Name: Bir Kütle Sitometri Platformunda Hücre Döngüsü Fazları Oluşturmak için Pirimidin Analogu, 5-İyodo-2′-Deoksiüridin (IdU) Hücre Döngüsü Belirteçleri ile Kullanımı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Öğrenin, kütle sitometri ile tek hücre düzeyinde hücre döngüsü fazlarını IdU belirteçleri kullanarak analiz etme yöntemini. Akut miyeloid lösemi hücrelerinin büyüme özelliklerini ve klinik sonuçları anlamak için uygulanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, deneysel destekleri için Palak Sekhri, Hussam Alkhalaileh, Hsiaochi Chang ve Justin Lyeberger'in çabalarına teşekkür eder. Bu çalışma Pelotonia Burs Programı tarafından desteklenmiştir. Bu materyalde ifade edilen herhangi bir görüş, bulgu ve sonuç, yazar(lar)a aittir ve Pelotonia Burs Programı'nınkileri yansıtmak zorunda değildir."

<ol><li>Ornatsky, O., Baranov, V. I., Bandura, D. R., Tanner, S. D., Dick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+cellular+antigen+detection+by+ICP-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Multiple cellular antigen detection by ICP-MS.</a> Journal of Immunological Methods. 308 (1-2), 68-76 (2006).</li>
<li>Ornatsky, O. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+cell+antigens+and+intracellular+DNA+by+identification+of+element-containing+labels+and+metallointercalators+using+inductively+coupled+plasma+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Study of cell antigens and intracellular DNA by identification of element-containing labels and metallointercalators using inductively coupled plasma mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 80 (7), 2539-2547 (2008).</li>
<li>Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+mass+cytometry+adapted+to+measurements+of+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle.</a> Cytometry A. 81 (7), 552-566 (2012).</li>
<li>Raval, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversibility+of+Defective+Hematopoiesis+Caused+by+Telomere+Shortening+in+Telomerase+Knockout+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Reversibility of Defective Hematopoiesis Caused by Telomere Shortening in Telomerase Knockout Mice.</a> PLoS One. 10 (7), 0131722(2015).</li>
<li>Behbehani, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Cytometric+Functional+Profiling+of+Acute+Myeloid+Leukemia+Defines+Cell-Cycle+and+Immunophenotypic+Properties+That+Correlate+with+Known+Responses+to+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Mass Cytometric Functional Profiling of Acute Myeloid Leukemia Defines Cell-Cycle and Immunophenotypic Properties That Correlate with Known Responses to Therapy.</a> Cancer Discovery. 5 (9), 988-1003 (2015).</li>
<li>Kimmey, S. C., Borges, L., Baskar, R., Bendall, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+analysis+of+tri-molecular+biosynthesis+with+cell+identity+and+function+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Parallel analysis of tri-molecular biosynthesis with cell identity and function in single cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 1185(2019).</li>
<li>Rabinovitch, P. S., Kubbies, M., Chen, Y. C., Schindler, D., Hoehn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BrdU-Hoechst+flow+cytometry%3A+a+unique+tool+for+quantitative+cell+cycle+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">BrdU-Hoechst flow cytometry: a unique tool for quantitative cell cycle analysis.</a> Experimental Cell Research. 174 (2), 309-318 (1988).</li>
<li>Rahman, A. H., Tordesillas, L., Berin, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin+reduces+nonspecific+eosinophil+staining+artifacts+in+mass+cytometry+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Heparin reduces nonspecific eosinophil staining artifacts in mass cytometry experiments.</a> Cytometry A. 89 (6), 601-607 (2016).</li>
<li>McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+Preparation+for+Mass+Cytometry+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (122), e54394(2017).</li>
<li>Behbehani, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunophenotyping+by+Mass+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Immunophenotyping by Mass Cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 2032, 31-51 (2019).</li>
<li>Leipold, M. D., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+cytometry%3A+protocol+for+daily+tuning+and+running+cell+samples+on+a+CyTOF+mass+cytometer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), e4398(2012).</li>
<li>Finck, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalization+of+mass+cytometry+data+with+bead+standards%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Normalization of mass cytometry data with bead standards.</a> Cytometry A. 83 (5), 483-494 (2013).</li>
<li>Kotecha, N., Krutzik, P. O., Irish, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Web-based+analysis+and+publication+of+flow+cytometry+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Web-based analysis and publication of flow cytometry experiments.</a> Current Protocols in Cytometry. , Chapter 10, Unit10 17(2010).</li>
<li>Devine, R. D., Sekhri, P., Behbehani, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+storage+time+and+temperature+on+cell+cycle+analysis+by+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Effect of storage time and temperature on cell cycle analysis by mass cytometry.</a> Cytometry A. 93 (11), 1141-1149 (2018).</li>
<li>Campos, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+immunological+markers+on+leukemic+cells+before+and+after+cryopreservation+and+thawing%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Expression of immunological markers on leukemic cells before and after cryopreservation and thawing.</a> Cryobiology. 25 (1), 18-22 (1988).</li>
<li>Kadic, E., Moniz, R. J., Huo, Y., Chi, A., Kariv, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cryopreservation+on+delineation+of+immune+cell+subpopulations+in+tumor+specimens+as+determinated+by+multiparametric+single+cell+mass+cytometry+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunology%22%5BJournal%5D)">Effect of cryopreservation on delineation of immune cell subpopulations in tumor specimens as determinated by multiparametric single cell mass cytometry analysis.</a> BMC Immunology. 18 (1), 6(2017).</li>
<li>Shabihkhani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+procurement%2C+storage%2C+and+quality+assurance+of+frozen+blood+and+tissue+biospecimens+in+pathology%2C+biorepository%2C+and+biobank+settings%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The procurement, storage, and quality assurance of frozen blood and tissue biospecimens in pathology, biorepository, and biobank settings.</a> Clinical Biochemistry. 47 (4-5), 258-266 (2014).</li>
</ol>

Dr. Behbehani, Fluidigm'den seyahat desteği alıyor. Fluidigm ayrıca laboratuvar kullanımı için reaktifler ve malzemeler satın aldı.

Burada sunulan örnekler, hücre döngüsü dağılımını analiz etmek için bir MCM platformunun nasıl kullanılacağını göstermektedir. Ayrıca, hücre döngüsü analizinin zaman ve sıcaklık gibi deneysel koşullara duyarlı olduğu gösterilmiştir; bu, araştırmacıların hücre döngüsü analizleri için MCM'yi düşünürken göz önünde bulundurmaları gereken önemli bir husustur14. Bir saatten fazla olmamak üzere kısa bir süre için depoda bırakılan örnekler, normal durumlarıyla karşılaştırılabilir IdU katılımına sahip olac...

Kütle sitometrisi, kütle spektroskopisinin yüksek çözünürlüklü ve kantitatif doğasından yararlanarak yaklaşık 40 parametrenin tespit edilmesini sağlar. Metal etiketli antikorlar, daha fazla sayıda kanala izin veren ve minimum yayılma üreten florofor konjuge antikorlar yerine kullanılır 1,2. MCM, akış sitometrisine kıyasla hücre döngüsü analizi açısından avantaj ve dezavantajlara sahiptir. MCM'nin en büyük avantajlarından biri, çok sayıda parametrenin, oldukça heterojen örneklerde çok sayıda immünofenotipik olarak farklı T hücresi tipinde hücre döngüsü durumunun eşzamanlı olarak ölçülmesini sağlamasıdır. MCM, insan kemik iliği3 ve telomeraz eksikliğinin transgenik murin modellerinde normal hematopoez sırasında hücre döngüsü durumunu ölçmek için başarıylakullanılmıştır. Akut miyeloid lösemide (AML) hücre döngüsü durumunun analizi, hücre döngüsünün klinik tedavilere bilinen yanıtlarla ilişkili olduğunu ve tedavi seçimlerini bilgilendirebilecek fonksiyonel özelliklere in vivo bir bakış açısı sağladığını göstermiştir5. Kütle sitometrik hücre döngüsü analizinin ikinci bir avantajı, hücre döngüsü durumu ile ilişkili olabilecek çok sayıda başka fonksiyonel belirteci ölçme yeteneğidir. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, protein ve RNA sentezini, BRU ve rRNA6'ya karşı IdU ve metal etiketli antikorların kullanımı yoluyla hücre döngüsü durumu ile ilişkilendirebilmiştir. Bir farklılaşma sürekliliğinde çok sayıda popülasyonda hücre döngüsü durumunu ölçen bu tür yüksek parametrik analizler, mevcut akış sitometri teknolojisi ile neredeyse imkansız olacaktır. MCM'nin en büyük dezavantajı, floresan akış sitometrisinde kullanılanlarla karşılaştırılabilir DNA veya RNA lekelerinin olmamasıdır (örneğin, DAPI, Hoechst, Pyronin Y, vb.). Floresan boyalar, DNA ve RNA içeriğinin nispeten hassas ölçümlerini verebilir, ancak bu hassasiyet yalnızca nükleotid bazları arasındaki interkalasyon sırasında meydana gelen bu boyaların floresan özelliklerindeki değişiklikler nedeniyle mümkündür. MCM analizi bu nedenle DNA veya RNA içeriğini benzer hassasiyetle ölçemez. Bunun yerine, kütle sitometrik hücre döngüsü analizi, siklin B1, fosforile retinoblastoma proteini (pRb) ve fosforile Histon H3 (pHH3) gibi hücre döngüsü durumuyla ilgili proteinlerin ölçümlerine ve IdU'nun S-faz hücrelerine dahil edilmesinden iyot atomunun doğrudan ölçümüne dayanır. Bu iki ölçüm yaklaşımı, normal hücresel proliferasyon sırasında oldukça benzer sonuçlar verir, ancak hücre döngüsü ilerlemesi bozulduğunda potansiyel olarak uyumsuz olabilir.
Her hücre döngüsü fazındaki hücre sayısının ölçülmesi, normal hücre döngüsü gelişiminin yanı sıra kanserlerde ve immünolojik hastalıklarda yaygın olarak gözlenen hücre döngüsü bozulmasını anlamada önemlidir. MCM, metal etiketli antikorlar kullanarak hücre dışı ve hücre içi faktörlerin güvenilir ölçümünü sağlar; Bununla birlikte, iridyum bazlı DNA interkalatörü 2N ve 4N DNA arasında ayrım yapamadığı için S-fazının ölçümü sınırlıydı. Hücre döngüsü fazlarını tanımlamak için Behbehani, kütle sitometresinin aralığına giren ve S-faz3'teki hücrelerin doğrudan ölçülmesine izin veren 127 kütleli IdU'yu kullanan bir yöntem geliştirdi. Bu doğrudan ölçüm, ikincil antikorlara olan ihtiyacı veya asit veya DNaz gibi DNA denatüre edici ajanların kullanımını ortadan kaldırır. Hücre içi döngü belirteçleri ile birlikte, deneysel modellerde hücre döngüsü dağılımının yüksek çözünürlüğüne izin verir.
Bu protokol, hücre döngüsü ölçümlerini MCM için ortak akış sitometri protokollerinden uyarlar. Yöntemlerimiz, hücre döngüsü parametrelerini dahil etmek için uygun ve basit bir yol sağlar. İn vitro numunelerin IdU ile dahil edilmesi, 37 ° C'de sadece 10 ila 15 dakikalık inkübasyon gerektirir; bu, birkaç saatlik inkübasyon süreleri öneren çoğu BrdU boyama protokolünden daha kısadır 3,7. IdU ve BrdU dahil numuneler bir proteomik stabilizatör kullanılarak sabitlenebilir ve daha sonra -80 ° C'lik bir dondurucuda bir süre saklanabilir. Bu, çok sayıda IdU boyalı numunenin, numune kalitesinde bir azalma olmadan parti analizi için arşivlenmesini sağlar.

<table><tbody><tr><td>Sığır Serum Albümini (BSA)</td> <td>Sigma</td><td>A3059</td><td>CSM</td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Bileşeni Thermo Scientific</td><td>75-217-420</td><td>Örnek santrifüjleme</td></tr><tr><td>Cleaved-PARP (D214)</td> <td>BD Biosciences</td><td>F21-852</td><td>Apoptotik hücrelerin tanımlanması</td></tr><tr><td>Cyclin B1</td><td>BD Biosciences</td><td>GNS-1</td><td>G2 Çözünürlük</td></tr><tr><td>Dimetilsülfoksit (DMSO)</td> <td>Sigma</td><td>D2650</td><td>Kriyokoruyucu</td></tr><tr><td>EQ Dört Elemanlı Kalibrasyon Boncukları</td><td>Fluidigm</td><td>201078</td><td>CyTOF performansı için dahili metal standardı</td></tr><tr><td>FACS Tüp, ağ süzgeci</td><td>ile Corning</td><td>08-771-23</td><td>CyTOF çalıştırmadan önce kümeleri/kalıntıları çıkarmak için hücre süzgeci</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td><td>VWR</td><td>97068-085</td><td>Hücre kültürü büyüme takviyesi</td></tr><tr><td>Helios</td><td>Fluidigm</td><td></td><td>CyTOF Sistemi/Platformu</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td>Spesifik olmayan lekelenmeyi önlemek için boyama katkı maddesi</td></tr><tr><td>IdU (5-İyodo-2 & prim; -deoksiuridin)</td> <td>Sigma</td><td>I7125</td>, <td>S fazı</td></tr><tr><td>Ki-67</td><td>eBiosciences'a</td> dahil olur <td>SolA15</td><td>G0 / G1</td></tr><tr><td>MaxPar Çoklu Etiket Kitinin Onayı</td><td>Fluidigm</td><td>201300</td><td>Metal etiketleme kiti, metalleri ekler antikorlara</td></tr><tr><td>Mikroplaka Çalkalayıcı</td><td>Thermo Scientific</td><td>88880023</td><td>Boyama sırasında numunelerin karıştırılması</td></tr><tr><td>Paraformaldehit (PFA)</td><td>Elektron Mikroskobu Hizmetleri</td><td>15710</td><td>Fiksatif</td></tr><tr><td>pentametilsiklopentadienil-Ir (III) -dipiridofenazin</td><td>Fluidigm</td><td>201192</td><td>CyTOF edinimi sırasında hücre tanımlama</td></tr><tr><td>p-H2AX (S139)</td> <td>Millipore</td><td>JBW301</td><td>DNA hasarının tespiti</td></tr><tr><td>p-HH3 (S28)</td><td>Biolegend</td><td>HTA28</td><td>M-faz Çözünürlük</td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Tuzlu Tuz (PBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>Hücre kültürü için yıkama çözeltisi ve fiksatif çözeltinin bileşeni</td></tr><tr><td>p-Rb (S807/811)</td><td>BD Biosciences</td><td>J112906</td><td>G0/G1 Çözünürlük</td></tr><tr><td>Proteomik Stabilizatör</td><td>SmartTube Inc</td><td>PROT1</td><td>Örnek sabitleyici</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>21870-076</td><td>Hücre kültürü büyüme ortamı</td></tr><tr><td>Sodyum Azide</td><td>Acros Organikler</td><td>AC447810250</td><td>CSM / Antikor tamponunun bileşeni, biyosit</td></tr></tbody></table>

bir kütle sitometri platformunda hücre döngüsü fazları oluşturmak için pirimidin analogu, 5-İyodo-2′-deoksiüridin (idu) hücre döngüsü belirteçleri ile kullanımı

Use of the Pyrimidine Analog, 5-Iodo-2&prime;-Deoxyuridine (IdU) with Cell Cycle Markers to Establish Cell Cycle Phases in a Mass Cytometry Platform

Hücre döngüsü fazının düzenlenmesi, hücresel proliferasyon ve homeostazın önemli bir yönüdür. Hücre döngüsünü yöneten düzenleyici mekanizmaların bozulması, kanser de dahil olmak üzere bir dizi hastalığın bir özelliğidir. Hücre döngüsünün incelenmesi, hücre döngüsü ilerlemesinin her bir bölümündeki hücre sayısını tanımlamanın yanı sıra her hücre döngüsü fazı arasında açıkça tanımlama yeteneğini gerektirir. Kütle sitometrisinin (MCM) ortaya çıkışı, elementel izotopların doğrudan ölçümleri yoluyla yüksek verimli tek hücre analizi için muazzam bir potansiyel sağlar ve MCM tarafından hücre döngüsü durumunu ölçmek için bir yöntemin geliştirilmesi, MCM'nin faydasını daha da genişletir. Burada, bir MCM sisteminde 5-bromo-2'-deoksiüridin (BrdU) benzeri 5-iodo-2′-deoksiüridin (IdU) 'yi doğrudan ölçen bir yöntemi açıklıyoruz. Bu IdU tabanlı MCM'nin kullanımı çeşitli avantajlar sağlar. İlk olarak, IdU, sentezi sırasında DNA'ya hızla dahil edilir ve S-fazındaki hücrelerin 10-15 dakika kadar kısa inkübasyonlarla güvenilir bir şekilde ölçülmesini sağlar. İkincisi, IdU, ikincil antikorlara ihtiyaç duymadan veya DNA yıkımına ihtiyaç duymadan ölçülür. Üçüncüsü, IdU boyaması, siklin B1, fosforile retinoblastoma proteini (pRb) ve fosforile histon H3 (pHH3) ölçümü ile kolayca birleştirilebilir ve bu da toplu olarak beş hücre döngüsü fazının net bir şekilde tanımlanmasını sağlar. Bu hücre döngüsü belirteçlerinin MCM ile mümkün olan çok sayıda parametre ile kombinasyonu, diğer birçok metrikle kombinasyona izin verir.

HL-60 hücreleri ve bir insan kemik iliği aspiratı kullanarak, deneysel koşulların hücre döngüsü dağılımını ve analizini nasıl etkileyebileceğini göstermek mümkündür. İlk olarak, hücre döngüsü fazlarının nasıl türetildiğini göstermek için geçit stratejisi oluşturulmalıdır. Şekil 1'de, hücresel enkaz ve çiftlerin ayrılmasında önemli olan singlet kapısının kurulmasını, tek bir hücre popülasyonunun oluşturulmasını gösteriyoruz. Hücre çizgileri için singlet kapısı, hücre döngüsü analizine geçmek ...

Bu protokol, hücre döngüsü ölçümlerini bir kütle sitometri platformunda kullanılmak üzere uyarlar. Kütle sitometrisinin çok parametreli yetenekleriyle, iyot katılımının doğrudan ölçümü, S-fazındaki hücrelerin tanımlanmasına izin verirken, hücre içi döngü belirteçleri, her bir hücre döngüsü durumunun bir dizi deneysel koşulda karakterizasyonunu sağlar.

Bir Kütle Sitometri Platformunda Hücre Döngüsü Fazları Oluşturmak için Pirimidin Analogu, 5-İyodo-2′-Deoksiüridin (IdU) Hücre Döngüsü Belirteçleri ile Kullanımı

The regulation of cell cycle phase is an important aspect of cellular proliferation and homeostasis. Disruption of the regulatory mechanisms governing the ...

Bu protokol, kütle sitometresini kullanarak hücre döngüsünü tek hücre düzeyinde incelememizi sağlar ve bu, birkaç yeni araştırma ve klinik çalışmanın yapılmasını sağlar. Bu tekniğin temel avantajı basitliğidir. IdU doğrudan hücrelere eklenir ve daha fazla tedaviye veya antikorlara gerek yoktur.Bu tekniği, kök ve progenitör hücre bölmelerinde akut miyeloid lösemili hastalarda hücre döngüsü durumunu araştırmak için kullandık. Ve bu, bu spesifik hücre tiplerinin hücre döngüsü özelliklerinin, bu hastalıkları olan hastaların klinik sonuçları ile ilişkili olabileceğini göstermiştir. Bu teknik, nadir kanser hücrelerinin büyüme özelliklerini anlamak ve bağışıklık hücresi alt kümelerinin çoğalmasını anlamak için yararlı olabilir.Hücre örneklerine IdU eklemeden önce ve sonra, hücreleri ilgilenilen büyüme koşullarında tutun. Bu durumda, hücreleri IdU ile etiketlemek için% 5 CO2'de nemlendirilmiş 37 santigrat derece inkübatör, konsantre IdU stok çözeltisini hücrelerin büyüme ortamına bir ila 50 arasında seyreltin. Daha sonra numuneleri bir biyogüvenlik başlığına aktarın ve her bir mililitre hücreye 10 mikrolitre bir milimolar IdU ekleyin.Numuneleri tek tek konik tüplere aktarmadan önce hücreleri inkübatöre 10 ila 15 dakika boyunca geri döndürün. Hücreleri 15 mililitrelik konik tüplerde santrifüjleme yoluyla toplayın ve peletleri tüp başına 200 mikrolitre PBS'de yeniden askıya alın. Gerekirse, ölü hücreleri işaretlemek için hücreleri uygun bir canlı / ölü leke ile etiketleyin.Canlı / ölü lekeyi takiben, hücreleri 25 mikrolitre% 16 paraformaldehit ile sabitlemeden önce CSM ile yıkanmış ortamlarla söndürün. Oda sıcaklığında 10 dakikalık bir inkübasyondan sonra, hücreleri santrifüjleme ile toplayın. Beş ila 15 mililitre CSM ekleyin ve tekrar santrifüj yapın.Peletleri% 10 dimetil sülfoksit ile desteklenmiş 500 mikrolitre hücre boyama ortamında tekrar askıya alın. Daha sonra hücreleri negatif 80 santigrat derecede saklamak için daha küçük tüplere aktarın. Hücre döngüsü analizini normalleştirmek için, dosyaları uygun bir akış sitometri analiz yazılımı programına aktarın ve 191 iridyuma karşı olay uzunluğunun iki eksenli bir grafiğini oluşturun.Hücreler belirgin bir parlak iridyum yüksek popülasyonu oluşturacaktır. Hücrelerin daha belirgin görünmesini sağlamak için olay uzunluğu ölçeğini değiştirin. Ardından, çiftlerin ve döküntülerin %50 ila 60'ını hariç tutmak için bir singlet kapısı oluşturun ve kalan çiftleri ve kalıntıları kaldırmak için artık ve ofset Gauss parametrelerini ayarlayın.S-faz kapısını ayarlamak için, bir çoğalma işaretleyicisine karşı IdU'nun iki eksenli bir grafiğini oluşturun. S-fazı IdU pozitif hücreler ayrı bir popülasyon oluşturacaktır. G0 / G1 ve G2 / M geçidi için, kapıları bir IdU'ya karşı Cyclin B1 grafiğinde oluşturun.G0 / G1 fazı Siklin B1 düşük, IdU negatif ve G2 / M fazı Siklin B1 yüksek, IdU negatif olacaktır. Belirli hücre tiplerine geçiş yapmak için, G0/G1 fazı ile G2/M faz hücreleri arasındaki ayrımı belirlemeye yardımcı olmak için Cyclin B1 ve IdU grafiğinde yalnızca S-fazı hücrelerini çizin. Cyclin B1 yüksek popülasyonunun etrafına bir kapı çizin.Bazı durumlarda, bunu ayırt etmek zor olabilir, ancak S-faz popülasyonunun yaklaşık% 5'inin Siklin B1 seviyesi tipik olarak G0 / G1 ve G2 / M faz kapıları arasındaki kesme noktasıdır. Önceki kapıda bulunan hücreler G2 / M faz popülasyonu olurken, geri kalanı G0 / G1 faz popülasyonu olacaktır. G0 faz popülasyonunu oluşturmak için, IdU grafiğine karşı fosforile edilmiş bir retinoblastoma proteini oluşturun.G0 fazı, fosforile retinoblastoma proteini düşük, IdU negatif popülasyon ile temsil edilecektir. Aktif döngü popülasyonu yüksek fosforile retinoblastoma proteini ve IdU katılımı göstereceğinden, G0 faz kapısı tipik olarak iki ayrı popülasyonda ifade edildiği gibi bu sınıra çizilebilir. G0 kapısının tanımlanması zorsa, S-fazı popülasyonunu aktif popülasyon haline getirin ve fosforile retinoblastoma proteini yüksek popülasyonunun en üst% 90 ila% 100'ünü içeren bir kapı çizin.Kapının dışındaki fosforile retinoblastoma proteini düşük popülasyonu tipik olarak G0 popülasyonudur, bu kapıya düşen pRb seviyelerine sahip G0 / G1 hücreleri ise G1 hücreleridir. M-faz geçişi için, eksenel grafik ile fosforile histon H3'e karşı bir IdU oluşturun. M-faz fazı, fosforile histon H3 popülasyonundaki hücrelerin çok küçük bir fraksiyonu olarak gözlenecektir.G2 / M popülasyonundaki pHH3 seviyeleri daha düşük olan hücreler G2 hücreleridir. IdU katılımı başarısız olduysa veya mümkün değilse, Ki67 ve fosforile retinoblastoma proteini kullanarak döngü hücre fraksiyonlarını değil, döngüyü tanımlayın. Çift pozitif popülasyon, G1, S, G2 ve M-fazları ile ilişkili aktif bisiklet popülasyonunu temsil edecektir.Çift düşük nüfus, G0 fazı ile ilişkili bisiklete binmeyen popülasyonu temsil edecektir. Tüm kapılar kurulduktan sonra, sayısal değerleri kapılardan dışa aktarın. Her döngüdeki yüzdeler, sonraki grafik ve istatistiksel analiz için her bir hücre döngüsü aşaması için sayısal değerler üretmek üzere birleştirilmiş popülasyonlardan tek popülasyonları çıkararak elde edilebilir.Singlet kapısının kurulması, hücresel enkazın ayrılması ve tek hücre popülasyonunun izolasyonuna izin vermek için çifte katlanması için önemlidir. Daha sonra tek hücrelerin hücre döngüsü analizi yapılabilir. IdU etiketleme ve dolayısıyla aşağı akış hücre döngüsü analizi, zaman ve sıcaklıktan önemli ölçüde etkilenebilir.Örneğin, kapalı damarlarda veya yerler arasında taşımada çok uzun süre kalan hücreler, S-faz fraksiyonlarını azaltacak ve bu hücre döngüsü analizi için doğru olmayacaktır. Bir saat veya daha kısa süreler boyunca tutulan hücre örnekleri hala normal bir hücre döngüsü dağılımı göstermektedir, bu da hızlı bir nakliyenin analizi olumsuz etkilemeyebileceğini göstermektedir. Kriyokorunmuş hücreler, hücreler aktif hücre döngüsüne dönmeden önce uzun bir denge periyodu gerektirebilir, bu da kriyoprezervasyon öncesi hücre döngüsü durumunu hala yansıtmayabilir.Farklı hücre tipleri de bakım koşullarından farklı şekilde etkilenebilir. Örneğin, bu insan kemik iliği örneğinde, T hücreleri, aynı numunedeki monoblastlara kıyasla hücre sayılarında bir azalma göstermiştir. Kütle sitometrisinin bir diğer yararı, hücre döngüsü durması sırasında veya anormal hücre döngüsü dağılımına sahip hücreleri ayırt etme yeteneğidir.Bu tekniğin en büyük avantajı, yüzey fenotiplemesi, kromatin yapısı, hücre içi sitokin uyarımı gibi hücre döngüsü durumu ile ilişkilendirilebilen diğer kütle sitometri ölçümleriyle kolayca uyumlu olmasıdır. Bu tekniği, bağışıklık hücresi tükenmesini, yaşlanmasını incelemek ve akut lösemili hastalarda kemoterapiye verilen yanıtın lösemi hücrelerinin hücre döngüsü özellikleri ile ilişkili olabileceğini göstermek için kullandık.

use-pyrimidine-analog-5-iodo-2-deoxyuridine-idu-with-cell-cycle

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Biz yetişkin farelerin dokulara hücre bölünme birbirini izleyen iki mermi ölçmek için timidin analogları sıralı dahil (CldU ve IDU) tespit etmek için bir strateji elde var. Bu strateji, uzun ömürlü dokuların hücre ciro, onkojenik transformasyon, ya da transit yükseltme hücreleri tespit etmek için yararlıdır.

İlköğretim Doku İki timidin analogları Immunofluorescent Algılama (CldU ve IDU)

, Hücrelerden oluşan bir nüfus hücre döngüsü konumunun belirlenmesi, ya da sinyalleri çoğalması nasıl etkilediğini anlamak, bu protokolü kullanarak flow sitometri ile kolayca ölçülebilir. Biz hücreleri boyama ve hücre döngüsü konumlarını miktarının belirlenmesi için basit bir deneysel yaklaşım raporu.

Memeli Hücreler, Hücre Döngüsü Pozisyon Analizi

Hücre döngüsü aşamaları ilerleme ve kinetikleri izleme ince değişiklikler Propidium iyodid ile BrdU ve toplam genomik DNA boyama yöntemi ile, nükleik asit metabolik etiketlenmesi bir kombinasyonu kullanılarak gerçekleştirilebilir. Bu yöntem, dolayısıyla da hücre siklus progresyonu etkileyen non-spesifik DNA hasarına, geliştirilmesinin önlenmesi, bisiklet hücrelerin kimyasal senkronizasyonu ihtiyacını ortadan kaldırır.

Metabolik Etiketleme ve Flow Sitometri ile Hücre Döngüsü İlerleme Kinetik Ölçüm

Bu videoda BrdU immünofloresan boyama protokolü açıklanmaktadır. Teknik, hücre döngüsünün farklı aşamalarındaki hücrelerin tanımlanmasına izin verir. DNA boyalarının ve antikor etiketlemesinin eklenmesi, daha sonraki zamanlarda S fazı hücrelerinin kaderinin ayrıntılı analizine izin verir.

BrdU İmmünofloresan Boyama: Hücre Döngüsünün Farklı Aşamalarındaki Hücreleri Tanımlamak İçin Bir Teknik

Video, kanser hücrelerinde replikasyon stresini ölçmek için immünofloresan tabanlı bir yaklaşımı göstermektedir. Hidroksiüre ile muamele edilen hücreler, immünofloresan yoluyla tespit edilen tek sarmallı DNA üretir. Yeşil floresan odaklarının sayısı, kanser hücrelerindeki replikasyon stresi seviyesini gösterir.

Kanser Hücrelerinde Replikasyon Stresini Ölçmek için İmmünofloresan Tabanlı Bir Yöntem

Bu protokol, zaman içinde belirli bir noktada S fazında olan hücrelerin zamansal izleme izin vermek için bromodeoksiüridin (BrdU) alımından kullanımını tarif eder. DNA boyalar ve antikor etiketleme eklenmesi daha sonraki zamanlarda S fazı hücrelerinin kaderi detaylı analizini kolaylaştırır.

Senkronizasyon Need for olmadan Akım Sitometri Kullanımı Hücre Döngüsü ilerleme zamansal İzleme

Burada, bir (hücre döngüsü) kinazın mitokondriyal lokalizasyonunun nasıl çalışılacağını ve alt mitokondriyal konumunun yanı sıra potansiyel mitokondriyal substratların/hedeflerin nasıl belirleneceğini ana hatlarıyla açıklıyoruz. Proteinlerin mitokondriye zorla ekspresyonu, ilgilenilen bir proteinin mitokondriyal lokalizasyonunun fonksiyonel sonuçlarını incelemek için yararlı bir araç sağlar.

Deneysel Yaklaşımlar Mitokondriyal Yerelleşme ve Nükleer Hücre Döngüsü Kinaz, Cdk1 Fonksiyonu Eğitim için

Mevcut protokolde, immünofluoresans bazlı bir yöntem kullanarak hücre döngüsünün S/G2 aşamasında DNA çift iplik ucu rezeksiyonunun nasıl görselleştirilerek görselleştirilmeyi gösteriyoruz.

BrdU-DNA Etiketlemesi Kullanılarak Küresel DNA Çift Telli Uç Rezeksiyonunun Değerlendirilmesi Hücre Döngüsü Ayrımcılığı Görüntüleme ile birleştiğinde

5-etil-2'-deoksiyridin (EdU) ve fosfo-histon H3 (pH3) etiketlemeli hücre döngüsü analizi, kapsamlı optimizasyon gerektirebilecek çok adımlı bir prosedürdür. Burada, farklı hücre döngüsü aşamalarındaki hücreleri ayırt etmek için görüntü analizi ve niceleme dahil olmak üzere bu prosedür için tüm adımları açıklayan ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

5-Etil-2'-Deoksiroridin/Fosfo-Histon H3 Drosophila Nöral Kök Hücrelerde Hücre Döngüsü İlerleme Analizi için Çift Etiketleme Protokolü

İn vivo olarak dahil edilen ve mikroskopi ve akış sitometrisi ile Click kimyası kullanılarak tespit edilen bir timidin analoğu olan EdU'yu kullanarak S. cerevisiae'deki S-faz süresini doğru bir şekilde belirlemek için iki tamamlayıcı protokol tanımladık. DNA replikasyon süresinin ve mutantlarda gözden kaçan replikasyon kusurlarının kolay karakterizasyonuna izin verir.

Saccharomyces cerevisiae'de 5-Etinil-2'-deoksiüridin Kullanımı Kullanılarak S-Faz Süresinin Belirlenmesi

Öğrenin, kütle sitometri ile tek hücre düzeyinde hücre döngüsü fazlarını IdU belirteçleri kullanarak analiz etme yöntemini. Akut miyeloid lösemi hücrelerinin büyüme özelliklerini ve klinik sonuçları anlamak için uygulanır.

Bir Kütle Sitometri Platformunda Hücre Döngüsü Fazları Oluşturmak için Pirimidin Analogu, 5-İyodo-2′-Deoksiüridin (IdU) Hücre Döngüsü Belirteçleri ile Kullanımı (Video) | JoVE Journal

Bir Kütle Sitometri Platformunda Hücre Döngüsü Fazları Oluşturmak için Pirimidin Analogu, 5-İyodo-2′-Deoksiüridin (IdU) Hücre Döngüsü Belirteçleri ile Kullanımı

Daha fazla video keşfet