bir diğer faktör, esas olarak Tfh hücreleri tarafından salgılanan sitokin IL21'dir. IL21, GC B hücrelerinin gelişimini ve yüksek benzeşimli antikorların üretimini doğrudan düzenler, ancak Tfh farklılaşmasındaki rolü hala tartışmalıdır7,8. Akış sitometrisi analizinde Tfh hücrelerinin tanımlanmasında en sık kullanılan PD-1 ve CXCR5 de bu alt kümenin farklılaşmasında ve işlevinde önemli roller oynamaktadır. CXCR5, B hücre foliküler kemokinin reseptörüdür ve B hücre foliküllerinde Tfh hücrelerinin lokalizasyonuna aracılık eder9. PD-1 artık sadece foliküler rehberlik işlevine sahip olmakla kalmaz, aynı zamanda GC B hücrelerinin benzeşim olgunlaşması sürecinde kritik sinyalleri iletir10. Bu bulgulara dayanarak, bu moleküllerin ekspresyonunu değerlendirmek temel olarak Tfh hücrelerinin olgunlaşmasını ve işlevini yansıtabilir.
GC, sekonder lenfoid organlarda indüklenmiş geçici bir mikroanatomik yapıdır ve Tfh hücrelerine oldukça bağımlıdır, bu nedenle Tfh yanıtını değerlendirmek için mükemmel bir okumadır. GC'de, sitokinler ve ko-uyarıcı moleküller tarafından aracılık edilen sinyalleri aldıktan sonra, B hücreleri yüksek benzeşimli antikorlar oluşturmak için sınıf değiştirme ve somatik hipermütasyona tabidir11. Diferansiyel antikor sınıfı anahtarlama, IL4 ve IL21'in IgG1 sınıfının değiştirilmesine neden olduğu diferansiyel sitokin nişinde gerçekleşirken, IFNφ IgG2 sınıfının12'yegeçmesine neden olur. Plazma hücreleri salgılanan antikorların üreticileridir ve ölümcül olarak farklılaştırılmış hücrelerdir. Tfh hücreleri gibi, GC'deki B hücrelerinin gelişimi de birçok önemli molekülün dinamik ekspresykülü ile ilişkilidir. Mevcut çalışmaya dayanarak, GC B hücreleri B220+PNA+Fas+ veya B220+GL7+Fas+ hücreler ve plazma hücreleri olarak tanımlanabilir, öncüllerine kıyasla, B220'nin downregulate ekspresyolu ve upregulate CD138 ifadesi13. Dahası, bu özelliklerin her ikisi de akış sitometrisinde ve immünofluoresans analizinde tespit edilebilir, böylece GC yanıtının uygun değerlendirmesidir.
Grip virüsü enfeksiyonunda sağlam hücresel ve humoral yanıtlar indüklenir, Tfh ve Th1 hücreleri CD4+ T hücre yanıtı14'e hakimdir, bu da onu Tfh hücreleri farklılaşma çalışması için mükemmel bir model haline getirir. Influenza A/Porto Riko/8/34 Fareye uyarlanmış bir suş olan H1N1 (PR8), bu çalışmada sıklıkla14,15,16. Burada, influenza virüsü enfeksiyonunda Tfh çalışması ile ilgili tahlillerin bazı temel protokollerini açıklıyoruz: 1) PR8 virüsünün intranazal infülasyonu; 2) antijene özgü Tfh hücreleri, GC B ve plazma hücreleri ve akış sitometrisi ile IL21 tespiti; 3) GC'nin histolojik görselleştirilmesi; 4) ELISA ile serumda antijene özgü antikor titresinin tespiti. Bu protokoller, Tfh ile ilişkili çalışmada yeni araştırmacılar için gerekli teknikleri sağlar.

<table><tbody><tr><td><Tfh hücrelerinin, NP'ye özgü Tfh hücrelerinin ve Bcl-6</güçlü></td>%37 formaldehitin güçlü> <td></td><td></td><td></td>immün boyaması</tr> <tr><td></td><td>Sigma</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD16/32 fare</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-0161-86</td><td></td></tr><tr><td>APC-konjuge-IAbNP311-325 MHC sınıf II tetramer</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bcl-6 PE</td><td>Biolegend</td><td>358504</td><td>klon:7D1</td></tr><tr><td>Biotin-CXCR5</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-7185-82</td><td>klonu: SPRCL5</td></tr><tr><td>CD4 Percp-eFluor 710</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>46-0041-82</td><td>klonu: GK1.5</td></tr><tr><td>CD44 eVolve 605</td><td>Thermo Fisher Scientifi</td><td>83-0441-42</td><td>klonu: IM7</td></tr><tr><td>CD44 FITC</td><td>Thermo Fisher Scientifi</td><td>11-0441-82</td><td>klonu: IM7</td></tr><tr><td>CD62L FITC</td><td>BD Pharmingen</td><td>553150</td><td>klonu: MEL-14</td></tr><tr><td>ICOS BV421</td><td>Biolegend</td><td>564070</td><td>klonu: 7E.17G9</td></tr><tr><td>PD1 PE / Cy7</td><td>Biolegend</td><td>135216</td><td>klonu: 29F.1A12</td></tr><tr><td>Streptavidin BV421</td><td>BD Pharmingen</td><td>563259</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>554081</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>IL21< / güçlü hücre içi boyama></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>% 37 formaldehit</td><td>Sigma</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>anti-insan IgG</td><td>Jackson İmmünoAraştırma Laboratuvarları</td><td>109-605-098</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>Sigma</td><td>B6542</td><td></td></tr><tr><td>insan FCc IL-21 reseptörü</td><td>R& D Sistemi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iyonomisin</td><td>Sigma</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>Canlı / Ölü Sabitlenebilir Aqua Ölü Hücre boyama kiti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L34966</td><td></td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>MP</td><td>102855</td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > GC B ve plazma hücreleri boyama< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B220 APC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17-0452-81</td><td>klonu: RA3-6B2</td></tr><tr><td>CD138 PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>561070</td><td>klonu: 281-2</td></tr><tr><td>CD95 (FAS) PE / Cy7</td><td>BD Pharmingen</td><td>557653</td><td>klonu: Jo2</td></tr><tr><td>IgD eFluor 450</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>48-5993-82</td><td>klonu: 11-26c</td></tr><tr><td>PNA FITC</td><td>Sigma</td><td>L7381</td><td></td></tr><tr><td>< güçlü >ELISA ile HA'ya özgü antikor titresinin tahlili< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PR8-HA</td><td>Çin Biyolojik</td><td>11684-V08H</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>SSBC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti fare Ig (SBA Klonotipleme Sistemi-HRP)</td><td>SouthernBiotech</td><td>5300-05</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti fare IgM (SBA Klonotipleme Sistemi-HRP)</td><td>SouthernBiotech</td><td>5300-05</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti fare IgG1 (SBA Klonotipleme Sistemi-HRP)</td><td>SouthernBiotech</td><td>5300-05</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti fare IgG2b (SBA Klonotipleme Sistemi-HRP)</td><td>SouthernBiotech</td><td>5300-05</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti fare IgG2c (SBA Klonotipleme Sistemi-HRP)</td><td>SouthernBiotech</td><td>5300-05</td><td></td></tr><tr><td>TMB Substrat Reaktif Seti</td><td>BD Pharmingen</td><td>555214</td><td></td></tr><tr><td>Histoloji</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555-Keçi-anti sıçan IgG</td><td>Yaşam Teknolojisi</td><td>A21434</td><td></td></tr><tr><td>anti-fare IgD</td><td>Biolegend</td><td>405702</td><td></td></tr><tr><td>biyotinile PNA</td><td>Vektör laboratuvarları</td><td>B-1075</td><td></td></tr><tr><td>seyreltik Alexa Fluor 488-streptavidin</td><td>Yaşam Teknolojisi</td><td>S11223</td><td></td></tr><tr><td>normal keçi serumu</td><td>SouthernBiotech</td><td>0060-01</td><td></td></tr><tr><td>Pro-uzun altın antifade reaktifi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P3630</td><td></td></tr><tr><td>STREPTAVIDIN / BIOTIN engelleme kiti</td><td>Vektör laboratuvarları</td><td>SP-2002</td><td></td></tr></tbody></table>

farelerde grip a virüs enfeksiyonu sırasında t foliküler yardımcı hücrelerin ve germinal merkez yanıtının değerlendirilmesi

Evaluation of T Follicular Helper Cells and Germinal Center Response During Influenza A Virus Infection in Mice

T Foliküler Yardımcı (Tfh) hücreleri, germinal merkez (GC) gelişimi ve yüksek benzeşimli antikorların üretimi için yardım sağlama konusunda uzmanlaşmış bağımsız bir CD4+ T hücre alt kümesidir. grip virüsü enfeksiyonunda, etkili virüs eradikasyonunu kolaylaştırmak için sağlam Tfh ve GC B hücre yanıtları indüklenir, bu da Tfh ile ilişkili çalışma için nitelikli bir fare modeli sağlar. Bu yazıda, farelerde influenza virüsü enfeksiyonu sırasında temel Tfh ilişkili immün yanıtın tespitinde protokolleri açıkladık. Bu protokoller şunlardır: influenza virüsünün intranazal infülasyonu; akış sitometrisi boyama ve poliklonal ve antijene özgü Tfh hücrelerinin, GC B hücrelerinin ve plazma hücrelerinin analizi; GC'lerin immünofluoresans tespiti; serumda influenza virüsüne özgü antikorun enzime bağlı immünosorbent tahlili (ELISA). Bu tahliller temel olarak influenza virüs enfeksiyonunda Tfh hücrelerinin farklılaşmasını ve işlevini ölçerek farklılaşma mekanizması ve manipülasyon stratejisinin aydınlatıcı çalışmalarında yardımcı olunmaktadır.

İnfluenza virüsü enfeksiyonunda fare morbiditesinin karakterizasyonu İnfluenza virüsü enfeksiyonundan sonra, fareler, fare morbiditesini izlemek için yaygın olarak kullanılan bir semptom olan şiddetli kilo kaybı ile yansıyan hastalık nedeniyle daha az aktif ve anoreksiktir19. Şekil 1'degösterildiği gibi, PR8 virüs bulaşmış fareler 6. günde kilo vermeye başladı, 8. günde en yüksek kayıp seviyesine ulaştı ve 10. günde başlangıç sevi...

Bu makalede, influenza virüs enfeksiyonunun fare modelinde Tfh ve GC B yanıtını değerlendirme protokolleri açıklanmaktadır.

Farelerde grip A Virüs Enfeksiyonu Sırasında T Foliküler Yardımcı Hücrelerin ve Germinal Merkez Yanıtının Değerlendirilmesi

T Follicular Helper (Tfh) cells are an independent CD4+&#160;T cell subset specialized in providing help for germinal center (GC) development and ...

T foliküler yardımcı hücreler, yüksek afiniteli hayvan üretiminde B hücrelerine yardımcı olan yeni tanımlanmış CD4 T hücreleri alt kümesidir. Bir influenza virüsü enfeksiyonunda Tfh hücrelerinin tanımlanmasının gösterilmesi, yeni araştırmacıların Tph ile ilişkili çalışmalar için gerekli tekniklerin nasıl gerçekleştirileceğini anlamalarına yardımcı olacaktır. Uygun olmayan bir virüs titresi mortaliteye veya çok zayıf bir bağışıklık tepkisine neden olabileceğinden, bir deney yapmadan önce titrenin belirlenmesini tavsiye ederiz.Sekiz haftalık erkek C57 siyah 6 farenin PR8 virüsü aşılaması için. Biyogüvenlik seviyesi 2 koşulları altında, eksi 80 santigrat derecede depolanmış PR8 virüsü stoğunu buz üzerinde çözün. Homojen bir çözelti elde etmek için virüsü vorteksleyin.Virüsü, önceden soğutulmuş 1.5 mililitrelik bir tüpte mikrolitre PBS başına iki platform birimine seyreltin ve anestezi uygulanmış hayvanlarda çimdikleme yanıt eksikliğini doğrulayın. Virüsü tekrar girdaplayın. 20 mikrolitrelik bir pipet ucunu 10 mikrolitre virüs ile doldurun.Diğer taraftaki aşılamayı tekrarlamadan önce, sakinleştirici üç hayvanın bir narisine dikkatlice virüs damlaları ekleyin. Daha sonra, tüm fareleri sternal yaslanmaya, tam iyileşmeye kadar izleme ile sıcak kafeslere yerleştirin ve her fareyi 10 gün boyunca günlük olarak tartın. Deneyin sonunda, fareleri biyogüvenlik seviyesi 2 laminer akış başlığına yerleştirin ve ilk hayvanı emici, kağıt kaplı bir köpük diseksiyon tahtasına sabitleyin.Cildi karın orta hattı boyunca kesmek için diseksiyon makası kullanın, cildi cımbızla gerin ve cildi diseksiyon tahtasına sabitleyin. Dalağı toplamak için peritonu açın ve dalağı% 1 FBS ile desteklenmiş 5 mililitre DMEM içeren 6 santimetrelik bir tabak ile 70 mikrometrelik bir filtreye yerleştirin. Diyaframı ve kaburgaları timusa kadar ayırın ve göğüs boşluğunu ortaya çıkarmak için kaburgayı yana sabitleyin.Trakeanın ventral tarafına yakın mediastinal lenf düğümünü bulmak için akciğeri ve kalbi hareket ettirin. Daha sonra, lenf düğümünü 5 mililitre ortam içeren 6 santimetrelik ikinci bir tabağa kendi süzgecine yerleştirin ve her iki dokuyu her iki süzgecin ağından nazikçe ezmek için 3 mililitrelik şırınga pistonları kullanın. Her süzgeci 1 mililitre taze DMEM artı FBS ile durulayın ve hücre süspansiyonlarını ayrı ayrı 15 mililitrelik santrifüj tüplerine aktarın.Hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve peletleri tüp başına 1 mililitre taze DMEM artı FBS'de iyice yeniden süspanse edin. Daha sonra dalak hücresi süspansiyonuna dört mililitre daha orta ekleyin ve her iki tüpü de buzun üzerine yerleştirin. Hücreleri CXCR5 ekspresyonu için boyamak için, tüpü birkaç kez ters çevirerek karıştırın ve numune başına 2 kez 10 ila 6 hücreyi ayrı ayrı FACS tüplerine aktarın.Her tüpe 2 mililitre boyama tamponu ekleyin ve hücreleri girdaplayarak karıştırın. Hücreleri santrifüjleme ile pelet haline getirin ve süpernatanları atın. Her bir tüpü emici kağıda iki kez hafifçe vurun ve kalan süpernatanttaki hücreleri yeniden süspanse etmek için iki alt kısmı hafifçe vurun.Spesifik olmayan bağlanmayı tüp başına 0.2 mikrolitre Fc reseptör bloğu ile bloke edin ve tüpleri 10 dakika boyunca buza yerleştirmeden önce karıştırmak için tüpü hafifçe vurun. Kuluçka işleminin sonunda, her tüpe 0,3 mikrolitre biotin anti-mouse CXCR5 ekleyin ve hafifçe hafifçe vurarak karıştırın. Tüpleri 30 dakikada hafifçe vurarak bir saat boyunca buzun üzerine yerleştirin.İnkübasyonun sonunda, tüplere 2 mililitre boyama tamponu ekleyin ve hücreleri santrifüjleme ile çökeltmeden önce karıştırmak için girdap yapın. Süpernatanı atın ve kalan tampondaki hücreleri yeniden süspanse etmek için hafifçe vurun. Daha sonra, tüpleri buzun üzerine yerleştirin ve hücreleri, az önce gösterildiği gibi tabloda belirtildiği gibi ilgilenilen yüzey işaretleyicisine karşı antikorlarla etiketleyin.İnkübasyonun sonunda, hücreleri 2 mililitre boyama tamponu ile yıkayın ve akış sitometrisi ile analiz için her peleti 400 mikrolitre taze boyama tamponunda yeniden süspanse edin. PR8 virüsü ile enfekte olmuş fareler altıncı günde kilo vermeye başlar, sekizinci günde en yüksek kayba ulaşır ve 10. günde ilk kilo seviyelerine geri döner. Beklendiği gibi, PBS ile tedavi edilen kontrol farelerinde kilo kaybı gözlenmez.Virüs enfeksiyonu ayrıca drenaj lenf nodu içinde sağlam bir lenfosit genişlemesine yol açar. Akış sitometrik analizi ile gözlemlendiği gibi, T foliküler yardımcı hücre farklılaşması, kontrol hayvanlarına kıyasla influenza virüsü ile enfekte farelerde indüklenen sağlam sayıda T foliküler yardımcı hücre ile beşinci günde başlar ve enfeksiyondan sonraki 10. günde zirve yapar. Ayrıca, hem mediastinal lenf düğümlerinde hem de dalaklarda, influenza antijenine özgü CD4 pozitif T hücre sayıları, PR8 hayvanlarında PD-1 pozitif CXCR5 pozitif hücre popülasyonlarının arttığı kontrol farelerinde gözlenenlere kıyasla önemli ölçüde indüklenir.Ek olarak, IL-21 için hücre içi boyama, PR8 enfeksiyonunun, virüs enfeksiyonuna yanıt olarak bu sitokinin önemli ölçüde daha yüksek üretimini indüklediğini ortaya koymaktadır. İmmünofloresan boyama, PR8 ile enfekte farelerde indüklenmiş bir germinal merkez reaksiyonunun varlığını gösterir ve ELISA, virüsle enfekte hayvanlarda influenza virüsüne özgü antikorların oluşumunu gösterir. CXCR5 boyamanın buz üzerinde bir saat boyunca yapılması önemlidir, çünkü lekenin kalitesi boyama sıcaklığından ve süresinden etkilenecektir.CXR5 ve IL-21 boyamasını göstermemize rağmen, diğer yüzey belirteçleri, transkripsiyon faktörleri ve sitokinler, Tfh farklılaşması ve fonksiyonu hakkında çok sayıda sağlamak için bu yöntemle değerlendirilebilir.

evaluation-t-follicular-helper-cells-germinal-center-response-during

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu yöntem, yüksek hassasiyet enfekte olmuş fareler bronkoalveoler lavaj (BAL) sıvısında H1N1 tespiti için Kızılötesi boya temelli görüntüleme sisteminin kullanımı açıklanmaktadır. Bu metodoloji, bir 96 veya plaka 384-iyi, test malzemesi &lt;10 ul hacmi gerektirir ve birden fazla patojenlerin eşzamanlı tarama için bir potansiyele sahiptir.

Gribi için yüksek verimlilik Tespit Yöntemi

Source: Wang, M., et al, Evaluation of T Follicular Helper Cells and Germinal Center Response During Influenza A Virus Infection in Mice. J. Vis. Exp. (2020).This video demonstrates intranasal infection of a mouse with a pathogenic influenza virus to establish a respiratory tract infection. The procedure outlines the administration of the virus into the nasal cavity. The virus enters host cells, replicates, and activates the immune system.

Intranasal Infection of a Mouse with a Pathogenic Influenza Virus

Farelerde Batı Nil virüsü mutant enfeksiyonuna karşı dendritik hücrelerin antijen sunma kapasitesini ve antijene özgü T hücresi yanıtlarını ölçmek için iki akış sitometrisi tabanlı yöntem - bir in vitro T hücre hazırlama testi ve hücre içi sitokin boyama kullanıldı.

Batı Nil Virüsü Mutant Soy Enfeksiyon MyD88-aracılı Hücresel Bağışıklık Tepki Vitro Analizi

Aşıların nasıl çalıştığı hakkında genel bir bilgi eksikliği var. Burada, dendritik hücrelere ve T hücresi bağışıklığına özel olarak odaklanarak, aşılara karşı erken konak bağışıklık tepkileri hakkında fikir edinmek için ters genetik ve kemik iliği kimerik farelerin birlikte kullanılmasını öneriyoruz.

Kimerik fare modellerinde Rekombinant Grip aşıların burun içinde yoluyla mukozal bağışıklık Okumak

Grip A virüs (IAVs) önemli insan solunum patojenler vardır. İnsan fizyolojisi taklit hayvan modelleri IAVs patojenitesi anlamak ve preklinik roman aşı yaklaşımlar sınamasını gerçekleştirmek için gereklidir. Burada, biz IAV Patogenez, humoral yanıt ve enfeksiyon bir fare modeli kullanarak aşı etkinliğini değerlendirmek için teknikler açıklanmaktadır.

Grip A virüs enfeksiyonu bir fare modeli çalışmalarda

Fc-aracılı efektör fonksiyonları aktivasyonu antikorlar tarafından hedefleyen grip virüsü hemagglutinin ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu tahlil de Fc-aracılı bağışıklık ikna etmek için monoklonal antikorlar veya poliklonal sera diğer viral yüzey glikoproteinlerin hedefleme yeteneklerini değerlendirmek için adapte edilebilir.

Grip Hemagglutinin özel antikorlar tarafından indüklenen Fc-aracılı efektör fonksiyonları değerlendirmek için bir yöntem

Ifnar1- / - fare modeli immunoprivileged organlarda Zika virüs (ZIKV) enfeksiyon için antijen spesifik T-hücre yanıtları değerlendirmek için bir protokol açıklanmıştır. Bu yöntem koruma hücresel mekanizmaları ve immunopathogenesis ZIKV aşı soruşturma için çok önemli ve aynı zamanda onların etkinliğini değerlendirme için değerlidir.

Virüslü Ifnar1- / - farelerin Immunoprivileged organlarında Zika virüs özgü T hücreli yanıt-e doğru değerlendirilmesi

Bu çalışmada, biz iki fotonlu intravital görüntüleme ve hücre etkileşim fare trakeal mukoza grip virüsü ile enfeksiyon sonra çözümlemesi için bir protokol mevcut. Bu iletişim kuralı bağışıklık hücre dynamics sırasında solunum yolu enfeksiyonları eğitim araştırmacılar için ilgili olacaktır.

İki fotonlu Intravital mikroskobu kullanılarak grip virüsü enfeksiyonu sırasında trakeal mukozasında görüntüleme hücre etkileşimi

Bu yazıda, viral enfeksiyon sırasında pnömokokların asemptomatik bir kolonizatörden hastalığa neden olan bir patojene geçişi için yeni bir fare modeli açıklanmaktadır. Bu model, hastalık progresyonunun farklı aşamalarında ve çeşitli konakçılarda polimikrobiyal ve konakçı-patojen etkileşimlerini incelemek için kolayca uyarlanabilir.

Streptococcus pneumoniae'nin Viral Ko-Enfeksiyon Üzerine Kolonizatörden Patojene Geçişi İçin Bir Fare Modeli, Yaşın Şiddetlendirdiği Hastalıkları Özetler

Mevcut çalışma, virüse özgü TFH hücrelerinin erken kader bağlılığını değerlendirmek ve bu hücrelerde gen ekspresyonunu manipüle etmek için protokoller göstermektedir.

Akut LCMV ile Enfekte Farelerde Virüse Özgü Foliküler Yardımcı CD4+ T Hücresinin Erken Farklılaşmasına Erişim

Bu protokol, IAV'nin intranazal uygulaması ve fare akciğer hasarının aşağı akış analizi ve akciğer hücre tiplerinde ilişkili transkripsiyonel değişiklikler için talimatlar sağlar.

İnfluenza Enfeksiyonu Sonrası Displastik ve Fonksiyonel Akciğer Alveoler Onarımının Modellenmesi

Öğrenin, farelerde influenza A virüsü enfeksiyonu sırasında T foliküler yardımcı hücre ve germinal merkez yanıtlarını değerlendirme yöntemlerini. Bu protokoller, immunoloji araştırmalarında yüksek afiniteli antikor üretimini anlamak için kritik öneme sahiptir.

Farelerde grip A Virüs Enfeksiyonu Sırasında T Foliküler Yardımcı Hücrelerin ve Germinal Merkez Yanıtının Değerlendirilmesi

Daha fazla video keşfet