Name: Hücresel Yapı ve Fonksiyonun Perturbasyonu için Genom Düzenlenmiş Hücre Hatları hücre-hücre Füzyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-07T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: Keşfedin hücre füzyonu yöntemiyle hücresel yapı ve fonksiyonun bozulmasını; farklı hücre tiplerinden melez hücreler oluşturarak organel homeostazını floresan mikroskopi ile inceleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Wellcome Trust Henry Wellcome Bursu ile R.M. (https://wellcome.ac.uk/grant numarası 100090/12/Z) tarafından finanse edilmiştir. Funder çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayımlama kararı, ya da el yazması hazırlanmasında hiçbir rolü vardı. Ashok Venkitaraman ve Paul French'e proje hakkında eleştirel tavsiyeler ve rehberlik için teşekkür ederiz. Biz mükemmel destek için Cambridge Enstitüsü Tıbbi Araştırma Akış Cytometry tesisinde Chiara Cossetti ve Gabriela Grondys-Kotarba teşekkür ederiz. Taslağı doğruldukları için Liam Cassiday, Thomas Miller ve Gianmarco Contino'ya teşekkür ederiz.

1. Diferansiyel Floresan Hücre Etiketleme
<ol><li>CRISPR Cas9 ile gen etiketleme<ol>
<li>CrispR Cas9 genom düzenlemesini kullanarak insan kanser hücresi hatlarındaki floresan proteinler meGFP veya mScarlet-I ile rootletin (veya diğer ilgi genlerini) etiketleyin. NOT: Genom düzenleme için ayrıntılı protokoller başka bir yerde24,25,26kapsamaktadır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Floresan boya etiketleme<ol>
<li>37 °C'de %10 fetal sığır serumu (FBS), L-glutamin ve 37 °C'de 100 μg/mL penisilin/streptomisin ve %5 CO 2 nemli bir inkuvtörde %5 CO2 ile desteklenen Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamında (DMEM) Cal51 insan kanser hücrelerini yetiştirin. NOT: Hücrelerin mikoplazma kontaminasyonu yokluğunda ve hücre hattının kimliği için düzenli olarak kontrol edilmesini sağlamak önemlidir. Kültürde kapsamlı olarak geçiş yapmış hücreleri kullanmayın (>15 pasajlar). Hücreler sağlıklı ve katlanarak büyüyen olmalıdır. Az birleşimden veya aşırı birleşmeden kaçının.</li>
		<li>Her hücre tipini (rootletin-meGFP, rootletin-mScarlet-I ve ebeveyn etiketsiz Cal51 hücreleri) böylece ~6 x 106 hücre her örnek için ertesi gün 70−90%'lik bir birleşmeyle hazır bulunun. NOT: Bu yaklaşık bir T75 doku kültürü şişesi veya hücre tipi başına bir 10 cm çanak. Ebeveyn etiketlenmemiş hücreler daha sonra protokolde negatif denetim olarak gereklidir. Bu protokol ~ 20.000 erimiş hücrelerin üretimi için izin verir, ancak bu sayı toplu daha fazla sayıda protokol ölçekleme yoluyla artırılabilir.</li>
		<li>Ertesi gün, prewarm DMEM, tripsin ve 1x fosfat tamponlu salin (PBS) 37 °C'de bir su banyosuna yerleştirerek.</li>
		<li>Orta dökerek veya azarlayarak ve 10 mL PBS ile değiştirerek rootletin-meGFP ve rootletin-mScarlet-I hücrelerini PBS'de 2x yıkayın.</li>
		<li>Etiket Cal51 rootletin-meGFP hücreleri 500 nM menekşe hücre boyası ekleyerek(Tablo Malzemeler) PBS oda sıcaklığında 1 dakika (RT).</li>
		<li>Etiket Cal51 rootletin-mScarlet-I hücreleri RT 1 dakika için PBS 200 nM uzak kırmızı hücre boyası(Malzeme Tablosu)ekleyerek. NOT: Floresan lekelenmeden sonra numuneleri mümkün olan her yerde ışıktan koruyun, floresan fotobeyazrlamasını önleyin.</li>
		<li>5 dakika boyunca 10 mL DMEM ekleyerek boya etiketleme reaksiyonlarını durdurun.</li>
		<li>Etiketlenmemiş ebeveyn Cal51 hücrelerini kuvözden çıkarın (adım 1.2.2'den). NOT: Bu hücreler daha sonra etiketlenmemiş negatif denetimler (adım 3.3.2) olarak kullanılacaktır.</li>
		<li>Büyüme ortamını dökerek ve 10 mL PBS ile değiştirerek tüm hücreleri bir kez yıkayın.</li>
		<li>1 mL önceden ısıtılmış 1x tripsin ile kültür koşullarında PBS ve inkübasyon 5 dakika için dökün.</li>
		<li>Hücreleri 15 mL plastik konik tüpe ve santrifüje 1000 x g'da 5 dk aktarın.</li>
		<li>Dikkatle çıkarın ve bir pipet ile hücre pelet ten tripsin atın.</li>
		<li>PBS'nin 1 mL'inde menekşe ve uzak kırmızı etiketli hücre peletlerini yavaşça askıya alın.</li>
		<li>DMEM'in 1 mL'sinde ebeveyn (floresan olmayan) hücre peletini yavaşça askıya alın ve kuvöze geri dönün. NOT: Bu örnek hücre-hücre füzyonundan geçmeyecek, daha sonra akış sitometrisi sırasında kullanılacaktır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Hücre-Hücre Füzyonu
<ol><li>1 mL pipet kullanarak her hücre tipinden 0,5 mL'lik bir boruyu hafifçe birbirine doğru borulandırarak 15 mL'lik bir tüpte 3 x 106 mor etiketli hücreleri karıştırın.</li>
	<li>Kalan karışık olmayan hücreleri adım 2.1'den 5 dk için 1.000 x g'da santrifüj edin, sonra PBS'yi dökün, peleti 1 mL DMEM'de yeniden askıya alın ve kuvöze geri dönün. NOT: Bu kalan tek etiketli örnekler daha sonra protokolün bölüm 3'te negatif ve telafi denetimleri olarak kullanılacaktır.</li>
	<li>5 dk için 1.000 x g adım 2.1 karışık hücreleri santrifüj ve dikkatle 1 mL pipet kullanarak PBS aspire.</li>
	<li>30 s'lik bir süre boyunca 1 mL pipet kullanarak hücre peletine (adım 2.3) damla gibi 0,7 mL 1450 PEG çözeltisi ekleyin.</li>
	<li>RT'de 3,5 dakika bekletin. NOT: PEG ile kuluçka süresi hücre tipine bağlı olarak optimize edilebilir, ancak daha uzun kuluçka süresi hücre toksisitesini artırır unutmayın.</li>
	<li>30 s için 10 mL serumsuz DMEM damlama ekleyin ve 10 dakika kuvözde bırakın.</li>
	<li>5 dakika boyunca 1.000 x g'de aşağı doğru dön, supernatant'ı atın ve 1 mL tam ortamda (FBS içeren DMEM) hafifçe askıya alın. NOT: Doğrudan bölüm 3'e gidin. Peg maruziyeti ile ilişkili toksisite ve ardından akış sitometrisi ve görüntüleme vardır, bu nedenle adımlar arasında hızla ilerleyen hücreleri mümkün olduğunca kültür koşullarında tutun.</li>
</ol>3. Erimiş Hücreleri Zenginleştirmek için Floresan Aktive Hücre Sıralaması (FACS)
<ol><li>Her numuneyi 70 μm'lik bir filtreden ayrı ayrı bir FACS tüpüne borulayarak tüm hücreleri akış sitometrisine hazırlayın. NOT: Dört örnek gereklidir: erimiş hücreler, tek etiketli uzak kırmızı hücreler, tek etiketli menekşe hücreleri, etiketlenmemiş ebeveyn hücreleri. Steril doku kültürü başlığından çıkarıldıktan sonra hücreler enfekte olma kapasitesine sahiptir, bu nedenle numunelerin buradan itibaren steril olmayan bir ortama maruz kalma süresini en aza indirir. Hücreler tam DMEM ortamda sıralanır.</li>
	<li>Tek hücre sıralama yeteneğine sahip bir sitometre kullanın.<ol>
<li>Hücre ayırıcısını aseptik sıralama için ayarlayın. Üreticinin tavsiyesi ne göre cihaz kalite kontrol gerçekleştirin.</li>
		<li>Yan dağılıma karşı ileri dağılım ve çift taraflı ayrımcılık komplosu çizin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Erimiş hücreleri tanımlamak için kapılar oluşturun.<ol>
<li>405 nm ve 635 nm dalga boylarında floresan boyaları heyecanlandırın. 450 nm ve 660 nm (sırasıyla mor ve uzak kırmızı dalga boylarında) tespit edin. Çizim çok kırmızı karşı menekşe dalga boyları.</li>
		<li>Etiketlenmemiş ebeveyn hücrelerini sitometreden geçirin ve floresan yoğunluğunu kaydedin. NOT: Bu taban çizgisinin üzerindeki değerler boya boyama için pozitifliği tanımlar.</li>
		<li>Sitometre ile tek etiketli menekşe hücreleri çalıştırın. Menekşenin uzak kırmızı kanala dökülmediğini doğrulayın.</li>
		<li>Sitometre ile tek etiketli çok kırmızı hücreler çalıştırın ve menekşe kanal içine çok kırmızı dökülme olduğunu onaylayın. NOT: Gösterilen temsili veriler için hücreler 100 μm nozula sahip bir ayıklayıcıda 20 psi olarak sıralandı.</li>
		<li>Erimiş hücrelerin adım 3.3'te oluşturulan kapılarla görülebilen hücreleri doğrulamak için füzyon örneğini kısaca çalıştırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sıralama akışını merkezi olarak 8 kuyulu bir görüntüleme kabına hizalayın.</li>
	<li>FACS, çift pozitif mor ve uzak kırmızı etiketli hücreler olarak doğrudan 100 μL büyüme ortamı içeren 8-well görüntüleme çanak içine mevcut erimiş hücreleri sıralamak. NOT: Önerilen maksimum hücre sayısı 8 kuyulu çanak başına ~50.000'dir. Sıralama sırasında hücre sağlığından emin olun. Hücre birleşimi hücre sağlığını etkileyebilir, bu nedenle görüntüleme çanağı için uygun sayıda hücre yi sıralayarak hücreleri sıralama sonrası %20−90'lık birleştirme arasında tutun. Sıralanmış her damlacık yaklaşık 3 nL kılıf sıvısı içerir. Kılıf sıvısının sıralama sırasında büyüme ortamını önemli ölçüde sulandırmadığından emin olun.</li>
	<li>Sıralamadan hemen sonra hücreleri kuvöze geri götürün ve >2 saat veya gece boyunca bekleyin. NOT: Yapışık hücreler bu dönemde, sıralamadan itibaren, coverslip'e kademeli olarak yeniden yapışır ve bu nedenle doğrudan mikroskoba götürülürlerse morfolojileri zamanla değişir.</li>
</ol>4. Hücre-Hücre Füzyonlarının İmmünofloresan Boyanışı ve Görüntüleme
NOT: Erimiş hücreler, gerekli deneylere ve ölçümlere bağlı olarak canlı olarak veya fiksasyon dan sonra ve daha fazla floresan boyama (veya her ikisi) görüntülenebilir.
<ol><li>Canlı hücre görüntüleme<ol>
<li>Büyüme ortamını fenol kırmızısı olmadan görüntüleme ortamıyla değiştirin(Malzeme Tablosu)ve doğrudan görüntülemeye geçin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fiksasyon ve boyama<ol>
<li>PBS'de taze %4 paraformaldehit (PFA) hazırlayın.</li>
		<li>Hücreleri 100 μL%4 PFA'da 15 dakika boyunca inkübederek düzeltin. DİkKAT: PfA bu adım uygun kişisel koruyucu ekipman ile bir duman başlık içinde yapılmalıdır bu yüzden solunduğunda toksiktir. NOT: Fiksasyondan sonra, deneme duraklatılmış ve gerekirse daha sonra yeniden başlatılabilir. Gerekirse numuneyi ışıktan korunan 4 °C'de saklayın.</li>
		<li>RT'de 200 μL PBS'de hücreleri 3x yıkayın.</li>
		<li>Hücreleri 200 μL'de RT'de 10 dakika boyunca permeabilize edin ve PBS'de seyreltilmiş %0,1 noniyonik yüzey aktif madde(Malzeme Tablosu)ve %0,1 niyonik deterjan (Malzeme Tablosu)ile seyreltilir.</li>
		<li>RT'de 30 dakika boyunca PBS'de %3 sığır serum albumininin 200 μL'sini bloke edin.</li>
		<li>150 μL PBS'de %3 büyükbaş serum albumin, %0.1 nonionik yüzey aktif madde ve %0.05 niyonik deterjan içeren antikorlar ile inkübat. NOT: Temsili sonuçları oluşturmak için kullanılan birincil antikorlar floresan konjuge anti-GFP nanobody (1:400 seyreltme kullanılır) ve floresan konjuge anti-mScarlet-I nanobody (1:500 seyreltme kullanılır). Bu zaten floresan proteinlerin sinyalini artırmak.</li>
		<li>300 μL PBS'de 5 dk boyunca 2x yıkayın ve 200 μL PBS'de bırakın. NOT: Örnekler PBS'de görüntülenir. Numuneler ışıktan korunan 4 °C'de saklanabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Görüntü edinimi<ol>
<li>Dört renkli görüntüleme (örneğin, konfokal, geniş alan, yapılandırılmış aydınlatma) yeteneğine sahip uygun bir floresan mikroskobu ile görüntüler elde edin.</li>
		<li>Sırasıyla 488 nm ve 561 nm dalga boyu lazerli meGFP ve mScarlet-I kanallarını heyecanlandırın. ~505−550 nm ve ~590−650 nm'de tespit etmek için dedektörleri ayarlayın. Sırasıyla 405 nm ve 633 nm lazerile mor ve uzak kırmızı boya kanallarını heyecanlandırın. ~430−500 nm ve ~660−750 nm'de dedektörleri ayarlayın.</li>
		<li>Ampirik olarak lazer yoğunluğunu önemli fotobeyazrlama nın oluşmadığını ve hücrelerin sağlıklı kaldığını (canlı hücre görüntülemesi durumunda) belirleyin.</li>
		<li>Piksel değerlerini doyruşmadan veya yapay olarak kırpmadan sinyalin elde edilen kazancı ampirik olarak belirleyin.</li>
		<li>Görüntülerin ~500 m adım boyutuyla 20−60 μm aralığını kapsayan üç boyutlu olması gibi Z destesi verilerini toplayın. NOT: Temsili verilerde gösterilen görüntüler konfokal (Şekil 2B), Havalandırıcı (Şekil 2C) veya yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (Şekil 2D) ile elde edilmiştir. Her hücre, sitoplazmada üst üste gelen hem menekşe hem de uzak kırmızı boyalar içeriyorsa iyi niyetli bir heterokaryondur.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Lane, N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLane%2C+N+%22Power%2C+Sex%2C+Suicide%3A+Mitochondria+and+the+meaning+of+life%22">Power, Sex, Suicide: Mitochondria and the meaning of life</a>. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2006).</li>
<li>Brukman, N. G., Uygur, B., Podbilewicz, B., Chernomordik, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+cells+fuse%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">How cells fuse.</a> The Journal of Cell Biology. 218 (5), 1436-1451 (2019).</li>
<li>Köhler, G., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+cultures+of+fused+cells+secreting+antibody+of+predefined+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.</a> Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).</li>
<li>Rao, P. N., Johnson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+Cell+Fusion%3A+Studies+on+the+Regulation+of+DNA+Synthesis+and+Mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mammalian Cell Fusion: Studies on the Regulation of DNA Synthesis and Mitosis.</a> Nature. 225 (5228), 159-164 (1970).</li>
<li>Lengauer, C., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+instability+in+colorectal+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic instability in colorectal cancers.</a> Nature. 386 (6625), 623-627 (1997).</li>
<li>Fournier, R. E., Ruddle, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcell-mediated+transfer+of+murine+chromosomes+into+mouse%2C+Chinese+hamster%2C+and+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Microcell-mediated transfer of murine chromosomes into mouse, Chinese hamster, and human somatic cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (1), 319-323 (1977).</li>
<li>Tada, M., Tada, T., Lefebvre, L., Barton, S. C., Surani, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+germ+cells+induce+epigenetic+reprogramming+of+somatic+nucleus+in+hybrid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Embryonic germ cells induce epigenetic reprogramming of somatic nucleus in hybrid cells.</a> The EMBO Journal. 16 (21), 6510-6520 (1997).</li>
<li>Skelley, A. M., Kirak, O., Suh, H., Jaenisch, R., Voldman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+control+of+cell+pairing+and+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Microfluidic control of cell pairing and fusion.</a> Nature Methods. 6 (2), 147-152 (2009).</li>
<li>Donaldson, J., Shi, R., Borgens, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyethylene+glycol+rapidly+restores+physiological+functions+in+damaged+sciatic+nerves+of+guinea+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Polyethylene glycol rapidly restores physiological functions in damaged sciatic nerves of guinea pigs.</a> Neurosurgery. 50 (1), 147-157 (2002).</li>
<li>Duelli, D. M., Hearn, S., Myers, M. P., Lazebnik, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primate+virus+generates+transformed+human+cells+by+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A primate virus generates transformed human cells by fusion.</a> The Journal of Cell Biology. 171 (3), 493-503 (2005).</li>
<li>Duelli, D. M., Lazebnik, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cells+suppress+oncogene-dependent+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Primary cells suppress oncogene-dependent apoptosis.</a> Nature Cell Biology. 2 (11), 859-862 (2000).</li>
<li>Duelli, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+virus+causes+cancer+by+inducing+massive+chromosomal+instability+through+cell+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A virus causes cancer by inducing massive chromosomal instability through cell fusion.</a> Current Biology. 17 (5), 431-437 (2007).</li>
<li>Paramio, J. M., Casanova, M. L., Alonso, A., Jorcano, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratin+intermediate+filament+dynamics+in+cell+heterokaryons+reveals+diverse+behaviour+of+different+keratins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Keratin intermediate filament dynamics in cell heterokaryons reveals diverse behaviour of different keratins.</a> Journal of Cell Science. 110, 1099-1111 (1997).</li>
<li>Lentz, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEG+as+a+tool+to+gain+insight+into+membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22European+Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">PEG as a tool to gain insight into membrane fusion.</a> European Biophysics Journal. 36 (4-5), 315-326 (2007).</li>
<li>Lentz, B. R., Lee, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28ethylene+glycol%29+%28PEG%29-mediated+fusion+between+pure+lipid+bilayers%3A+a+mechanism+in+common+with+viral+fusion+and+secretory+vesicle+release%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">Poly(ethylene glycol) (PEG)-mediated fusion between pure lipid bilayers: a mechanism in common with viral fusion and secretory vesicle release?</a> Molecular Membrane Biology. 16 (4), 279-296 (1999).</li>
<li>Pontecorvo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+mammalian+somatic+cell+hybrids+by+means+of+polyethylene+glycol+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Somatic+Cell+Genetics%22%5BJournal%5D)">Production of mammalian somatic cell hybrids by means of polyethylene glycol treatment.</a> Somatic Cell Genetics. 1 (4), 397-400 (1975).</li>
<li>Okada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+giant+polynuclear+cell+formation+caused+by+HVJ+virus+from+Ehrlich%27s+ascites+tumor+cells.+I.+Microscopic+observation+of+giant+polynuclear+cell+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Analysis of giant polynuclear cell formation caused by HVJ virus from Ehrlich's ascites tumor cells. I. Microscopic observation of giant polynuclear cell formation.</a> Experimental Cell Research. 26, 98-107 (1962).</li>
<li>Zimmermann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electric+field-mediated+fusion+and+related+electrical+phenomena%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Electric field-mediated fusion and related electrical phenomena.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 694 (3), 227-277 (1982).</li>
<li>Hu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+of+cells+by+flipped+SNAREs%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fusion of cells by flipped SNAREs.</a> Science. 300 (5626), 1745-1749 (2003).</li>
<li>Bahadori, A., Lund, A. R., Semsey, S., Oddershede, L. B., Bendix, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+cellular+fusion+using+optically+trapped+plasmonic+nano-heaters%5BTitle%5D)+AND+%22Optical+Trapping+and+Optical+Micromanipulation+XIII%22%5BJournal%5D)">Controlled cellular fusion using optically trapped plasmonic nano-heaters.</a> Optical Trapping and Optical Micromanipulation XIII. 9922, 992211(2016).</li>
<li>Kao, K. N., Michayluk, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+high-frequency+intergeneric+fusion+of+plant+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">A method for high-frequency intergeneric fusion of plant protoplasts.</a> Planta. 115 (4), 355-367 (1974).</li>
<li>Ahkong, Q. F., Fisher, D., Tampion, W., Lucy, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+cell+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of cell fusion.</a> Nature. 253 (5488), 194-195 (1975).</li>
<li>Mahen, R., Venkitaraman, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+formation+in+centrosome+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Pattern formation in centrosome assembly.</a> Current Opinion in Cell Biology. 24 (1), 14-23 (2012).</li>
<li>Mahen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+centrosomal+roots+disentangle+to+allow+interphase+centriole+independence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Stable centrosomal roots disentangle to allow interphase centriole independence.</a> PLoS Biology. 16 (4), e2003998(2018).</li>
<li>Mahen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+assessment+of+fluorescent+transgene+methods+for+quantitative+imaging+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Comparative assessment of fluorescent transgene methods for quantitative imaging in human cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 25 (22), 3610-3618 (2014).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li>
<li>Yang, J., Shen, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyethylene+glycol-mediated+cell+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Polyethylene glycol-mediated cell fusion.</a> Methods in Molecular Biology. 325, 59-66 (2006).</li>
<li>Huang, L., Chen, Y., Huang, W., Wu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+pairing+and+polyethylene+glycol+%28PEG%29-mediated+cell+fusion+using+two-step+centrifugation-assisted+single-cell+trapping+%28CAScT%29%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Cell pairing and polyethylene glycol (PEG)-mediated cell fusion using two-step centrifugation-assisted single-cell trapping (CAScT).</a> Lab on a Chip. 18 (7), 1113-1120 (2018).</li>
<li>Feliciano, D., Nixon-Abell, J., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triggered+Cell-Cell+Fusion+Assay+for+Cytoplasmic+and+Organelle+Intermixing+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Triggered Cell-Cell Fusion Assay for Cytoplasmic and Organelle Intermixing Studies.</a> Current Protocols in Cell Biology. 81 (1), e61(2018).</li>
<li>Vaughan, V. L., Hansen, D., Stadler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parameters+of+polyethylene+glycol-induced+cell+fusion+and+hybridization+in+lymphoid+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Somatic+Cell+Genetics%22%5BJournal%5D)">Parameters of polyethylene glycol-induced cell fusion and hybridization in lymphoid cell lines.</a> Somatic Cell Genetics. 2 (6), 537-544 (1976).</li>
<li>Frye, L. D., Edidin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rapid+intermixing+of+cell+surface+antigens+after+formation+of+mouse-human+heterokaryons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The rapid intermixing of cell surface antigens after formation of mouse-human heterokaryons.</a> Journal of Cell Science. 7 (2), 319-335 (1970).</li>
<li>Mattenberger, Y., James, D. I., Martinou, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+of+mitochondria+in+mammalian+cells+is+dependent+on+the+mitochondrial+inner+membrane+potential+and+independent+of+microtubules+or+actin%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Fusion of mitochondria in mammalian cells is dependent on the mitochondrial inner membrane potential and independent of microtubules or actin.</a> FEBS Letters. 538 (1-3), 53-59 (2003).</li>
<li>Kerbel, R. S., Lagarde, A. E., Dennis, J. W., Donaghue, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+fusion+in+vivo+between+normal+host+and+tumor+cells%3A+possible+contribution+to+tumor+progression+and+metastasis+studied+with+a+lectin-resistant+mutant+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Spontaneous fusion in vivo between normal host and tumor cells: possible contribution to tumor progression and metastasis studied with a lectin-resistant mutant tumor.</a> Molecular and Cellular Biology. 3 (4), 523-538 (1983).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Hücreleri eritmek ve hücre melezlerinin sonraki mimarisini mikroskopi ile görselleştirmek için kolay ve uygun maliyetli bir protokol gösteriyoruz, baştan sona yaklaşık iki gün sürüyor. Bu protokolün kritik bölümleri, erimiş hücrelerin hücre sıralaması (protokol bölüm 3) ile zenginleşmesi ve erimiş hücrelerin mikroskopi ile dikkatli bir şekilde doğrulanmasıdır (protokol bölümü 4). Bu bölümler, erimiş hücrelerin kolayca elde edilmesini ve iyi niyetli heterokaryonlar olmasını sağlar. Konsantrasyonlar ve kuluçka süreleri uyu...

Hücresel yapının homeostatik bakımı yaşam için çok önemlidir. Hücreler karakteristik morfolojilere, hücre altı organel sayılarına ve iç biyokimyasal bileşimlere sahiptir. Bu temel özelliklerin nasıl oluşturulduğunu ve hastalık sırasında nasıl ters gittiklerini anlamak, onları tedirgin etmek için laboratuvar araçları gerektirir.
Hücre füzyonu iki veya daha fazla ayrı hücrenin birleşmesidir. Hücre füzyonu ökaryotik yaşamın ortaya çıkması için kritik olabilir1. İnsan vücudunda, hücre füzyonu nispeten nadirdir, sınırlı gelişimsel durumlar ve doku tipleri sırasında meydana gelen, döllenme veya kas oluşumu sırasında gibi, kemik ve plasenta2. Bu protokol, hücre yapısını ve işlevini kontrol eden mekanizmaları anlamak için bir araç olarak, farklı floresan olarak etiketlenmiş organeller ile doku kültürü hücre hatlarında hücre-hücre füzyoninin indüksiyonunu tanımlar.
In vitro indüklenen hücre-hücre füzyonu monoklonalantikorlarınüretiminde merkezi 3 , biyolojik araştırma ve hastalık tedavisi için önemli bir araçtır. Hücre füzyonu da hücre döngüsü hakimiyeti hakkında birçok farklı temel hücre biyolojik sorular sormak için kullanılmıştır4, aneuploidy5,6, hücresel yeniden programlama7,8, hasarlı nöronlarınonarımı 9, viral proliferasyon10, apoptoz11, tümörigenesis12, sitoskeletal dinamik13, ve membran füzyon14,15. Hücre-hücre füzyonu ikna etmek için laboratuvar tabanlı yöntemler16,17,18,19 bir iki iki katmanlı fiziksel birleştirme yoluyla lipid membran birleşmesi neden. Hücre füzyonu elektrik tarafından indüklenen olabilir18, viral tabanlı yöntemler17, termoplazmaik ısıtma20, transgen ekspresyonu19, ve polietilen glikol dahil kimyasallar (PEG)16,21,22.
Centrozsomes hücresel şekil, hareketlilik, polarizasyon ve bölüm23kontrol mikrotübül organize merkezleri vardır. Centrozomal kökler,24 protein rootletini içeren centrozomlardan yayılan lifli yapılardır (CROCCgeni tarafından kodlanmıştır). Biz son zamanlarda nasıl centrosome pozisyon ve sayı ebeveyn hücreleri24göre heterokaryoniçinde değişir anlamak için hücre-hücre füzyon kullanılır. Bu yöntemin kullanımının arkasındaki mantığı farklıfloresan floresan etiketli ebeveyn hücrelerinin füzyon sonra bir heterokaryon içinde köklerin kökeni hücre izlemek için, ve böylece görüntü organel füzyon ve fizyon için. Floresan etiketli proteinler rootletin-meGFP veya rootletin-mScarlet-I, daha sonra PEG aracılı hücre füzyonu ile eritilen ayrı hücre hatlarında genom düzenleme tarafından oluşturulur. Akış sitometrisi ve daha sonraki floresan mikroskobu ile erimiş hücreleri tanımlamak için hücre boyalarının(Malzeme Tablosu)kullanımını ve daha sonra menşe ve morfolojisentrozom hücresinin tanımlanmasını tanımlarız (Şekil 1). Bu yaklaşım, hücre homeostazı üzerine organel sayısı da dahil olmak üzere hücresel devlet büyük değişiklikler nasıl incelenmesi için sağlam ve benzersiz bir yöntemdir.

<table><tbody><tr><td>15 mL tüp</td><td>Sarstedt</td><td>62554502</td><td></td></tr><tr><td>%37 formaldehit çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8875</td><td></td></tr><tr><td>880 Lazer Taramalı Konfokal Airyscan Mikroskobu</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8 kuyulu görüntüleme çanakları</td><td>Ibidi</td><td>80826</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFP alpaka GFP güçlendirici nanobody</td><td>Chromotek</td><td>gba-488</td><td></td></tr><tr><td>BD Akışı Hücre Sıralayıcı:</td><td>BD Biosciences,</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini,</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr>, <tr><td>Hücre Filtreleri (70 &; m)</td> <td>Biofil</td><td>CSS010070</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace Uzak Kırmızı</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C34572</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace Menekşe</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C34571</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM), yüksek glikoz, GlutaMAX, piruvat</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31966021</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>FluoTag-X2 anti-mScarlet-I alpaka nanobody</td><td>NanoTag Biyoteknoloji</td><td>N1302-At565</td><td></td></tr><tr><td>L15 CO2 bağımsız görüntüleme ortamı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21083027</td> Penisilin / streptomisin Sigma-Aldrich 15140122 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fenol kırmızı içermeyen DMEM, yüksek glikoz</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21063029</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu tuzlu su (1x PBS)</td><td></td><td></td><td>8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4, 0,24 g KH2HPO4, dH2O, 1 L'ye kadar</td></tr><tr><td>Polietilen Glikol Hybri-Max 1450</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7181</td><td></td></tr><tr><td>Polipropilen tüpler</td><td>BD Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher BiyoReaktifleri</td><td>BP151</td><td>noniyonik yüzey aktif madde</td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP337</td><td>noniyonik deterjan</td></tr></tbody></table>

hücresel yapı ve fonksiyonun perturbasyonu için genom düzenlenmiş hücre hatları hücre-hücre füzyon

Cell-cell Fusion of Genome Edited Cell Lines for Perturbation of Cellular Structure and Function

Yaşam, hücre ve organeller içinde farklı moleküler durumların izole oluşumunu sağlamak için lipid membranları içinde mekansal olarak bölümlenir. Hücre füzyonu, tek bir hücreyi oluşturmak için iki veya daha fazla hücrenin birleşmesidir. Burada iki farklı hücre türünün hücre füzyonu için bir protokol salıyoruz. Erimiş hibrid hücreler akış sitometri tabanlı sıralama ile zenginleştirilmiş, hibrid hücre yapısı ve fonksiyonufloresan mikroskobu takip. Genom düzenleme tarafından üretilen floresan etiketli proteinler erimiş hücrelerin içinde görüntülenir, hücre yapıları floresan emisyona göre tespit ve kökeni hücre tipine geri başvurulmasını sağlar. Bu sağlam ve genel yöntem, hücresel yapıyı ve işlevi bir dizi temel biyolojik soru da anlamak için farklı hücre tiplerine veya ilgi organlarına uygulanabilir.

Uygun şekilde etiketlenmiş hücreler akış sitometrisi sırasında floresan sinyali ile etiketlenmemiş kontrol hücrelerinden daha yüksek görünür(Şekil 2A). Kapılar çift pozitif hücrelerin ayıklanması için ayarlanmış, daha fazla mikroskobik analizler için görüntüleme yemekleri doğrudan bu popülasyon zenginleştirmek. Erimiş hücreler farklı çift floresan pozitif hücreler olarak saptanabilir ve nüfusun yaklaşık ~ 1% oluşturmaktadır.
<p class="jov...

Bu protokolün amacı, melez hücreler oluşturmak için iki farklı hücre türünü birleştirmektir. Erimiş hücrelerin floresan mikroskobu analizi hücresel organellerin menşe hücresini izlemek için kullanılır. Bu tetki, hücre yapısı nın ve fonksiyonun hücre füzyonu ile tedirginlik lere nasıl tepki verdiğinin araştırılması için kullanılabilir.

Hücresel Yapı ve Fonksiyonun Perturbasyonu için Genom Düzenlenmiş Hücre Hatları hücre-hücre Füzyon

Life is spatially partitioned within lipid membranes to allow the isolated formation of distinct molecular states inside cells and organelles. Cell fusion ...

Bu yöntem, hücrelerin organel sayısındaki değişikliklere nasıl tepki verdiği gibi soruları yanıtlamak için iki farklı hücre türünün birleşmesi yoluyla hücresel yapı ve fonksiyonun tedirgin olmasını sağlar. Erimiş hücreler içinde floresan etiketli proteinlergörüntüleme ile, hücresel yapılar organel homeostaz ve fonksiyon mekanizmaları çalışma için kökeni kendi hücre tipine geri başvurulabilir. Floresan boya etiketleme için, her kültür en az altı kez 10 altıncı hücrelere ertesi sabah% 70-90 biraraya kadar genişletilmiş olacak gibi ilgi insan kanser hücresi popülasyonları bakın.Etiketleme gününde, rootletin eGFP ve rootletin-mScarlet hücreleri yıkama başına 10 mililitre PBS ile iki kez yıkayın. PBS'de 500 nanomolar ve PBS'de 200 nanomolar için Far Red hücre boyasına seyreltin. Seyreltilmiş Menekşe hücre boyası ve rootletin-mScarlet hücreleri ile seyreltilmiş Uzak Kırmızı hücre boyası ile oda sıcaklığında bir dakika için rootletin eGFP hücreleri etiketleyin.Kuluçkaların sonunda, 10 mililitre DMEM ile reaksiyonları beş dakika durdurun. Tüm kültürleri bir mililitre önceden ısıtılmış tripsin ile kuluçkaya yatırmadan önce hem etiketli hücre kültürlerini hem de etiketsiz bir ebeveyn hücre kültürünü 10 mililitre taze PBS ile yıkayın. Kuluçka sonunda, müstakil hücre çözümlerini santrifüj için tek tek 15 mililitrelik konik tüplere aktarın ve pbs bir mililitre ve DMEM bir mililitre etiketsiz hücreleri yavaşça boya etiketli pelet ler yeniden askıya.Sonra tüm hücre örneklerini hücre kültürü kuluçka makinesine geri döndürün. Hücre füzyonu deneyi için, 500 mikrolitre Mor boya etiketli hücreleri 500 mikrolitre Far Red boya etiketli hücrelerle yeni bir 15 mililitrelik tüpte karıştırın ve kalan karıştırılmamış etiketli hücreleri santrifüj le çökün. Bir mililitre taze DMEM'deki peletleri yeniden askıya alın ve hücreleri tekrar kuvöze yerleştirin.Santrifüj ile karışık hücreleri toplayın ve 30 saniye lik bir süre boyunca pelete damla şeklinde 50%1450 PEG 700 mikrolitre ekleyin. Oda sıcaklığında 3,5 dakika kaldıktan sonra, 30 saniye lik bir süre boyunca 10 mililitre serumsuz DMEM damlası ekleyin ve tüpleri 10 dakika boyunca kuvöze yerleştirin. Kuluçka sonunda, santrifüj ile karışık hücreleri tortu ve yavaşça tam orta bir mililitre pelet resuspend.FACS tarafından erimiş hücre popülasyonu için zenginleştirmek için, 70 mikrometrelik bir süzgeç aracılığıyla tüm hücreleri tek tek FACS tüpleri halinde hafifçe filtreleyin ve sitometre yazılımında yan dağılıma karşı ileri dağılım ve çift ayrımcılık çizimleri oluşturun. Floresan yoğunluğunu kaydetmek ve erimiş hücreleri tanımlamak için kapılar oluşturmak için etiketlenmemiş hücreleri çalıştırın. Daha sonra, Uzak Kırmızı kanala Violet sinyalinin dökülmediğini doğrulamak için tek pozitif Violet boya etiketli hücreleri ve Violet kanalında Uzak Kırmızı sinyali olmadığını doğrulamak için tek pozitif Far Red boya etiketli hücreleri çalıştırın.Sonra kısa bir süre erimiş hücrelerin bu kapılar ile görünür olduğunu doğrulamak için füzyon örneği çalıştırın. Sıralama parametreleri ayarlandığında, sıralama akışını merkezi olarak 100 mikrolitre büyüme ortamı içeren sekiz kuyulu bir görüntüleme kabına hizalayın ve çift pozitif erimiş hücreleri doğrudan çanağa sıralayın. Tüm hücreler sıralandığında, hemen iki ila 16 saat boyunca hücre kültürü kuluçka içine çanak yerleştirin.İmmünofloresan boyama için, ilk oda sıcaklığında 15 dakikalık bir kuluçka için% 4 paraformaldehit 200 mikrolitre ile hücre kültürü supernatant değiştirin. Fiksasyon sonunda, hücreleri yıkama başına 200 mikrolitre PBS ile üç kez yıkayın ve hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca %0,1'lik noniyonik yüzey aktif maddenin 200 mikrolitresinde geçirin. Daha sonra, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca PBS'de %3'lük büyükbaş serum albuminin 200 mikrolitresi ile spesifik olmayan bağlamayı engelleyin ve ardından 150 mikrolitre boyama tamponunda ilgi antikorları ile etiketleyin.Oda sıcaklığında bir saat sonra, yıkama başına beş dakika boyunca PBS 300 mikrolitre hücreleri iki kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, 200 mikrolitre taze PBS ile yıkamayı değiştirin. Erimiş hücrelerin görüntülerini elde etmek için, dört renkli görüntüleme yeteneğine sahip uygun bir floresan mikroskobu kullanın ve üç boyutlu görüntüler toplayın.Uygun şekilde etiketlenmiş hücreler akış sitometrisi sırasında floresan sinyal le etiketlenmemiş kontrol hücrelerinden daha yüksek bir düzeyde görülebilir. Kapılar daha fazla mikroskobik analiz için görüntüleme yemekleri doğrudan çift pozitif hücre popülasyonu için zenginleştirmek için sıralama için ayarlanabilir. Füzyon, iki hücrenin bir araya getirilmesi yoluyla hücresel mimarinin büyük bir yeniden düzenlenmesini sağlar.Heterokaryonlar plazma membranları müdahale etmeden tek bir hücre içinde karışık hem floresan boya sinyalleri içeren hücreler olarak tanımlanır. Ayrıca, brightfield görüntüleme ile erimiş hücrelerde iki çekirdek de görülebilir. Hücre yapısı ve fonksiyonu daha fazla meGFP ve mScarlet etiketli proteinler içeren hücrelerin birleştirilmesi ile araştırılabilir.Füzyon, sentrozom perisentriolar bileşen NEDD1 floresan etiketli olduğunda en az dört perisentrioler malzeme foci olarak görülebilir heterokaryoniçinde sentrozom sayısının iki katına çıkar. Endojen floresan etiketli rootletin ile hücrelerin füzyon her centrozsome kökeni hücre bir heterokaryon tespit edilmesine olanak sağlar. Bu protokol, farklı olarak etiketlenmiş hücre çizgilerini nasıl birleştirirken, organellerinin yapılarını ve işlevlerini anlamak için nasıl görüntüleneceğimi göstermektedir.Bu sağlam protokol, benzer yöntemlerle karşılaştırıldığında gerçekleştirmek için hem nispeten kolay hem de nispeten ucuzdur. Bu teknik, organel füzyonunun nasıl düzenlendiği ve hücrelerin hücre altı organel sayısındaki değişikliklere nasıl tepki verebildiği gibi bir dizi soru sormak için kullanılabilir.

cell-cell-fusion-genome-edited-cell-lines-for-perturbation-cellular

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu video, insan pluripotent kök hücrelerinde (hPSC'ler) çinko parmak nükleaz tabanlı genom düzenleme tekniğini göstermektedir. hPSC'ler potansiyel olarak çeşitli hücre tiplerine ayrılabildiğinden, bu teknoloji hastaya özgü bir şekilde in vitro patolojik ve farmakolojik çalışmalar için yararlıdır.

Çinko Parmak Nükleaz Tabanlı Genom Düzenleme: İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinde Çift Sarmallı Homoloji Bağımlı Onarım Mekanizması ile Genomu Değiştirme Tekniği

CRISPR/Cas9, genlerin ve genetik elementlerin bozulmasını sağlayan sağlam bir sistemdir. Burada, CRISPR / Cas9 kullanarak memeli hücre hatlarında genomik delesyonların verimli bir şekilde oluşturulması için bir protokol açıklıyoruz.

CRISPR / Cas9 üzerinden Memeli Hücre Hatlarında Genomik Delesyonlar Üretimi

İnsan pluripotent kök hücrelerinin (hPSC'ler) genom düzenlemesi hızlı ve verimli bir şekilde yapılabilir. Burada, EGFP'yi eksprese etmek ve antibiyotik direncini ortaya çıkarmak için AAVS1 güvenli liman lokusunun düzenlenmesiyle örneklendiği gibi, hPSC'leri genetik olarak tasarlamak için sağlam bir deneysel prosedür sunulmaktadır.

Genom düzenlenmiş İnsan Pluripotent Kök Hücre Hatları oluşturulması: İzolasyon hedefleyen Gönderen

Hücresel bütünlüğü ve protein homeostazını koruyan tükenme-kurtarma deneyleri için bir yöntem tanımlıyoruz. Adenofeksiyon, tek hücre düzeyinde mitotik hücre bölünmesi ve miyogenez gibi ince ayarlanmış aktin bazlı dinamiklere dayanan biyolojik süreçler içindeki proteinlerin fonksiyonel analizlerini sağlar.

Adenofection: tükenmesi-Kurtarma Experiments Hücresel Morphodynamics Moleküler şaperonlar Rolü incelenmesi için Bir Yöntem

Protokoller iCRISPR platformu kullanılarak hPSC mutan çizgileri oluşturmak için ve tarif edilen glukoz duyarlı β-benzeri hücrelere hPSCs ayırt etmek. hPSC yönettiği farklılaşma ile genom düzenleme teknolojisini birleştirerek insan gelişimi ve hastalık seyrinde soy belirleyicilerinin rolü sistematik analizi için güçlü bir platform sunmaktadır.

İnsan Pankreas Geliştirme Lineage Belirleyicileri sorgulanması için Genom Düzenleme ve hPSCs arasında Yönetmen Farklılaşma

Bu iletişim kuralı iş akışı sistemi onarıma memeli hücrelerinde noktası mutasyonların düzenleme CRISPR/Cas9-tabanlı bir gen özetliyor. Burada, gen Indel oluşumu hedef sitesindeki ölçmek için detaylı bir follow-on deneysel stratejisi ile düzenleme bir Kombinatorik yaklaşım kullanın — özünde, yerinde mutagenesis analiz.

Yerinde mutagenisitesinin CRISPR/Cas9 ve SsODN insan hücrelerinde tarafından katalize nokta mutasyon onarım bir fonksiyonu olarak incelemek için standart bir metodoloji

Preassembled Cas9 kullanan karmaşık Ribonükleoprotein (RNP) kesin, verimli genom düzenleme için güçlü bir yöntemdir. Burada, biz yararını hücreleri ve organizmalar, geniş aralığında birincil insan hücreleri ve her iki klasik de dahil olmak üzere ve model organizmalar gelişmekte olan vurgulayın.

Gelişmiş genom Cas9 Ribonükleoprotein yılında çeşitli ile hücreleri ve organizmaların düzenleme

CRISPR-Cas bitki ve hayvan karmaşık genleri Mühendisi için güçlü bir teknolojidir. Burada, verimli bir şekilde farklı Cas endonucleases kullanarak insan genomu düzenlemek için bir iletişim kuralı ayrıntılı. Biz ilgili önemli noktalar ve Düzenleme verimliliği optimize etmek için tasarım parametreleri vurgulayın.

Memeli hücre CRISPR-Cas kullanarak satırları genom düzenleme

Burada, piggyBac bazlı bir donör plazmid ve Cas9 nickaz mutantı kullanarak insan pluripotent kök hücrelerinde dikişsiz gen düzenleme için ayrıntılı bir yöntem açıklıyoruz. İnsan embriyonik kök hücrelerinde (hESC'ler) hepatosit nükleer faktör 4 alfa (HNF4α) lokusunun ekzon 8'ine iki nokta mutasyonu getirildi.

Kesintisiz Genom Düzenleme Kullanarak İnsan Pluripotent Kök Hücrelerine Nokta Mutasyonlarının Tanıtılması

Genom editörlerinin RNA olarak sunulması, birincil memeli hücrelerinin ve hücre hatlarının genomlarını değiştirmek için özellikle güçlü bir yöntemdir. Bu protokolün amacı, genom düzenleyicilerini mRNA olarak birincil memeli hücrelerine ve hücre hatlarına göndermek, ardından düzenleme sonuçlarını nicelendirmek için hedefli Illumina dizileme ve analizi yapmaktır.

Birincil memeli hücrelerinde editör RNA'nın elektroporasyonu yoluyla genom düzenlemesi

Keşfedin hücre füzyonu yöntemiyle hücresel yapı ve fonksiyonun bozulmasını; farklı hücre tiplerinden melez hücreler oluşturarak organel homeostazını floresan mikroskopi ile inceleyin.

Hücresel Yapı ve Fonksiyonun Perturbasyonu için Genom Düzenlenmiş Hücre Hatları hücre-hücre Füzyon

Daha fazla video keşfet