Name: Deniz Hıyar Bağırsak Hücrelerinin Birincil Kültüründe Apoptosis İndüksiyon uyupve tayini (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Öğrenin, deniz hıyarı Apostichopus japonicus bağırsak hücrelerinin birincil kültür protokolünü. Bu yöntem, deniz omurgasızları için uzun süreli hücre kültürü sağlar ve deniz biyolojisi araştırmalarında tutarlı genetik arka plan sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, Zhejiang Üniversitesi'nden Prof. Naiming Zhou'ya teknik tavsiyeleri ve laboratuvarının ekipmanını kullanıma hazır hale getirmeleri için teşekkür etmek isterler. Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (hibe numaraları 41876154, 41606150 ve 41406137) ve Zhejiang İl Üniversiteleri ve Araştırma Enstitüleri Için Temel Araştırma Fonları [hibe numarası 2019JZ00007) tarafından finansal olarak desteklenmiştir. ].

1. Hücre Kültürü Orta Hazırlık
<ol><li>
Coelomik sıvı hazırlama
	<ol>
<li>
Coelomik sıvı toplama: Steril koşullar altında, sağlıklı bir deniz hıyarı (85-105 g ıslak ağırlık) incelemek, coelomik sıvı toplamak ve steril bir cam şişesinde saklayın.</li>
		<li>
Koelomik hücre çıkarılması: 50 mL santrifüj tüpteki coelomik sıvıyı 5 dk için 1.700 x g'da santrifüj edin ve supernatant'ı yeni bir steril cam şişeye aktarın; sonra, deniz hıyarı hücresiz coelomik sıvı toplamak.</li>
		<li>
Kompleman bileşenleri inaktivasyonu: Deniz hıyarı coelomik sıvıiçeren steril cam şişeyi, kompleman bileşenleri-inaktive coelomik sıvı elde etmek için 20-40 dk boyunca 40-50 °C su banyosunda kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>
Mikrop kaldırma: 0,22 μm membran filtreler ilerleyerek bakteri ve klamidya kaldırın. Daha sonra, koelomik sıvı ön işlem çözümü elde etmek için 0,1 μm membran filtreleri kullanarak filtrasyon ile mikoplazma ve diğer ince partikülleri çıkarın.</li>
		<li>
Tuzluluk ayarı: Coelomic sıvı ön arıtma solüsyonunun tuzluluğunu sterilize edilmiş ve filtrelenmiş NaCl çözeltisi (önceden işlenmiş coelomik sıvı ile seyreltilmiş) veya DDW (çift distile su) ekleyerek %30'a (salinometre ile ölçülür) ayarlayın. Deniz hıyarı coelomik sıvıyı steril bir şişeye aktarın, şişeyi kapatın ve daha fazla deney için sıvıyı 4 °C'de saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Leibovitz's L-15 hücre kültürü orta optimizasyon
	<ol>
<li>Tartmak 5.05 G NaCl, 0.135 g KCl, 0.15 g CaCl2, 0.25 g Na2SO4, 0.975 g MgCl2, 0.25 g glikoz, ve 6.25 mg taurin ve seyreltmek 40 mL Leibovitz's L-15 orta 50 mL steril steril tüp. Tuzların tamamen eridiğinden emin olmak için tüpü 1 saat çalkalayın.</li>
		<li>Daha önce hazırlanmış Leibovitz'in L-15 ortamına 2,5 mL L-glutamin (100 mg/mL) ve 500 μL VE solüsyonu (1,75 mg/L) ekleyin ve orta yı 0,22 μm membran filtreleri ile daha fazla filtreleyin.</li>
		<li>Taze Leibovitz'in L-15 orta ve önceden hazırlanmış 100 mL coelomic sıvı ile 500 mL toplam orta hacmi ayarlayın; sonra, NaOH çözeltisi kullanarak pH'ı 7.6'ya ayarlayın. İşlem işlemini steril bir ortamda tutun. Coelomik sıvının bileşik oranı %10-%50, A. japonicus intestinal hücre kültürü için %20 yeterlidir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Bağırsak Hücre Hazırlığı
<ol><li>
Deniz hıyar bağırsak işleme
	<ol>
<li>Bir buz kutusunda sağlıklı deniz hıyarları anestezik. Kesip ön bağırsakları toplayın, sonra doku örneklerini dikey olarak kesip iç içeriğini çıkarın.</li>
		<li>Doku örneklerini fosfat tamponlu salin (PBS) ile iki kez yıkayın ve sulu bir etanol çözeltisi (hacim olarak %75) en fazla 2 s daldırma ile dezenfekte edin.</li>
		<li>Etanol çıkarmak ve 2.0 mL steril mikrosantrifüj tüpüiçine doku örneğinin yaklaşık 100 mg aktarmak için PBS doku örneklerini üç kez yıkayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Hücre koleksiyonu
	<ol>
<li>Deniz hıyar bağırsak dokusu bloğuna önceden optimize edilmiş kültür ortamının 1,5 mL'sini ekleyin ve çözelti bulutlu olana kadar steril cerrahi makasla bloğu doğrama. NOT: İsteğe bağlı basitleştirilmiş protokol için, deniz hıyar bağırsak dokusu bloğuna önceden optimize edilmiş kültür ortamının 0,5 mL'sini ekleyin ve sterilize edilmiş cerrahi makas ile bloğu 1 mm3'ekesin. Örnekleri doğrudan kültür yemeklerine aktarın ve ardından kuluçka adımlarını takip edin.</li>
		<li>400 μL tripsin (%0,25) ekleyin, çözeltiyi ters çevrilerek karıştırın ve oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatırın; daha sonra çözeltiyi 100 μm hücreli süzgeç kullanarak filtreleyin. NOT: Farklı doku örnekleri tedavi ederken hücre dağılımı için tripsin eklemek isteğe bağlıdır. Etilendimintetraasetik asit (EDTA), kültür ortamında Ca2+ ve Mg2+'dan gelen inhibitör aktiviteyi azaltmak için tripsin çözeltisinde bulunmalıdır.</li>
		<li>Yeni bir steril 2.0 mL mikrosantrifüj tüp, santrifüj de 1.700 x g 3 dakika için filtrasyon toplamak, supernatant atmak, sonra kültür orta pelet resuspend (antibiyotik ile birlikte) ve iki kez yıkayın. NOT: Deney başlamadan önce %2 penisilin-streptomisin çözeltisi (10.000 U/mL penisilin ve 10 mg/mL streptomisin) ve %1'i gentamisin (4 mg/mL) ile takviye edilmiş taze önceden optimize edilmiş kültür ortamı hazırlayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Hücre Kültürü
<ol><li>
Kuluçka makinesi ön ayarı: Hücre kültürü için kuluçka önceden ayarlayın ve 18 ° C sıcaklık ve doymuş nem ile en az 24 saat önceden çalıştırın. NOT: HÜCRE KÜLTÜRÜ orta özelliklerine bağlı olarak CO2'yi kuluçka makinesine yedirin; Leibovitz'in L-15'inin temel ortamını kullanırken co2'nin sağlanmasına gerek yoktur.</li>
	<li>
İlk aşama hücre kültürü
	<ol>
<li>Mikropların büyümesini engellemek ve hücre kültürünün ilk aşamasında çoğalmayı teşvik etmek için, optimize edilmiş kültür ortamının her 500 mL'sine 10 mL penisilin-streptomisin çözeltisi (10.000 U/mL penisilin ve 10 mg/mL streptomisin) ve 0,5 mL gentamisin (40 mg/mL) ekleyin. Ayrıca, 0,6 mL insülin (10 mg/mL), 100 μL insülin benzeri büyüme faktörü (0.1 g/μL) ve 25 μL fibroblast büyüme faktörü (0.1 μg/μL) ile her 500 mL kültür ortamını tamamlayınız.</li>
		<li>Hücreleri 1,5 mL tüpler halinde toplayın, 200 μL'lik belirtilen ortamı kullanarak yeniden askıya alın ve 4 cm'lik tabaklara yerleştirin.</li>
		<li>Kültür bir kuluçka hücreleri ve 6 h sonra hücre culturing yemekleri için belirtilen orta 2.0 mL ekleyin. NOT: Hücreler yemeklere sıkıca bağlı olmadığından orta değişimi hafifçe ele alın. Poli-D-lizin kaplı yemekler gevşek çanak hücrelerine takmak için kullanılabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
İkinci aşama hücre kültürü
	<ol>
<li>Kültürlü hücrelere antibiyotiklerin olumsuz etkilerini azaltmak için, yarı yarıya kültür orta belirtilen antibiyotik konsantrasyonu azaltmak (penisilin, streptomisin, ve gentamicin). NOT: İnsülin kullanımı ve büyüme faktörleri hücre kültürü koşullarına bağlıdır ve isteğe bağlıdır.</li>
		<li>Hücre kültürü ortamını değiştirin; hücre yoğunluğuna bağlı olarak her 2-3 günde bir orta değişiklikler yapar. NOT: Kültürlü hücreleri mikroskop altında her gün gözlemleyin ve büyüme koşullarını kaydedin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Hücre geçişi NOT: Birincil hücre yoğunluğu %60'a ulaştığında hücreleri geçiş ve alt kültür.<ol>
<li>Kültür hücrelerini oda sıcaklığında PBS kullanarak iki kez yıkayın. 200 μL tripsin çözeltisi (%0.25) ekleyin her yemek için ve el ile tüm alt kaplı olmasını sağlayan çanak ajite. Tripsin çözeltisini atın ve hücreleri oda sıcaklığında 5 dk kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Hücreleri pipetleme ve yeniden sulendirme yaparak 1,0 mL taze kültür ortamı ile yıkayın. 0,5 mL hücre süspansiyonunun yeni bir tabağa aktarılması, 1,5 mL taze ortam ekleyip 18 °C'de hücreleri kuluçkaya yatırın. NOT: Tripsin çözeltisi hücreleri sindirip ayıramayınca hücre kazıyıcılar hücre toplama için kullanılabilir (bazı hücre hatları çok yapışkandır). Ancak, her iki yöntemi de aynı anda yapmayın.</li>
		<li>12 saat sonra orta değiştirin ve koşulları değerlendirmek için bir mikroskop altında hücreleri gözlemleyin. Kültür daha deneysel tahliller için hücreleri.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. A. japonicus Intestinal Hücrelerde Apoptosis İndüksiyon ve Saptanması
<ol><li>
Hücre kültürü ve deksametazon tedavisi
	<ol>
<li>Daha önce tanıtılan protokolü izleyerek bağırsak hücrelerini hazırlayın ve hücreleri kuyu başına 2 x 106'lık bir hücre hacminde 12 kuyuluk bir plakaya damlayla ekleyin.</li>
		<li>Kültürde üç gün sonra, "ilk aşama hücre kültürü" adımlarını izleyerek, pbs ile hücreleri üç kez yıkayın ve optimize edilmiş orta (antibiyotik ve büyüme faktörleri olmadan) ile orta değiştirin.</li>
		<li>Deneylere başlamadan önce taze 2 μM ve 200 μM DXMS çözeltileri hazırlamak için kültür ortamında seyreltilmiş deksametazon (DXMS).</li>
		<li>Aynı hacimde kültür ortamıyla yetiştirilen kültürlü hücrelere farklı konsantrasyonlarda DXMS çözümleri ekleyin; kontrol (CTL), 1 μM ve 100 μM DXMS dahil olmak üzere üç deneysel grup ayarlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Hoechst boyama 
	<ol>
<li>Belirtilen süreler için (0 saat, 24 saat ve 48 saat) DXMS ile/DXMS'siz kuluçkadan sonra hücreleri Üç kez PBS ile yıkayın.</li>
		<li>12 kuyulu bir tabağa her kuyubaşına 300 μL Hoechst 33258 çözeltisi ekleyin ve 18 °C'de 30 dakika boyunca kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Hoechst boyama çözeltisini çıkarın ve her kuyuya %4 paraformaldehit çözeltisinin (PBS içinde) 300 μL'lik kısmını ekleyerek hücreleri düzeltin. Hafifçe 15 dakika boyunca çalkalayın. DİkKAT: Paraformaldehit cilt teması veya inhalasyon ile orta derecede toksik, ve olası bir insan kanseriojen olarak belirlenmiştir. Paraformaldehitin tartılması ve işlenmesi sırasında kimyasal duman başlıkları, havalandırmalı denge muhafazaları veya diğer koruyucu önlemler kullanılmalıdır.</li>
		<li>Sabit hücreleri PBS'de üç kez yıkayın. Hücreleri kapalı tutmak için yıkadıktan sonra PBS'yi atmayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Floresan mikroskopi analizi
	<ol>
<li>Cıva lamba gücü, floresan ışık gücü ve PC dahil olmak üzere floresan mikroskop donanımını açın. İşletim sistemi hesabına giriş yapın, yazılımı başlatın ve yapılandırmasını kontrol edin.</li>
		<li>Hazırlanan plakayı mikroskop aşamasına yerleştirin. Sahne denetleyicisini kullanarak örneği nesnel merceğin üzerine yerleştirin.</li>
		<li>Işık mikroskobu altında ilgi çeken hücreleri bulun, floresan mikroskobu na geçin ve parametreleri ayarı yaparak görüntüleri yakalayın. NOT: Çekirdek DNA'sına bağlı Hoechst 33258 floresan sinyalini gözlemlemek için floresan mikroskobu sırasıyla 352 nm ve 461 nm'de uyarma ve emisyon ile yapılmalıdır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Naganuma, T., Degnan, B. M., Horikoshi, K., Morse, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myogenesis+in+primary+cell+cultures+from+larvae+of+the+abalone%2C+Haliotis+rufescens%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Marine+Biology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Myogenesis in primary cell cultures from larvae of the abalone, Haliotis rufescens.</a> Molecular Marine Biology and Biotechnology. 3 (3), 131-140 (1994).</li>
<li>Reinardy, H. C., Emerson, C. E., Manley, J. M., Bodnar, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+regeneration+and+biomineralization+in+sea+urchins%3A+role+of+Notch+signaling+and+presence+of+stem+cell+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Tissue regeneration and biomineralization in sea urchins: role of Notch signaling and presence of stem cell markers.</a> Plos One. 10 (8), 0133860(2015).</li>
<li>Schaffer, A. A., Bazarsky, M., Levy, K., Chalifa-Caspi, V., Gat, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcriptional+time-course+analysis+of+oral+vs.+aboral+whole-body+regeneration+in+the+Sea+anemone+Nematostella+vectensis%5BTitle%5D)+AND+%22Bmc+Genomics%22%5BJournal%5D)">A transcriptional time-course analysis of oral vs. aboral whole-body regeneration in the Sea anemone Nematostella vectensis.</a> Bmc Genomics. 17, 718(2016).</li>
<li>Chiaramonte, M., Inguglia, L., Vazzana, M., Deidun, A., Arizza, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+and+immune+response+to+bacterial+LPS+in+the+sea+urchin+Paracentrous+lividus+%28Lamarck%2C+1816%29%5BTitle%5D)+AND+%22Fish+and+Shellfish+Immunology%22%5BJournal%5D)">Stress and immune response to bacterial LPS in the sea urchin Paracentrous lividus (Lamarck, 1816).</a> Fish and Shellfish Immunology. 92, 384-394 (2019).</li>
<li>Meng, J., Wang, T., Li, L., Zhang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+variation+in+anaerobic+energy+metabolism+reflects+hypoxia+tolerance+across+the+intertidal+and+subtidal+distribution+of+the+Pacific+oyster+%28Crassostrea+gigas%29%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Environmental+Research%22%5BJournal%5D)">Inducible variation in anaerobic energy metabolism reflects hypoxia tolerance across the intertidal and subtidal distribution of the Pacific oyster (Crassostrea gigas).</a> Marine Environmental Research. 138, 135-143 (2018).</li>
<li>Han, G., Zhang, S., Dong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anaerobic+metabolism+and+thermal+tolerance%3A+The+importance+of+opine+pathways+on+survival+of+a+gastropod+after+cardiac+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Zoology%22%5BJournal%5D)">Anaerobic metabolism and thermal tolerance: The importance of opine pathways on survival of a gastropod after cardiac dysfunction.</a> Integrative Zoology. 12 (5), 361-370 (2017).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sea+cucumber+genome+provides+insights+into+morphological+evolution+and+visceral+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">The sea cucumber genome provides insights into morphological evolution and visceral regeneration.</a> PLoS Biology. 15 (10), 2003790(2017).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iTRAQ+reveals+proteomic+changes+during+intestine+regeneration+in+the+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology+Part+D%3A+Genomics+and+Proteomics%22%5BJournal%5D)">iTRAQ reveals proteomic changes during intestine regeneration in the sea cucumber Apostichopus japonicus.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part D: Genomics and Proteomics. 22, 39-49 (2017).</li>
<li>Xu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+loss+by+apoptosis+is+involved+in+the+intestinal+degeneration+that+occurs+during+aestivation+in+the+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology+Part+B%3A+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell loss by apoptosis is involved in the intestinal degeneration that occurs during aestivation in the sea cucumber Apostichopus japonicus.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 216, 25-31 (2018).</li>
<li>Yang, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+characteristics+of+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus+%28Selenka%29+during+aestivation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Marine+Biology+and+Ecology%22%5BJournal%5D)">Metabolic characteristics of sea cucumber Apostichopus japonicus (Selenka) during aestivation.</a> Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 330 (2), 505-510 (2006).</li>
<li>Xiang, X. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycolytic+regulation+in+aestivation+of+the+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus%3A+evidence+from+metabolite+quantification+and+rate-limiting+enzyme+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+biology%22%5BJournal%5D)">Glycolytic regulation in aestivation of the sea cucumber Apostichopus japonicus: evidence from metabolite quantification and rate-limiting enzyme analyses.</a> Marine biology. 163 (8), 1-12 (2016).</li>
<li>Jiang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+feedback+loop+involving+FREP+and+NF-kappaB+regulates+the+immune+response+of+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Macromolecules%22%5BJournal%5D)">A feedback loop involving FREP and NF-kappaB regulates the immune response of sea cucumber Apostichopus japonicus.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 135, 113-118 (2019).</li>
<li>Zhou, X., Chang, Y., Zhan, Y., Wang, X., Lin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+mRNA-miRNA+interaction+analysis+associate+with+immune+response+of+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus+based+on+transcriptome+database%5BTitle%5D)+AND+%22Fish+and+Shellfish+Immunology%22%5BJournal%5D)">Integrative mRNA-miRNA interaction analysis associate with immune response of sea cucumber Apostichopus japonicus based on transcriptome database.</a> Fish and Shellfish Immunology. 72, 69-76 (2018).</li>
<li>Cai, X., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marine+invertebrate+cell+culture%3A+a+decade+of+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oceanography%22%5BJournal%5D)">Marine invertebrate cell culture: a decade of development.</a> Journal of Oceanography. 70 (5), 405-414 (2014).</li>
<li>Maselli, V., Xu, F., Syed, N. I., Polese, G., Di Cosmo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Approach+to+Primary+Cell+Culture+for+Octopus+vulgaris+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">A Novel Approach to Primary Cell Culture for Octopus vulgaris Neurons.</a> Frontiers in Physiology. 9, 220(2018).</li>
<li>Pinsino, A., Alijagic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sea+urchin+Paracentrotus+lividus+immune+cells+in+culture%3A+formulation+of+the+appropriate+harvesting+and+culture+media+and+maintenance+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Sea urchin Paracentrotus lividus immune cells in culture: formulation of the appropriate harvesting and culture media and maintenance conditions.</a> Biology Open. 8 (3), (2019).</li>
<li>Odintsova, N. A., Dolmatov, I. Y., Mashanov, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerating+holothurian+tissues+as+a+source+of+cells+for+long-term+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Biology%22%5BJournal%5D)">Regenerating holothurian tissues as a source of cells for long-term cell cultures.</a> Marine Biology. 146 (5), 915-921 (2005).</li>
<li>Rastogi, R. P., Richa, R. P., Sinha, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%3A+Molecular+Mechanisms+and+Pathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Excli+Journal%22%5BJournal%5D)">Apoptosis: Molecular Mechanisms and Pathogenicity.</a> Excli Journal. 8, 155-181 (2009).</li>
<li>Wan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%2C+proliferation%2C+and+morphology+during+vein+graft+remodeling+in+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics+and+Molecular+Research%22%5BJournal%5D)">Apoptosis, proliferation, and morphology during vein graft remodeling in rabbits.</a> Genetics and Molecular Research. 15 (4), (2016).</li>
<li>Kasibhatla, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staining+of+suspension+cells+with+hoechst+33258+to+detect+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Staining of suspension cells with hoechst 33258 to detect apoptosis.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (3), (2006).</li>
<li>Mikiewicz, M., Otrocka-Domagala, I., Pazdzior-Czapula, K., Rotkiewicz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+long-term%2C+high-dose+dexamethasone+administration+on+proliferation+and+apoptosis+in+porcine+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Research+in+Veterinary+Science%22%5BJournal%5D)">Influence of long-term, high-dose dexamethasone administration on proliferation and apoptosis in porcine hepatocytes.</a> Research in Veterinary Science. 112, 141-148 (2017).</li>
<li>Rinkevich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cultures+from+marine+invertebrates%3A+new+insights+for+capturing+endless+stemness%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell cultures from marine invertebrates: new insights for capturing endless stemness.</a> Marine Biotechnology. 13 (3), 345-354 (2011).</li>
<li>Bello, S. A., Abreu-Irizarry, R. J., Garcia-Arraras, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cell+cultures+of+regenerating+holothurian+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Primary cell cultures of regenerating holothurian tissues.</a> Methods in Molecular Biology. 1189, 283-297 (2015).</li>
<li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+water+temperature+on+the+growth+and+fatty+acid+profiles+of+juvenile+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus+%28Selenka%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thermal+Biology%22%5BJournal%5D)">Impact of water temperature on the growth and fatty acid profiles of juvenile sea cucumber Apostichopus japonicus (Selenka).</a> Journal of Thermal Biology. 60, 155-161 (2016).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Kapsamlı araştırma çabaları son yıllarda hücre hatları kurmaya ayrılmış, ancak, hala deniz omurgasızlar14,22hücrelerin inuzun uzun vadeli kültür üzerinde bir ilerleme yapmak zordur. Bu rejenerasyon holotoryian dokulardan kültürlü hücrelerin uzun bir süre için canlı olduğu bildirilmiştir ve çoğalma yüksek aktivite belirli hücrelerde tespit edilebilir17,23. Ancak, normal deniz omurgasız hücreleri için, henü...

Hücreleri doğal ortamlarında değil, yapay olarak kontrol edilen koşullarda, biyolojik çalışmalar için, özellikle de laboratuvar ortamında kolayca kültürlendirileemeyen türler için tek tip deneysel malzemeler sağlar. Deniz omurgasızlar tüm hayvan türlerinin % 30'undan fazlasını oluştururlar1, ve rejenerasyon2,3,stres tepkisi4ve çevresel adaptasyon5,6gibi belirli biyolojik süreçlerin düzenleyici mekanizmaları üzerinde araştırma üstlenmek için çok sayıda biyolojik malzeme sağlarlar.
Deniz hıyarı, Apostichopus japonicus, Kuzey Pasifik kıyıları boyunca ılıman sularda yaşayan en çok çalışılan echinoderm türlerinden biridir. Bu iyi ticari olarak önemli bir tür olarak bilinir ve Doğu Asya'da büyük bir ölçekte maricultured, ÖzellikleÇin'de 7. A. japonicusile ilgili çok sayıda bilimsel soru , evisceration sonra bağırsak rejenerasyon u yatan düzenleyici mekanizmalar dahil8 ve aestivationdejenerasyon 9, metabolik kontrol10,11, ve bağışıklık yanıtı12,13 termal veya patojenik stresaltında, araştırmacıların dikkatini çekmiştir. Ancak, iyi çalışılmış model hayvanlarile karşılaştırıldığında, temel araştırma, özellikle hücresel düzeyde, teknik darboğazları ile sınırlıdır, gelişmiş hücre kültürü yöntemlerinin eksikliği gibi.
Araştırmacılar hücre hatları oluşturmak için çok çaba ayrılmış, ama onlar da birçok zorluklarla karşı karşıya kalmıştır ve herhangi bir deniz omurgasız hiçbir hücre hattı henüz kurulmuştur14. Ancak, deniz omurgasızların birincil hücre kültürleri son yıllarda gelişmiş15,16, ve hücresel düzeyde deney için bir fırsat sağlamıştır. Örneğin, A. japonicus'un rejeneratif intesini, deniz omurgasızlarının birincil hücre kültürü için pratik bir yöntem sağlayan uzun süreli hücre kültürleri için hücre kaynağı olarak kullanılmıştır17. Bu protokol omurgasız hücre kültürü yaklaşımlarını birleştirmiş ve optimize etmiş ve deniz hıyarı veya diğer deniz omurgasızları için çok uygun bir birincil kültür yöntemi geliştirmiştir.
Apoptosis çeşitli eksojen ve endojen uyaranlar tarafından tetiklenen bir içsel hücre intihar programıdır. Koordine apoptosis birçok biyolojik sistemler için çok önemlidir18,19, ve aestivation sırasında deniz hıyarı bağırsak regresyonu karıştığı olmuştur9. İlgi çeken organizmalarda apoptotik süreci araştırmak için, Hoechst boyama ve mikroskopi tahlilleri de dahil olmak üzere bir dizi yöntem kurulmuş ve başarıylauygulanmıştır 20. Burada deniz omurgasızlarının biyolojik çalışmalarında birincil hücrelerin kullanılabilirliğini değerlendirmek için deniz hıyarı primer kültürlü bağırsak hücrelerinde apoptosis indüksiyonu ve tespiti gerçekleştirdik. Deksametazon, yaygın olarak kullanılan sentetik glukokortikosteroidler21,deniz hıyar kültürlü bağırsak hücrelerinde apoptoz neden olarak kullanılan, ve önemli Hoechst 33258 sinyal floresan mikroskoposkopi ile lekeli hücrelerde başarıyla tespit edildi.

<table><tbody><tr><td>0.1 ve mu; m filtre</td><td>Millipore</td><td>SLVV033RS</td><td></td></tr><tr><td>0.22 & mu; m filtre</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RB</td><td></td></tr><tr><td>%0.25 Tripsin</td><td>Genom</td><td>GNM25200</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; m filtre</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>4 cm tabaklar</td><td>ExCell Bio</td><td>CS016-0124</td><td></td></tr><tr><td>%4 paraformaldehit çözeltisi</td><td></td><td>PBS Tezgah Üstü Santrifüjlerde</td><td>80096618 Sinopharm Kimyasal Reaktif</td></tr><tr><td></td><td>Beckman</td><td>Allegra X-30R</td><td></td></tr><tr><td>BeyoClick EdU-488 kiti</td><td>Beyotime</td><td>C0071S</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sinopharm Kimyasal Reaktif</td><td>10005817</td><td></td></tr><tr><td>Sabit sıcaklık inkübatörü</td><td>Şanslı Riptile</td><td>HN-3</td><td></td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Sinopharm Kimyasal Reaktif</td><td>XW00500221</td><td></td></tr><tr><td>Elektrikli termostatik su banyosu</td><td>senxin17</td><td>DK-S28</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sinopharm Kimyasal Reaktif</td><td>80176961</td><td>%75</td></tr> <tr><td>Fibroblast Büyüme Faktörü (FGF</td><td>)PEPROTECH</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Floresan mikroskop</td><td>Leica DMI3000B</td><td>DMI3000B</td><td></td></tr><tr><td>Garamisin</td><td>Sinopharm Kimyasal Reaktif</td><td>XW14054101</td><td></td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>Sinopharm Kimyasal Reaktif</td><td>63005518</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst33258 Boyama çözeltisi</td><td>Beyotime</td><td>C1017</td><td></td></tr><tr><td>İnsülin</td><td>Sinopharm Kimyasal Reaktif</td><td></td><td></td>XW1106168001</tr><tr><td>İnsülin benzeri Büyüme Faktörü (IGF)</td><td>PEPROTECH</td><td>100-11</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sinopharm Kimyasal Reaktifi</td><td>10016308</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz'in L-15</td><td>Genomu</td><td>GNM41300</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamin (100 mg / mL)</td> <td>Genom</td><td>GNM-21051</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sinopharm Kimyasal Reaktif</td><td></td><td></td>XW77863031</tr><tr><td>Na2SO4</td> <td>Sinopharm Kimyasal Reaktif</td><td>10020518</td> NaCl Sinopharm Kimyasal Reaktif 10019308 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sinopharm Kimyasal Reaktif</td><td>10019718</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Solarbio</td><td>P1020</td><td>pH7.2-7.4</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Genomu</td><td></td><td></td>GNM15140</tr><tr><td>PH metre</td><td>Bante</td><td>A120</td><td></td></tr><tr><td>Taurin</td><td>SIGMA</td><td>T0625</td><td></td></tr><tr><td>VE</td><td>Seebio</td><td>185791</td><td></td></tr></tbody></table>

deniz hıyar bağırsak hücrelerinin birincil kültüründe apoptosis İndüksiyon uyupve tayini

Apoptosis Induction and Detection in a Primary Culture of Sea Cucumber Intestinal Cells

Birincil kültür hücreleri biyolojik maddelerin fonksiyonel değerlendirilmesi veya belirli biyolojik faaliyetlerin karakterizasyonu için son derece önemli araçlar olarak bilimsel disiplinlerde çeşitli kullanılır. Ancak, evrensel olarak uygulanabilir hücre kültürü medya ve protokollerin eksikliği nedeniyle, deniz canlıları için iyi tanımlanmış hücre kültürü yöntemleri hala sınırlıdır. Bu arada, deniz omurgasız hücrelerinin yaygın olarak meydana gelen mikrobiyal kontaminasyon ve politropik özellikleri deniz omurgasızlar için etkili bir hücre kültürü stratejisinin kurulmasını engeller. Burada, deniz hıyarı Apostichopus japonicusbağırsak hücrelerini culturing için kolay bir yöntem işlemek için açıklar; ayrıca, birincil kültürbağırsak hücrelerinde in vitro apoptosis indüksiyon ve saptama bir örnek sağlar. Ayrıca, bu deneme uygun kültür orta ve hücre toplama yöntemi hakkında ayrıntılı bilgi sağlar. Açıklanan protokol, Echinodermata, Mollusca ve Crustacea gibi deniz organizmalarından alınan çeşitli yaygın doku örnekleri ile uyumludur ve birden fazla in vitro deneysel uygulama için yeterli hücre sağlayabilir. Bu teknik, araştırmacıların deniz omurgasızlarından birincil hücre kültürlerini verimli bir şekilde manipüle etmelerini ve hücreler üzerindeki hedeflenen biyolojik maddelerin işlevsel değerlendirmesini kolaylaştırmasını sağlayacaktır.

Burada A. japonicus'un birincil bağırsak hücre kültürünü kurduk ve hücreleri geçişyaptık. Şekil 1, farklı evrelerde yuvarlak hücreleri göstermektedir. Ve EdU boyama tahlilleri daha sonraki aşamada bu yuvarlak hücrelerin proliferatif aktivitesini ortaya çıkarmak için doğrudan kanıtlar sağlar (Şekil 2). Ayrıca protokolü biraz ayarladık, filtratedilmiş hücreler yerine kıymalı doku bloklarını kuşattık; ayrıca, bir mil hücre tipi başarıyla kültürlenebilir. B...

Bu protokol deniz hıyarı Apostichopus japonicus bağırsak hücreleri kültür için kolay bir yöntem sağlar ve Echinodermata, Mollusca ve Crustacea gibi deniz organizmalarından yaygın olarak kullanılabilir doku örnekleri çeşitli ile uyumludur.

Deniz Hıyar Bağırsak Hücrelerinin Birincil Kültüründe Apoptosis İndüksiyon uyupve tayini

Primary cultured cells are used in a variety of scientific disciplines as exceptionally important tools for the functional evaluation of biological ...

Protokol deniz omurgasızlar için kullanımı kolay ve yaygın olarak uyumlu birincil hücre kültürü yöntemi sağlar. Bu teknik araştırmacılarnispeten uzun süre deniz omurgasız hücreleri kültür için bir yol verir. Deniz biyolojisi araştırmalarında farklı biyolojik deneysel uygulamalar için tutarlı genetik arka plan ile hücre kültürü sağlanmalıdır.Bu alandaki yeni araştırmalara göre, belirtilen basitleştirilmiş protokolün egzersiz yapmak için iyi bir seçim olması gerektiğine inanıyoruz. Anesteziden sonra ön bağırsakları inceleyin ve toplayın, ardından doku örneklerini dikey olarak kesip iç içeriğini çıkarın. Doku örneklerini PBS'de iki kez yıkayın ve %75 etanol çözeltisi içinde iki saniyeden fazla bir sürede batırarak dezenfekte edin.Daha sonra etanol kaldırmak için PBS doku örnekleri üç kez yıkayın ve iki mililitre steril mikro santrifüj tüp içine doku örneği yaklaşık 100 miligram aktarın. Deniz hıyar bağırsak dokusu bloğuna önceden optimize edilmiş kültür ortamının 1,5 mililitresini ekleyin ve çözelti bulutlu olana kadar sterilcerrahi makasla bloğu doğrama. % 0.25 tripsin 400 mikrolitre ekleyin.Inversion tarafından çözelti karıştırın ve oda sıcaklığında beş dakika kuluçka. Daha sonra 10

apoptosis-induction-detection-primary-culture-sea-cucumber-intestinal

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz fare embriyolarının programlanmış hücre ölümü bölgeleri (PCD) ve LysoTracker adlı oldukça çözünür boya kullanarak embriyonik kök (ES) hücre kültürleri ayırt görselleştirmek için basit bir protokol mevcut.

Embriyolar yılında Programlı Hücre Ölümü Algılama LysoTracker kullanımı ve Embriyonik Kök Hücreler Farklılaşan

Bazı genetik bozulmalar veya toksinlere maruz kalma, belirli hücre tiplerinin ölümüne yol açan normal gelişimsel süreçleri bozabilir. Zebra balığı embriyolarında tam montajlı immünofloresan ile aktive edilmiş Kaspaz 3'ün analizi, spesifik olarak apoptoz geçiren hücrelerin evre ve dokuya özgü lokalizasyonunu ortaya koymaktadır.

Aktif Kaspaz 3 Algılama Tüm montaj immünofloresans tarafından Zebra balığı Embriyolar Apaptozun Analizi

Anastaz terimi, ölmekte olan hücrelerin geç bir aşamada hücre intihar sürecini tersine çevirdiği, kendilerini onardığı ve nihayetinde hayatta kaldığı fenomeni ifade eder. Burada, anastaz geçiren hücreleri tespit etmek ve izlemek için protokoller gösteriyoruz.

Takip inişi, Apoptosisi tersine Cep Survival Fenomeni için Stratejiler

Burada, bitişik ölü veya ölmekte olan hücrelerle fiziksel etkileşim yoluyla canlı hücrelerde indüklenen hücre içi sinyal olaylarının belirlenmesi için bir protokol sunuyoruz. Protokol, fagositik alımlarının veya çözünür aracıların salınmasının aksine, ölü hücrelerin reseptör aracılı tanınmasıyla indüklenen sinyal olaylarına odaklanır.

Hücre içi Komşu maruz kalan hücreler, apoptotik hücre ölümü ile etkileşim yoluyla canlı hücreler İndüklenen sinyal olaylarının tanımlanması

Efferocytosis, apoptotik hücreler, fagositik kaldırılması homeostazı korumak için gerekli ve reseptörleri ve tanıma, engulfment ve apoptotik hücreler içselleştirilmesi için izin sinyal yollar tarafından yönetilir. Burada, biz efferocytosis miktar ve efferocytic sinyal yolları etkinlik için bir floresans mikroskobu Protokolü mevcut.

Efferocytosis tek hücreli floresans mikroskobu tarafından miktar

Akış Sitometresi veya diferansiyel Santrifüjü kullanarak bir iş akışı tespit etmek, ölçmek ve apoptotik vücutlarından apoptotik örneği yüksek saflıkta yalıtmak için geliştirilmiştir.

Algılama ve yalıtım için yüksek saflıkta apoptotik organlarının

Biz burada pre-harekete geçirmek CD8 sitotoksisite araştırmak için bir protokol tarif+ T hücreleri kanser hücrelerine karşı apoptotik kanser hücreleri aracılığıyla gerçek zamanlı mikroskobu tespit ederek. Bu protokol mekanizmaları myeloid hücre kaynaklı T hücre bastırma arkasında araştırmak ve T hücreleri ile abluka bağışıklık baskılayıcı myeloid hücre yenileyici amaçlı bileşikler değerlendirmek.

Gerçek zamanlı hafiye-in Vitro tümör hücre Apoptosis içinde CD8 tarafından indüklenen+ T hücreleri Myeloid hücrelerin tümör infiltre bağışıklık baskılayıcı işlevlerini çalışmaya

Burada, apoptotik tirositler ve periton makrofajlar hazırlamak ve effersitoz verimliliğini ve apoptotik tirositlerin özel inhibitörü-aracılı engellemesini analiz etmek için bir protokol sunuyoruz. Bu protokol yapay boncuk ve bakteri dahil olmak üzere diğer parçacıklar hücre aracılı boşluk geniş bir uygulama vardır.

Makrofajlar tarafından apoptotik thymocyte engulfment deneysel Analizi

Sunulan protokol, kültürlü fare enteroidlerinde çoğalan ve ölü hücrelerin sayısını ölçmek için akış sitometrisini kullanır. Bu yöntem, ilaç tedavisinin organoid proliferasyon ve sağkalım üzerindeki etkilerini değerlendirmek için yararlıdır.

Enteroidlerde Proliferatif ve Ölü Hücrelerin Sayısallaştırılması

Bu protokol, apikal yüzeye erişime izin veren, ters polariteye sahip ince bağırsak enteroidlerini kullanan apikal-dışarı nekrotizan enterokolit (NEC) bir çanak içi modelini tanımlar. NEC ile ilişkili epitel bozulmasını tespit etmek için bir immünofloresan boyama protokolü ve NEC-in-a-dish protokolüne tabi tutulan apikal-out enteroidlerin yaşayabilirliğini belirlemek için bir yöntem sunuyoruz.

İn Vitro Nekrotizan Enterokolitin Apikal-Out Enteroid Modeli

Bu protokol, sitokinler gibi sitotoksik pertürbagenlere yanıt olarak insan kolonik organoidlerinde hücre ölümünü araştırmak ve ölçmek için basit ve uygun maliyetli bir yöntemi tanımlar. Yaklaşım, sitotoksik uyaranlara tek organoid tepkileri ölçmek için bir floresan hücre ölüm boyası (SYTOX Yeşil Nükleik Asit Boyası), canlı floresan mikroskobu ve açık kaynaklı görüntü analiz yazılımı kullanır.

Canlı Floresan Mikroskobu Kullanılarak İnsan Kolonik Organoidlerinde Sitokin ile İndüklenen Hücre Ölümünün Miktar Tayini

Öğrenin, deniz hıyarı Apostichopus japonicus bağırsak hücrelerinin birincil kültür protokolünü. Bu yöntem, deniz omurgasızları için uzun süreli hücre kültürü sağlar ve deniz biyolojisi araştırmalarında tutarlı genetik arka plan sunar.

Deniz Hıyar Bağırsak Hücrelerinin Birincil Kültüründe Apoptosis İndüksiyon uyupve tayini

Daha fazla video keşfet