Drosophila Wing Disc'ten Görüntüleme Dpp Salınımı
30 Ekim 2019
Ligandlara maruz kalmanın zamanlaması gelişimsel sonuçlarını etkileyebilir. Burada kanat diskhücrelerinden Dpp adı verilen Drosophila kemik morfogenetik proteininin (BMP) nasıl görüntülenebildiğini gösteriyoruz.
DPP reseptörleri bağlayarak hücre kaderini etkiler ve transkripsiyon etkilemek için hücre içi bir sinyal gönderme. DPP üretilir ancak serbest bırakılmazsa, reseptörlere erişimi yoktur ve bu nedenle rollerini yerine getiremez. Bu teknik, araştırmacıların hangi genetik ve çevresel faktörlerin DPP salınım dinamiklerini değiştirdiğini incelemelerini sağlayan DPP salınımLarını görselleştirmeyi mümkün kılar.
BMP sinyal yolu sineklerden insanlara kadar korunur, bu yüzden DPP salınımını belirleyen mekanizmanın da insan gelişimi ve yenilenmesi için uygun olmasını bekliyoruz. 30-40 bakire dişi DPP GAL4 10 ila 15 erkek UAS DPP-GFP sinekler ile uçar geçerek başlayın. Taze bir gıda şişesine az miktarda maya salçası ekleyerek yumurtlamayı teşvik edin.
Yumurtaları toplamak için, çapraz sinekleri şişeye çevirin ve çıkarmadan önce 3-4 saat yumurtlamalarına izin verin. Larvalar üçüncü yıldız aşamasında olana kadar yumurta toplama şişelerini yaklaşık 144 saat boyunca 25 derecede tutun. Sonra diseksiyon için uygun larvaseçin.
İlk olarak, kısa ve yağ yerine normal uzunlukta olacak tüberküloz olmayan larvaları seçin. Larvaları ifade eden DPP-GFP'yi seçmek için, bunları floresan stereo mikroskop altında görüntüleyin. Tüberküloz olmayan tüm larvalar bazı floresan lara sahip olur, ancak GFP kanat diskleri ile sınırlıdır ve DPP-GFP larvaları üzerinde daha az parlaktır.
Kanat disklerini görüntüleme için canlı tutacak el yazması talimatlara göre modifiye HL3 ortamhazırlayın. HEPES ile pH'ı 7,1'e ayarlayın ve 0,22 mikrometrelik bir filtreden geçirin. İki adet renksiz çift taraflı bant genişliğini mikroskop slaytına yerleştirin ve aralarında yaklaşık beş milimetrelik bir boşluk bırakarak ve bandın uçlarının kaydıraktan kenarlarıyla kızardığından emin olun.
Bandı slayta sıkıca bastırmak için düz bir kenar kullanın. İki bant parçası arasına modifiye edilmiş HL3 ortamının 25 mikrolitresini ekleyin. Kanat diski ortama monte edildiğinde, bant parçaları kapak kayması tarafından ezilmekten önler.
Larvayı incelemek için, modifiye edilmiş HL3 ortamına yerleştirin ve iki çift forceps kullanarak yavaşça ikiye bölün. Arka yarısı atın, sonra bir çift forceps ile ön yarısında orta kavramak ve tamamen ters kadar larva içine ağız kanca geri itmek için diğer çifti kullanın. Larvanın her iki tarafından aşağı doğru çalışan trakeanın iki koyu renkli ana dalındaki keskin kıvrımlara bakın.
Kanat diskleri doğrudan altında yatıyor. Diskleri yavaşça çıkarın ve hazırlanan slayttaki HL3 ortamına koyarak disklere hala trakea parçalarının bağlı olmadığından emin olun. Kanat disklerini, kanat kesesinin peripodial tarafının diskdüz yatarken yukarı bakacak şekilde düzenleyin.
Bir coverslip ve oje ile mühür ile kanat kapağı. Cila kurudıktan sonra, hemen görüntüleme ile devam edin. 40X yağ hedefi ve 488 nanometre lazer ile konfokal lazer tarama mikroskobu kullanarak monte kanat diski görüntüleyin.
İki dakika boyunca iki hertz hızında görüntüleri toplayın. En iyi sonuçlar için, lazer gücünü, ağartma üzerinde önlemek için DPP serbest hücrelerin net bir görüntü elde etmek için yeterince güçlü ayarlayın. Bir zaman serisi olarak görüntüleri toplamak ve DPP sürümü bir video elde etmek için AVI dosyaları olarak dışa aktarın.
Protokol başarılı olduğunda, DPP-GFP kanat diskinin merkezinde bir şerit olarak görünür ve çekirdekleri floresan olmayan daireler olarak görünür. DPP-GFP salınımı, hücre gövdelerinde ve hücre gövdelerinden uzakta görünen ve kaybolan floresan puncta olarak görülebilir. Farklı puncta sitoknemes veya sitokinmes sinaps muhtemeldir.
Kanat diskleri, görüntülemeperipodial tarafından yapılacak şekilde monte edilir. Kanat diski ters taraftan görüntülenirse, DPP-GFP floresansı odak dışında görünür ve çözünürlük zayıf olur. GFP DPP'ye eritilemediğinde, hücre vücutlarının dışında hiçbir delinme gözlenmez.
Bu denetim, DPP-GFP'nin tek başına GFP'den farklı davrandığını gösterir. Ayrıca, DPP-GFP ifade edilmezse floresan puncta görünür. Bu işlem sırasında kanat diskinin peripodial tarafa monte edilmiş olması önemlidir.
Kanat diski yanlış yönlendirilmişse, DPP-GFP odak dışında görünür. Bu yöntem kanatsız veya kirpi gibi diğer gelişimsel sinyal ligands salınımını incelemek için kullanılabilir. DPP salınımını etkileyebilecek tüm farklı çevresel ve genetik faktörleri inceleyebiliriz.
Buna ek olarak, diğer hücre tiplerinden BMP salınımı çalışma için bu yöntemi uyarlayabilirsiniz.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, Drosophila kemik morfojenetik protein (BMP) Dpp'nin salınım dinamiklerini inceleyerek, maruz kalma zamanlamasının gelişimsel sonuçları nasıl etkilediğini vurgulamaktadır. Geliştirilen teknik, Dpp salınımının görselleştirilmesine olanak tanıyarak bu süreci etkileyen genetik ve çevresel faktörler hakkında içgörüler sağlamaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Gelişimsel Biyoloji
- Hücre Sinyalizasyonu
Arka Plan
- Dpp, reseptörlere bağlanarak ve hücre içi sinyal iletimini tetikleyerek hücre kaderini etkiler.
- Serbest kalmadan Dpp, reseptörlerine erişemez ve görevlerini yerine getiremez.
- Bu araştırma, Dpp salınımını görselleştirmek için görüntüleme tekniklerinden yararlanmaktadır.
- BMP sinyal yolu evrimsel olarak korunmuştur, bu da insan biyolojisi ile ilgili olduğunu göstermektedir.
Çalışmanın Amacı
- Kanat diski hücrelerinden Dpp salınımını görselleştirmek.
- Genetik ve çevresel faktörlerin Dpp salınım dinamiklerini nasıl değiştirdiğini incelemek.
- Dpp salınımının gelişim ve rejenerasyon üzerindeki etkilerini anlamak.
Kullanılan Yöntemler
- DPP GAL4 sineklerin UAS DPP-GFP sineklerle çaprazlanması.
- Maya macunu ile yumurtlama teşvik edilmesi.
- Dpp salınımını görüntülemek için görüntüleme teknikleri.
- Salınım dinamikleri üzerindeki genetik ve çevresel etkilerin analizi.
Ana Sonuçlar
- Çalışma, hücrelerden Dpp salınımını başarıyla görselleştirmektedir.
- Dpp salınım dinamiklerini etkileyen temel faktörleri tanımlamaktadır.
- BMP sinyal yolaklarının korunumlu olduğunu kanıtlamaktadır.
- İnsan gelişimi ve rejenerasyonuyla ilgili bilgiler sunmaktadır.
Sonuçlar
- Dpp salınımının anlaşılması, gelişimsel süreçlere dair içgörüler elde etmek açısından kritik öneme sahiptir.
- Bulgular, rejeneratif tıp için önemli sonuçlar doğurabilir.
- Gelecekteki araştırmalar, diğer BMP'leri incelemek için bu tekniklerden yararlanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önemi
Ligand salınım dinamiklerinin görselleştirilmesi, sinyal iletiminin kullanılabilirliğinin doğrudan gözlemlenmesine olanak tanıyarak hedef validasyonundaki kritik bir boşluğu doldurur; bu durum, terapötik hipotezin gücünün değerlendirilmesi için gereklidir. Bu yöntem, bir ligandın biyolojik olarak ilgili bir bağlamda reseptörüyle etkileşime girip giremeyeceğini netleştirerek, erken keşif aşamasındaki mekanizmaya dayalı risk azaltma sürecini destekler. Bu yaklaşım, özellikle BMP/TGF-β gibi korunan sinyal iletim ağları için yolak modülasyon stratejilerindeki öngörü güvenilirliğini artırır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Reseptör etkileşimi ve sinyal iletimi için bir ön koşul olan ligand salınımının sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Ligand mevcudiyetine dair doğrudan bir okuma sağlayarak hedef etki mekanizmasındaki belirsizliği azaltır.
- Bilimsel Değer: Genetik veya çevresel pertürbasyonların yalnızca ekspresyonu değil, ligand erişilebilirliğini de etkilediğini doğrulayarak biyolojik risk azaltmayı destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Salınım olayları için bir vekil olarak ölçülebilir floresan punctalar oluşturarak genetik veya kimyasal modülatörlerin karşılaştırmalı taramasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Deneyler arasında yeniden üretilebilir görüntüleme koşulları sağlamak için standartlaştırılmış diseksiyon ve montaj protokollerini kullanır.
- Bilimsel Değer: Deney optimizasyonu için yol aktivasyon durumlarıyla ilişkilendirilebilen zaman-çözünürlüklü veriler sağlar.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Gelişim ve rejenerasyondaki insan ligand salınım mekanizmaları hakkındaki hipotezleri bilgilendirmek için BMP sinyalleme yolağının evrimsel korunumundan yararlanır.
- Operasyonel Değer: Diğer gelişimsel ligandlara (örn. Wingless, Hedgehog) uyarlanabilir, böylece farklı yolak sınıfları genelinde kullanım alanını genişletir.
- Bilimsel Değer: Hücresel dinamikleri fenotipik sonuçlarla ilişkilendirerek, hastalıkla ilişkili sistemlerde ligand salınımının incelenmesine olanak tanır.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, aşağı yönlü tarama veya öncü bileşik optimizasyon çalışmalarına yatırım yapmadan önce ligand fonksiyonelliğinin erken aşama doğrulamasını sağlayarak keşif sürekliliğine uyum sağlar.
- Keşif Biyolojisi: Bir ligandın sadece eksprese edilmediğini, aynı zamanda salındığını ve reseptör bağlanması için erişilebilir olduğunu varsayan hipotezi test eder.
- Tarama: Farklı koşullar altındaki salınım kinetiğinin yüksek içerikli analizi için uygun, kantitatif, zaman ayarlı görüntüleme verileri üretir.
- Analitik: Deney grupları arasındaki istatistiksel karşılaştırmayı destekleyen ölçülebilir çıktılar (floresan puncta frekansı, dağılımı, süresi) oluşturur.
- Translasyonel Araştırma: Ligand salınım dinamiklerini gelişimsel fenotiplerle ilişkilendirerek, yolak konservasyonu aracılığıyla insan biyolojisine ekstrapolasyonu destekler.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Projeler genelinde birden fazla sinyal ligandının salınım mekanizmalarını incelemek için yeniden kullanılabilir bir görüntüleme platformu kurar.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Genellikle ölçülmek yerine varsayılan temel bir adım olan ligand erişilebilirliğini doğrulayarak, hedef validasyon güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Standartlaştırılmış numune hazırlama ve yönelim kontrolleri (peripodial taraf yukarı gelecek şekilde) aracılığıyla tekrarlanabilirliği geliştirir.
- Stratejik Değer: Hedefleri sadece ekspresyon seviyelerine göre değil, fonksiyonel ligand mevcudiyetine göre filtreleyerek go/no-go (devam/tamam) kararlarını iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Ligandları ilgili dokularda regüle salınım gösteren hedeflerin risk ayarlı önceliklendirmesine olanak tanır.
Uygulama Hususları
- Drosophila genetiği, diseksiyon ve floresan mikroskopisi konularında uzmanlık gerektirir.
- Optimal sinyal tespiti için 40X yağ daldırma objektif ve 488 nm lazerli konfokal lazer tarama mikroskobuna bağımlıdır.
- Görüntüleme sırasında doku canlılığını korumak için standardize edilmiş ortam hazırlığı (modifiye HL3, pH 7.1, HEPES tamponlu, filtrelenmiş) gereklidir.
- Odak düzlemi artefaktlarını önlemek ve tekrarlanabilir sonuçlar sağlamak için tutarlı örnek yönlendirmesi (kanat diskinin peripodial tarafı yukarı bakacak şekilde) gereklidir.
- Ex vivo doku görüntülemesi ile sınırlıdır; sağlam organizmalar veya yüksek kapasiteli canlı hayvan taramaları için uygun değildir.
