Kornea Endotel Hücre Kaybının Noninvaziv, Lazer Destekli Deneysel Modelinin Geliştirilmesi

Kornea endotel hücre kaybı için mevcut hastalık modelleri endotel yıkımı üzerinde duruluyor ve daha büyük olasılıkla kornea nakli kaçınılmaz olduğunda hastalığın son aşamalarını temsil ediyor. Kök hücre veya gen tedavisi kullanarak yeni tedaviler, ancak, şimdi hastalığın erken aşamalarında daha yararlı olabilir mevcuttur, hangi eksik modelleri. Nd:YAG lazer kullanılarak fotopatasyon ile noninvaziv göz içi cerrahisi göz doktorları için rutin bir işlem haline gelmiştir.

Yerel mezbahadan taze enükleated domuz gözleri elde ettikten sonra, dört derece santigrat tam orta örnekleri yerleştirin. Ekstrasellüler dokuları kaldırmak ve beş dakika boyunca% 5 povidone iyot oftalmik çözelti gözleri ıslatmak için makas kullanın. Daha sonra dezenfekte edilmiş numuneleri oda sıcaklığında steril PBS'ye yerleştirin.

Spektral etki alanı optik koherens tomografi cihazı kullanarak, kornea skar, ödem ve diğer opacities gibi büyük ön segment patolojileri için gözleri tarar. Taramadan sonra, gözleri 1, 064 nanometre dalga boyu ve havada 10 mikrometre odak nokta çapı ile nd:YAG lazer ile donatılmış bir kayma lambası ünitesinin önüne yerleştirin. 12X büyütmeyi seçin ve tek tek kornea katmanlarını görselleştirmek için aydınlatmayı saptırın.

Kornea endotel hücrelerinin selektif ablasyon için uygun parametrelere darbe enerjisi ve odak noktası ayarı yaptıktan sonra, dokuya birkaç lazer çekim uygulayın. Daha sonra bir diseksiyon mikroskobu altında, limbus yakın net bir kornea paracentesis yerleştirin ve ön oda stabilize etmek için viskolastik enjekte. Sonra lazer tedavi merkezi kornea çıkarmak ve 12-iyi plaka endotel tarafı bir kuyu içine izole kornea yerleştirmek için sekiz milimetrelik trephine kullanın.

Korneaların tamamı toplandığında, her numuneye üç milimetrelik tam orta madde ekleyin ve numuneleri 37 santigrat derecede üç güne kadar kuluçkaya yatırın. Kuluçka sonunda, oda sıcaklığında 20 dakikalık bir kuluçka için Sorensen tamponmetan sızma% 4 paraformaldehit ile her kuyuda orta değiştirin. Kuluçka sonunda, kornealar batana kadar yaklaşık bir saat pbs% 20 sakaroz sabit örnekleri yerleştirin.

Eksi 80 santigrat derecede depolama için en uygun kesme sıcaklığında dokuları gömmeden önce numuneleri pbs'de bir gecede %30 sakaroza aktarın. Bir kriyostat eksi 27 santigrat derece ayarlanmış dondurulmuş dokuların 10 mikrometre kalınlığında bölümleri elde etmek için bir mikroskop slayt üzerinde her bölümü toplama bir dakika içinde elde ediliyor. Daha sonra slaytları lekelenme kadar eksi 80 derecede saklayın.

Hematoksilin ve eozin boyama için, hava 50 mililitrelik bir tüp 10 dakika boyunca süzülen% 0.1 Mayer hematoksin ile boyama önce nem kaldırmak için birkaç dakika dondurulmuş bölümleri kuru. Kuluçka sonunda, bir cuvette beş dakika boyunca çift distile su slaytlar durulayın. Daha sonra, slaytları %0,5 eozin 10 kez batırın, ardından eozin çizgileri durdurana kadar çift distile suda durulayın.

Durulanmış slaytları %50 etanolde 10 kez ve %70 etanolde 10 kez batırın. Son% 70 etanol daldırma sonra, 30 saniye için% 95 etanol bölümleri dengeleyin, ksilen birkaç dips önce% 100 etanol 60 saniye izledi. Daha sonra hafif bir mikroskop üzerinde görüntü elde etmeden önce coverslip ile örnekleri monte.

İki foton ve ışık mikroskobu görüntüsü bağımsız olarak hasar, çok fazla hasar veya doğru miktarda hasar olarak değerlendirilmelidir. Bu değerlendirmelere dayanarak, bir ısı haritası daha sonra çevre dokuya en az hasar ile kornea endotel hücrelerinin selektif ablasyon için lazer parametreleri sağ takımyıldızı seçmek için hesaplanabilir. Önceki analizler, lazerin odak noktasının test edilen en düşük darbe enerjisi için kornea endotellerinin en az 0,15 milimetre gerisinde olması gerektiğini belirlemiştir.

2.9 milijoules'ten yüksek darbe enerjileri için test edilen en uzun odak uzaklığı hala endotel'e çok yakındır. Ekstremite numuneleri kültürde yken çeşitli sitoprotektif ajanlar test edilebilir. Başarılı olduğu kanıtlanırsa, tedavi için sulama çözeltisine eklenebilirler.