Name: Kornea Endotel Hücre Kaybının Noninvaziv, Lazer Destekli Deneysel Modelinin Geliştirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-24T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 23 s
Description: Öğrenin, Nd:YAG lazer kullanarak kornea endotel hücrelerini Descemet membranından ayırma yöntemini. Bu noninvaziv teknik, erken evre bullöz keratopati için güvenilir bir ekz vivo hastalık modeli sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Christine Örün ve Jan A. M. Sochurek'e deneysel yöntemlerdeki yardımları için teşekkür ederiz.

Hayvan dokusu ile ilgili tüm prosedürler yerel Hayvan Bakım ve Etik Komitesi yönergelerine uyar.
1. Organ kültürünün hazırlanması ve lazer tedavisi
<ol><li>Yerel mezbaha dan taze enükleated domuz gözleri elde edin. Onları serin tutun (4 °C) Dulbecco modifiye Eagle orta (DMEM) yüksek glikoz ile, L-glutamin ile takviye, sodyum pirüuvat, penisilin / streptomisin (%1), ve domuz serumu (%10), bundan böyle tam orta olarak bu makalede belirtilen.</li>
	<li>Makas ile ekstrasellüler dokuları çıkarın ve kullanıma kadar sterilfosfat tamponlu salin (PBS) yerleştirmeden önce 5 dakika boyunca% 5 povione-iyot oftalmik çözelti gözleri ıslatın.</li>
	<li>Spektral etki alanı optik koherens tomografi cihazı(Tablo Of Materials)ile kornea skar, ödem ve diğer opakentler gibi ana anterior segment patolojileri için ekran gözleri.</li>
	<li>Gözleri, dalga boyu 1.064 nm ve havada 10 μm odak noktası çapına sahip Nd:YAG lazeri(Malzeme Tablosu)ile donatılmış bir lamba ünitesinin önüne yerleştirin. NOT: En iyi konumlandırma için 3D baskılı bir tutma aparatı kullanılır, bu da göz firmasını tutmak için tasarlanmıştır, üzerinde çok fazla baskı olmadan(Şekil 1).</li>
	<li>12x büyütme kullanın ve tek tek kornea katmanları görselleştirmek için aydınlatma saptırmak.</li>
	<li>Endotel hücrelerinin seçici ablasyonunu ayarlamak için darbe enerjisini (örn. 1,6 mJ) ve odak noktasını (örn. 0,16 mm) ayarlayın.</li>
	<li>Limbus yakın net bir kornea paracentesis yerleştirin ve ön oda stabilize etmek için viskoelastik enjekte(Malzeme Tablosu).</li>
	<li>Lazerle tedavi edilen merkezi korneayı 8 mm trephine kullanarak çıkar.</li>
	<li>Eksintise korneayı 12 kuyulu bir tablaya yerleştirin ve endotel bölgesi yukarı bakacak şekilde 3 mL'lik tam orta 3 mL'lik bir alanda 3 7 °C'ye kadar 3 gün kuluçkaya yatırın. NOT: Bu adımda ortama potansiyel sitoprotektif maddeler eklenebilir.</li>
</ol>2. Histolojiye hazırlık
<ol><li>133 mM KH2PO4 19,6 mL içeren 7,4 pH ile Sorensen tampon hazırlayın ve 133 mM Na2HPO480,4 mL .</li>
	<li>Metanoliçermeyen paraformaldehit (%4) kullanarak kornea içeren kuyudan ortayı çıkarın ve 20 dakika oda sıcaklığında (RT) dokuyu sabitle Sorensen'in tamponunda.</li>
	<li>Doku battı kadar PBS% 20 sakaroz yerleştirin (1 saat) ve daha sonra% 30 sakaroz PBS bir gecede RT. Kabarcıklar ve hava yüzeyi arayüzü ile temas önlemek için dikkat edin. Dokuyu optimum kesme sıcaklığına (OCT) yerleştirin ve -80 °C'de saklayın.</li>
	<li>-27 °C'de bir kriyostat kullanarak 10 μm kalınlığında kesin. NOT: Bir deve saç fırçası bıçak bıçak üzerinde ortaya çıkan bölüm rehberlik yardımcı olmak için yararlıdır.</li>
	<li>Dokuyu dondurup kurutmaktan kaçınmak için kesişten 1 dakika sonra kaydırağa dokunarak bölümü mikroskop slaytına aktarın. Slaytları -80 °C'de saklayın.</li>
</ol>3. Hematoksilin ve eozin (H&E) boyama
<ol><li>Hava kuru bölümleri birkaç dakika nem kaldırmak için.</li>
	<li>50 mL tüpte 10 dk boyunca %0.1 Mayers hematoksinilin ile leke.</li>
	<li>Bir Coplin kavanozda, 5 dakika boyunca serin çalışan ddH2O durulayın ve % 0.5 eozin 10x daldırma.</li>
	<li>DDH2O'ya din eozin çizgileri durdurana kadar daldırın ve %50 (10x) ve %70 (10x) EtOH'a daldırın.</li>
	<li>Ksilene birkaç kez daldırma önce% 95 EtOH (30 s) ve% 100 EtOH (60 s) dengeleyin.</li>
	<li>Son olarak, hafif bir mikroskop kullanarak görüntü almadan önce numuneyi monte edin ve kapağını kapatın.</li>
</ol>

<ol><li>DelMonte, D. W., Kim, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+and+physiology+of+the+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cataract+and+Refractive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Anatomy and physiology of the cornea.</a> Journal of Cataract and Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).</li>
<li>Edelhauser, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+balance+between+corneal+transparency+and+edema%3A+the+Proctor+Lecture%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">The balance between corneal transparency and edema: the Proctor Lecture.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (5), 1754-1767 (2006).</li>
<li>Tuft, S. J., Coster, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+corneal+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Eye%22%5BJournal%5D)">The corneal endothelium.</a> Eye. 4, London, England. Pt 3 389-424 (1990).</li>
<li>Bourne, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+the+corneal+endothelium+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Eye%22%5BJournal%5D)">Biology of the corneal endothelium in health and disease.</a> Eye. 17, 912-918 (2003).</li>
<li>He, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+map+of+the+human+corneal+endothelial+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">3D map of the human corneal endothelial cell.</a> Scientific Reports. 6, 29047(2016).</li>
<li>Gain, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Survey+of+Corneal+Transplantation+and+Eye+Banking%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Global Survey of Corneal Transplantation and Eye Banking.</a> JAMA Ophthalmology. 134 (2), 167-173 (2016).</li>
<li>Schwartzkopff, J., Bredow, L., Mahlenbrey, S., Boehringer, D., Reinhard, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+corneal+endothelium+following+complete+endothelial+cell+loss+in+rat+keratoplasty%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Regeneration of corneal endothelium following complete endothelial cell loss in rat keratoplasty.</a> Molecular Vision. 16, 2368-2375 (2010).</li>
<li>Bredow, L., Schwartzkopff, J., Reinhard, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+corneal+endothelial+cells+following+keratoplasty+in+rats+with+bullous+keratopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Regeneration of corneal endothelial cells following keratoplasty in rats with bullous keratopathy.</a> Molecular Vision. 20, 683-690 (2014).</li>
<li>Bartakova, A., Kunzevitzky, N. J., Goldberg, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+Cell+Therapy+for+Corneal+Endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Ophthalmology+Reports%22%5BJournal%5D)">Regenerative Cell Therapy for Corneal Endothelium.</a> Current Ophthalmology Reports. 2 (3), 81-90 (2014).</li>
<li>Zhao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+three-dimensional+organ+culture+model+for+corneal+wound+healing+and+corneal+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Development of a three-dimensional organ culture model for corneal wound healing and corneal transplantation.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (7), 2840-2846 (2006).</li>
<li>Aron-Rosa, D., Aron, J. J., Griesemann, M., Thyzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+neodymium-YAG+laser+to+open+the+posterior+capsule+after+lens+implant+surgery%3A+a+preliminary+report%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+-+American+Intra-Ocular+Implant+Society%22%5BJournal%5D)">Use of the neodymium-YAG laser to open the posterior capsule after lens implant surgery: a preliminary report.</a> Journal - American Intra-Ocular Implant Society. 6 (4), 352-354 (1980).</li>
<li>Vogel, A., Hentschel, W., Holzfuss, J., Lauterborn, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cavitation+bubble+dynamics+and+acoustic+transient+generation+in+ocular+surgery+with+pulsed+neodymium%3A+YAG+lasers%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Cavitation bubble dynamics and acoustic transient generation in ocular surgery with pulsed neodymium: YAG lasers.</a> Ophthalmology. 93 (10), 1259-1269 (1986).</li>
<li>Vogel, A., Schweiger, P., Frieser, A., Asiyo, M. N., Birngruber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraocular+Nd%3AYAG+laser+surgery%3A+laser-tissue+interaction%2C+damage+range%2C+and+reduction+of+collateral+effects%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Journal+of+Quantum+Electronics%22%5BJournal%5D)">Intraocular Nd:YAG laser surgery: laser-tissue interaction, damage range, and reduction of collateral effects.</a> IEEE Journal of Quantum Electronics. 26 (12), 2240-2260 (1990).</li>
<li>Zhu, Q., Zhu, Y., Tighe, S., Liu, Y., Hu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+Human+Corneal+Endothelial+Cells+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Engineering of Human Corneal Endothelial Cells In Vitro.</a> International Journal of Medical Sciences. 16 (4), 507-512 (2019).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotinamide+inhibits+corneal+endothelial+mesenchymal+transition+and+accelerates+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Nicotinamide inhibits corneal endothelial mesenchymal transition and accelerates wound healing.</a> Experimental Eye Research. 184, 227-233 (2019).</li>
<li>Pescina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+convenient+ex+vivo+model+for+the+study+of+the+transcorneal+permeation+of+drugs%3A+histological+and+permeability+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Development of a convenient ex vivo model for the study of the transcorneal permeation of drugs: histological and permeability evaluation.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (1), 63-71 (2015).</li>
<li>Smeringaiova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+Wound+Repair+of+the+Organ-Cultured+Porcine+Corneas%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Endothelial Wound Repair of the Organ-Cultured Porcine Corneas.</a> Current Eye Research. 43 (7), 856-865 (2018).</li>
<li>Yamashita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rabbit+Corneal+Endothelial+Dysfunction+Model+Using+Endothelial-Mesenchymal+Transformed+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A Rabbit Corneal Endothelial Dysfunction Model Using Endothelial-Mesenchymal Transformed Cells.</a> Scientific Reports. 8 (1), 16868(2018).</li>
<li>Schubert, H. D., Trokel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+repair+following+Nd%3AYAG+laser+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Endothelial repair following Nd:YAG laser injury.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 25 (8), 971-976 (1984).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rabbit+Model+of+Corneal+Endothelial+Injury+Established+Using+the+Nd%3A+YAG+Laser%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Rabbit Model of Corneal Endothelial Injury Established Using the Nd: YAG Laser.</a> Cornea. 36 (10), 1274-1281 (2017).</li>
<li>McCally, R. L., Bonney-Ray, J., de la Cruz, Z., Green, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+endothelial+injury+thresholds+for+exposures+to+1.54+micro+m+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Health+Physics%22%5BJournal%5D)">Corneal endothelial injury thresholds for exposures to 1.54 micro m radiation.</a> Health Physics. 92 (3), 205-211 (2007).</li>
<li>Nash, J. P., Wickham, M. G., Binder, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+damage+following+focal+laser+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Corneal damage following focal laser intervention.</a> Experimental Eye Research. 26 (6), 641-650 (1978).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu pilot çalışmanın sonuçları, enerji dozu ve odak noktası pozisyonu için uygun parametreler seçildiğinde kornea endotel hücrelerini seçici olarak ablate etmek için nd:YAG lazerin kullanılabileceğini göstermektedir.
Endotel fonksiyonu kornea şeffaflığı ve korneanın stromal ödemden korunması açısından önemli olduğundan, endotel disfonksiyonu modelleri ödem önleyici ilaçların veya cerrahi işlemlerin geliştirilmesinde önemli rol oynamaktadır. In vivo durum taklit etmek için çeşitli in vitro model...

Korneanın saydamlığı, ışığın retinaya ve fotoreseptörlerine iletilmesi için gereklidir1. Bu bağlamda, dehidratasyon göreceli bir devlet kornea stroma içinde kollajen lifleri doğru hizalanmış tutmak için önemlidir. Bu homeostaz Descemet membran (DM)2üzerinde bulunan kornea endotel hücreleri (MSK) tarafından korunur. Endotel en içteki kornea tabakasıdır. Bu kornea şeffaflık için çok önemli bir bariyer ve pompa fonksiyonu vardır3. Epitelaksine, endotel kendini yenilemek mümkün değildir4. Bu nedenle, hastalık veya travma nedeniyle herhangi bir hücre hasarı büyütmek ve göç, ortaya çıkan kusurları kapsayacak ve kornea işlevselliğini korumak için kalan endotel hücrelerini uyarır5. Ancak, CEC yoğunluğu kritik bir eşiğin altına düşerse, endotel dekompansasyonu bir ödem yol açar, bulanık görme ve rahatsızlık ve hatta şiddetli ağrı ile sonuçlanan4. Semptomları hafifletmek için ilaçların mevcudiyetine rağmen, şu anda bu durumlarda tek kesin tedavi kornea naklidir, tam kalınlıkta greft veya lamellar endotel transplantasyonu şeklinde yapılabilir. İkinci prosedür Descemet membran endotel keratoplasti olarak kullanılabilir (DMEK) yanı sıra Descemet's sıyırma otomatik endotel keratoplasti (DSAEK)6. Ancak, kalan MK'nin korunması ve hayatta kalmalarının artırılması alternatif bir hedef olabilir, potansiyel terapötik ilaçları test etmek için yeterli bir hastalık modeline ihtiyaç vardır.
Mevcut CEC kaybı hastalığı modelleri toksik ajanların enjeksiyonu yoluyla endotel imha odaklanmak (örneğin, benzalkonyum klorür) ön hazneiçine veya bir invaziv descemetorheks tekniği kullanarak hücrelerin mekanik aşınma ile7,8. Bu modeller iyi kurulmuş olmakla birlikte, genel inflamatuar yanıt ve kesin olmayan ikincil hasar gibi dezavantajları var. Bu nedenle, bu modeller daha fazla hastalığın son aşamalarında temsil etmek olasıdır, yukarıda belirtilen cerrahi seçenekler kaçınılmaz olduğunda.
Kök hücre ve gen tedavisi gibi hücresel tedavi stratejilerindeki gelişmelerle, bu hücresel tedavilerin uygulanması MK kaybının erken evrelerinde yararlı olabilir9. Daha sonra, hastalığın bu erken evrelerini daha yeterli bir şekilde temsil eden bir modele ihtiyacımız vardır. Bu bağlamda, hücre kültürü modelleri son on yılda geliştirilmiş ama yine de geçerliliği sınırlıdır, in vitro hücreleri kornea içinde farklı hücre türleri arasında meydana gelen karmaşık etkileşimleri çoğaltma yakın gelemez gibi10. Bu nedenle, ex vivo ve in vivo hastalık modelleri hala yüksek talep ve mevcut olanları iyileştirilmesi son derece ilgi çekicidir.
Noninvaziv, göz içi cerrahisi bir neodimyum kullanarak fotoaksilik:YAG (Nd:YAG) lazer geç 1970'lerin sonlarında piyasaya sunulmasından bu yana dünya çapında göz doktorları için rutin bir prosedür haline gelmiştir11. Photodisruption plazma oluşumuna yol açan doğrusal olmayan ışık emilimi dayanır, akustik şok dalgaları üretimi, ve kavitasyon kabarcıkları oluşturulması, uygulama sitesi sıvı bir ortamda bulunduğunda12. Genel olarak, bu süreçler hassas doku kesme amaçlanan etkiye katkıda bulunur. Ancak, onlar da lazer cerrahisi13yerel hapsi sınırlayan gereksiz teminat hasar kaynağı olabilir.
Ortaya çıkan mekanik etkilerin tahmini, şok dalgası yayılımı ve kavitasyon rotasının karakterizasyonu ile önemli ölçüde iyileşmiştir. Amacımız MSK kaybının erken evreleri için noninvaziv, lazer destekli deneysel bir hastalık modeli sağlamak için çevre dokulara mümkün olduğunca az hasar ile MSK hedef. Bu amaçla lazerin odak noktalarının optimum darbe enerjilerini ve konumlarını belirlemek gerekir.

<table><tbody><tr><td>BARRON VAKUM TREPHINE</td><td>Katena</td><td>K20-2058</td><td></td></tr><tr><td>Kriyostat</td><td>Leica</td><td>CM 3050S</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modifiye Kartal' s Orta - yüksek glikoz</td><td>PAA</td><td>E-15009</td><td></td></tr><tr><td>Göz tutucu</td><td>Kendinden</td><td>N / A Ters</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Leica</td><td>DMI 6000 B</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO 4</td><td>Merck</td><td>529568</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Merck</td><td>1065860500</td><td></td></tr><tr><td>Nd: YAG lazer</td><td>Zeiss Meditec</td><td>visuLAS YAG II plus</td><td></td></tr><tr><td>OCT Doku Tek</td><td>Sakura Finetechnical</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Salin (PBS)</td><td>Gibco</td><td>10010056</td><td></td></tr><tr><td>Domuz serumu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12736C</td><td></td></tr><tr><td>Spektral alanlı optik koherens tomografi</td><td>Heidelberg Mühendislik</td><td>Spektrali</td><td></td></tr><tr><td>Doku kültürü plakası 12 kuyulu</td><td>Sarstedt</td><td>833921</td><td></td></tr><tr><td>İki Foton Mikroskobu</td><td>JenLab</td><td>DermaInspect</td><td></td></tr><tr><td>Viskoelastik</td><td>OmniVision</td><td>Methocel</td><td></td></tr></tbody></table>

kornea endotel hücre kaybının noninvaziv, lazer destekli deneysel modelinin geliştirilmesi

Development of a Noninvasive, Laser-Assisted Experimental Model of Corneal Endothelial Cell Loss

Nd:YAG lazerler noninvaziv göz içi cerrahisi gerçekleştirmek için kullanılmaktadır, kapsulotomi gibi şimdi birkaç on yıldır. Kesi etkisi lazer odaklama optik arıza dayanır. Akustik şok dalgaları ve kavitasyon kabarcıkları üretilir, doku yırtılmasına neden olur. Kabarcık boyutları ve basınç genlikleri darbe enerjisi ve odak noktasının konumuna göre değişir. Bu çalışmada, enükleatlı domuz gözleri ticari olarak mevcut nd:YAG lazerin önüne yerleştirilmiştir. Değişken darbe enerjileri ve korneaya arka fokal noktaların farklı konumları test edildi. Ortaya çıkan lezyonlar iki foton mikroskobu ve histoloji ile değerlendirildi ve kornea endotel hücrelerinin (MSK) en az ikincil hasarla özel bir ayrılması için en iyi parametreler belirlendi. Bu yöntemin avantajları, CEC'nin kesin ablasyon, azaltılmış ikincil hasar ve hepsinden önemlisi temassız tedavidir.

Burada sunulan prosedürü kullanarak, uygun parametreleri bulmak için farklı darbe enerjilerini (1.0−4.6 mJ) ve odak noktalarının (korneanın arka yüzeyinden uzaklık: 0.0−0.2 mm) konumlarını değerlendirerek gözleri Nd:YAG lazerile tedavi ettik. Lazer parametrelerinin her takımyıldızı için birden fazla çoğaltma (n = 3) değerlendirildi (12 x 21).
Yukarıda belirtilen protokole ek olarak, numune fiksasyon ve H&amp;E boyamadan önce iki foton mikroskop la analiz edildi. İki fotonmikroskop, 690−1b040 n...

Burada kornea endotel hücrelerinin (MSK) neodimyum kullanarak Descemet zarından (DM) ayrılması için bir protokol sunuyoruz:YAG (Nd:YAG) lazer, büllöz keratopati (BK) için eksvivo hastalık modeli olarak.

Kornea Endotel Hücre Kaybının Noninvaziv, Lazer Destekli Deneysel Modelinin Geliştirilmesi

Nd:YAG lasers have been used to perform noninvasive intraocular surgery, such as capsulotomy for several decades now. The incisive effect relies on the ...

Kornea endotel hücre kaybı için mevcut hastalık modelleri endotel yıkımı üzerinde duruluyor ve daha büyük olasılıkla kornea nakli kaçınılmaz olduğunda hastalığın son aşamalarını temsil ediyor. Kök hücre veya gen tedavisi kullanarak yeni tedaviler, ancak, şimdi hastalığın erken aşamalarında daha yararlı olabilir mevcuttur, hangi eksik modelleri. Nd:YAG lazer kullanılarak fotopatasyon ile noninvaziv göz içi cerrahisi göz doktorları için rutin bir işlem haline gelmiştir.Yerel mezbahadan taze enükleated domuz gözleri elde ettikten sonra, dört derece santigrat tam orta örnekleri yerleştirin. Ekstrasellüler dokuları kaldırmak ve beş dakika boyunca% 5 povidone iyot oftalmik çözelti gözleri ıslatmak için makas kullanın. Daha sonra dezenfekte edilmiş numuneleri oda sıcaklığında steril PBS'ye yerleştirin.Spektral etki alanı optik koherens tomografi cihazı kullanarak, kornea skar, ödem ve diğer opacities gibi büyük ön segment patolojileri için gözleri tarar. Taramadan sonra, gözleri 1, 064 nanometre dalga boyu ve havada 10 mikrometre odak nokta çapı ile nd:YAG lazer ile donatılmış bir kayma lambası ünitesinin önüne yerleştirin. 12X büyütmeyi seçin ve tek tek kornea katmanlarını görselleştirmek için aydınlatmayı saptırın.Kornea endotel hücrelerinin selektif ablasyon için uygun parametrelere darbe enerjisi ve odak noktası ayarı yaptıktan sonra, dokuya birkaç lazer çekim uygulayın. Daha sonra bir diseksiyon mikroskobu altında, limbus yakın net bir kornea paracentesis yerleştirin ve ön oda stabilize etmek için viskolastik enjekte. Sonra lazer tedavi merkezi kornea çıkarmak ve 12-iyi plaka endotel tarafı bir kuyu içine izole kornea yerleştirmek için sekiz milimetrelik trephine kullanın.Korneaların tamamı toplandığında, her numuneye üç milimetrelik tam orta madde ekleyin ve numuneleri 37 santigrat derecede üç güne kadar kuluçkaya yatırın. Kuluçka sonunda, oda sıcaklığında 20 dakikalık bir kuluçka için Sorensen tamponmetan sızma% 4 paraformaldehit ile her kuyuda orta değiştirin. Kuluçka sonunda, kornealar batana kadar yaklaşık bir saat pbs% 20 sakaroz sabit örnekleri yerleştirin.Eksi 80 santigrat derecede depolama için en uygun kesme sıcaklığında dokuları gömmeden önce numuneleri pbs'de bir gecede %30 sakaroza aktarın. Bir kriyostat eksi 27 santigrat derece ayarlanmış dondurulmuş dokuların 10 mikrometre kalınlığında bölümleri elde etmek için bir mikroskop slayt üzerinde her bölümü toplama bir dakika içinde elde ediliyor. Daha sonra slaytları lekelenme kadar eksi 80 derecede saklayın.Hematoksilin ve eozin boyama için, hava 50 mililitrelik bir tüp 10 dakika boyunca süzülen% 0.1 Mayer hematoksin ile boyama önce nem kaldırmak için birkaç dakika dondurulmuş bölümleri kuru. Kuluçka sonunda, bir cuvette beş dakika boyunca çift distile su slaytlar durulayın. Daha sonra, slaytları %0,5 eozin 10 kez batırın, ardından eozin çizgileri durdurana kadar çift distile suda durulayın.Durulanmış slaytları %50 etanolde 10 kez ve %70 etanolde 10 kez batırın. Son% 70 etanol daldırma sonra, 30 saniye için% 95 etanol bölümleri dengeleyin, ksilen birkaç dips önce% 100 etanol 60 saniye izledi. Daha sonra hafif bir mikroskop üzerinde görüntü elde etmeden önce coverslip ile örnekleri monte.İki foton ve ışık mikroskobu görüntüsü bağımsız olarak hasar, çok fazla hasar veya doğru miktarda hasar olarak değerlendirilmelidir. Bu değerlendirmelere dayanarak, bir ısı haritası daha sonra çevre dokuya en az hasar ile kornea endotel hücrelerinin selektif ablasyon için lazer parametreleri sağ takımyıldızı seçmek için hesaplanabilir. Önceki analizler, lazerin odak noktasının test edilen en düşük darbe enerjisi için kornea endotellerinin en az 0,15 milimetre gerisinde olması gerektiğini belirlemiştir.2.9 milijoules'ten yüksek darbe enerjileri için test edilen en uzun odak uzaklığı hala endotel'e çok yakındır. Ekstremite numuneleri kültürde yken çeşitli sitoprotektif ajanlar test edilebilir. Başarılı olduğu kanıtlanırsa, tedavi için sulama çözeltisine eklenebilirler.

development-noninvasive-laser-assisted-experimental-model-corneal

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Bu video, domuz gözündeki kornea endotel hücrelerine seçici olarak zarar vermek için invaziv olmayan lazer destekli bir prosedürü göstermektedir. Geliştirilen ex vivo endotel hücre hasarı modeli, kornea endotel hastalıklarını incelemek için kullanılabilir.

Domuz Kornea Endotel Hücrelerinin Lazer Destekli Seçici Ablasyonu: Ex Vivo Çalışmalar için Odaklanmış Domuz Kornea Endotel Hasarını İndüklemek İçin Bir Teknik

Korneanın neovaskülarizasyon (NV) çoklu görsel patolojileri karmaşık hale getirebilir. Kontrollü, alkali-yanık yaralanması modeli kullanılarak, korneal NV bir ölçülebilir düzeyde neovasküler hastalıkları için potansiyel tedavilerinin kornea NV ve değerlendirme mekanik çalışma için üretilebilir.

Fare Kornea Neovaskülarizasyonunun bir Alkali-yanık Yaralanma Modeli

Endotel naklinde tüm lazer prosedürü önerilmektedir. Cerrahi teknik, donör dokuyu hazırlamak için bir femtosaniye lazerin kullanılmasına dayanır. Daha sonra donör endotelyumu doğru pozisyonda sabitlemek için lazer kaynak tekniği kullanılır.

Bir &quot;All-lazer&quot; Endotelyal Nakli

Burada, neovasküler yaşa bağlı makula dejenerasyonunun (AMD) vasküler özelliklerini yeniden yaratan deneysel bir model olan fare lazer kaynaklı koroidal neovaskülarizasyon (CNV) protokolünü sunuyoruz. Bir kez ustalaştıktan sonra, çeşitli deneysel önlemleri test etmek için bir model sistem olarak CNV'yi güvenilir ve etkili bir şekilde indükleyebilir.

Lazer kaynaklı Koroid Neovaskülarizasyonlarında A Fare Modeli

sığır endotel hücrelerinin ana bir kültürü kornea endotelial-mezenkimal geçiş mekanizmasını araştırmak için kullanıldı. Ayrıca, bir fare endotel cryoinjury modeli in vivo olarak endotel-mezenkimal geçiş göstermek için kullanılmıştır.

Vitro ve in vivo Modelleri Kornea Endotel-mezenkimal Geçiş Çalışması için

aşağıdaki makale etkin bir limbal kök hücre yetmezliği (LSCD) sürdürülebilir bir fare modeli oluşturmak için kolay, tekrarlanabilir teknik sağlar. Bu hayvan modeli test ve limbal kök hücre hastalıkları için tedavi etkinliğini karşılaştıran yararlıdır.

Basit mekanik Prosedür Mouse Limbal Kök Hücre Eksikliği oluşturma

Burada, boyuna vivo içinde görüntüleme kullanışlılığı lazer kaynaklı choroidal neovaskülarizasyon farelerde morfolojik değişiklikler takip içinde mevcut.

Vivo Multimodal görüntüleme ve fare lazer kaynaklı Choroidal neovaskülarizasyon Model analizi

Burada domuz eti bölünmüş kornea düğmelerinin hazırlanması ve yetiştirilmesi için adım adım bir protokol sunulmuştur. Bu organo-tipik ekili organ kültürü modeli 15 gün içinde hücre ölüm oranlarını gösterir gibi, insan donör kornea karşılaştırılabilir, toksik dekstran eklemeden insan dışı kornea uzun vadeli ekimi sağlayan ilk modeli temsil eder.

Split Korneal Düğmeleri Kullanarak Bir Domuz Korneal Endotel Organ Kültür Modeli

Descemet's Stripping Only, Fuchs Endotelyal Kornea Distrofisinden kaynaklanan merkezi kornea guttası olan hastalarda, periferik hücrelerin endotel tabakasını yenilemesi için Descemet'in zarının sıyrıldığı deneysel bir prosedürdür. Bu yazıda, eFGF1 (NM141) tarafından uyarılan hızlandırılmış iyileşme ile distrofik insan kornealarında ex vivo'da DSO'yu simüle eden yeni metodoloji sunulmaktadır.

Descemet'in Sadece Mühendislik Fibroblast Büyüme Faktörü 1 Tarafından Uyarılan Hızlandırılmış İyileşme ile Sıyırılmasının İnsan Kornea Organ Kültürü Modeli

Bu protokol, bir fare modelinde doğru ve tekrarlanabilir bir kornea ve limbal alkali hasarını indüklemek için bir yöntemi açıklar. Protokol, oldukça kavisli fare korneası ve limbusunda eşit olarak dağılmış bir yaralanmaya izin verdiği için avantajlıdır.

Bir fare modelinde punch-trephine tekniği kullanılarak kornea ve limbal alkali yaralanma indüksiyonu

Burada, korneayı innerve eden duyu liflerine zarar vermek için üç farklı yöntem öneriyoruz. Bu yöntemler, farelerde akson rejenerasyonunun incelenmesini kolaylaştırır. Diğer hayvan modellerine uyarlanabilen bu üç yöntem, kornea innervasyon fizyolojisi ve rejenerasyonunun incelenmesi için idealdir.

Murin Korneasında Nörotrofik Keratit ve Sinir Rejenerasyonunu İndüklemek için Üç Strateji

Öğrenin, Nd:YAG lazer kullanarak kornea endotel hücrelerini Descemet membranından ayırma yöntemini. Bu noninvaziv teknik, erken evre bullöz keratopati için güvenilir bir ekz vivo hastalık modeli sunar.

Kornea Endotel Hücre Kaybının Noninvaziv, Lazer Destekli Deneysel Modelinin Geliştirilmesi

Daha fazla video keşfet