Name: Koroner Anjiyogenezin In Vitro Modeli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Öğrenin, fare embriyo kalp dokularından sinus venosus ve endokard eksplant kültürleri kullanarak koroner anjiyogenezi in vitro modellemeyi. VEGF-A yanıtlarını ve endotelyal hücre göçünü inceleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar destekleyici bir araştırma ortamı sağlamak için Sharma laboratuvar üyelerine teşekkür ederiz. Fare kolonimizi koruyan ve önemseyen Diane (Dee) R. Hoffman'a özel teşekkürlerimizi sunmayı seviyoruz. Ayrıca Dr. Philip J. Smaldino ve Carolyn Vann'a el yazmasının iyice kanıtlanması ve yararlı yorumlar da sunulması için teşekkür ederiz. Bu çalışma Ball State Üniversitesi Provost Office ve Biyoloji Bölümü B.S, Indiana Academy of Sciences Senior Research Grant fonları B.S ve NIH (RO1-HL128503) ve New York Kök Hücre Vakfı fonlarından K.R.'ye kadar desteklenmiştir.

Bu protokoldeki tüm hayvanların kullanımı Ball State University Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) yönergelerine uymaktadır.
1. Fare Yetiştiricileri Kurulması ve Zamanlanmış Gebelikler için Vajinal Fişler Tespit
<ol><li>Yabani tip erkek ve dişi fareler ile bir fare üreme kafesi kurmak. Üreme farelerinin yaşının 6-8 hafta arasında olduğundan emin olun. Üremeiçin bir çift (1 erkek ve 1 kadın) veya üçlü (1 erkek ve 2 kadın) ayarlayın.</li>
	<li>Ertesi sabah vajinal fiş olup yok. Vajinal açılış içine takarak derin bir fiş tespit etmek için açılı bir metal prob kullanın. Pozitif vajinal fişin sabahını embriyonik gün 0.5 (e0.5) olarak belirleyin. NOT: Vajinal fiş yüzeysel (kolayca görülebilir, bkz. Şekil 1)veya derin (kolayca görülemez) olabilir. Derin bir fişin varlığı probun tam olarak eklenmesini engellerken, bir fişin yokluğu direnç olmadan tam takılmaya olanak sağlar.</li>
	<li>Embriyolar hasat edilecekleri e11.5'e ulaşana kadar zamanlanmış gebeliği koruyun. Embriyo ları hasat etmeden önce gebeliği doğrulamak için dişi farelerin ağırlığını e7.5 ve e11.5 arasında kaydedin. NOT: Annenin kilosundaki günlük artış başarılı bir gebeliğe işaret ederken, kiloda herhangi bir değişiklik başarısız bir gebeliğe işaret eder.</li>
</ol>2. Hamile Farelerden Embriyo Toplama
NOT: Başlamadan önce aşağıdaki ekipman ve reaktiflere sahip olduğunuzdan emin olun: CO2 ötenazi odası, %70 etanol, kağıt havlu, düzenli forseps, ince forseps, makas, 1x steril fosfat tamponlu salin (PBS), 10 cm steril Petri yemekleri, buzlu konteyner, delikli kaşık, diseksiyon stereomikroskop.
<ol><li>Bir e11.5 hamile fareyi temiz bir CO2 ötenazi odasına yerleştirin. Farenin kaçmasını önlemek için odanın kapağını kapatın.</li>
	<li>Fare ötanazi odasında sabitledikten sonra CO2'yiaçın. IACUC önerileri başına CO2'nin akış hızını (yani dakikada %10-30 yer değiştirme) düzenlediğinden emin olun. Fare tamamen ötenazi olduktan sonra, ölümü sağlamak için servikal çıkığı gerçekleştirin.</li>
	<li>Sprey% 70 etanol ile fare. Forseps kullanarak karın üzerinde deri kaldırın, makas bir çift kullanarak küçük bir kesi yapmak ve yanal kesi uzatmak. Kesiyi diyaframa kadar anteriora kadar büyütün ve embriyoları içeren rahim boynuzunu ortaya çıkarın(Şekil 2).</li>
	<li>Embriyo dizisini (rahim boynuzu + embriyolar) rahmi kavrayarak ve serbest keserek çekin. Buz gibi steril 1x PBS embriyo dize yerleştirin.</li>
	<li>Rahim boynuzundaki embriyoları rahim boynuzundan, rahim kasını, sarısı kesesini ve amniyonu tek tek(Şekil 3A-F)stereomikroskop altında sökerek ayırın. Temizlenmiş embriyoları delikli bir kaşıkla buz üzerinde steril 1x PBS içeren petri kabına aktarın. Embriyoları soğuk tuttuğundan emin ol.</li>
</ol>3. E11.5 Embriyolardan Kalpleri Yalıtan
NOT: Başlamadan önce, aşağıdaki ekipman ve reaktiflere sahip olduğunuzdan emin olun: düzenli forsepsler, ince forsepsler, 1x steril PBS, 10 cm steril Petri kabı, 6 cm steril Petri kabı, buzlu konteyner, delikli kaşık, diseksiyon stereomikroskop.
<ol><li>Stereomikroskop altında buz gibi steril 1x PBS ile yeni bir Petri kabı kurun. Kalbi parçalamak için 2.5.</li>
	<li>Forceps kullanarak embriyo nun başını çıkarın. İlk olarak, bir eliyle forseps arasında baş sıkmak ve daha sonra kapalı forseps kullanarak diğer el ile kazıyarak baş kaldırmak(Şekil 4A-C).</li>
	<li>Başı çıkardıktan sonra, embriyoyu ventral tarafıyla tek eliyle karnında forsepslerle tutarak yönlendirin(Şekil 4D).</li>
	<li>Diğer taraftan, ilk ince forseps kullanarak diyafram biraz üzerinde göğüs küçük bir kesi yaparak embriyonun göğüs duvarını açın. Daha sonra, kapalı çerkesler takarak ve forceps açarak göğüs duvarı yırtılma tarafından çok dikkatli bir şekilde kesi büyütün. Kalbe zarar verebilir çok derin itme değil emin olun. Forceps yardımıyla, göğüs duvarı geniş göğüs boşluğunda kalp ve akciğerler ortaya çıkarmak için açık tutmak (Şekil 4E).</li>
	<li>İnce forceps kullanarak, kalbi hafifçe (90°) hareket ettirin ve dorsal aort/damarı ortaya çıkarın. Kalbin tabanındadorsal aort /ven yakalayarak kalbi/akciğerleri anteriora çekin(Şekil 4F-H). NOT: Kalbin dorsal tarafında bulunan SV,.</li>
	<li>Kan hücrelerini temizlemek için soğuk 1x PBS ile kalp / akciğerleri durular.</li>
	<li>Kalan embriyolardan kalp/akciğerleri çıkarmak için 3.1-3.6 adımlarını tekrarlayın. İzole edilmiş kalp/akciğerleri buzda tuttuğundan emin olun.</li>
</ol>4. E11.5 Embriyonik Fare Kalplerinden SV ve Ventriküllerin İzine
<ol><li>SV'leri ve tüm ventrikülleri izole etmek için Petri kabını 3.7. İnce forceps kullanarak akciğerlerin bağlı loblarını kökünden tektek sök.</li>
	<li>Onun dorsal tarafında kalp Orient ve SV yırtılma olmadan anteriorly SV çevreleyen atria ve bitişik doku kaldırın. Tabanında tutarak ve ince forseps kullanarak kazıyarak kalpten sol ve sağ atria çıkarın(Şekil 5B). Benzer bir teknikle SV'yi çevreleyen bitişik dokuyu çıkarın(Şekil 5C). NOT: Sağ atriyumun SV'ye bağlı olduğunu unutmayın, bu nedenle sadece atriyumu çıkarmaya dikkat edin.</li>
	<li>SV izole etmek için, ilk sırt tarafı yukarı bakan kalp yönlendirmek (SV sırt tarafında olduğu için) ve yavaşça forseps ile ventriküllerde kalp tutarak bu pozisyonda kalbi tutmak. NOT: SV kalbin dorsal tarafında atria arasında yatan bir embriyonik kalp bir giriş organıdır.</li>
	<li>SV'yi bağlı olduğu kalpten dikkatlice soyarak veya SV'yi ince çerkeslerle ekinin tabanında tutarak ve kapalı çişlerle kazıyarak çıkarın(Şekil 5D,E).</li>
	<li>İzole Edilmiş SV'yi steril transfer pipetiyle buz üzerinde buz gibi steril 1x PBS içeren yeni bir 6 cm Petri kabına aktarın ve Petri kabını SV olarak etiketlendirin.</li>
	<li>Tüm ventrikülleri izole etmek için, SV çıkarıldıktan sonra kalpten çıkış yolu (aort ve pulmoner gövde) çıkarın(Şekil 5F,G).</li>
	<li>Steril transfer pipeti kullanarak buz üzerinde steril 1x PBS içeren yeni bir 6 cm Petri kabına tüm ventrikülleri aktarın ve Petri kabını ventrikül olarak etiketlendirin. İzole SV ve ventrikülleri buzüzerinde tutun.</li>
	<li>Kalan kalplerden SV ve ventrikülleri izole etmek için 4.1-4.7 adımlarını tekrarlayın.</li>
</ol>5. Ekler ve Ekstrasellüler Matris Kaplama ile Doku Kültürü Plakaları Kurma
NOT: Başlamadan önce, aşağıdaki ekipman ve reaktiflere sahip olduğunuzdan emin olun: ticari hücre dışı matris çözeltisi (ECM; örneğin, Matrigel), 8,0 μM polietilen tereftalat (PET) kültür ekler, 24 kuyu plakası, 37 °C, %5 CO2 kuluçka makinesi.
<ol><li>ECM çözeltisinin buzüzerinde erimesine izin verin. Katılaşmayı önlemek için ECM çözeltisini buzüzerinde tutun.</li>
	<li>PET membran kültür kesici uçlarını (gözenek boyutu = 8,0 μm, filtrasyon alanı = 0,3 cm2, filtre çapı = 6,5 mm) doku dışı kültürün 24 kuyu plakasının kuyularına yerleştirin. Plakaları sırasıyla SV veya endokardiyal anjiyogenez tahlilleri için SV veya ventrikül olarak etiketlayın. NOT: Her iki kültürü aynı anda gerçekleştirirken uçları SV ve ventriküller için ayrı plakalar halinde ayarlayın. Tüm deneysel numuneler ve kontroller için yeterli kuyu lar kurduğunuzdan emin olun.</li>
	<li>ECM çözeltisi çözüldükten sonra, önceden soğutulmuş bazal ortamda (ebm-2 bazal ortamda ECM 1:2) yeterli hacimde (100 μL/insert x uç sayısı)hemen seyreltin. NOT: Örneğin, altı kesici uç varsa, toplam hacim 100 μL x 6 = 600 μL olacaktır.</li>
	<li>100 μL taze seyreltilmiş ECM ile uçları doğrudan membranın üzerine ekleyerek katlandı. ECM'nin katılaşabilmesi için plakayı en az 30 dakika 37 °C'de kuluçkaya yatırın. NOT: Kontaminasyonu önlemek için laminar akış dokusu kültürü başlığı altında yapılmalıdır.</li>
</ol>6. SVs ve Tüm Ventrikül Kültürleri
NOT: Başlamadan önce, aşağıdaki ekipman ve reaktifler olduğundan emin olun: 70% etanol, transfer pipet, stereomikroskop, forceps, laminar akış doku kültür başlık, mikrovasküler endotel hücre takviyesi kiti (Malzeme Tablosu), bazal orta, 1x steril PBS. Şekil 6, SV ve ventrikül kültürünün iş akışını göstermektedir.
<ol><li>Buz üzerinde ek kiti içeriğini eritin. Sertifikalı bir laminar akış doku kültürü başlık altında bazal orta 500 mL içine ek kiti tüm içeriğini ekleyerek tam orta hazırlayın. Orta iyi karıştırın ve 50 mL aliquots içine dağıtın.</li>
	<li>Stereomikroskop tabanını ve çevresindeki çalışma alanını %70 etanol ile sterilize edin.</li>
	<li>5.4. adımdan doku kültürü plakalarını alın. Bir transfer pipet iyardımıyla, eksersekleri kesici uç zarının üzerine dikkatlice 4.7 adıma aktarın. Stereomikroskop altında ve temiz çerseps yardımıyla, eklerin köşesine sıkışmadığından veya yan duvarlara bağlı kalmadığından emin olmak için eksekleri kesici uçların ortasına yerleştirin.</li>
	<li>Ekseler yerleştirilen ve ekler inorta edildikten sonra, kesici uçlardan ekstra PBS'leri dikkatlice çıkarın ve plakaların kapaklarını kapatın.</li>
	<li>Laminar akış dokusu kültür başlığı altında, uçların üzerine önceden ısıtılmış komple ortamın 100 μL'sini ekleyin ve 200°L'lik kısmı kuyulara ekleyerek hava-sıvı arabirimindeki ekskbitkileri kültüre sokarak, kesici uçtaki bazal yüzeyin orta ile temas halinde olduğunu , ama üst yüzeyi havaya maruz kalır. NOT: Farklı boyut uçları/kuyu plakaları kullanıyorsanız, hava-sıvı arabirimi elde etmek için ses seviyesini ayarladıktan emin olun.</li>
	<li>24 kuyu plakasının kullanılmayan kuyularına 300 μL PBS ekleyin ve kapakla kaplayın. Plakayı 37 °C, %5 CO2 kuluçka makinesinde kuluçkaya yatırın ve kültürleri 5 gün boyunca büyütün.</li>
	<li>İlerleyen günlerde, eksplant kültürlerinin durumunu değerlendirmek için ters ışık mikroskobu altında kültürleri rutin olarak gözlemleyin. Eksplants kontraktil dayak sergilemek ve tüm ekstesyenler ECM ile gömülü membran ın altına bağlı olduğundan emin olun. Yüzen eksplants dikkat edin. NOT: Ekstremitelerin periyodik olarak daralması canlı olduklarını gösterir. Kayan eksponisler analizden çıkarılmalıdır.</li>
	<li>Kültür durumunu değerlendirdikten sonra kültür plakasını tekrar kuvöze koyun ve kültürü 5 güne kadar büyütmeye devam edin.</li>
</ol>7. VEGF-A (Pozitif Kontrol) ile Kültürlerin Tedavisi
NOT: Başlamadan önce, aşağıdaki ekipman ve reaktifler olduğundan emin olun: laminar akış doku kültür başlık, 1x PBS, bazal orta + 1% fetal büyükbaş serum (FBS), bazal orta + VEGF-A, pipetler ve pipet ipuçları.
<ol><li>Bazal orta + 1% FBS ve bazal orta + VEGF-A hazırlayın.<ol>
<li>Bazal orta + 1% FBS hazırlamak için, ilk kontrol kuyuları gerekli sayısını belirleyin. Örneğin, üç kontrol kuyusu varsa, 300 μL/well x 3 = 900 μL gereken toplam hacimdir. Bazal orta +% 1 FBS yapmak için bazal orta 891 μL içine FBS 9 μL ekleyin.</li>
		<li>Bazal orta + VEGF-A hazırlamak için öncelikle VEGF-A ortamına ihtiyaç duyan toplam kuyu sayısını belirleyin. Üç kuyu varsa, 300 μL/iyi x 3 = 900 μL toplam hacim dir ve 50 ng/iyi x 3 = 150 ng VEGF-A'dır. Bazal orta + VEGF-A yapmak için bazal orta 900 μL içine VEGF-A 150 ng ekleyin. NOT: Bu çözümü, her deneme için yeterli sayıda daha küçük aliquots sigortalamak için hesaplanandan daha büyük bir hacimde birleştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>2. gün, ortamı her iki odadan (ekler ve kuyular) çıkarın. Uçlara 100 μL ve kuyulara 200 μL ekleyerek 300 μL 1x PBS ile kültürleri yıkayın. Sıkıca plakaları birkaç kez girdap ve PBS kaldırın.</li>
	<li>Kültürleri 24 saat aç kalmak için 300 μL bazal ortam + %1 FBS (kesici uç içine 100 μL ve kuyulara 200°L) ekleyin.</li>
	<li>3. gün, açlıktan sonra, kontrol kuyularına ve bazal ortama (50 ng/well) sırasıyla 300°L bazal orta + %1 FBS (kesici uç içine 100°L ve kuyulara 200°L) ekleyin.</li>
	<li>Tedaviden sonra, kuvözdeki kültürleri büyütmeye devam edin.</li>
</ol>8. Fiksasyon ve İmmünBoyama
NOT: Başlamadan önce, aşağıdaki ekipman ve reaktiflere sahip olduğunuzdan emin olun: %4 paraformaldehit (PFA), 1x PBS, primer ve sekonder antikorlar, sarsıcı, PBS'de (PBT) %0.5 niyonik yüzey aktif madde.
<ol><li>Culturing altıncı gününde, oda sıcaklığında 1x PBS (RT) ile orta ve yıkama kültürleri çıkarın.<ol>
<li>Kuyulara %4 PFA çözeltisi ve kesici uçlara 100°L ekleyerek kültürleri düzeltin. 4 °C'de 20 dk sallarken kültürleri düzeltin.</li>
		<li>20 dk fiksasyondan sonra, duman kaputundaki kültürlerden PFA'yı çıkarın ve kuyulara 200 μL ve kesici uçlara 100°L ekleyerek kültürleri 1x PBS ile yıkayın.</li>
		<li>Tekrar yıkama 3x, 10 dk her, sallanan iken. Sonra immünboyama gerçekleştirmek için devam edin. NOT: Tüm yıkama adımları RT'deki bir tezgah üzerinde gerçekleştirilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bloklama çözeltisinde primer antikorları (anti-VE-Kadherin, anti-ERG 1/2/3) seyreltin (%5 eşek serumu, %0.5 PBT). 300 μL primer antikor çözeltisi (alt kuyularda 200 μL ve kesici uçlara 100°L) ekleyin. Sallanan sırasında 4 °C'de bir gecede primer antikorlarda kuluçka kültürleri. NOT: Anti-VE-Kadherin endotel hücre zarını etiketlemek için kullanılır ve anti-ERG 1/2/3 endotel hücrelerinin anjiyojen filizlerini görselleştirmek için endotel hücre çekirdeğini etiketlemek için kullanılır.</li>
	<li>Ertesi gün, yıkama ve% 0.5 PBT 10x kültür plakaları kaya, Her 10 dakika PBT değiştirerek.</li>
	<li>İkincil antikorları (eşek anti-sıçan Alexa Fluor 488 ve eşek anti-tavşan Alexa Fluor 555) engelleme çözeltisi seyreltin. Adım 8.2'deki gibi sekonder antikordan 300 μL ekleyin ve sallanan sırasında kültürleri bir gecede 4 °C'de kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, ikincil antikorları 10x'i PBT'de yıkayın ve her 10 dakikada bir PBT'yi değiştirin. NOT: En az 10x yıkayın ama daha fazla yıkayın daha iyidir. Yıkıntılar tamamlandıktan sonra, kültürler slaytlara monte edilene kadar 1x PBS ile saklanabilir.</li>
</ol>9. Kültürlerin Slaytlara Monte Edilmesi, Görüntüleme ve Analiz
NOT: Başlamadan önce, aşağıdaki ekipman ve reaktifler olduğundan emin olun: ince çiller, slaytlar, 4', 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI), coverslips ve konfokal mikroskop ile montaj orta. Sekonder antikor boyama sonra, aşağıdaki adımları kullanarak görüntüleme için slaytlar üzerine kültürleri monte.
<ol><li>İnce pratisyen ler kullanarak kesici uçtan membranı dikkatlice soyun ve membran tarafını aşağı koyup eksplant kültürlerini yukarı doğru yerleştirerek slaytlara aktarın. Çoğaltma örneklerini aynı slaytlara yerleştirin ve slaytları denetim veya VEGF-A olarak etiketleyin. DAPI ile birkaç damla montaj ortamını doğrudan membranın üzerine ekleyin ve slaytları kapak fişleri ile kapatın. NOT: Kapakları yerleştirirken hava kabarcıklarından kaçındıktan emin olun.</li>
	<li>Açık oje ile slaytların kenarlarını kapatın ve kurumasını bekleyin. NOT: Slaytlar uzun süreli depolama için -20 °C'de saklanabilir.</li>
	<li>Konfokal mikroskop kullanarak görüntü kaydırıyor.</li>
	<li>Anjiyojenik büyümenin uzunluğunu ölçmek için analiz yapın. Ventrikül kültürlerindeki ERG 1/2/3+ hücrelerinin iç sınırından ve SV kültürlerindeki SV ekbitkilerinin merkezinden genişletilmiş endotel hücrelerinin (Ve-Kadherin+/ERG 1/2/3+) uzaklıklarını ölçerek anjiyojenik büyüme uzunluğunu ölçün.<ol>
<li>FIJI/ImageJ kullanarak niceliklendirme gerçekleştirmek için önce FIJI yazılımLarını indirin.</li>
		<li>FIJI'de resim dosyalarını açın: Dosyaya git | Aç | Klasör | Dosya Adı | Aç.</li>
		<li>Analize Git | Ölçümleri Ayarla | Çevre'yi seçin.</li>
		<li>Ana pencereden Düz Çizgi aracını seçin.</li>
		<li>Adım 9.4'te önerildiği gibi bir filizin uzunluğu boyunca bir çizgi çizin.</li>
		<li>Analize Git | Ölçün. NOT: Uzunluk ölçümleri yeni pencerede görüntülenir.</li>
		<li>Rasgele seçilen en az üç görüş alanını temsil eden görüntülerde nicelik lendirme gerçekleştirin. Filiz uzunluğu ölçümlerini ortalaman ve ortalama ± standart sapma olarak bildirin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Red-Horse, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+arteries+form+by+developmental+reprogramming+of+venous+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells.</a> Nature. 464 (7288), 549-553 (2010).</li>
<li>Chen, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sinus+venosus+contributes+to+coronary+vasculature+through+VEGFC-stimulated+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The sinus venosus contributes to coronary vasculature through VEGFC-stimulated angiogenesis.</a> Development. 141 (23), 4500-4512 (2014).</li>
<li>Volz, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+are+progenitors+for+coronary+artery+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Pericytes are progenitors for coronary artery smooth muscle.</a> Elife. 4, (2015).</li>
<li>Chen, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF-C+and+aortic+cardiomyocytes+guide+coronary+artery+stem+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">VEGF-C and aortic cardiomyocytes guide coronary artery stem development.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (11), 4899-4914 (2014).</li>
<li>Chang, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DACH1+stimulates+shear+stress-guided+endothelial+cell+migration+and+coronary+artery+growth+through+the+CXCL12-CXCR4+signaling+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">DACH1 stimulates shear stress-guided endothelial cell migration and coronary artery growth through the CXCL12-CXCR4 signaling axis.</a> Genes and Development. , (2017).</li>
<li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subepicardial+endothelial+cells+invade+the+embryonic+ventricle+wall+to+form+coronary+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Subepicardial endothelial cells invade the embryonic ventricle wall to form coronary arteries.</a> Cell Research. 23 (9), 1075-1090 (2013).</li>
<li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocardial+Cells+Form+the+Coronary+Arteries+by+Angiogenesis+through+Myocardial-Endocardial+VEGF+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Endocardial Cells Form the Coronary Arteries by Angiogenesis through Myocardial-Endocardial VEGF Signaling.</a> Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).</li>
<li>Katz, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+compartments+of+the+proepicardial+organ+give+rise+to+coronary+vascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct compartments of the proepicardial organ give rise to coronary vascular endothelial cells.</a> Developmental Cell. 22 (3), 639-650 (2012).</li>
<li>Das, S., Red-Horse, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+plasticity+in+cardiovascular+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Cellular plasticity in cardiovascular development and disease.</a> Developmental Dynamics. 246 (4), 328-335 (2017).</li>
<li>Sharma, B., Chang, A., Red-Horse, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+Artery+Development%3A+Progenitor+Cells+and+Differentiation+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Coronary Artery Development: Progenitor Cells and Differentiation Pathways.</a> Annual Review of Physiology. 79, 1-19 (2017).</li>
<li>Tian, X., Pu, W. T., Zhou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+origin+and+developmental+program+of+coronary+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Cellular origin and developmental program of coronary angiogenesis.</a> Circulation Research. 116 (3), 515-530 (2015).</li>
<li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocardial+cells+form+the+coronary+arteries+by+angiogenesis+through+myocardial-endocardial+VEGF+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling.</a> Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).</li>
<li>Gerhardt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF+guides+angiogenic+sprouting+utilizing+endothelial+tip+cell+filopodia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">VEGF guides angiogenic sprouting utilizing endothelial tip cell filopodia.</a> Journal of Cell Biology. 161 (6), 1163-1177 (2003).</li>
<li>Ruhrberg, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+restricted+patterning+cues+provided+by+heparin-binding+VEGF-A+control+blood+vessel+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Spatially restricted patterning cues provided by heparin-binding VEGF-A control blood vessel branching morphogenesis.</a> Genes and Development. 16 (20), 2684-2698 (2002).</li>
<li>Kikuchi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+antiangiogenic+isoform+of+VEGF-A+contributes+to+impaired+vascularization+in+peripheral+artery+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">An antiangiogenic isoform of VEGF-A contributes to impaired vascularization in peripheral artery disease.</a> Nature Medicine. 20 (12), 1464-1471 (2002).</li>
<li>Folkman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+tumor+factor+responsible+for+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Isolation of a tumor factor responsible for angiogenesis.</a> Journal of Experimental Medicine. 133 (2), 275-288 (1971).</li>
<li>Ferrara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+VEGF+in+the+regulation+of+physiological+and+pathological+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Experientia+Supplementum%22%5BJournal%5D)">The role of VEGF in the regulation of physiological and pathological angiogenesis.</a> Experientia Supplementum. (94), 209-231 (2005).</li>
<li>Ferrara, N., Bunting, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+endothelial+growth+factor%2C+a+specific+regulator+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Nephrology+and+Hypertension%22%5BJournal%5D)">Vascular endothelial growth factor, a specific regulator of angiogenesis.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 5 (1), 35-44 (1996).</li>
<li>Sharma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+Progenitor+Cells+Compensate+to+Rebuild+the+Coronary+Vasculature+in+Elabela-+and+Apj-Deficient+Hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Alternative Progenitor Cells Compensate to Rebuild the Coronary Vasculature in Elabela- and Apj-Deficient Hearts.</a> Developmental Cell. 42 (6), 655-666 (2017).</li>
<li>Rhee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+deletion+of+Ino80+disrupts+coronary+angiogenesis+and+causes+congenital+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Endothelial deletion of Ino80 disrupts coronary angiogenesis and causes congenital heart disease.</a> Nature Communications. 9 (1), 368(2018).</li>
</ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan etmezler.

SV ve Endo ata dokularından başarılı bir şekilde büyüyen koroner damarlar için en kritik adımlardan bazıları şunlardır: 1) SV kültürü için SV dokusunun doğru tanımlanması ve izole edilmesi; 2) doğru Endo kültürü için e11−11.5 yaşları arasında embriyolardan ventriküller kullanarak; 3) diseksiyon süresi boyunca steril koşulları korumak ve dokuları her zaman soğuk tutmak; ve 4) ortamda yüzen doku önlemek için ECM kaplı membran bağlı eksplants tutmak.
İlk olarak, SV dokusunun izolasyon zor olabili...

Kalbin kan damarları genellikle koroner damarlar denir. Bu damarlar arterler oluşur, damarlar, ve kılcal damarlar. Geliştirme sırasında, yüksek dallı kılcal damarlar ilk kurulur, daha sonra koroner arterler ve damarlar içine remodel1,2,3,4,5. Bu ilk kılcal damarlar proepicardium bulunan endotel progenitor hücreleri inşa edilmiştir, sinüs venöz (SV), ve endokardiyum (Endo) dokular1,6,7,8. SV embriyonik kalbin giriş organı dır ve Endo kalp lümen iç astar olduğunu. SV ve Endo bulunan endotel progenitor hücreleri koroner vaskülatür çoğunluğu oluşturmak, proepikardiyum bunun nispeten küçük bir kısmına katkıda ise2. Koroner damarların kılcal ağ önceden varolan öncü hücrelerinden kalpte büyümek hangi süreci koroner anjiyogenez denir. Koroner arter hastalığı dünya çapında önde gelen ölüm nedenlerinden biridir ve henüz bu hastalık için etkili bir tedavi eksiktir. Koroner anjiyogenezin ayrıntılı hücresel ve moleküler mekanizmalarını anlamak, hasarlı koroner arterleri onarmak ve yenilemek için yeni ve etkili tedavilerin tasarımında yararlı olabilir.
Son zamanlarda, koroner damarların nasıl geliştiğine olan anlayışımızda bir dalgalanma kısmen yeni araçlar ve teknolojilerin geliştirilmesi ile sağlanmıştır. Özellikle, in vivo soy etiketleme ve gelişmiş görüntüleme teknolojileri koroner damarların hücresel kökenli ve farklılaşma yollarını ortaya çıkarmak için çok yararlı olmuştur9,10,11,12. Bu in vivo araçlarının avantajlarına rağmen, hız, esneklik ve erişilebilirlik açısından sınırlamalar vardır. Bu nedenle, sağlam in vitro model sistemleri yüksek iş lenme li bir şekilde koroner anjiyogenezin hücresel ve moleküler mekanizmalarını açıklığa kavuşturmak için in vivo sistemleri tamamlayabilir.
Burada koroner anjiyogenezin in vitro modelini tanımlıyoruz. Biz iki ata dokuları, SV ve Endo koroner damarlar büyümek için bir in vitro ekplant kültür sistemi geliştirdik. Bu model ile, in vitro doku eksplant kültürleri büyüme ortamı tarafından uyarıldığında koroner damar filizi büyümek olduğunu göstermektedir. Ayrıca, eksplant kültürleri vasküler endotelyal büyüme faktörü A (VEGF-A), son derece güçlü bir anjiyojenik protein tarafından uyarıldığında kontrol ile karşılaştırıldığında hızla büyür. Ayrıca, SV kültüründen anjiyojenik filizlerin venöz defarkyasyona (COUP-TFII ekspresyonu kaybı), vivo1'dekiSV anjiyogenezine benzer bir mekanizmaya maruz kaldığımız saptandı. Bu veriler, in vitro explant kültür sisteminin in vivo'da meydana gelen anjiyojenik olayları sadakatle yeniden ortaya attığını göstermektedir. Burada açıklanan anjiyogenezin in vitro modelleri, koroner anjiyogenezin hücresel ve moleküler mekanizmalarını yüksek iş ve erişilebilir bir şekilde araştırmak için idealdir.

<table><tbody><tr><td>100 x 20 MM Doku Kültürü Kabı</td><td>Fisher Scientific</td><td>877222</td><td>Protokolde Petri kabı olarak anılır</td></tr><tr><td>24 oyuklu plakalar</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-51</td><td></td></tr><tr><td>8.0 uM PET membran kültürü ekleri</td><td>Millipore Sigma</td><td>MCEP24H48</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor Eşek tavşan karşıtı 555</td><td>Fisher Scientific</td><td>A31572</td><td>İkincil antikor</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Eşek anti-sıçan 488</td><td>Fisher Scientific</td><td>A21206</td><td>İkincil antikor</td></tr><tr><td>Açılı Metal Prob</td><td>Güzel bilim araçları</td><td>10088-15</td><td>Açılı 45 derece, derin tıkaçları tespit etmek için kullanılır</td></tr><tr><td>Anti-ERG 1/2/3 antikoru</td><td>Abcam</td><td>Ab92513</td><td>Birincil antikor</td></tr><tr><td>Anti-VE-Cadherin antikoru</td><td>Fisher Scientific</td><td>BDB550548</td><td>Birincil antikor, üretici BD BioSciences</td></tr><tr><td>CO2 gaz tankı</td><td>Çeşitli tedarikçiler</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>CO2 İnkübatör</td><td>Fisher Scientific</td><td>13998223</td><td>37 & deg için; C,% 5 CO2 inkübasyon</td></tr><tr><td>Diseksiyon stereomicrosope</td><td>Leica</td><td>S9i</td><td>Leica S9i Stereomikroskop</td></tr><tr><td>EBM-2 bazal medya</td><td>Lonza</td><td>CC-3156</td><td>Endotel hücre büyümesi bazal medya</td></tr><tr><td>ECM çözümü</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Ticari olarak Matrigel</td></tr><tr><td>EGM-2 MV Singlequots Kit</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td> <td>olarak bilinirMikrovasküler endotel hücre takviyesi kiti; Bu, EGM-2'yi eksiksiz hale getirmek için EBM-2'ye karıştırılır</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3007003IR</td><td></td></tr><tr><td>FiJi</td><td>NIH</td><td>NA</td><td>Görüntü işleme yazılımı (<a href="https://imagej.net/Fiji/Downloads" target="_blank">https://imagej.net/Fiji/Downloads</a>)</td></tr><tr><td>İnce Forseps</td><td>Güzel bilim araçları</td><td>11412-11</td><td>Embriyo için kullanılır diseksiyon</td></tr><tr><td>Fisherbrand Düz Bıçaklı çalıştırma makası</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-808-4</td><td></td></tr><tr><td>Hiklon Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (1X)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH-302-5601LR</td><td></td></tr><tr><td>Laminer akış doku kültürü başlığı</td><td>Fisher Scientific</td><td>çeşitli modeller mevcuttur</td><td></td></tr><tr><td>Orta Vektör</td><td>Laboratuvarları</td><td>H-1200</td><td>Vectashield DAPI ile</td> Montaj</tr><tr><td>Paraformaldehit (PFA)</td><td>Elektron Mikroskobu/Fisher</td><td>50-980-494</td><td>Bu %32'de mevcuttur; %4'e kadar seyreltilmesi gerekiyor</td></tr> <tr><td>Delikli kaşık</td><td>Güzel bilim araçları</td><td>10370-18</td><td>Bir çözeltiden embriyo / dokuların çıkarılmasında faydalıdır</td></tr><tr><td>Rekombinant Murin VEGF-A 165</td><td>PeproTech</td><td>450-32</td><td></td></tr><tr><td>Standart forseps, Dumont #5</td><td>Güzel bilim araçları</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>Sure-Seal Fare / Sıçan odası</td><td>Easysysteminc</td><td>EZ-1785</td><td>Ötenazi odası</td></tr></tbody></table>

koroner anjiyogenezin in vitro modeli

In Vitro Model of Coronary Angiogenesis

Burada, koroner anjiyogenezi incelemek için in vitro kültür analizini tanımlıyoruz. Koroner damarlar kalp kasını besler ve klinik öneme sahiptir. Bu damarlarda kusurları ateroskleroz gibi ciddi sağlık riskleri temsil, hangi hastalarda miyokard enfarktüsü ve kalp yetmezliğine yol açabilir. Sonuç olarak, koroner arter hastalığı dünya çapında önde gelen ölüm nedenlerinden biridir. Klinik önemine rağmen, hasarlı koroner arterlerin nasıl yenilenecekkonusunda nispeten az ilerleme kaydedilmiştir. Bununla birlikte, koroner damar gelişiminin hücresel kökeni ve farklılaşma yollarının anlaşılmasında son zamanlarda ilerleme kaydedilmiştir. Araştırmacıların flüoresanslı ata hücrelerini etiketlemelerine, kaderlerini takip etmelerine ve in vivo'da ataları görselleştirmelerine olanak tanıyan araç ve teknolojilerin ortaya çıkışı, koroner damar gelişimini anlamada etkili olmuştur. In vivo çalışmalar değerlidir, ancak deneysel tasarımda hız, erişilebilirlik ve esneklik açısından sınırlamalar vardır. Alternatif olarak, koroner anjiyogenezin in vitro modelleri bu sınırlamaları aşabilir ve araştırmacıların önemli biyolojik soruları hız ve esneklikle sorgulamalarına olanak sağlar. Uygun in vitro model sistemlerinin eksikliği koroner damar büyümesinin hücresel ve moleküler mekanizmalarının anlaşılmasında ilerlemeyi engellemiş olabilir. Burada, sinüs venöz (SV) ve endokardyum (Endo), koroner damarların çoğu ortaya çıkan iki ata dokularından koroner damarlar büyümek için bir in vitro kültür sistemi açıklar. Ayrıca kültürlerin bilinen in vivo mekanizmaların bazılarını doğru bir şekilde özetlediğini de doğruladık. Örneğin, SV'den gelen kültürdeki anjiyojenik filizlerin in vivo gözlenene benzer COUP-TFII ifadesini etkisiz kizlediğini gösteriyoruz. Buna ek olarak, vivo'da iyi bilinen bir anjiyojenik faktör olan VEGF-A'nın hem SV hem de Endo kültürlerinden anjiyogenezi sağlam bir şekilde uyardığını gösteriyoruz. Koroner anjiyogenezi incelemek için topluca doğru bir in vitro kültür modeli tasarladık.

In vivo SV anjiyogenezinin en çarpıcı özelliklerinden biri, belirli bir yolu izlemesi ve basmakalıp zamanlarda vekonumlardameydana gelen hücre defarklılaşması ve yeniden farklılaşma olaylarını izlemesidir 1 . İlk SV hücreleri kalp ventrikülüne doğru büyüdükçe COUP-TFII gibi venöz belirteçler üretmeyi bırakırlar (Şekil 7). Daha sonra, koroner filiz iki göç yolları almak, ya kalp yüzeyinde ya da miyokardinin derinliklerinde. Yüzey damarl...

Koroner anjiyogenezin in vitro modelleri koroner anjiyogenezin hücresel ve moleküler mekanizmalarının keşfinde kullanılabilir. Sinüs venöz ve endkard dokularının in vitro eksplant kültürleri VEGF-A'ya yanıt olarak sağlam bir büyüme gösterir ve in vivo olarak coup-TFII ekspresyonunun benzer bir modelini gösterir.

Koroner Anjiyogenezin In Vitro Modeli

Here, we describe an in vitro culture assay to study coronary angiogenesis. Coronary vessels feed the heart muscle and are of clinical importance. Defects ...

Protokolümüz önemli çünkü araştırmacıların bir organizmanın dışındaki koroner anjiyogenezin moleküler mekanizmasını araştırmalarına olanak sağlıyor. Bu tekniğin en büyük avantajı, bir organizmanın içindeki koroner anjiyogenez sürecini doğru bir şekilde modelleyerek koroner anjiyogenez mekanizmalarının incelenmesini kolaylaştırıyor olmasıdır. Embriyonik gün taşıyan hamile bir fare püskürtme ile başlayın 11.5 embriyolar ile 70%etanol.Forseps ile karın üzerinde deri kaldırma, rahim boynuzu ortaya çıkarmak için bir karın deri ve periton insizyonu yanal ve anteriora kadar diyafram yapmak için makas kullanın. Rahmi kavrayarak, dokuyu serbest bırakıp rahim boynuzunu çıkar. Bir stereo mikroskop altında buz gibi steril PBS içine embriyoların dize yerleştirin ve rahim kas soyma, sarısı kese, ve her embriyo amnion kapağı.Her embriyo izole olarak, buz üzerinde steril PBS içeren yeni bir Petri kabına dokuları aktarmak için delikli bir kaşık kullanın. Embriyonik kalp dokusunu hasat etmek için, mikroskop altında yeni bir Petri kabına kesilecek ilk embriyoyu transfer edin ve embriyoyu ventral tarafa yerleştirin. Göğüste küçük bir kesi yapmak için ince forceps kullanın, diyafram biraz üzerinde, ve kesi büyütmek için kesi içine kapalı çifekler ekleyin.Kalp ve akciğerleri ortaya çıkarmak için göğüs duvarını açık tutmak için forceps kullanarak, hafifçe dorsal aort ve damar ortaya çıkarmak için kalbi anteriorly 90 derece hareket etmek için ikinci bir çift forceps kullanın. Sonra, kalbin tabanında bu damarları kavrayarak, dikkatle kalp ve akciğerler ön lüzuni çekin ve soğuk PBS ile dokuları durulayın. Tüm kardiyak doku hasat edildiğinde, mikroskop altında kalp örnekleri yerleştirin ve her kalpten akciğer lobları kaldırın.Onun sırt tarafında ilk kalp Orient, ve tabanında kalp tutarak, kalpTen SV çevreleyen bitişik dokuda sol ve sağ atria kazımak için ince forseps kullanın. SV'yi izole etmek için, kalp dorsal tarafını yukarı doğru yönlendirin. SV'yi dikkatlice kalpten çıkarın ve izole edilmiş dokuyu buz üzerinde buz soğuk steril PBS içeren yeni bir altı santimetrelik Petri kabına yerleştirmek için steril bir transfer pipeti kullanın.Tüm ventrikülleri izole etmek için, çıkış yolu kaldırmak ve buz üzerinde buz soğuk steril PBS içeren ayrı bir altı santimetre Petri kabına ventriküller yerleştirmek için yeni bir steril transfer pipet kullanın. SV ve tüm ventrikül kültürleri kurmak için, ilk kat bir sekiz mikrometre gözenek PET kültür membranlar 24 iyi kültür plaka sıcağı başına, taze seyreltilmiş ekstrasellüler matriks 100 mikrolitre ile kültür başına en az 30 dakika 37 santigrat derece. Matris katılaşmış olduğunda, her kesici uç üzerine bir ekstrüzyon aktarmak için bir transfer pipet kullanın ve mikroskop altında plaka hareket ettirin.Temiz pratisyenler kullanarak, eksmeleri yan duvarlara bağlı olmadığından emin olmak için her kesici ucun ortasına yerleştirin ve ekstra PBS'yi dikkatlice çıkarın. Daha sonra, bir laminar akış doku kültür başlığı altında kapak kapalı plaka aktarın ve her eklemek için önceden ısıtılmış komple orta 100 mikrolitre ekleyin ve 200 mikrolitre her eklemek altında çok. Daha sonra kullanılmayan kuyulara 300 mikrolitre PBS ekleyin ve plakayı beş gün boyunca hücre kültürü kuluçka makinesine yerleştirin.Kültürün ikinci gününde VEGF-A tedavisi için, her kültürün her iki odasından orta çıkarın ve her eklemek için PBS 100 mikrolitre ekleyin ve her kuyuya 200 mikrolitre PBS. Plakabirkaç kez döndükten sonra, kültürleri başlatmak için% 1 fetal sığır serumu ile takviye bazal orta 300 mikrolitre ile PBS değiştirin, ve kuvöz plaka dönmek. Açlıktan sonraki üçüncü günde, kontrol kuyularına 300 mikrolitre taze bazal orta artı serum ekleyin ve bazal ortam ait 50 nanogramı ve vegf-A'nın mililitresi başına tedavi kuyularına ekleyin ve plakayı hücre kültürü kuluçka makinesine geri döndürün.Kültürün altıncı gününde, gösterildiği gibi PBS ile odaları yıkayın ve her kuyuda % 4 paraformaldehit 200 mikrolitre ve her kesici uçta 100 mikrolitre fiksatif ile kültürleri düzeltin. Sallanan 4 derece santigrat ile 20 dakika sonra, oda sıcaklığında sallanan yıkama başına 10 dakika pbs 300 mikrolitre ile kültürleri yıkayın. Son yıkamadan sonra, kuyulara 300 mikrolitre birincil antikor çözeltisi ekleyin ve sallanan dört santigrat derecede bir gecede kültür için ekler.Ertesi sabah, kültürleri PBS'de iyonik olmayan yüzey aktif maddede 10 kez yıkayın, yıkama solüsyonunu her 10 dakikada bir değiştirerek kültürleri 300 mikrolitre uygun bir florofor konjuge ikincil antikor ile etiketlemeden önce bir gecede dört derece santigrat derece ile sallantıda. Ertesi gün, gösterildiği gibi non-iyonik yüzey aktif ile taze PBS kültürleri 10 kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, membranı her kesici uçtan dikkatlice soymak ve membranları tek tek cam mikroskop slaytlarına yerleştirmek için ince prökler kullanın.Numuneleri DAPI takviyeli montaj ortamıyla kaplayın ve kapak fişlerinin kenarlarını açık ojeile kapatın. Oje kuruduğunda, confokal mikroskopi ile slaytlar görüntü. İlk SV hücreleri kalp ventrikülüzerine büyüdükçe, Coup-TF2 gibi venöz belirteçler üretmeyi bırakırlar.Kültür beş gün sonra, SV endotel hücreleri filizlenir ve membran üzerine göç. Embriyonik kalpte olduğu gibi, kaplar SV'den uzaklaştıkça Coup-TF2 ifadesi azalır. VEGF-A ile uyarılan kültürler, hem yoğunluk hem de uzunluk olarak anjiyojenik filizlerin arttığını göstermektedir. VEGF-A tarafından uyarılan diğer SV kültürleri, kontrollere kıyasla filiz uzunluğunun neredeyse üç kat arttığını göstererek, SV ve enddokardyumdan gelen endotel filizlerinin VEGF-A'ya yanıt verdiğini düşündürmektedir.Kalp ve akciğerleri çekerken, atria çıkarırken ve SV'yi çevreleyen komşu dokuyu temizlerken SV dokusunu kaybetmemek önemlidir. Koroner anjiyogenezi görselleştirmek ve süreç boyunca hücresel ve moleküler dinamiğin ayrıntılarını yakalamak için canlı görüntüleme deneyleri yapılabilir. Bu teknik koroner anjiyogenezin potansiyel moleküler mekanizmalarının değerlendirilmesinde ve genel olarak anjiyogenezin incelenmesinde model bir sistem olarak son derece yararlıdır.

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Bu video in vitro anjiyogenez tayininde bir protokol anjiyogenez özetlediği çeşitli aşamaları olduğunu göstermektedir. Zaman atlamalı çimlenme görüntüleri, lümen oluşumu, dallanma ve anastomoz - anjiyogenez temel özellikleri gösterilmektedir.

Anjiyogenez Çalışmaları için optimize edilmiş Fibrin Jel Boncuk Testi

Bu video, anjiyogenezin erken aşamalarında endotel filizlenmesini incelemek için perisitleri içeren modifiye edilmiş bir mikro taşıyıcı boncuk bazlı testi göstermektedir. Test, anjiyogenezin moleküler mekanizmalarını ve anti-anjiyogenetik terapötiklerin etkisini anlamak için in vitro deneysel bir model sağlar.

Erken Evre Anjiyogenez Değerlendirmesi için Boncuk Filizlenme Testi: Perisitlerin Varlığında Endotelyal Filizlenmeyi İncelemek İçin İn Vitro Boncuk Tabanlı Bir Model

Yenidoğan fare retina bir anjiyogenez modüle farklı genler ya da uyuşturucu rolleri soruşturma izin anjiyogenez bir iyi karakterize fizyolojik modeli...

Anjiyogenez Araştırma Yenidoğan Fare Retina Tüm Dağı Immunofluorescent Boyama<em&gt; In vivo</em

Protokol farelerde geliştirilen komea mikro-tahlili tarif eder.

Kornea mikrocep Testi: Fare Eye Angiogenezis Bir Model

Bu izole edilmiş ve iyi karakterize edilmiş bir ortamda in vivo damarlanmayı analiz etmek için bir model olarak bir arteriovenöz (AV) döngü üretilmesi için bir mikro yaklaşımı açıklar. Bu model yalnızca anjiyojenezde araştırılması için yararlıdır, ama aynı zamanda en iyi şekilde mühendislik eksenel vaskülarize ve transplante dokuların için uygundur.

Bir Küçük Hayvan Modelinde Arteriovenöz (AV) Döngü Anjiogenez ve Vaskülarize Doku Mühendisliği Eğitim için

Burada, prelabelled Mezenkimal hücrelerin sıçan aort kaynaklı endotel ağları ile birlikte kültürlü nerede aort yüzük testin yeni bir uygulama mevcut. Bu roman yöntemi görselleştirme Mezenkimal Stromal hücre (MSCs) posta ve endotel ağları ile entegrasyon, miktar ağ özellikleri ve MSC immunophenotypes ve gen ifade değerlendirme sağlar.

Aort yüzük ortak kültür tahlil: Mezenkimal Stromal hücre Vitro anjiogenik potansiyelini değerlendirmek için uygun bir araç

Bir roman vitro boncuk tahlil bu protokolü sunar daha uygun modelleri perisitlerden dahil ederek angiogenez çimlenme vivo içinde süreci. Bu değişiklik daha sadakatle heterotypic hücresel etkileşimlerin endotel hücreleri ve anjiogenezi için kritik olan duvar hücreler arasındaki özetlemek boncuk tahlil sağlar.

Perisitlerden tahlil filizlenen bir endotel hücre boncuk birleşmeyle

Bu tahlil, filizlenen anjiyogenezi in vitro olarak kontrol eden biyolojik süreçleri analiz etmek için 3D-kollajen jel içinde kültürlenmiş embriyoid cisimlere farklılaştırılmış fare embriyonik kök hücrelerini kullanır. Bu teknik, ilaçları test etmek, hastalıkları modellemek ve embriyonik olarak ölümcül olan delesyonlar bağlamında spesifik genleri incelemek için uygulanabilir.

In Vitro Vasküler Hastalık Modellemesi ve İlaç Testi için Fare Embriyonik Kök Hücreleri Kullanılarak Anjiyogenezin Üç Boyutlu Filizlenme Testi

Burada sunulan yöntem, reaktiflerin anjiyogenez veya vasküler geçirgenlik üzerindeki etkisini in vivo boyamadan değerlendirebilir. Yöntem, neo-damarları veya vasküler sızıntıyı görselleştirmek için kuyruk damarı yoluyla dekstran-FITC enjeksiyonunu kullanır.

Anjiyogenez Çalışmaları için Modifiye In Vivo Matrix Jel Plug Testi

Gelişim ve hastalık için temel olan filizlenme anjiyogenez, karmaşık moleküler ve mekanik süreçleri içerir. Domuz karotis arterlerinden hücresel filizlenmeyi analiz eden, sertliğe bağlı anjiyogenezi ve farklı lider-takipçi hücre mekaniğini ortaya çıkaran çok yönlü bir 2.5D ex vivo model sunuyoruz. Bu model, doku mühendisliği stratejilerinin ve kanser tedavisi yaklaşımlarının geliştirilmesine yardımcı olur.

Canlı Dokuda Filizlenen Anjiyogenezin Ex Vivo Mekanik Karakterizasyonu için 2.5D Model

Öğrenin, fare embriyo kalp dokularından sinus venosus ve endokard eksplant kültürleri kullanarak koroner anjiyogenezi in vitro modellemeyi. VEGF-A yanıtlarını ve endotelyal hücre göçünü inceleyin.

Koroner Anjiyogenezin In Vitro Modeli

Daha fazla video keşfet