Name: İnsan Amniyotik Membranının Farklı Anatomik Bölgelerinden Epitel Hücrelerin In Vitro Kültürü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Keşfedin, insan amniyotik membranının farklı anatomik bölgelerinden epitel hücrelerin in vitro izolasyonu ve kültürü yöntemini. Bu protokol, hücre heterojenliğini anlamak ve klinik uygulamalar için fonksiyonel özellikleri değerlendirmek amacıyla geliştirilmiştir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Araştırmamız Instituto Nacional de Perinatología de México (21041 ve 21081) ve CONACYT (A1-S-8450 ve 252756) tarafından desteklenmiştir. Teknik destek için Jessica González Norris ve Lidia Yuriria Paredes Vivas'a teşekkür ederiz.

Bu protokol Mexico City'deki Instituto Nacional de Perinatología etik komitesi tarafından onaylanmıştır (Kayıt numarası 212250-21041). Bu çalışmalarda yapılan tüm prosedürler Instituto Nacional de Perinatología'nın etik standartlarına, Helsinki Deklarasyonu'na ve Sağlık Bakanlığı'nın Resmi Meksika Standardı'nda belirtilen yönergelere uygun olarak yapılmıştır.
1. Hazırlık
<ol><li>EDTA ile 1x PBS bir çözüm hazırlayın. Bunun için, 0,5 mM EDTA'lık son konsantrasyon için 500 mL 1x PBS'ye 500 mL 0,5 M EDTA stoku ekleyin.</li>
	<li>HAEC için kültür ortamını hazırlayın. 450 mL yüksek glukoz-DMEM alın, 5 mL sodyum pirüuvat (100 mM), kök hücreler için uygun 50 mL ısı-inaktif fetal sığır serumu, 5 mL anti-antimikotik (100x), 5 mL L-glutamin (200 mM) ve 500 μL mercaptoetanol (1000x).</li>
	<li>Doku taşıma ve işleme için konteyner sterilize: laboratuvara ameliyathane tüm plasenta taşımak için bir kapak ile paslanmaz çelik konteyner, bir tepsi (20 cm x 30 cm x 8 cm) yıkamak ve tüm plasenta önce kan kaldırmak için amniyotik membran diseksiyon ve üç bölgeye amniyotik membran ayırmak için plastik bir kesme tahtası.</li>
	<li>Cerrahi aletleri (neşterler, makaslar, forsepsler ve kelepçeler), 500 mL bealer, pamuk gazlı bezler ve tuzlu çözeltiyi sterilize edin.</li>
</ol>2. Plasental dokunun elde edilmesi
NOT: Amniyotik membranlar tam süreli gebelikte (37−40 hafta) kadınlardan, sezaryen doğum endikasyonu altında, aktif doğum bulgusu olmaksızın ve enfeksiyonun mikrobiyolojik özellikleri olmaksızın elde edilmiştir. Tam izolasyon ve kültür prosedürleri steril koşullar altında bir biyogüvenlik kabineiçinde gerçekleştirildi.
<ol><li>Ameliyathanede, doku geri kalanına kan akışını önlemek için göbek kordonu kelepçeleyin. Steril kapta kenetlenmiş göbek kordonu ile tüm plasenta toplamak.</li>
	<li>Plasentayı nemlendirmek için kabın 500 mL'lik tuz çözeltisini ekleyin.</li>
	<li>Kabı kapatın ve odayı sıcaklıkta laboratuvara taşıyın.</li>
	<li>Plasentalı kabı biyogüvenlik dolabının içine koy. NOT: Diseksiyonu 15 dakika içinde plasenta nın toplanmasından sonra yapılmazsa, plasenta ile birlikte işleme konana kadar saklayın. Plasenta nın alınması ile diseksiyonun başlaması arasında geçen sürenin 1 saatten fazla lığından kaçının.</li>
</ol>3. Amniyotik membranın bölgeye göre mekanik ayrıştırma
NOT: Prosedür steril koşullarda ve oda sıcaklığında bir biyogüvenlik kabini içinde yapılmalıdır.
<ol><li>Tüm plasentayı kaptan çıkarın ve göbek kordonu yukarı bakacak şekilde tepsiye yerleştirin.</li>
	<li>Steril pamuklu gazlı bez kullanarak, plasentayı kaplayan korrion-amnion yüzeyinden kan pıhtılarını temizleyin.</li>
	<li>Membranın üç bölgesini tanımlayın: göbek kordonu saran göbek amnionu, decidua bazalis'i kaplayan plasental amnion ve plasentaya bağlı olmayan amnın geri kalanı olan yansıyan bölge(Şekil 1).</li>
	<li>Göbek amnion bölgesini inceleyin (Şekil 2A).<ol>
<li>Kesme forceps kullanarak, plasenta ve göbek kordonu kavşak kapsayan amnion membran kısmını tutun.</li>
		<li>Bir neşter ile, kordodan ayırmak için germe sırasında kordonçevreleyen bölgeyi inceleyin.</li>
		<li>Ayrılmış dokuyu 100 mL tuzlu çözelti ile etiketli bir kabın içinde yatırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Plasental amnion bölgesini diseksiyon (Şekil 2B).<ol>
<li>Steril bir pamuk gazlı bez ile, plasenta kapsayan chorion-amnion yüzeyinden kan pıhtıları kaldırın.</li>
		<li>Plasenta ile yansıyan bölge arasındaki sınırda membranı diseksiyon forceps ile tutun.</li>
		<li>Neşter ile plasenta çevresi boyunca kesin.</li>
		<li>Plasentadan herhangi bir damar kesmemeye dikkat edin, chorion plasenta dan plasental amnion ayırın.</li>
		<li>Ayrılmış dokuyu 300 mL tuzlu çözeltiile etiketlenmiş başka bir kabın içinde yerleştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Plasentaya bağlı olmayan amniyotik zarın geri kalanını chorion'dan(Şekil 2C)ayırın.<ol>
<li>300 mL tuzlu çözeltiile yansıtılan bölgeyi başka bir etiketli kabın içinde toplayın. NOT: Dokuların kurumasını önlemek için diseksiyon sırasında sürekli olarak tuz çözeltisi ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Membranların yıkanması
NOT: İşlem, oda sıcaklığında steril koşullarda bir biyogüvenlik kabini içinde yapılmalıdır.
<ol><li>Her membran bölgesinin tuzlu çözeltisini ayrı ayrı atın.</li>
	<li>Göbek bölgesine 100 mL taze tuzlu çözelti ekleyin.</li>
	<li>Plasental ve yansıyan bölgelere sırasıyla 300 mL taze tuzlu çözelti ekleyin.</li>
	<li>Kan kalıntısını gidermek için kopma forceps yardımı ile membranları karıştırın.</li>
	<li>Tuzlu çözeltiyi atın.</li>
	<li>Membranlar yarı saydam olana kadar yıkıntıları ve ajitasyonu en az 3x tekrarlayın.</li>
	<li>Steril gazlı bez ile temizlemek için tahta üzerindeki membranları yerleştirin ve genişletin yıkar ile çıkarılmadı kan pıhtıları. NOT: Mümkün olduğunca çok eritrositin çıkarılması çok önemlidir, çünkü bunların varlığı tripsin fonksiyonunu ve sonraki hücre kültürlerinin canlılığını etkiler.</li>
</ol>5. Farklı bölgelerden membranların enzimatik sindirimi
NOT: Prosedür steril koşullarda bir biyogüvenlik kabini içinde yapılmalıdır.
<ol><li>Yansıyan ve plasental bölgeleri iki veya üç parçaya bölün.</li>
	<li>Göbek bölgesini kesmeyin.</li>
	<li>Santrifüj tüpleri her bölgenin parçaları yerleştirin. Yansıyan ve plasental bölgelere 20 mL tripsin/EDTA, göbek bölgesine sırasıyla %0,5 tripsin/EDTA 5 mL ekleyin. NOT: Tripsin çözeltisine tamamen daldırılması gerektiğinden, yansıyan ve plasental bölgelerin daha küçük parçalara dönüştürülmesi önemlidir.</li>
	<li>Santrifüj tüplerini 30 s. Tripsin için hafifçe çalkalayın.</li>
	<li>Yansıyan ve plasental bölgelere %0,5 tripsin/EDTA 30 mL, göbek bölgesine ise %0,5 tripsin/EDTA ekleyin.</li>
	<li>Tüpleri kuvözün içine bir rotator yerleştirin.</li>
	<li>37 °C'de 40 dk boyunca rotasyonlu (20 rpm) inkübül. NOT: Tüp rotator yoksa, tüpleri her 10 dakikada bir hafifçe elle sallayın.</li>
	<li>Her bölgeden tripsin/hücre çözümlerini yeni santrifüj tüplerine aktarın.</li>
	<li>Enzimi inaktive etmek için tüp başına 37 °C'de ısınmış HAEC ortamının hacmini 2 kat artırın.</li>
	<li>İlk sindirimi buzda saklayın.</li>
	<li>İkinci bir sindirim dönemi için 5.6−5.8 adımlarını tekrarlayın.</li>
	<li>Her bölge için, diseksiyon forsepskullanarak amnion kısmının bir ucunu tutun ve önceki kuluçka dönemlerinde tamamen soyulmamış epitel hücrelerinin satırlarını kaldırmak için doku boyunca başka bir çift sıkmak ile.</li>
	<li>Santrifüj tüpleri başka bir dizi içine ikinci sindirim toplamak ve 2x HAEC medya hacmi ile inaktive.</li>
	<li>Sindirilmiş membranları biyolojik tehlike kabına atın.</li>
</ol>6. HAEC'in İzolasyon
NOT: Prosedür steril koşullarda bir biyogüvenlik kabini içinde yapılmalıdır.
<ol><li>Tüm tüpleri 200 x g'de 10 dk 4 °C'de santrifüj edin.</li>
	<li>Supernatant atın ve her pelet ayrıştırmak için tüp başına önceden ısıtılmış HAEC medya (37 °C) ve boru hafifçe ekleyin.</li>
	<li>Her membran bölge için ayrı bir tüp iki sindirim hücresel süspansiyonlar birleştirin.</li>
	<li>Hücre dışı matris enkazını çıkarmak ve tek hücre elde etmek için hücre içi selektonu kullanarak hücresel süspansiyonları filtreleyin.</li>
	<li>Mikrosentrifuge tüpiçinde 90 μL trypan mavisi ile üç aliquot hazırlayın.</li>
	<li>Membran bölgesi başına her hücre süspansiyonunun 10 μL'sini mikrosantrifüj tüplere ekleyin ve karıştırın.</li>
	<li>Hücreleri hemositometreile ışık alanı mikroskobu altında sayın.</li>
</ol>7. HAEC Kültürü
<ol><li>Tohum HAEC ayrı ayrı üç bölgeden 3 × 104 hücre/ cm2 önceden ısıtılmış HAEC medya ile bir yoğunluk, insan epidermal büyüme faktörü (EGF) 10 ng / mL ile desteklenmektedir.<ol>
<li>Hücreleri 100 mm plakahalinde tohumlayarak in vitro veya immünokimyasal analiz için 24 kuyu plakasında saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tabakları 37 °C'de normoksik koşullarda (%5 CO2)nemli bir kuluçka makinesinde kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Günlük EGF ekleyin ve her üç günde bir ortamı değiştirin. NOT: Hücreler 4−6 gün sonra konspalanrolurlar.</li>
	<li>Konvansiyonel immünohistokimya, hücre sıralama analizi, kriyokoruma, RNA ve protein ekstraksiyonu için hücreleri kullanın, ya da geçişi devam etmek için.</li>
</ol>8. HAEC'in geçişi
<ol><li>HAEC ortamını çıkarın ve PBS/EDTA 0.01M çözeltisi ile 2 kat yıkayın.</li>
	<li>37 °C'de 15 dk pbs/EDTA 0.01M çözeltisi ile kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>PBS/EDTA'yı çıkarın ve 1,5 mL %0,5 tripsin/EDTA ekleyin.</li>
	<li>37 °C'de 5−8 dk kuluçka.</li>
	<li>Enzimi iki cilt HAEC media ile inaktive edin.</li>
	<li>200 x g5 dakika karışık çözelti ve santrifüj toplamak.</li>
	<li>Hücreleri sayın ve aşağıdaki pasajlar ile devam edin veya daha fazla analiz için hücreleri kullanın.</li>
</ol>

<ol><li>Shahbazi, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+the+human+embryo+in+the+absence+of+maternal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues.</a> Nature Cell Biology. 18 (6), 700-708 (2016).</li>
<li>Garcia-Lopez, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+amniotic+epithelium+%28HAE%29+as+a+possible+source+of+stem+cells+%28SC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Gaceta+Medica+de+Mexico%22%5BJournal%5D)">Human amniotic epithelium (HAE) as a possible source of stem cells (SC).</a> Gaceta Medica de Mexico. 151 (1), 66-74 (2015).</li>
<li>Gramignoli, R., Srinivasan, R. C., Kannisto, K., Strom, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Human+Amnion+Epithelial+Cells+According+to+Current+Good+Manufacturing+Procedures%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Stem+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation of Human Amnion Epithelial Cells According to Current Good Manufacturing Procedures.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 37, (2016).</li>
<li>Murphy, S., et al. Amnion epithelial cell isolation and characterization for clinical use. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMurphy%2C+S+%22Current+Protocols+in+Stem+Cell+Biology%22">Current Protocols in Stem Cell Biology</a>. , Chapter 1, Unit 1E 6 (2010).</li>
<li>Garcia-Castro, I. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markers+of+Pluripotency+in+Human+Amniotic+Epithelial+Cells+and+Their+Differentiation+to+Progenitor+of+Cortical+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Markers of Pluripotency in Human Amniotic Epithelial Cells and Their Differentiation to Progenitor of Cortical Neurons.</a> PLoS One. 10 (12), 0146082(2015).</li>
<li>Garcia-Lopez, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotency+markers+in+tissue+and+cultivated+cells+in+vitro+of+different+regions+of+human+amniotic+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Pluripotency markers in tissue and cultivated cells in vitro of different regions of human amniotic epithelium.</a> Experimental Cell Research. 375 (1), 31-41 (2019).</li>
<li>Yang, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+characterization+of+human+amniotic+epithelial+cells+in+a+serum-free+system+and+their+safety+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharmacological+Sinica%22%5BJournal%5D)">Biological characterization of human amniotic epithelial cells in a serum-free system and their safety evaluation.</a> Acta Pharmacological Sinica. 39 (8), 1305-1316 (2018).</li>
<li>Zou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA32+silences+WWP2+expression+to+maintain+the+pluripotency+of+human+amniotic+epithelial+stem+cells+and+beta+isletlike+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">MicroRNA32 silences WWP2 expression to maintain the pluripotency of human amniotic epithelial stem cells and beta isletlike cell differentiation.</a> International Journal of Molecular Medicine. 41 (4), 1983-1991 (2018).</li>
<li>Avila-Gonzalez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+the+ephemeral+human+pluripotent+state%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Capturing the ephemeral human pluripotent state.</a> Developmental Dynamics. 245 (7), 762-773 (2016).</li>
<li>Niknejad, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+amniotic+membrane+for+potential+use+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22European+Cells+%26+Materials%22%5BJournal%5D)">Properties of the amniotic membrane for potential use in tissue engineering.</a> European Cells & Materials. 15, 88-99 (2008).</li>
<li>Miki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+characteristics+and+the+therapeutic+potential+of+amniotic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Reproductive+Immunology%22%5BJournal%5D)">Stem cell characteristics and the therapeutic potential of amniotic epithelial cells.</a> American Journal of Reproductive Immunology. 80 (4), 13003(2018).</li>
<li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+proliferation%2C+migration+and+angiogenic+properties+of+human+amniotic+epithelial+and+mesenchymal+stem+cells+and+their+effects+on+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Comparison of the proliferation, migration and angiogenic properties of human amniotic epithelial and mesenchymal stem cells and their effects on endothelial cells.</a> International Journal of Molecular Medicine. 39 (4), 918-926 (2017).</li>
<li>Hammer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amnion+epithelial+cells%2C+in+contrast+to+trophoblast+cells%2C+express+all+classical+HLA+class+I+molecules+together+with+HLA-G%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Reproductive+Immunology%22%5BJournal%5D)">Amnion epithelial cells, in contrast to trophoblast cells, express all classical HLA class I molecules together with HLA-G.</a> American Journal of Reproductive Immunology. 37 (2), 161-171 (1997).</li>
<li>Benirschke, K., et al. Anatomy and Pathology of the Placental Membranes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBenirschke%2C+K+%22Pathology+of+the+Human+Placenta%22">Pathology of the Human Placenta</a>. , Springer. 268-318 (1995).</li>
<li>Banerjee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+metabolic+activity+in+placental+and+reflected+regions+of+the+human+amniotic+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Different metabolic activity in placental and reflected regions of the human amniotic membrane.</a> Placenta. 36 (11), 1329-1332 (2015).</li>
<li>Kim, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-143+regulation+of+prostaglandin-endoperoxidase+synthase+2+in+the+amnion%3A+implications+for+human+parturition+at+term%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">miR-143 regulation of prostaglandin-endoperoxidase synthase 2 in the amnion: implications for human parturition at term.</a> PLoS One. 6 (9), 24131(2011).</li>
<li>Han, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Region-specific+gene+expression+profiling%3A+novel+evidence+for+biological+heterogeneity+of+the+human+amnion%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Region-specific gene expression profiling: novel evidence for biological heterogeneity of the human amnion.</a> Biology of Reproduction. 79 (5), 954-961 (2008).</li>
<li>Alcaraz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autocrine+TGF-beta+induces+epithelial+to+mesenchymal+transition+in+human+amniotic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Autocrine TGF-beta induces epithelial to mesenchymal transition in human amniotic epithelial cells.</a> Cell Transplantation. 22 (8), 1351-1367 (2013).</li>
<li>Canciello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+prevents+epithelial-mesenchymal+transition+of+ovine+amniotic+epithelial+cells+and+enhances+their+immunomodulatory+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Progesterone prevents epithelial-mesenchymal transition of ovine amniotic epithelial cells and enhances their immunomodulatory properties.</a> Scientific Reports. 7 (1), 3761(2017).</li>
<li>Canciello, A., Greco, L., Russo, V., Barboni, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amniotic+Epithelial+Cell+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Amniotic Epithelial Cell Culture.</a> Methods in Molecular Biology. 1817, 67-78 (2018).</li>
<li>Singh, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+network+crosstalk+in+human+pluripotent+cells%3A+a+Smad2%2F3-regulated+switch+that+controls+the+balance+between+self-renewal+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Signaling network crosstalk in human pluripotent cells: a Smad2/3-regulated switch that controls the balance between self-renewal and differentiation.</a> Cell Stem Cell. 10 (3), 312-326 (2012).</li>
<li>Villa-Diaz, L. G., Kim, J. K., Laperle, A., Palecek, S. P., Krebsbach, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Focal+Adhesion+Kinase+Signaling+by+Integrin+alpha6beta1+Supports+Human+Pluripotent+Stem+Cell+Self-Renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Focal Adhesion Kinase Signaling by Integrin alpha6beta1 Supports Human Pluripotent Stem Cell Self-Renewal.</a> Stem Cells. 34 (7), 1753-1764 (2016).</li>
<li>Bednar, A. D., Beardall, M. K., Brace, R. A., Cheung, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+and+regional+distribution+of+aquaporins+in+amnion+of+normal+and+gestational+diabetic+pregnancies%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">Differential expression and regional distribution of aquaporins in amnion of normal and gestational diabetic pregnancies.</a> Physiological Reports. 3 (3), 12320(2015).</li>
<li>Avila-Gonzalez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+amniotic+epithelial+cells+as+feeder+layer+to+derive+and+maintain+human+embryonic+stem+cells+from+poor-quality+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Human amniotic epithelial cells as feeder layer to derive and maintain human embryonic stem cells from poor-quality embryos.</a> Stem Cell Research. 15 (2), 322-324 (2015).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

HAEC'i dönem zarlarından izole etmek için yeni bir protokol uyguladık. Her zarın izolasyondan önce üç anatomik bölgeye bölünerek her bir membrandan hücreleri analiz ettiği önceki raporlardan farklıdır.
Protokoldeki en kritik adımlardan biri, epitel hücrelerini ayırırken tripsin aktivitesine engel olabileceğinden, tüm kan pıhtılarını temizlemek için zarın yıkanmasıdır. Bu adımın düzgün bir şekilde gerçekleştirilememesi, aşırı eritrositler ve az sayıda yapışık epitel hücreleri ile birincil kültü...

İnsan amniyotik epitel hücreleri (HAEC) embriyonik gelişimin erken aşamalarında, yaklaşık sekiz gün postfertilizasyon kaynaklanır. Onlar amniyotik membran1en iç tabakasından türetilen epiblast skuamöz epitel hücrelerinin bir popülasyon ortaya çıkar. Böylece, HAEC embriyo nun üç mikrop katmanları na ayırt etme potansiyeline sahip epiblast pluripotent hücrelerin kalıntıları olarak kabul edilir2. Son on yılda, çeşitli araştırma grupları in vitro bir kültür modeli onların varsayımsal pluripotency ile ilgili özellikleri karakterize etmek için gebelik döneminde amniyotik membran bu hücreleri izole etmek için yöntemler geliştirdik3,4.
Buna göre, HAEC'in yüzey antijenleri SSEA-3, SSEA-4, TRA 1-60, TRA 1-81; pluripotency transkripsiyon faktörleri OCT4, SOX2 ve NANOG çekirdek; ve çoğalma belirteci KI67, kendi kendini yenileyen olduğunu düşündüren5,6,7. Ayrıca, bu hücreler üç germ katmanları (ektoderm, mezoderm ve endoderm)4,5,8,yanı sıra insan hastalıklarının hayvan modellerinde soy-spesifik belirteçleri için pozitif hücreleri elde etmek için farklılaşma protokolleri kullanılarak meydan edilmiştir. Son olarak, HAEC ekspres E-kadherin, onlar hpsc gibi bir epitel doğasını korumak olduğunu göstermektedir5,9.
Onların embriyonik kökenli dışında, HAEC farklı klinik uygulamalar için uygun hale diğer içsel özelliklere sahip, anti-inflamatuar ve antibakteriyel moleküllerin salgılanması gibi10,11, büyüme faktörleri ve sitokin salınımı12, onlar HPSCileaksine immüneksik fareler içine nakledildiğinde teratom oluşumu , ve immünolojik tolerans ifade hla-G ifade çünkü, hangi reddedilme riskini azaltır transplantasyon13.
Ancak, önceki raporlar insan amnion homojen bir membran olduğunu varsayılmıştır, anatomik ve fizyolojik olarak üç bölgeye ayrılabilir dikkate almadan: plasental (decidua bazaliskapsayan amnion ), göbek (göbek kordonu saran parçası), ve yansıyan (plasenta bağlı olmayan membran geri kalanı)14. Bu morfoloji, mitokondriyal aktivite, reaktif oksijen türlerinin tespiti15,miRNA ekspresyonu16ve sinyal yollarının aktivasyonu nda amnion ekran farklılıkları plasental ve yansıyan bölgelerde gösterilmiştir17. Bu sonuçlar, insan amnion yerinde veya in vitro modellerde yapılan ileri çalışmalar için düşünülmelidir farklı işlevsellik ile heterojen bir popülasyon tarafından entegre olduğunu göstermektedir. Diğer laboratuvarlar HAEC'in tüm membrandan izolasyonu için protokoller tasarlarken, laboratuvarımız farklı anatomik bölgelerdeki hücreleri izole etmek, kültürünü ve karakterizesini sağlamak için bir protokol oluşturmuştur.

<table><tbody><tr><td><>Kültür reaktifleri</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-Merkaptoetanol</td><td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td><td>21985023</td><td>55 mM</td></tr><tr><td>Hayvansız Rekombinant İnsan EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>Antibiyotik-Antimikotik</td><td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td><td>15240062</td><td>100X</td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı</td><td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td><td>12430054</td><td>Yüksek glikoz ve HEPES EDTA ile desteklenmiştir</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific/Ambion</td><td></td><td>AM9260G 0,5 M</td></tr><tr><td>Embriyonik kök hücre FBS, nitelikli</td><td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td><td>10439024</td> Esansiyel Olmayan Amino Asitler Thermo Fisher Scientific/Gibco 11140050 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>100X</td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>herhangi bir marka</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu</td> Tuzlu <td>Termo Fisher Scientific / Gibco</td><td>10010023</td><td>1X</td></tr><tr><td>Tuzlu çözelti (sodyum klorür% 0.9)</td> <td>herhangi bir marka</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Piruvat</td><td>Thermo Fisher Scientific / Gibco</td><td>11360070</td><td>100 mM</td></tr><tr><td>Tripsin / EDTA %0.05</td> <td>Thermo Fisher Scientific / Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td><güçlü> Tek kullanımlık malzeme< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 ve mikro; m Hücre Süzgeci</td><td>Corning/Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>100 mm TC ile İşlenmiş Kültür Kabı</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>24 kuyulu Şeffaf TC ile işlenmiş Çoklu Kuyulu Plakalar</td><td>Corning/Costar</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>6 kuyulu Şeffaf TC ile muamele edilmiş Çoklu Kuyulu Plakalar</td><td>Corning/Costar</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Pirojenik Olmayan Steril Santrifüj Tüpü</td> konik <td>olan herhangi bir marka</td><td></td><td> alt</td></tr><tr><td>Pirojenik olmayan steril uçlar 1.000 & mikro; l, 200 ve mikro; L ve 10 &mikro;l.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steril pamuklu gazlı bezler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5, 10 ve 25 mL'lik steril serolojik pipetler</td><td>herhangi bir marka</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steril cerrahi eldiven</td><td>herhangi bir marka</td><td></td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Ekipman< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Biyolojik güvenlik kabini</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td></td><td>Santrifüj</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipetler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Motorlu Pipet Doldurucu/Dispenseri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>500 mL'lik</td><td></td><td></td><td></td>steril beherler</tr><tr><td>Steril plastik kesme tahtası</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steril neşterler, makaslar, forsepsler, kelepçeler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steril paslanmaz çelik kap</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steril tepsi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tüp Döndürücü</td><td>MaCSmix</td><td></td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Antikorlar ve Kitler</güçlü></td><td></td><td></td><td><güçlü>Antikor Kimliği</güçlü></td></tr><tr><td>Anti-E-cadherin</td><td>BD Biosciences</td><td>610181</td><td>RRID: AB_3975</td></tr><tr><td>Anti-KI67</td><td>Santa Cruz</td><td>23900</td><td>RRID: AB_627859)</td></tr> <tr><td>Anti-NANOG</td><td>Peprotech</td><td>500-P236</td><td>RRID:AB_1268274</td></tr><tr><td>Anti-OCT4</td><td>Abcam</td><td>ab19857</td><td>RRID:AB_44517</td></tr><tr><td>Anti-SOX2</td><td>Millipore</td><td>AB5603</td><td>RRID:AB_2286686</td></tr><tr><td>Anti-SSEA-4</td><td>Hücre Sinyali</td><td>4755</td><td>RRID:AB_1264259</td></tr><tr><td>Anti-TRA-1-60</td><td>Hücre Sinyali</td><td>4746</td><td>RRID:AB_2119059</td></tr><tr><td>Keçi Anti-Fare Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11029</td><td>RRID:AB_2534088</td></tr><tr><td>Keçi Anti-Tavşan Alexa Fluor 568</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11036</td><td>RRID:</td></tr><tr><td>AB_10563566 Tünel Test Kiti</td><td>Abcam</td><td>66110</td><td></td></tr></tbody></table>

İnsan amniyotik membranının farklı anatomik bölgelerinden epitel hücrelerin in vitro kültürü

In Vitro Culture of Epithelial Cells from Different Anatomical Regions of the Human Amniotic Membrane

Literatürde insan amniyotik epitel hücrelerinin (HAEC) izolasyonu ve kültürü için çeşitli protokoller bildirilmiştir. Ancak, bu amniyotik epitel homojen bir tabaka olduğunu varsayalım. İnsan amnionu üç anatomik bölgeye ayrılabilir: yansıyan, plasental, ve göbek. Her bölgenin patolojik koşullar gibi farklı fizyolojik rolleri vardır. Burada, insan amnion dokusunu üç bölümden ayırıp tüp bebek olarak muhafaza etmek için bir protokol uyguluyoruz. Kültürde, yansıyan amniondan elde edilen hücreler küloidal morfoloji speküel, hem plasental hem de göbek bölgelerindeki hücreler skuamözdür. Bununla birlikte, elde edilen tüm hücrelerde e-kadherin immünositinin immünotespiti ile gösterilen bir epitel fenotip vardır. Bu nedenle, yerinde plasental ve yansıyan bölgeler hücresel bileşenler ve moleküler fonksiyonlar farklı olduğundan, in vitro çalışmalar için bu farklılıkları dikkate almak için gerekli olabilir, çünkü HAEC kullanımı için fizyolojik etkileri olabilir biyomedikal araştırma ve rejeneratif tıpta bu hücrelerin umut verici uygulama.

HAEC amniyotik membranın üç anatomik bölgesinin her birinden izole edildi ve in vitro olarak ayrı ayrı kültürlendi. 48 saat kültürden sonra, epitel fenotipli hücreler plaka yüzeyine yapışmış olsa da, ortam değiştirildikten sonra çıkarılan hücre enkazı ve yüzen hücreler de içeriyordu(Şekil 3).
Birincil kültürün işlenmesi sırasında (sıfır, P0 geçidi) deneysel veri analizini etkileyebilecek bazı komplikasyonlar ortaya çıkabilir (Şekil 4)...

Bu protokol, klinik ve fizyopatolojik modellerde olası uygulama için heterojenliklerini ve fonksiyonel özelliklerini belirlemek için insan amniyotik zarının farklı anatomik bölgelerinden epitel hücrelerinin izolasyonu açıklanmaktadır.

İnsan Amniyotik Membranının Farklı Anatomik Bölgelerinden Epitel Hücrelerin In Vitro Kültürü

Several protocols have been reported in the literature for the isolation and culture of human amniotic epithelial cells (HAEC). However, these assume that ...

Bu protokol, amniyotik membrandan izole edilmiş insan amniyotik epitel hücrelerinin heterojenliği ve fonksiyonel özellikleri ile ilgili anahtar soruların yanıtlatılabilir. Önceki protokoller bölgeler arasında ayrım yapmadan ko-amniyotik membrandan hücreleri izole ederken, protokolümüz üç farklı anatomik bölgeden izole edilmiş hücre popülasyonunun kültürünü sağlar. Bölgeye göre amniyotik membran ayırmak için, steril koşullar altında bir biyogüvenlik kabine, göbek kordonu saran göbek amnion tanımlamak, decidua bazalis kapsayan plasental amnion, ve yansıyan bölge, plasenta bağlı olmayan amnion geri kalanı olarak kabul edilir.Göbek amnion bölgesini incelemek için, plasenta ve göbek kordonu kavşağını kaplayan amnion zarının bir kısmını tutmak için diseksiyon terpler kullanın ve kordonu çevreleyen bölgeyi incelemek için neşter kullanın, bölgeyi kornden ayırmak için uzanırken. Daha sonra, tuzlu çözelti 100 mililitre ile etiketli bir beher ayrılmış doku mevduat. Plasental amnion bölgesini incelemek için, plasentayı kaplayan korrion/amnion yüzeyindeki kan pıhtılarını temizlemek için steril pamuklu gazlı bez kullanın.Ve plasenta ve yansıyan bölge arasındaki sınırda membran kavramak için dise

in-vitro-culture-epithelial-cells-from-different-anatomical-regions

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Insan derisi canlı yetişkin epitelyal kök hücreleri izole bir hızlı, sağlam bir şekilde açıklanmıştır. Bu yöntem cilt kollajen matriks enzimatik sindirim, saç folikülleri ve hücre kültürü için, tek bir hücre süspansiyonları ya da doku parçalarının izolasyonu koparma kullanır.

İnsan Cilt Yetişkin Epitel Kök Hücre İzolasyonu ve Kültür

Insan meme cerrahi ıskarta malzeme işlemek için bir yöntem tarif edilmiştir. Organoids şeklinde işlenmiş doku, süresiz olarak dondurulmuş ya da uzun süreli büyüme için kültür içinde yerleştirilmiş saklanabilir. Bu yöntem deneysel normal insan epitel hücre biyolojisi incelenmesi ve eksojen pertürbasyonların etkileri sağlar.

Hücre Kültürü İnsan Azaltma Meme Cerrahisi ve Mastektomi Doku İşleme

Insan gönüllülerin yüzeysel sıyrık biyopsi yoluyla elde edilen nazal epitel hücreleri, doku kültürü ekler üzerine genişletilmiş ve aktarılır. Ortak akışkanlığa eriştikten sonra hücreler, kirpikli olmayan silli hücre kültürleri, sonuçta hava sıvı arayüzü yetiştirilir. Farklılaşmış nazal epitel hücre kültürleri solunum mukozasını eğitim için uygun deneysel modeller sunar.

Hava Sıvı Arayüz İnsan Burun Epitel Hücrelerinin ekimi

Mevcut iyi üretim uygulamaları (cGMP) yönergelerine uygun olarak hayvansal ürün içermeyen reaktifler kullanarak insan amnion epitel hücrelerini (hAEC'ler) izole etmek ve kültürlemek için bir protokol açıklıyoruz.

İzolasyon, Kriyoprezervasyon ve Kültür Klinik Uygulamaları İnsan Amniyon Epitel Hücreleri

Bu yazıda, üç boyutlu (3D) tek tip diziler ekstraselüler matriks çevrili tanımlanan geometri epitel doku mühendisi yumuşak litografi tabanlı teknik anlatılmaktadır. Bu yöntem, hücre tipleri ve deneysel bağlamlarda çeşitli için uygun olan ve aynı çoğaltır yüksek verimli tarama sağlar.

Ekstraselüler Matrix içinde Gömülü Mühendislik Üç boyutlu Epitel Dokular

Bu çalışma, in vitro desidualizasyon çalışma için Coculture sisteminde kullanılabilen birincil fare, endometriyal stromal ve epitelyal hücrelerin izolasyonu ve kültürü, bir standart ve geçerli bir yöntem sunulur.

Fare Endometrial stromal ve epitelyal hücrelerin izolasyonu için<em&gt; İn Vitro</em&gt; sidualizasyonu

Bu iletişim kuralı birincil amniyotik sıvı ve membran Mezenkimal kök hücrelerin içine İndüklenmiş pluripotent kök hücreler tamamen kimyasal olarak tanımlanan koşullarda bir sigara entegre episomal yaklaşım kullanarak yeniden programlama açıklar. Yordamlar, ayıklama, kültür, yeniden programlama ve elde edilen İndüklenmiş pluripotent kök hücreler sıkı yöntemlerle karakterizasyonu ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Birincil amniyotik sıvı ve membran hücreler Pluripotent Xeno-Alerjik koşullarında için yeniden programlama

Burada geleneksel yönteme Kaya inhibitörü Y-27632 eklenerek insan dişeti epitel hücrelerinin izolasyonu ve kültürü için değiştirilmiş bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem daha kolay, daha az zaman alıcıdır, kök hücre özelliklerini geliştirir ve hem laboratuvar hem de klinik uygulamalar için daha fazla sayıda yüksek potansiyelli epitel hücresi üretir.

Y-27632 Kullanarak Birincil İnsan Dişeti Epitel Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre farklılaşma protokollerindeki son gelişmeler, organa özgü hücre tiplerinin kademeli olarak türetilmesine izin vermektedir. Burada, iPSC türevi hava yolu bazal hücrelerinin bakımı ve genişlemesi ve hava-sıvı arayüz kültürlerinde mukosiliyer bir epitel halinde farklılaşması için ayrıntılı adımlar sunuyoruz.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Hava Yolu Epitel Hücresi Hava-Sıvı Arayüz Kültürlerinin Oluşturulması

Burada, nanofibröz membran bazlı iki katmanlı sistemde fibroblastlarla kültürlenen epitel hücrelerinin membrana nasıl stabil bir şekilde yapışabileceğini ve zar üzerinde büyüyebileceğini gösteriyoruz.

Nanolifli membranlar kullanılarak epitel hücrelerinin üç boyutlu bir kokültür modülünün kurulması

Keşfedin, insan amniyotik membranının farklı anatomik bölgelerinden epitel hücrelerin in vitro izolasyonu ve kültürü yöntemini. Bu protokol, hücre heterojenliğini anlamak ve klinik uygulamalar için fonksiyonel özellikleri değerlendirmek amacıyla geliştirilmiştir.

İnsan Amniyotik Membranının Farklı Anatomik Bölgelerinden Epitel Hücrelerin In Vitro Kültürü

Daha fazla video keşfet