Name: İnsan Embriyonik Kök Hücrelerinin Tek Hücre Kültürünü Kullanarak Etkin Nöral Farklılaşma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: Öğrenin, insan embriyonik kök hücrelerinin tek hücre kültürü yöntemiyle nöral öncü hücrelere verimli farklılaşmasını. Bu ölçeklenebilir protokol, ilç tarama ve rejeneratif tıp için değerli bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr. Carl D. Bortner'e (NIEHS) FACS analizine yaptığı yardımlar için teşekkür ederiz. Bu araştırma, Ulusal Çevre Sağlığı Bilimleri Enstitüsü, Ulusal Sağlık Enstitüleri, Z01-ES-101585 ve AMJ'nin Intramural Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir.

1. HESC nitelikli Bodrum Membran Matris Kaplı Plakaların Hazırlanması
<ol><li>Bir jel oluşumunu önlemek için hESC nitelikli bazal membran matrisini (Bkz. Malzeme Tablosu)çözeltisini en az 2-3 saat veya bir gecede 4 °C'de yavaşça eritin.</li>
	<li>Bodrum membran matris kaplı plakalar hazırlamak için, soğuk DMEM/F12'de seyreltik matris %2 nihai konsantrasyona kadar. İyi bir şekilde karıştırın ve seyreltilmiş matris çözeltisinin 1 mL'si ile 6 kuyulu bir plakanın her kuyusunu kaplayın.</li>
	<li>Bodrum membran matris kaplı plakaları oda sıcaklığında (RT) en az 3 saat veya gece boyunca 4 °C'de kuluçkaya yatırın. NOT: Bazal membran matrisli plakalar, matris çözeltisi çıkarılmadan ve plakalar kullanılmadan önce 1 hafta boyunca 4 °C'de saklanabilir.</li>
</ol>2. Koloni tipi hESC'lerin Tek Hücreli HESC Kültürüne Uyarlamı
<ol><li>Bazal membran matrisi üzerinde yetişen koloni tipi H9 (WA09) hESC'lerin besleyicisiz kültürlerini geçişiçin, kuyulardan ortayı aspire etmek(Şekil 1A)9.</li>
	<li>1 mL DPBS ile 1x yıkayın. Kuyu başına 1 mL dispase çözeltisi (1 U/mL) ekleyin ve 37 °C'de 20 dk kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Dispase'yi çıkarın, hücreleri 2 mL DMEM/F12 ile 1 x hafifçe yıkayın, ortamı çıkarın ve her tabağa 2 mL DMEM/F12 ekleyin.</li>
	<li>Kolonileri yavaşça yukarı ve aşağı borular oluşturarak ayırın ve 15 mL'lik bir tüpe aktarın.</li>
	<li>370 x g 2 dakika pelet santrifüj ve orta aspire.</li>
	<li>Hücre peletlerini tek hücrelere ayırmak için 2 mL hücre dekolmanı çözeltisi (1x konsantrasyonu, bkz. Malzeme Tablosu)ekleyin ve 37 °C'de 10 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>370 x g 2 dakika için santrifüj hücreleri ve ayırma çözeltisi kaldırın.</li>
	<li>Taze mTeSR1 insan ESC ortamını ekleyin ve hücreleri yukarı ve aşağı hafif borular oluşturarak tek hücrelere ayırın.</li>
	<li>Koloni tipi hESC'leri tek hücreli tip kültüre uyarlamak için, 2 mTeSR1'de 2 mL'lik 10 μM ROCK inhibitörü içeren bodrum membran matris kaplı 6 kuyu plakasının her kuyusuna yaklaşık 1,5-2.0 x 106 hESC'yi plakalayın (Şekil 1A).</li>
	<li>24 saat sonra, hESC ortamını ROCK inhibitörü olmadan taze mTeSR1 ile değiştirin ve hESC'lerin 3 gün boyunca tek hücreli tip olarak büyümesine izin verin. Orta yı günlük olarak değiştirin.</li>
	<li>4. günde, kültürler yaklaşık %100 biraraya geldiğinde, ayırma çözeltisi hücreleri ayrıştırın, sonra adım 2.6'da açıklandığı gibi yeniden plakalanır. NOT: ROCK inhibitörü tek hücreli tip hESC kültürünün ilk 24 saat sırasında hücre sağkalımını artırır.</li>
</ol>3. Embriyoid Cisim Oluşumu ve Üç Mikrop Tabakasına Farklılaşması (Şekil 2)
<ol><li>EB'ler oluşturmak için, ilk 24 saat boyunca 10 μM ROCK inhibitörü ile mTeSR1 orta 3 mL hücreleri resuspend, daha sonra bir gecede 60 mm düşük ek yemekleri içine kuluçka 37 °C inkuvatör toplama izin vermek.</li>
	<li>24 saat sonra küçük EB'ler 15 mL'lik bir tüpe aktarılır. EB'ler tüpün dibine yerleşin ve bir pipetle ortamı nazikçe çıkarın. EB'leri EB ortamına aktarın (nakavt-DMEM %20 nakavt serum replasmanı, 1x glutamin takviyesi [Bkz. Malzeme Tablosu], %1 NEAA [esansiyel olmayan amino asitler; bkz. Malzeme Tablosu], ve %0.2 β-mercaptoetanol) ve düşük ek tabaklarda 7 gün boyunca genişlemelerine izin verin. Ortam, yukarıda açıklandığı gibi her gün değiştirilebilir (Şekil 2A).</li>
	<li>7. günde, eB'leri tabaklardan toplayın ve 15 mL'lik bir tüpe aktarın. Hafifçe bir pipet ile orta çıkarın ve bir bodrum membran matris kaplı 6 kuyu plaka eBs aktarın.</li>
	<li>EB'lerin tabağa bağlanmasına ve EB ortamda 12 gün kuluçkaya yatırmalarına izin verin ve bu süre zarfında üç mikrop tabakasına ayrılacaktır(Şekil 2B). Her gün orta değiştirin. NOT: Hücrelerin toplanması sırasında, düşük eki çanak EB eki önlemeye yardımcı olur.</li>
</ol>4. Tek hücreli Tip hESC'lerin NPC'lere Farklılaşması (Şekil 3)
<ol><li>NPC farklılaşmasını sağlamak için, tek hücreli tip hESC'leri 1 mL dekolmanı çözeltisi (1x) ile ayırın ve 37 °C'de 10 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>370 x g 2 dakika hücreleri santrifüj ve ayırma çözeltisi supernatant kaldırın. 1 mL DMEM/F12 ekleyin ve hücreleri nazik pipetleme ile yeniden askıya alın.</li>
	<li>10 μM ROCK inhibitörü içeren mTeSR1 2 mL'de 2 x 105 hücre/kuyu yoğunlukta 6 kuyu plakalı bir taban membran matris kaplı plaka hücreleri.</li>
	<li>24 saat sonra kültür ortamını 1 μM dorsomorfin ve 5 μM SB431542 ile takviye edilmiş nöral indüksiyon ortamını (DMEM %1 B27 eksi A vitamini ile) değiştirin.</li>
	<li>Nöral indüksiyonun ilk 4 günü boyunca her gün ortayı değiştirin, sonra 7. günde birleştiğizamana kadar her gün(Şekil 3B). NOT: (1) Dorsomorfin ALK2,3,6 reseptörlerini hedefleyerek BMP yolunu inhibe eder ve ampk'yi inhibe eder; SB431542, ALK5,7'yi hedefleyerek TGFβ/Activin yolunun bir inhibitörüdür. (2) Aynı protokol wa0916gibi benzer sonuçlar verdi başka bir ESC hattı (WA01) ile test edildi. (3) Biz genellikle bodrum membran matris için Matrigel kullandık; ancak, hücreler Geltrex üzerinde kültürlenebilir ve daha sonra birkaç NPC belirteçleri(Şekil 4D,E)ifadesi ile gösterildiği gibi çok benzer sonuçlar ile NPC'ler içine ayırt edilebilir. Geltrex'i Matrigel ile aynı şekilde ele alın (bölüm 1'e bakın).</li>
</ol>5. NPC Genişleme ve Kriyopreservation
<ol><li>7 günlük nöral indüksiyondan sonra hücreleri 1 mL dekolmanı çözeltisi (1x) ile ayırın ve 37 °C'de 10 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>370 x g 2 dakika hücreleri santrifüj ve ayırma çözeltisi supernatant kaldırın. 1 mL NPC genişletme ortamı ekleyin (bkz. Malzemeler Tablosu)ve hücreleri nazik pipetleme ile yeniden askıya alın.</li>
	<li>Taban membran matris kaplı 6 kuyu plakası üzerinde 2 mL NPC genleşme ortamında plaka 1 x 105 hücre.</li>
	<li>Geçiş NP'leri, kültürlerin yaklaşık %90 biraraya gelmesiyle, gerektiğinde birden çok kez. İlk 3-4 pasajlar sırasında, hücre ölümünü önlemek için ilk 24 saat boyunca 10 μM ROCK inhibitörü ekleyin. Bu pasajlardan sonra hücreler ROCK inhibitörü olmadan geçiş ve kültürlenebilir. Genişletme sırasında ortamı her gün değiştirin.</li>
	<li>Kültürler birleştiğinde Kriyokoru NPT'leri.<ol>
<li>Kriyopreservation için, 37 °C'de 5 dakika için 1 mL dekolmanı çözeltisi (1x) hücreleri ayırmak, sonra ayırma çözeltisini kaldırmak için 2 dakika 370 x g santrifüj süspansiyon.</li>
		<li>1 x 106 hücre/mL'de ayrıştırılatan NP'lere hücre dondurma çözeltisi (bkz.</li>
		<li>Cryovials dondurucu konteyner içine yerleştirin ve bir gecede saklayın -80 °C dondurucuda.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cryovials sıvı nitrojen saklayın.</li>
</ol>6. Poli-L-ornitin (FKÖ) ve Laminin Kaplı Plakaların hazırlanması
<ol><li>PLO/laminin kaplı plakalar hazırlamak için FKÖ stok çözeltisini PBS'ye veya suya 10 μg/mL'lik son konsantrasyona seyreltin. İyi bir şekilde karıştırın ve 1 mL seyreltilmiş PLO çözeltisi ile 6 kuyulu bir plakanın her kuyusunu kaplayın.</li>
	<li>37 °C'de en az 2 saat veya 4 °C'de geceleme.</li>
	<li>Her biriyi PBS ile yıkayın.</li>
	<li>Lamina stok çözeltisi soğuk PBS veya su da seyreltin 10 μg/mL. Laminin çözeltisini iyice karıştırın. PBS'yi çıkarın ve her kuyuyu 1 mL laminin çözeltisi ile hemen kaplayın. Plakaları 4 °C'de tutun ve 1 hafta içinde kullanın. PBS ile yıkayın ve hemen kültür ortamı ekleyin. NOT: FKÖ/laminin kaplı plakaların kurumasına izin vermeyin.</li>
</ol>7. HESC türetilmiş NP'lerin Dopaminerjik Nöronlara Farklılaşması (Şekil 6A)
<ol><li>Yaklaşık %50 yoğunlukta NPC genişletme ortamında PLO/laminin kaplı tabaklarda plaka NPC'ler.</li>
	<li>24 saat sonra ortayı DA1 ortamına (2 mM glutamin takviyesi, 1x NEAA, 1x B27, 200 ng/mL SHH ve 100 ng/mL FGF8 içeren nörobazal ortam) değiştirin ve her gün ortayı değiştirin.</li>
	<li>Biraraya geldiklerinde geçiş kültürleri. 1 mL dekolmanı çözeltisi (1x) ile hücreleri ayırın ve 37 °C'de 10 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>370 x g 2 dakika hücreleri santrifüj ve ayırma çözeltisi supernatant kaldırın. 1 mL DA1 orta ekleyin ve nazik pipetleme ile hücreleri yeniden askıya alın.</li>
	<li>Plo/laminin kaplı 6 kuyu plakasında 2 mL DA1 orta plaka1 x 105 hücre.</li>
	<li>10 gün sonra, DA2 ortamına (2 mM glutamin takviyesi içeren nörobazal ortam, 1x NEAA, 1x B27, 200 μM askorbik asit, 20 ng/mL BDNF ve 20 ng/mL GNDF) değiştirin ve her gün 20 gün boyunca orta yı değiştirin(Şekil 6A). NOT: DA2 ortamına günlük taze askorbik asit ekleyin. İlk 14 gün içinde, farklılaşmış hücreler %90 biraraya geldiklerinde geçirilmelidir, ancak bundan sonra değil.</li>
</ol>8. ESC kaynaklı NCD'lerin Astrositlere Farklılaşması
<ol><li>Yaklaşık %50 yoğunlukta NPC genleşme ortamında Plo/laminin kaplı plakalarda plaka nöral progenitor hücreleri.</li>
	<li>24 saat sonra ortayı astrosit ortamına (1:100 N2, 1:100 B27, 200 ng/mL IGF, 10 ng/mL activin A, 10 ng/mL heregulin β-1 ve 8 ng/mL bFGF dahil) değiştirin ve her gün ortayı değiştirin.</li>
	<li>Biraraya geldiklerinde geçiş kültürleri. 1 mL dekolmanı çözeltisi (1x) ile hücreleri ayırın ve 37 °C'de 10 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>370 x g 2 dakika hücreleri santrifüj ve ayırma çözeltisi supernatant kaldırın. Astrosit orta 1 mL ekleyin ve nazik pipetleme ile hücreleri yeniden askıya alın.</li>
	<li>Plo/laminin kaplı 6 kuyu da 2 mL astrosit ortamda plaka 1 x 105 hücre.</li>
	<li>Diferansiyasyonun toplam 5-6 hafta devam etmesine izin verin(Şekil 6B).</li>
</ol>9. İmmünofluoresan Boyama
<ol><li>Her hücre tipi için yukarıda açıklandığı gibi 35 mm μ-tabaklarda kültür hücreleri. Orta aspire ve çanak başına% 4 PFA çözeltisi 1 mL ekleyin ve RT 20 dakika kuluçka.</li>
	<li>PBS ile 5 dakika boyunca 2x yıkayın. NOT: Hücreler sabitlendikten sonra, ataşme plakaları parafilm ile kapatılabilir ve 4 °C'de saklanabilir. Fiksasyondan sonra 1 hafta içinde antikor ile leke.</li>
	<li>Çanak başına 300 μL bloklama çözeltisi (PBS'de keçi veya eşek serumu) ekleyin ve 30-60 dakika boyunca RT'de kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>5 dakika PBS ile çanak 2x yıkayın.</li>
	<li>300 μL primer antikor(Tablo 1) çözeltisi (bloklama çözeltisinde seyreltilmiş) ekleyin ve RT'de 1,5 saat veya geceleme 4 °C'de inkübül.</li>
	<li>10 dakika PBS ile 2x yıkayın.</li>
	<li>Bloklama çözeltisindeki 300 μL floresan konjuge sekonder antikor(Tablo 1)ekleyin ve RT'de 1 saat boyunca karanlıkta kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>PBS ile 10 dakika boyunca hücreleri 2x yıkayın.</li>
	<li>Çekirdekleri lekelemek için Hoechst boyama çözeltisini (PBS'de 1 μM son konsantrasyon) ekleyin. RT 5 dakika boyunca karanlıkta hücreleri kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Hücreleri 5 dakika Boyunca PBS ile 1 kat yıkayın ve ardından 500 μL PBS ekleyin. Yemekleri karanlıkta tutun, sonra bir konfokal mikroskop ile floresan gözlemlemek (Şekil 2B, Şekil 5C, Şekil 6A, ve Şekil 7B).</li>
</ol>

<ol><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li>
<li>Rosler, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+human+embryonic+stem+cells+in+feeder-free+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of human embryonic stem cells in feeder-free conditions.</a> Developmental Dynamics. 229 (2), 259-274 (2004).</li>
<li>Mallon, B. S., Park, K. Y., Chen, K. G., Hamilton, R. S., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+xeno-free+culture+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Toward xeno-free culture of human embryonic stem cells.</a> The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 38 (7), 1063-1075 (2006).</li>
<li>Hoffman, L. M., Carpenter, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+culture+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Characterization and culture of human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 23 (6), 699-708 (2005).</li>
<li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+derivation+of+primitive+neural+stem+cells+and+generation+of+brain+subtype+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid derivation of primitive neural stem cells and generation of brain subtype neurons from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cells Translational Medicine. 2 (11), 862-870 (2013).</li>
<li>Goncalves, J. T., Schafer, S. T., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+Neurogenesis+in+the+Hippocampus%3A+From+Stem+Cells+to+Behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Adult Neurogenesis in the Hippocampus: From Stem Cells to Behavior.</a> Cell. 167 (4), 897-914 (2016).</li>
<li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li>
<li>International Stem Cell Initiative. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+human+embryonic+stem+cell+lines+by+the+International+Stem+Cell+Initiative%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative.</a> Nature Biotechnology. 25 (7), 803-816 (2007).</li>
<li>Hartung, O., Huo, H., Daley, G. Q., Schlaeger, T. M. Clump passaging and expansion of human embryonic and induced pluripotent stem cells on mouse embryonic fibroblast feeder cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHartung%2C+O+%22Current+Protocols+in+Stem+Cell+Biology%22">Current Protocols in Stem Cell Biology</a>. 14 (1), Chapter 1 Unit 1C 10(2010).</li>
<li>Chen, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-colony+type+monolayer+culture+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Non-colony type monolayer culture of human embryonic stem cells.</a> Stem Cell Research. 9 (3), 237-248 (2012).</li>
<li>Chen, G., Hou, Z., Gulbranson, D. R., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin-myosin+contractility+is+responsible+for+the+reduced+viability+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Actin-myosin contractility is responsible for the reduced viability of dissociated human embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 7 (2), 240-248 (2010).</li>
<li>Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROCK+inhibitor+improves+survival+of+cryopreserved+serum%2Ffeeder-free+single+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells.</a> Human Reproduction. 24 (3), 580-589 (2009).</li>
<li>Ohgushi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+pathway+and+cell+state+responsible+for+dissociation-induced+apoptosis+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular pathway and cell state responsible for dissociation-induced apoptosis in human pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 7 (2), 225-239 (2010).</li>
<li>Pakzad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+a+ROCK+inhibitor+in+extracellular+matrix+supports+more+undifferentiated+growth+of+feeder-free+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells+upon+passaging%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Presence of a ROCK inhibitor in extracellular matrix supports more undifferentiated growth of feeder-free human embryonic and induced pluripotent stem cells upon passaging.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 6 (1), 96-107 (2010).</li>
<li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).</li>
<li>Jeon, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GLIS3+Transcriptionally+Activates+WNT+Genes+to+Promote+Differentiation+of+Human+Embryonic+Stem+Cells+into+Posterior+Neural+Progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">GLIS3 Transcriptionally Activates WNT Genes to Promote Differentiation of Human Embryonic Stem Cells into Posterior Neural Progenitors.</a> Stem Cells. 37 (2), 202-215 (2019).</li>
<li>Emre, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ROCK+inhibitor+Y-27632+improves+recovery+of+human+embryonic+stem+cells+after+fluorescence-activated+cell+sorting+with+multiple+cell+surface+markers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">The ROCK inhibitor Y-27632 improves recovery of human embryonic stem cells after fluorescence-activated cell sorting with multiple cell surface markers.</a> PLoS ONE. 5 (8), e12148(2010).</li>
<li>Hanna, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cells+with+biological+and+epigenetic+characteristics+similar+to+those+of+mouse+ESCs%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cells with biological and epigenetic characteristics similar to those of mouse ESCs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (20), 9222-9227 (2010).</li>
<li>Saha, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface-engineered+substrates+for+improved+human+pluripotent+stem+cell+culture+under+fully+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Surface-engineered substrates for improved human pluripotent stem cell culture under fully defined conditions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (46), 18714-18719 (2011).</li>
<li>Tsutsui, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+small+molecule+inhibitor+cocktail+supports+long-term+maintenance+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">An optimized small molecule inhibitor cocktail supports long-term maintenance of human embryonic stem cells.</a> Nature Communications. 2, 167(2011).</li>
<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+a+core+signaling+regulatory+mechanism+for+pluripotent+stem+cell+survival+and+self-renewal+by+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Revealing a core signaling regulatory mechanism for pluripotent stem cell survival and self-renewal by small molecules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (18), 8129-8134 (2010).</li>
<li>Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducible%2C+ultra+high-throughput+formation+of+multicellular+organization+from+single+cell+suspension-derived+human+embryonic+stem+cell+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Reproducible, ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates.</a> PLoS ONE. 3 (2), e1565(2008).</li>
<li>Kim, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+pure+and+expandable+PSA-NCAM-positive+neural+precursors+from+human+ESC+and+iPSC-derived+neural+rosettes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Highly pure and expandable PSA-NCAM-positive neural precursors from human ESC and iPSC-derived neural rosettes.</a> PLoS ONE. 7 (7), e39715(2012).</li>
<li>Sun, Y., Hu, J., Zhou, L., Pollard, S. M., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+FGF2+and+BMP+controls+the+self-renewal%2C+dormancy+and+differentiation+of+rat+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Interplay between FGF2 and BMP controls the self-renewal, dormancy and differentiation of rat neural stem cells.</a> Journal of Cell Science. 124 (Pt 11), 1867-1877 (2011).</li>
<li>Zhou, J. M., Chu, J. X., Chen, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+protocol+that+induces+human+embryonic+stem+cells+to+differentiate+into+neural+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+International%22%5BJournal%5D)">An improved protocol that induces human embryonic stem cells to differentiate into neural cells in vitro.</a> Cell Biology International. 32 (1), 80-85 (2008).</li>
<li>Smith, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Activin%2FNodal+signaling+promotes+specification+of+human+embryonic+stem+cells+into+neuroectoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm.</a> Developmental Biology. 313 (1), 107-117 (2008).</li>
</ol>

Yazarlar çıkar çatışması beyan etmezler.

HSK'ların çeşitli soylara farklılaşması ve yeterli sayıda farklılaştırılmış hücre nin üretilmesi için ölçeklenebilir ve etkili yöntemler ilaç taraması ve kök hücre tedavisi için önemli kriterlerdir. Çeşitli tek hücreli geçiş yöntemleri, hangi hücrelerin ROCK inhibitörü veya diğer küçük moleküllerin varlığında hayatta kalmayı artırmak için kültürlü, ancak bu kültür yöntemlerinin son ürünleri koloni tipi hESCs17,18,19,<...

İnsan embriyonik kök hücreleri (hESCs) daha sonra çeşitli çok güçlü progenitor hücre soyları ayırt üç birincil mikrop katmanları, ayırt etme potansiyeline sahip. Bu soylar daha sonra insan vücudunda tüm hücre tipleri neden. In vitro hESC kültür sistemleri insan embriyonik gelişimini inceleme yeteneğini dönüştürmüş ve bu süreçlerin biyolojik ve moleküler düzeyde nasıl düzenlendiğine dair yeni bilgiler edinmek için değerli bir araç olarak hizmet vermiştir. Benzer şekilde, insan hastalardan izole edilen somatik hücrelerin yeniden programlanmasından elde edilen indüklenen pluripotent kök hücrelerin (iPSCs) çalışmaları çeşitli hastalıklar hakkında yeni bilgiler sağlamaktadır. Buna ek olarak, atave ve hESCtt türetilen farklılaşmış hücreler kök hücre tedavisi ve ilaç tarama içeren araştırma için yararlı olabilir1,2,3,4.
hESC'ler, geniş bir kendini yenileme kapasitesine sahip çok potansiyelli hücreler olan nöral progenitor hücrelere (NPC) farklılaşmak için indüklenebilir. Daha sonra, bu hücreler nöronlar, astrositler ve oligodendrocytes5,6içine ayırt edilebilir. NDC'ler ayrıca nörogelişimsel biyoloji ve çeşitli nörolojik hastalıkların in vitro çalışmaları için bir hücresel sistem sunuyoruz. Ancak, hESCs ve NPCs içine farklılaşma içeren mevcut koloni tipi kültür yöntemleri verimsiz ve genellikle coculture yanı sıra embriyoid vücut (EB) ve rozet oluşumu5,7,8,9içerir. Bu protokoller daha düşük sağkalım oranları ve spontan farklılaşma sergiler ve daha fazla zaman alır.
Burada sunulan kolayca ölçeklenebilir ve hESCs10yüksek yoğunluklu tek hücreli türü kültür kullanan gelişmiş ve sağlam bir kültür sistemidir. Roh-kigaz (ROCK) inhibitörü dahil hESC10,11,12,13,14tek hücre tipi kültür sırasında önemli ölçüde geliştirilmiş sağkalım verimliliği katkıda bulunmuştur. Bu kültür sisteminde, HESC'ler kolayca korunabilir ve genişletilebilir. Buna ek olarak, protokol hESC'lerin tek hücreli tip kültüründen NCD oluşturmak için etkili bir yöntem sunar, son derece saf NPCs üretimine olanak sağlar. ALK inhibitörleri ile BMP / TGFβ / aktivin sinyal yollarının inhibisyonu verimli npcs içine tek hücreli tip hESCs farklılaşmasıneden15,16, daha sonra dopaminerjik nöronlar ve astrositler gibi fonksiyonel nöral soyları, ayırt etmek için indüklenebilir.
Özetle, hESC'ler kullanarak tek hücreli tip kültür protokolü, bu hücrelerin NP'ler de dahil olmak üzere çeşitli soylara farklılaşmasını incelemek için cazip bir model sunar. Bu protokol kolayca ölçeklenebilir ve bu nedenle rejeneratif tedavi ve ilaç tarama içeren araştırma için hücre oluşturmak için uygundur.

<table><tbody><tr><td>35 mm m-tabaklar</td><td>ibidi</td><td>81156</td><td>Hücre kültürü kabı</td></tr><tr><td>6 oyuklu plakalar</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Yenilikçi Hücre Teknolojileri</td><td>AT104-500</td><td>Hücre ayırma çözeltisi</td></tr><tr><td>Activin A</td><td>R& D sistemi</td><td>338-AC-050</td><td></td></tr><tr><td>Askorbik Asit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4403</td><td></td></tr><tr><td>B27 takviyesi</td><td>Thermo Fisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>B27 takviyesi (-Vit A)</td><td>Thermo Fisher</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Peprotech</td><td>100-18C</td><td></td></tr> Santrifüj <tr><td>Z100065</td><td></td><td>BDNF</td><td>Uygulamalı Biyolojik Malzemeler</td></tr><tr><td></td><td>DAMON/ICE</td><td>428-6759</td><td></td></tr><tr><td>CO2 inkübatörü</td><td>Thermo Fisher</td><td>4110</td><td></td></tr><tr><td>Corning hESC-qulified Matris (Magrigel)</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>Bazal membran matrisi (buradaki protokolün çoğu için kullanılır)</td></tr><tr><td>Cryostor CS 10</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>7930</td><td>Hücre dondurma çözeltisi</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>7923</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher</td><td>10569-010</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo Fisher</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>Dorsomorphin</td><td>Tocris</td><td>3093</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-16A</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır</td><td>Serumu Fisher Scientific</td><td>SH3007003HI</td><td></td></tr><tr><td>FGF8</td><td>Uygulamalı Biyolojik Malzemeler</td><td>Z101705</td><td></td></tr><tr><td>GDNF</td><td>Uygulamalı Biyolojik Malzemeler</td><td>Z101057</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex matrisi</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1569601</td><td>Bazal membran matrisi</td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Thermo Fisher</td><td>35050061</td><td>Glutamin takviyesi, 100X</td></tr><tr><td>H9 (WA09) insan embriyonik kök hücre hattı</td><td>WiCell</td><td>WA09</td><td></td></tr><tr><td>Heregulin b-1</td><td>Peprotech</td><td>100-3</td><td></td></tr><tr><td>IGF</td><td>Peprotech</td><td>100-11</td><td></td></tr><tr><td>Nakavt DMEM</td><td>Thermo Fisher</td><td>10829018</td><td></td></tr><tr><td>Nakavt Serum Değiştirme</td><td>Thermo Fisher</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>85850</td><td>hESC kültür ortamı</td></tr><tr><td>N2 takviyesi</td><td>Thermo Fisher</td><td>17502001</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Thermo Fisher</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Neurobazal</td><td>Thermo Fisher</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-ornitin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3655</td><td></td></tr><tr><td>ROCK inhibitörü</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Tocris</td><td>1614</td><td></td></tr><tr><td>SHH</td><td>Uygulamalı Biyolojik Malzemeler</td><td>Z200617</td><td></td></tr><tr><td>Stemdiff Nöral Progenitör ortamı</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>5833</td><td>NPC genişleme ortamı</td></tr></tbody></table>

İnsan embriyonik kök hücrelerinin tek hücre kültürünü kullanarak etkin nöral farklılaşma

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

İnsan embriyonik kök hücrelerinin (HESC' ler) in vitro farklılaşması, insan gelişimini hem biyolojik hem de moleküler düzeylerde inceleme yeteneğini dönüştürmüş ve rejeneratif uygulamalarda kullanılmak üzere hücreler sağlamıştır. Farklılaşmamış hESC'leri ve embriyoid gövdeyi (EB) korumak için koloni tipi kültürünü kullanan hESC kültürü için standart yaklaşımlar ve farklı mikrop katmanlarına farklılaşma için rozet oluşumu verimsiz ve zaman alıcıdır. Burada sunulan bir koloni tipi kültür yerine hESCs kullanarak tek hücreli bir kültür yöntemidir. Bu yöntem, koloni tipi hESC'lere benzer düzeylerde hESC belirteçlerinin ekspresyonu da dahil olmak üzere, farklılaşmamış hESC'lerin karakteristik özelliklerinin sürdürülmesini sağlar. Buna ek olarak, protokol 1 hafta içinde NPC'ler üreten tek hücreli tip hESC'lerden nöral progenitor hücre (NPC) üretimi için etkili bir yöntem sunar. Bu hücreler son derece çeşitli NPC marker genleri ifade ve çeşitli nöral hücre tipleri ayırt edebilirsiniz, dopaminerjik nöronlar ve astrositler de dahil olmak üzere. HSS'ler için bu tek hücreli kültür sistemi, bu süreçlerin moleküler mekanizmalarının, bazı hastalıkların çalışmalarının ve ilaç keşif ekranlarının araştırılmasında yararlı olacaktır.

Burada sunulan bakım ve hESC'lerin tek hücreli tip kültürünün genişletilmesi ve nöral progenitor hücrelere verimli farklılaşma için geliştirilmiş bir protokol, daha sonra çeşitli downstream nöral soylar halinde ayırt, dopaminerjik nöronlar ve astrositler de dahil olmak üzere.
Temsili faz kontrast görüntüleri, koloni tipi hESC'lerin tek hücreli tip kültüre uyarlaması sırasında hücre morfolojisini farklı basamaklarda göstermektedir(Şekil 1A). Tek hü...

Burada sunulan insan embriyonik kök hücrelerinin tek hücreli kültür ve nöral progenitor hücrelere sonraki farklılaşma için bir protokoldür. Protokol basit, sağlam, ölçeklenebilir ve ilaç tarama ve rejeneratif tıp uygulamaları için uygundur.

İnsan Embriyonik Kök Hücrelerinin Tek Hücre Kültürünü Kullanarak Etkin Nöral Farklılaşma

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

İnsan embriyonik kök hücreleri nöral progenitor hücreleri ve daha sonra nöron astrosit ve oligodendrocyte içine ayırt etmek için indüklenebilir. Ancak, insan embriyonik kök hücreleri için tip kültür yöntemi ve nöral progenitor hücrelere farklılaşma çok verimsiz ve açık in vivo co-kültür sistemi Burada kolayca insan embriyonik kök hücreleri ile yüksek yoğunluklu tek hücre tipi kültür kullanılarak ölçeklenebilir gelişmiş ve sağlam bir kültür sistemi saiyoruz. İnsan embriyonik kök hücrelerinin tek hücre tipi kültürü, nöral progenitor hücreleri ve ek nöral soyların daha sonraki farklılaşması da dahil olmak üzere çeşitli ve farklı farklılaşmış soylar boyunca çok adımlı farklılaşmayı düzenleyen moleküler mekanizmaları incelemek için hızlı ve verimli bir sistem sağlar.İnsan embriyonik kök hücre nitelikli bodrum membran matris kaplı plakalar hazırlayarak başlayın. En az 2-3 saat veya bir gecede dört santigrat derecede bodrum membran matris çözeltisini yavaşça eritin. Çözüldüğünde, matrisi soğuk DMEM/F-12 ile %2 oranında seyreltin ve altı kuyulu bir plakanın her kuyusunu seyreltilmiş çözeltinin bir mililitresi ile kaplayın.Kaplamalı tabakları oda sıcaklığında en az üç saat veya bir gecede dört santigrat derecede kuluçkaya yatırın. İnatzar matriksüzerinde yetişen koloni tipi H9 insan embriyonik kök hücrelerinbesleyicisiz kültürlerini geçişiçin, kuyulardan ortayı aspire edin ve bir mililitre DPBS ile bir kez yıkayın. Her kuyuya bir mililitre Dispase çözeltisi ekleyin ve plakayı 37 derecede 20 dakika kuluçkaya yatırın.Dispase çıkarın ve yavaşça dMEM/ F-12 iki mililitre ile bir kez hücreleri yıkayın. Yıkadıktan sonra ortayı çıkarın ve her kuyuya iki mililitre DMEM/F-12 ekleyin. Kolonileri yukarı ve aşağı borularla yavaşça ayırın ve 15 mililitrelik bir tüpe aktarın.Tüpü 370 kez g'de iki dakika santrifüj edin. Orta aspiratör. Daha sonra hücre peletlerini iki mililitre hücre ayırma çözeltisi ekleyerek ve 37 derecede 10 dakika kuluçkaya yatırarak tek bir hücreye ayırın.Santrifüj'u tekrarlayın ve ayırma çözümlerini çıkarın. mTeSR-1 insan ESC ortamındaki hücreleri yavaşça yukarı ve aşağı borular oluşturarak yeniden askıya alın. Koloni tipi insan embriyonik kök hücrelerini tek bir hücre tipi kültüre uyarlamak için, 10 mikromolar ROCK inhibitörü içeren iki mililitre mTeSR-1'deki bodrum membran matris kaplamalı plakanın her bir kuyusuna yaklaşık 1,5 ila iki milyon hücre yerleştirin.24 saat sonra, rock inhibitörü olmadan taze mTeSR-1 ile orta değiştirin. Hücrelerin günlük ortamı değiştirerek üç gün boyunca tek bir hücre tipi olarak büyümesine izin verin. Dördüncü gün, ayırma çözeltisi hücreleri ayırmak ve daha önce açıklandığı gibi onları yeniden plaka.Hücreleri el yazması talimatlara göre yeniden suladıktan ve kuluçkaya yattıktan sonra, küçük embriyonik bedenleri 15 mililitrelik bir tüpe aktarın, dibe yerleşin ve bir pipetle ortamı nazikçe çıkarın. EB ortamına aktarın ve yedi gün boyunca düşük ek tabaklarda genişletmelerine izin verin. Nöral progenitor hücre veya NPC farklılaşmasını sağlamak için, tek hücre tipi insan embriyonik kök hücrelerini bir mililitre ayırma solüsyonu ile ayırın ve 10 dakika boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın.Hücreleri 370 kez g iki dakika santrifüj edin. Ayırma çözeltisini süpernatant'ı çıkarın. Daha sonra DMEM/F-12'deki hücreleri yeniden askıya alın.Bir bodrum membran matris üzerinde plaka 10 mikromolar ROCK inhibitörü ile mTeSR-1 iki mililitre de beşhücre başına iki kez 10 bir yoğunlukta altı iyi plaka kaplı. 24 saat sonra, bir mikromolar Dorsomorphin ve beş mikromolar SB431542 ile takviye nöral indüksiyon ortamı ile kültür ortamı değiştirin. Nöral indüksiyonun ilk dört günü boyunca her gün orta yı değiştirin, sonra yedinci günde biraraya gelene kadar her gün.Nöral indüksiyon yedi gün sonra, ayırma çözeltisi bir mililitre ekleyerek hücreleri ayırmak ve 37 santigrat derece 10 dakika kuluçka. Hücreleri 370 kez g'de santrifüj edin ve ayırma solüsyonunu süpernatant olarak çıkarın. Bir mililitre NPC genişletme ortamı ekleyin ve hücreleri yavaşça tekrar askıya almak için yukarı ve aşağı pipetler ekleyin.Sonra taban membran matris altı iyi plakalar kaplı NPC genişleme aracı iki mililitre de başına beşhücre başına bir kez 10 plaka. Kültürler ilk üç ila dört pasajda 10 mikromolar ROCK inhibitörü ekleyerek %90 biraraya geldiğinde hücreleri gerektiği gibi iletin. Genişletme sırasında ortamı her gün değiştirin.PLO laminin kaplı plakalar hazırlamak için, PBS veya su plo stok çözeltisi mililitre başına 10 mikrogram nihai konsantrasyonseyreltmek, iyi karıştırın, sonra çözeltinin bir mililitre ile altı kuyuplaka her iyi kat. Plakaları en az iki saat boyunca 37 derecede veya bir gecede dört santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Daha sonra, her kuyuyu PBS ile yıkayın ve paltodan hemen sonra her kuyuda el yazması talimatlara göre hazırlanan bir mililitre laminin çözeltisi ile yıkayın.Plakaları bir haftaya kadar dört derecede tutun. NPC'leri dopaminerjik nöronlara ayırmak için, NPC genişleme ortamındaki FKÖ laminin kaplı kaplanmış tabaklarda 24 saat sonra yaklaşık %50 yoğunlukta hücreleri plakalayın, ortayı DA1 olarak değiştirin ve bundan sonraki her gün ortayı değiştirin. Kültürleri biraraya geldiklerinde geçiş için, hücreleri bir mililitre ayırma çözeltisi ile ayırın ve 37 santigrat derecede 10 dakika kuluçkaya yatırın.Sonra 370 kez g onları santrifüj ve ayırma çözeltisi supernatant kaldırın. PLO laminin kaplı altı kuyulu plakalar üzerinde orta iki mililitre de DA1 orta ve plaka bir mililitre hücreleri bir mililitre ve plaka bir kez 10. NPC'leri astrositlere ayırmak için, FKÖ laminin plakaları üzerindeki hücreleri ve NPC genişleme ortamını %50 yoğunlukta plakalayın ve 24 saat sonra ortayı astrosit ortamına dönüştürün ve hücreleri daha önce açıklandığı gibi iletin.Koloni tipi insan embriyonik kök hücreleri tek hücre tipi kültüre uyarlandığında, hücreler yüksek yoğunlukta muhafaza edilebildiği, daha sonra biraraya geldiğinde kolayca ve verimli bir şekilde alt kültürlühale getirildi. Bu hücreler kısa bir G1 fazı ve S fazı hücrelerinin yüksek oranda gibi koloni tipi insan embriyonik kök hücrelerintipik hücre döngüsü özelliklerini korudu. Kantitatif PCR analizi de koloni tipi hücrelerinkilerle karşılaştırılabilir seviyelerde ESC belirteçleri ifade doğruladı.Ayrıca, tek hücreli insan embriyonik kök hücrelerinin her üç mikrop katmanından hücreler içeren embriyoid cisimler oluşturabildiği gösterilmiştir: endoderm, mezoderm ve ektoderm. Daha sonra, tipik insan embriyonik kök hücre morfolojisi ve NPC morfolojisinin görünümü nde belirtildiği gibi, tek hücre tipi insan embriyonik kök hücrelerinin npc'lere etkin bir şekilde farklılaştırdığı gösterilmiştir. Farklılaşma, imza NPC belirteçlerinin artan ekspresyonu ile desteklenmiş ve immünostaining ve FACS analizi ile doğrulanmış.Aynı analiz aynı zamanda hücrelerin %90'ından fazlasının SOX1, PAX6 ve NCAM proteinleri için pozitif olduğunu göstermiştir. Ayrıca, türetilmiş NCD'ler karakteristik morfolojileri ve soya özgü belirteçlerin ekspresyonu ile belirtildiği gibi dopaminerjik nöronlar ve astrositler ayırt başardık. Bu prosedürü denerken, sağlıklı, farklılaşmamış insan embriyonik kök hücre kültürünü korumak için insan embriyonik kök hücrelerini yüksek yoğunlukta kaplamak esastır.Bu protokol, temel çalışma, ilaç taraması ve nörodejeneratif tıpta uygulama için ölçeklenebilir olacak ata ve farklılaştırılmış hücrenin basit, sağlam ve ölçeklenebilir üretimi için bir platform sağlar.

efficient-neural-differentiation-using-single-cell-culture-human

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Biz insan nöronal atalarıdır ve sinir onarımı için gelişmekte olan MSS nöronal hücre tipleri büyük bir arz türetme sağlayan küçük moleküller ile tanımlanan koşullar altında tutulan pluripotent insan embriyonik kök hücreleri doğrudan neuroblasts indüksiyonu için bir protokol kurduk.

Küçük Molekül İndüksiyon Pluripotent İnsan Embriyonik Kök Hücreleri İnsan Nöronal atalarıdır ve Nöronlar Verimli türetilmesi

Pluripotent insan kök hücrelerinin nöronal farklılaşma (hPSCs) için Protokoller genellikle zaman alıcı ve önemli hücre kültürü becerileri gerektirir. Burada, kontrollü bir şekilde insan nöronlarının, basit, hızlı ve verimli üretimi sağlayan bir multititre plaka biçiminde küçük bir moleküldür tabanlı farklılaşma prosedürü adapte var.

Bir Multititre Plaka Biçimi İnsan Pluripotent Kök Hücreler Nöron Hızlı ve Verimli Üretim

Bu video, insan embriyonik kök hücrelerinin veya hESC'lerin, besleyici hücreler veya herhangi bir ara adım kullanmadan doğrudan nöral progenitör hücrelere farklılaşmasını göstermektedir. Kemik morfogenetik proteininin veya BMP'nin seçici inhibisyonu ve transforme edici büyüme faktörü-beta veya TGF-β sinyal yolakları, hESC'lerin nöral progenitör hücrelere veya NPC'lere farklılaşmasına yol açar.

İnsan Embriyonik Kök Hücrelerinin Nöral Progenitörlere Farklılaşması

Bu video, işleyen sinapslara sahip ağa bağlı bir nöron popülasyonuna embriyonik kök hücre farklılaşması için bir tekniği göstermektedir. Embriyonik kök hücrenin nöronlara farklılaşması, nöronal ağ oluşumunun indüklenmesi ve kültürün ağa bağlı nöronlarla zenginleştirilmesi ile ilgili aşamaları ana hatlarıyla belirtir.

Fare Embriyonik Kök Hücrelerini Ağa Bağlı Bir Nöron Popülasyonuna Farklılaştırmak

Bir yöntem de periferik kan hücrelerinden zenginleştirilen hematopoietik projenitör hücrelerinden insan nöral kök hücrelerini elde etmek için geliştirilmiştir.

Periferik kan Hematopoetik Progenitör Hücreleri İnsan Sinir Kök Hücre Doğrudan İndüksiyon

Farklılaşmış insan nöral kök hücreleri (hNSC'ler) üzerindeki miRNA'lardaki değişiklikleri karakterize etmek amacıyla, üç boyutlu bir sistemde hNSC farklılaşmasını, miRNA PCR dizisi ile mikroRNA ekspresyonundaki değişikliklerin değerlendirilmesini ve miRNA hedef tahmini için hesaplamalı analizi ve ikili lusiferaz testi ile doğrulanmasını açıklıyoruz.

Üç Boyutlu Kültürleri, mıkroRNA Analizi ve Putatif Hedef Genler üzerinde bir İnsan Sinir Kök Hücre Hattı Farklılaşma

Bu protokol, serum içermeyen tek katmanlı bir yöntem kullanarak embriyonik kök hücrelerden nöral progenitörler üretme yöntemini ayrıntılı olarak açıklar. Bu progenitörler, olgun nöral hücre tiplerini türetmek veya nöral spesifikasyon sürecini incelemek için kullanılabilir ve bileşik tarama için çok kuyulu format ölçeklendirmesine uygundur.

Serum serbest Tek tabakalı Kültüründe Fare Embriyonik Kök Hücre Sinir Farklılaşma

Burada embriyonik kök hücrelerden nöronlara hızlı ve verimli farklılaşmayı yönlendiren düşük maliyetli ve kullanımı kolay bir yöntem kurduk. Bu yöntem laboratuvarlar arasında popülerleşmeye uygundur ve nörolojik araştırmalar için yararlı bir araç olabilir.

Fare Embriyonik Kök Hücre in vitro nöronal farklılaşma

Fare embriyonik kök hücrelerinin asma damlası yöntemini kullanarak nöronal hücrelere in vitro farklılaşması prosedürünü açıklıyoruz. Ayrıca RT-qPCR, immünofluoresans, RNA-seq ve akış sitometrisi ile kapsamlı bir fenotipik analiz gerçekleştiriyoruz.

Nöral Progenitörlerin ve Nöronların Fare Embriyonik Kök Hücrelerinden Farklılaşması ve Karakterizasyonu

Mevcut protokol, retinal organoidlerin yapışmasını ve füzyonunu yüksek tekrarlanabilirlik ve verimlilikle azaltan optimize edilmiş bir 3D nöral retina indüksiyon sistemini tanımlamaktadır.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Nöral Retina Üretimi

Öğrenin, insan embriyonik kök hücrelerinin tek hücre kültürü yöntemiyle nöral öncü hücrelere verimli farklılaşmasını. Bu ölçeklenebilir protokol, ilç tarama ve rejeneratif tıp için değerli bir araç sunar.

İnsan Embriyonik Kök Hücrelerinin Tek Hücre Kültürünü Kullanarak Etkin Nöral Farklılaşma

Daha fazla video keşfet