Name: Kronik Pseudomonas aeruginosa Yara Enfeksiyonu Gecikmiş Aşılama Modeli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Öğrenin, gecikmiş aşılama ile immün yetenekli farelerde kronik Pseudomonas aeruginosa yara enfeksiyonu modeli oluşturmayı. Bu yöntem bakteri patogenezini ve konak-patojen etkileşimlerini incelemek için değerlidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

pUT-Tn5-EM7-lux-Km1 parlak yapı vektörj Hardy zarif bir hediye oldu. Şemalar BioRender.com ile oluşturuldu. G. Gurtner'ın laboratuvarına yara enfeksiyonu modeli hakkındaki tavsiyelerinden dolayı teşekkür ederiz. Ayrıca Stanford In Vivo Imaging Yenilik Merkezi'nden T. Doyle'a teknik uzmanlığı için teşekkür ederiz. Bu çalışma R21AI133370, R21AI133240, R01AI12492093 hibeleri ile desteklenmiş ve Stanford SPARK, Falk Medical Research Trust ve Kistik Fibrozis Vakfı'ndan (CFF) P.L.B. C.R.D.'ye verilen hibeler T32AI007502 tarafından desteklenmiştir. Gabilan Stanford Bilim ve Mühendislik Yüksek Lisans Bursu ve Lubert Stryer Bio-X Stanford Disiplinlerarası Yüksek Lisans Bursu J.M.S. tarafından desteklendi.

Burada açıklanan tüm yöntemler Stanford Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
1. Bakterilerin hazırlanması ve büyümesi
<ol><li>P. aeruginosa ve hayvanlarla, araştırmacının kurumsal biyogüvenlik komitesi ve hayvan kullanım komitesi yönergelerine göre BSL-2 önlemleri ile tüm çalışmaları gerçekleştirin. Burada p. aeruginosaiçeren açıklanan tüm adımları yapın , fare aşılama dahil, bir biyogüvenlik kabine.</li>
	<li>Parlak PAO1:lux P. aeruginosa suş isteği üzerine laboratuarımızdan kullanılabilir. Streak PAO1, dondurulmuş gliserol stok olarak depolanan, Lysogeny Suyu (LB) agar. Parlak PAO1:lux suşu için LB agar selektif antibiyotikler içermelidir (100 μg/mL carbenicillin ve 12.5 g/mL kanamisin). Bir bakteri kuvözde bir gecede 37 °C'de büyüyün.</li>
	<li>İzole bir koloni seçin ve 3 ml LB orta, pH 7.4 37 °C'de bir gecede büyümek. Parlak suşlar için, suyu 100 μg/mL carbenicillin içermelidir. Sallayarak, aerobik koşullar altında büyümek.</li>
</ol>2. Prosedür hazırlığı
<ol><li>Ameliyat yapan tüm personelin temiz bir gece elbisesi/Laboratuvar önlüğü, yüz maskesi, saç ağı ve eldiven giymesini önleyin.</li>
	<li>Makas ve forceps dahil olmak üzere tüm cerrahi aletler, otoklav. Hayvanlar arasında araçları sterilize etmek için aseptik tekniği kullanın.</li>
	<li>Cerrahi tabloyu etanol ile temizleyin ve temiz bir cerrahi alan hazırlayın.</li>
</ol>3. Epilasyon
<ol><li>Anestezi 8-12 haftalık C57BL/6J fareler kullanarak 1%-3% isoflurane. Müfettişler isoflurane kullanırken anestezi için kendi kurumun veteriner personel yönergeleri ne zaman takip etmelidir.<ol>
<li>%1-3 izofluran vererek anesteziye başlayın ve oksijen akış hızını 1,5 L/dk'ya ayarlayın. Fareyi indüksiyon odasına yerleştirin.</li>
		<li>Anestezinin derinliğini değerlendirmek için farenin parmak parmaklarını çimdikleyin. Fare artık uyarıma yanıt vermediğinde, indüksiyon odasından çıkarın ve burnu izoflurane burun konisine burun ile cerrahi tezgahüzerine yerleştirin.</li>
		<li>Her iki göze de göz yağlayıcı uygulayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Temel işlem öncesi ağırlık elde etmek için fareyi tartın.</li>
	<li>Fareyi eğilimli bir konuma yerleştirin. Fareye önceden ısıtılmış steril %0,9 sodyum klorür, her bir kanadında toplam 500 μL için 250 μL enjekte edin.</li>
	<li>Elektrikli tıraş layıcı kullanarak farenin sırt alanını tıraş edin. Yaranın saç kontaminasyonunu önlemek için cerrahi istasyondan farklı bir yerde tıraş yapılmalıdır.</li>
	<li>Epilasyon losyonu ince bir tabaka uygulayın. Losyon 20-60 s. Sıcak suda nemlendirilmiş gazlı bez ile saç ve aşırı losyon çıkarın. Epilasyondan sonra eksizyonel yaralama işlemine devam edin.</li>
</ol>4. Tam kalınlıkta eksizyonel yara cerrahisi
<ol><li>Farenin orta dorsal bölgesinde 25 G iğne kullanarak 0.6-1 mg/kg deri altı serbest buprenorfin enjekte edin. Yavaş salınımlı buprenorfin 48-72 saat üzerinde ağrı kesici sağlar.</li>
	<li>Ameliyat bölgesini dezenfekte edin. Steril betadine bezi ile dorsal yüzeyi silin. Steril bir alkol bezi ile aşırı betadine silin. Bu 3 kez yapılmalıdır (betadin ve alkol arasında dönüşümlü), kenarına dairesel bir şekilde merkezinden hareket ederek swabbing. Alanın kurumasını bekleyin.</li>
	<li>Steril gazlı bez veya plastik yapışkan şal kullanarak cerrahi siteyi çevreleyen bir perde oluşturun.</li>
	<li>Streç cilt gergin caudally. Sol dorsal epidermis ile ilk kesi yapmak için steril 6-mm çapında deri biyopsisi yumruk kullanın. Sağ dorsal epidermis tekrarlayın.</li>
	<li>Sol ana hatlı yara alanının merkezinden deri çadır için forceps kullanın. Makas kullanarak epidermal ve dermal tabakaları özelleştirin. Simetrik eksizyonel yaralar oluşturmak için sağ daki yara bölgesini tekrarlayın.</li>
	<li>Yaraları 50 μL steril salin ile yıkayın. Cerrahi bölge ve çevresindeki cildin kurumasını bekleyin. Sonra, şeffaf bir film pansuman ile yaraları ve dorsum kapağı.</li>
	<li>Fareyi temiz bir kafese geri yerleştirin. Kafes başına ev 1 hayvan.</li>
	<li>Kafesi Bir ısıtma yastığına yerleştirin ve fare uyanana kadar izleyin.</li>
	<li>Birden fazla hayvan üzerinde yukarıdaki ameliyatı yaparken, hayvanlar arasındaki tüm cerrahi aletleri temizlemek için sıcak boncuk sterilizatör kullanın.</li>
	<li>Farelerin cerrahi işlemden sonra iyileşmesi ve bakterilerle aşılamaya başlamadan önce yaraların üzerinde geçici bir yara matrisi oluşması için 24 saat bekleyin.</li>
</ol>5. P. aeruginosa ile aşılama
<ol><li>OD600 için bir gecede PAO1:lux kültürü seyreltin = 0.05 LB medya 75 mL içinde 100 μg/mL carbenicillin içeren ve kültür erken üstel faz (OD600 』 0.3) kadar bakteri büyümek. Bu yaklaşık 2-3 saat sürer.</li>
	<li>PBS'de seyreltik PAO1:lux konsantrasyonu (7.5 ± 2.5) x 102 CFU/mL. Yeterli hacim sağlamak ve deneyden sonra kaplama için izin vermek için aşırı inokül hazırlamak için emin olun. Tesisler arasında taşıma (yani laboratuvardan vivarium'a) taşıyorsanız, Biohazard olarak açıkça işaretlenmiş bir sızıntı yalıtım kutusunda çift çevreleme kullanın.</li>
	<li>P. aeruginosa ve fareler ile tüm çalışmaları hayvan biyogüvenlik seviyesi 2 (ABSL-2) onaylı biyolojik güvenlik kabininde (BSC) onaylanmış kişisel koruyucu ekipman kullanarak gerçekleştirin. Tartım terazisi gibi yeniden kullanılabilir ekipmanlar kontaminasyonu önlemek için sargı lı sargı ile kaplanmalıdır.</li>
	<li>Yukarıda açıklandığı gibi% 3 isoflurankullanarak anestezik. Fareyi tartın ve ağırlığı kaydedin. Fareye önceden ısıtılmış steril %0,9 sodyum klorür, her bir kanadında toplam 500 μL için 250 μL enjekte edin.</li>
	<li>Farenin saydam film pansumanı bir gecede çıktıysa, ortaya çıkan yarayı dikkatlice çıkarın ve yeni bir pansuman giyin.</li>
	<li>Her yaranın içine şeffaf film pansumanı ile 40 000 ADET PAO1:lux süspansiyon enjekte etmek için 500 μL tüberkülin 27 G emniyet kapağı şırıngası kullanın. Kontralateral taraftan çapraz kontaminasyonu önlemek için aşısız/PBS yara kontrolleri için farklı fareler kullanılmalıdır.</li>
	<li>Fareyi bir ısıtma yastığının üzerine tekrar kafesine yerleştirin ve uyanana kadar izleyin. Çapraz kontaminasyonu önlemek için tüm fareler ayrı kafeslere ayrı ayrı yerleştirilmelidir.</li>
	<li>Kafesin zemininde gıda peletleri arasında sıkışmış yüksek kalorili besin takviyesi hamur sağlayın.</li>
	<li>Lb agar plaka çizgi için kalan inoculum kullanın. Verilen bakteri sayısını doğrulamak için kolonileri saymak.</li>
</ol>6. Enfekte yaraların in vivo görüntüleme
<ol><li>Farelerin görüntüleme cihazına ve görüntüleme cihazına taşınması için ikincil bir konteyner kullanımı da dahil olmak üzere BSL-2 kapsama protokollerini uygulayın. Farenin indüksiyon odasına veya görüntüleme aletine transferi sırasında herhangi bir hayvan yatakını aktarmamaya veya düşürmemeye dikkat edin.</li>
	<li>Adım 3.1'de açıklandığı gibi indüksiyon odasında inhale %1-3 izofluran ile farenin anestezisini indükler.</li>
	<li>Fare anestezi edildikten sonra, izofluran burun konisinde burun ile optik görüntüleme sisteminin görüntüleme odasında eğilimli bir konuma yerleştirin.</li>
	<li>Yazılım programını açın.</li>
	<li>Edinme parametreleri aynı anda görüntülenilen hayvan sayısına ve biyolüminesans yoğunluğuna bağlı olarak değişir. Ayarlanan temel parametreler pozlama süresi, binning, f/stop ve görüş alanı (FOV) içerir. Varsayılan başlangıç ayarlarımız pozlama süresi 30 saniyedir, düşük (2), f/stop 1.2 ve FOV 25'tir. Bu ayarları araştırmacının ihtiyaçlarına bağlı olarak gerektiği gibi ayarlayın.</li>
	<li>Bir görüntüleme programı kullanarak parlaklık verilerini analiz edin (bkz. Malzemeler Tablosu). Luminescence farelerin renkli bir fotoğraf üzerine kaplanmış bir psödocolor görüntü olarak temsil edilecektir.<ol>
<li>Yara yerinde ilgi çekici bir bölge (ROI) oluşturun ve tespit edilen ortalama akısı (foton/saniye) ölçün. Verilerin parlaklık (foton/saniye/cm²/steradian) olarak da rapor edilebildiği, ancak görüntüleme platformunun kameradan uzaklığı görüntüleme arasında sabit kaldığı sürece akı yeterli olduğu unutulmamalıdır.</li>
		<li>Görüntüleme platformunda rasgele bir alanda bir yatırım getirisi oluşturarak arka planı ölçün. Fotonların/saniyenin arka plan numarasını çıkarın.</li>
		<li>Daha fazla analiz için verileri bir elektronik tabloya dışa aktarın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Enfeksiyon ilerlemesini izlemek için günlük olarak sık sık yukarıda açıklandığı gibi görüntüleme gerçekleştirin.</li>
</ol>7. Postoperatif yönetim
<ol><li>Fareleri araştırmacının IACUC protokolü tarafından belirlenen kurallara göre izleyin. İlk 4 gün boyunca tüm fareleri her gün, sonra deney sonuna kadar her gün izliyoruz. Fareleri ameliyat sonrası ilk 4 gün boyunca günde bir kez BSC'de tartın. Enfeksiyon sonrası 1 ve 2 gün lerinde 250 μL %0,9 sodyum klorür enjekte edin.</li>
	<li>Kambur duruş, pasaklı palto, uyuşukluk, nefes alma da dahil olmak üzere farelerde ağrı / sıkıntı belirtileri olup yok, yüz grimace, ve kilo kaybı.</li>
	<li>Hayvanlar da sağlığının kötüye gittiğine dair belirtiler gösteriyorsa, bir veterinere danışın. Ağrı / sıkıntı ve% 20 veya daha fazla bir kilo kaybı kötüleşen belirtileri göstermek için görünen herhangi bir fare ötenazi olmalıdır.</li>
</ol>8. Yara eksizyonu
<ol><li>Deneyin sonunda, CO2 inhalasyonu kullanarak fareleri kurban edin, ardından servikal çıkış. Hayvan leşini kurumun ABSL-2 protokollerine göre atın.</li>
	<li>BSC'de steril makas ve forceps kullanarak yara yataklarını özel olarak çıkar. Her yara yatağını 1 mL steril PBS'ye 1,5 mL polipropilen tüpe yerleştirin. Yara dokusunu makasla doğrama. Tüm yaralar enfekte olarak kabul edilmese bile ASBL-2 olarak tedavi edilmelidir.</li>
	<li>4 °C'de 2 saat için 300 rpm bir shaker üzerinde kuluçka. Girdap 10 s için her tüp ve seri PBS bakteriyel atık seyreltmek. Plaka lb agar üzerinde seyreltilmiş bakteriyel atık bakteriyel yükü sayısallamak için.</li>
	<li>Yarada ki Parlak sinyal arka plan parlaklığının üzerindeyse ve yara atıklarında kontrol olarak PBS ile aşılanmış yaralardan daha fazla bakteri tespit edilirse, enfekte olmuş yaraları düşünün.</li>
</ol>

<ol><li>Sen, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skin+wounds%3A+a+major+and+snowballing+threat+to+public+health+and+the+economy%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy.</a> Wound Repair and Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).</li>
<li>Serra, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+wound+infections%3A+the+role+of+Pseudomonas+aeruginosa+and+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Anti-infective+Therapy%22%5BJournal%5D)">Chronic wound infections: the role of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus.</a> Expert Review of Anti-infective Therapy. 13 (5), 605-613 (2015).</li>
<li>Obritsch, M. D., Fish, D. N., MacLaren, R., Jung, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nosocomial+infections+due+to+multidrug-resistant+Pseudomonas+aeruginosa%3A+epidemiology+and+treatment+options%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">Nosocomial infections due to multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa: epidemiology and treatment options.</a> Pharmacotherapy. 25 (10), 1353-1364 (2005).</li>
<li>Secor, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filamentous+Bacteriophage+Produced+by+Pseudomonas+aeruginosa+Alters+the+Inflammatory+Response+and+Promotes+Noninvasive+Infection+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Filamentous Bacteriophage Produced by Pseudomonas aeruginosa Alters the Inflammatory Response and Promotes Noninvasive Infection In Vivo.</a> Infection and Immunity. 85 (1), (2017).</li>
<li>Rice, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biofilm+life+cycle+and+virulence+of+Pseudomonas+aeruginosa+are+dependent+on+a+filamentous+prophage%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">The biofilm life cycle and virulence of Pseudomonas aeruginosa are dependent on a filamentous prophage.</a> The ISME Journal. 3 (3), 271-282 (2009).</li>
<li>Bayes, H. K., Ritchie, N., Irvine, S., Evans, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+model+of+early+Pseudomonas+aeruginosa+lung+disease+with+transition+to+chronic+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A murine model of early Pseudomonas aeruginosa lung disease with transition to chronic infection.</a> Scientific Reports. 6, 35838(2016).</li>
<li>van Gennip, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+polymorphonuclear+leukocytes+and+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+on+silicone+implants+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Interactions between polymorphonuclear leukocytes and Pseudomonas aeruginosa biofilms on silicone implants in vivo.</a> Infection and Immunity. 80 (8), 2601-2607 (2012).</li>
<li>Trøstrup, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+aggravates+skin+inflammatory+response+in+BALB%2Fc+mice+in+a+novel+chronic+wound+model%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa biofilm aggravates skin inflammatory response in BALB/c mice in a novel chronic wound model.</a> Wound Repair and Regeneration. 21 (2), 292-299 (2013).</li>
<li>Zhao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+study+of+delayed+wound+healing+in+a+biofilm-challenged+diabetic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Time course study of delayed wound healing in a biofilm-challenged diabetic mouse model.</a> Wound Repair and Regeneration. 20 (3), 342-352 (2012).</li>
<li>Brubaker, A. L., Rendon, J. L., Ramirez, L., Choudhry, M. A., Kovacs, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+neutrophil+chemotaxis+and+infiltration+contributes+to+delayed+resolution+of+cutaneous+wound+infection+with+advanced+age%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunolology%22%5BJournal%5D)">Reduced neutrophil chemotaxis and infiltration contributes to delayed resolution of cutaneous wound infection with advanced age.</a> Journal of Immunolology. 190 (4), 1746-1757 (2013).</li>
<li>Watters, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+perturb+wound+resolution+and+antibiotic+tolerance+in+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa biofilms perturb wound resolution and antibiotic tolerance in diabetic mice.</a> Medical Microbiology and Immunology. 202 (2), 131-141 (2013).</li>
<li>Lee, C., Kerrigan, C. L., Picard-Ami, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclophosphamide-induced+neutropenia%3A+effect+on+postischemic+skin-flap+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Cyclophosphamide-induced neutropenia: effect on postischemic skin-flap survival.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 89 (6), 1092-1097 (1992).</li>
<li>Sweere, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+response+to+Chronic+Pseudomonas+aeruginosa+wound+infection+in+immunocompetent+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">The immune response to Chronic Pseudomonas aeruginosa wound infection in immunocompetent mice.</a> Advances in Wound Care. , (2019).</li>
<li>Sweere, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophage+trigger+antiviral+immunity+and+prevent+clearance+of+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacteriophage trigger antiviral immunity and prevent clearance of bacterial infection.</a> Science. 363 (6434), (2019).</li>
</ol>

Yazarların ifşa etmek için hiçbir rakip mali çıkarları var.

Biz yeni bir gecikmiş inoülsülasyon P. aeruginosa yara enfeksiyonu modeli geliştirdik. Eksizyoniyal yarası sonrası bakterilerle aşılamayı 24 saate kadar geciktirme stratejisi, yara enfeksiyonlarının 1 haftalık bir zaman dilimi içinde değerlendirilmesini sağlar. P. aeruginosabir Parlak suşu kullanarak , enfeksiyon ders boyunca enfeksiyon ilerlemesini izlemek mümkündür. Diğer P. aeruginosa enfeksiyon modellerine göre enfeksiyonun uzun seyri, ev sahibi-patojen etkileşimlerini ve P. aeruginosa<...

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa)insan sağlığı ve hastalığı ile artan alaka ile gram-negatif çubuk şeklinde bir bakteridir. Nosokomial ortamlarda, özellikle immünazasyonsuz hastalarda yara enfeksiyonlarını içeren geniş morbidite ve mortaliteden sorumludur1,2. Bu patojenin çoklu ilaca dirençli suşlarının ortaya çıkması P. aeruginosa virülans, P. aeruginosa antibiyotik direnci mekanizmaları ve bu ölümcül enfeksiyonun önlenmesi ve tedavisi için yeni yöntemler katkıda bulunan faktörlerin araştırılması için daha fazla ivme sağlamıştır3. Bu nedenle, bu araştırma soruları araştırmak için araç olarak kronik yara enfeksiyonu hayvan modelleri için ihtiyaç daha büyük olmamıştı.
Ne yazık ki, P. aeruginosa enfeksiyonu birçok hayvan modelleri yeterli bu enfeksiyonların oftentimes kronik doğasını taklit etmez sepsis4,5nedeniyle enfeksiyon veya hızlı düşüş hızlı çözünürlüğü ile akut enfeksiyon simüle eğilimindedir. Bu dezavantajı gidermek için, bazı modeller agar boncuk, silikon implantlar veya aljinat jeller6,7,8gibi yabancı cisimlerin implantasyonu kullanmak. Diğer modeller ileri yaş, obezite veya diyabet nedeniyle bağışıklık veya siklofosfamid kaynaklı nötropeni9,10,11,12gibi farmakolojik yollarla bağışıklık bozulan fareler kullanın. Ancak, yabancı maddelerin kullanımı ya da bağışıklık bozulmuş konaklar büyük olasılıkla yerel inflamatuar süreci değiştirir, zor aksi normal bağışıklık sistemleri ile konaklarda kronik yara enfeksiyonları dahil patofizyolojisi bir anlayış kazanmak için yapım.
Farelerde eksizyonel yarası sonrası bakterilerle gecikmiş aşılama içeren kronik bir P. aeruginosa yara enfeksiyonu modeli geliştirdik. Gecikmiş aşılama, en az 7 güne kadar uzanan bakteriyel yükü değerlendiren deneylere olanak sağlar. Bu model hem patogenezi hem de P. aeruginosa kronik enfeksiyonların yeni tedavileri için yeni fırsatlar sunmaktadır.

<table><tbody><tr><td>% 0.9 Sodyum Klorür enjeksiyonu</td><td>Hospira</td><td>2484457</td><td></td></tr><tr><td>18 G x 1 steril iğne</td><td>BD</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>25 G x 1 1/5 steril iğne</td><td>BD</td><td>305127</td><td></td></tr><tr><td>Alkollü çubuk</td><td>BD</td><td>326895</td><td></td></tr><tr><td>Aura Görüntüleme Yazılımı</td><td>Spektral Aletler Görüntüleme</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Purdue Frederick Şirketi</td><td>19-065534</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfin SR LAB</td><td>Zoopharm</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J erkek fareler</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>Tek kullanımlık biyopsi zımbası, 6mm</td><td>Integra</td><td>33-36</td><td></td></tr><tr><td>İnce makas - Tungsten Karbür</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>14568-09</td><td></td></tr><tr><td>Cam Boncuk Kuru Sterilizatör</td><td>Harvard Aparatı</td><td>61-0183</td><td></td></tr><tr><td>Granül Agar</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP9744</td><td></td></tr><tr><td>Isıtma Yastığı</td><td>Miliard</td><td>804879481218</td><td></td></tr><tr><td>28 G iğneli insülin şırıngası</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>Lago X Görüntüleme</td><td>Sistemi Spektral Aletler</td><td>Görüntüleme n/a</td><td></td></tr><tr><td>LB suyu</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP1426</td><td></td></tr><tr><td>Leur-Lok 1 mL şırınga</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>Mini Arco Hayvan Düzeltici</td><td>Wahl Profesyonel</td><td>919152</td><td></td></tr><tr><td>Nair Bebek Yağı ile Epilasyon Losyonu</td><td>Kilise ve Dwight</td><td>n/a</td><td>Herhangi bir eczanede mevcuttur</td></tr><tr><td>Sekizgen Forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11041-08</td><td></td></tr><tr><td>Petri kabı</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Salin (PBS) 1x</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Pres ve Mühür Streç Sarma</td><td>Glad</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>SafetyGlide İnsülin şırıngası, 30 G iğne</td><td>ile BD</td><td>305934</td><td></td></tr><tr><td>Safetyglide İnsülin şırıngası, 1/2 mL, 30 G x 5/16 TW</td><td>BD</td><td>305934</td><td></td></tr><tr><td>Ölçeği</td><td>Ohaus Scout Pro</td><td>SP202</td><td></td></tr><tr><td>Supplical Besin Takviyesi</td><td>Henry Schein Hayvan Sağlığı</td><td>29908</td><td></td></tr><tr><td>Tegaderm, 6 cm x 7 cm</td><td>3M</td><td>1624W</td><td></td></tr></tbody></table>

kronik pseudomonas aeruginosa yara enfeksiyonu gecikmiş aşılama modeli

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa),özellikle diyabetik ve hastanede yatan hastalarda kronik yara enfeksiyonlarının belirlenmesinde, insan sağlığı ve hastalığı ile olan alakadüzeyinin giderek artan önemli bir nosokomiyal patojenidir. Yara patogenezinin araştırılmasına ve bu patojene karşı yeni tedavilerin geliştirilmesine yardımcı olmak için kronik enfeksiyon modellerine acil ihtiyaç vardır. Burada, tam kalınlıkta eksizyonel yaralanmadan 24 saat sonra gecikmiş aşı kullanan bir protokol açıklıyoruz. Şu anda mevcut olan geçici yara matrisinin enfeksiyonu, enfeksiyonun hızlı bir şekilde temizlenmesini veya yayılmasını engeller ve bunun yerine yabancı maddelerin implantasyonuna veya immün baskılanmasına gerek kalmadan 7-10 gün süren kronik enfeksiyon oluşturur. Bu protokol insanlarda ameliyat sonrası enfeksiyonun tipik bir temporal seyrini taklit eder. Bir Parlak P. aeruginosa suşu kullanımı (PAO1:lux) P. aeruginosa yara enfeksiyonları için bakteriyel yükün kantitatif günlük değerlendirme sağlar. Bu yeni model bakteriyel patogenezin araştırılmasında ve kronik P. aeruginosa yara enfeksiyonları için yeni tedavilerin geliştirilmesinde yararlı bir araç olabilir.

LuxABCDE muhabir sistemini (PAO1:lux) kodlayan bir plazmid ile PAO1'in parlak bir suşını kullanarak, farelerde eksizyonel yaralar uyguladık, bu yaraları planktonik P. aeruginosa 24 saat sonra aşıladık ve zaman içinde ölçülen bakteriyel yükü(Şekil 1 ve Şekil 2). Görüntüleme optik sistemi kullanılarak elde edilen temsili bir görüntü, bu modelin saptanabilir parlaklıkla sonuçverdiğini göstermektedir(Şek...

İmmün yetersiz farelerde kronik yara enfeksiyonları oluşturmak için gecikmiş bir aşılama protokolünü tanımladık.

Kronik Pseudomonas aeruginosa Yara Enfeksiyonu Gecikmiş Aşılama Modeli

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major nosocomial pathogen of increasing relevance to human health and disease, particularly in the setting of ...

Bu protokol, yabancı madde implantasyonu veya immün baskılama gerek kalmadan kronik Pseudomonas aeruginosa yara enfeksiyonu için bir model açıklar, çünkü önemlidir. Pseudomonas aeruginosa ile gecikmiş aşılama 24 saat sonra tam kalınlıkta eksizyonel yara prostalls hızlı açıklık ve bakteri yayılması, 7 ila 10 gün süren bir enfeksiyon oluşturur. Bu benzersiz model bakteriyel patogenez intifaları, konak patojen etkileşimleri ve kronik Pseudomonas aeruginosa yara enfeksiyonları için yeni tedavilerin geliştirilmesi için yararlı bir araç olacaktır.Prosedürün bir gösterisinde bana yardımcı olan Dan Liu, Bollyky Laboratuvarı'ndan bir tıp öğrencisi olacak. İşleme başlamadan önce, temel ağırlık elde etmek ve fareyi eğilimli konuma getirmek için sekiz ila 12 haftalık bir fareyi tartın. Pedal refleksine yanıt eksikliğini doğruladıktan sonra, fareye her kanadında önceden ısıtılmış steril %0,9 sodyum klorür 250 mikrolitre sodyum klorür enjekte edin.Farenin sırt alanından saç kaldırmak ve maruz kalan cilde piliç krem ince bir tabaka uygulamak için bir elektrikli tıraş makinesi kullanın. 20 ila 60 saniye sonra, ılık suda nemlendirilmiş gazlı bez ile saç ve aşırı losyonu çıkarın. Tam kalınlıkta eksizyonel yara cerrahisi için, ilk deri altı farenin orta dorsal alanda sürekli salınım buprenorfin kilogram başına 0,6 ila bir miligram enjekte etmek için 25 gauge iğne kullanın ve üç alternatif steril Betadine ve alkol bezleri ile dairesel bir şekilde cerrahi site silmek.Cerrahi site nin üzerine plastik bir yapışkan şal drap yerleştirin ve caudally cilt gergin germek. Cilt kuruduğunda, sol dorsal epidermis ile ilk kesi yapmak için steril altı milimetre çapında deri biyopsisi yumruk kullanın, sağ dorsal epidermis üzerinde ikinci bir kesi takip. Sol özetlenen yara alanının merkezinden cildi çadır ve epidermal ve dermal katmanları çıkarmak için makas kullanın forceps kullanın.Simetrik eksizyonel yaralar oluşturmak için sağ daki yara bölgesinde kesi tekrarladıktan sonra her iki yarayı 50 mikrolitre steril salin ile yıkayın. Cerrahi bölge ve çevresindeki cilt kuruduğunda, yaraları ve dorsum şeffaf bir film pansum ile kapatın ve fareyi tam recumbency kadar izleme ile bir ısıtma yastığı üzerinde temiz bir kafese yerleştirin. Ameliyattan 24 saat sonra, yeniden anestezi li fareyi tekrar tartın ve hayvana her iki tarafta da 250 mikrolitre önceden ısıtılmış steril klorür enjekte edin.Daha sonra, 27 gauge iğne ile donatılmış 500 mikrolitre tüberkülin emniyet kapağı şırınga içine parlak P.aeruginosa gerinim süspansiyon 100 mikrolitre yük ve her yara içine şeffaf film pansuman yoluyla bakteri süspansiyon 40 mikrolitre enjekte. Bakteriyel süspansiyonun iyi bir şekilde karıştırıldığından ve şeffaf pansumanın sağlam olduğundan emin olun. Şeffaf pansumanı iğne çerçevesi yan tarafı yukarı doğru sadece bir kez deldiğinizden emin olun.Daha sonra izleme ile bir ısıtma sayfasında kendi kafese fare dönmek ve kafesin zemin üzerinde gıda pelet arasında sandviç yüksek kalorili besin takviyesi yapıştırmak sağlar. Bir LB agar plaka üzerinde kalan inoculum plaka ve uygulanan bakteri sayısını doğrulamak için koloniler saymak. Enfekte yaraların canlı görüntülemesinde, farelerin görüntüleme aletine taşınması için biyo güvenlik seviyesi iki koruma protokolünü uygulayın ve anestezili fareyi görüntüleme odası içinde yatkın konuma yerleştirin.Görüntüleme yazılımında, pozlama süresini, binning, f-stop'u ve görüş alanını deney için uygun olarak ayarlayın. Daha sonra, yara yerinde ilgi bir bölge oluşturmak ve saniyede fotonlar ortalama algılanan akı ölçmek. Arka planı ölçmek için, görüntüleme platformunda rasgele bir alan üzerinde ilgi alanı oluşturun ve saniyede fotonların arka plan numarasını çıkarın.Deneyin sonunda, bir biyo güvenlik kabininde, yara yataklarını çıkarmak için steril makas ve çömeçler kullanın ve her yatağı 1,5 mililitrelik polipropilen tüpe bir mililitre steril PBS'ye yerleştirin. Makasla yara dokusunu doğrama ve doku parçalarını iki saat boyunca dakikada 300 dönüşte dört derece santigrat derecede bir çalkalayıcıya katarak. Kuluçka sonunda, girdap 10 saniye boyunca seri PBS bakteriyel atık seyreltilmiş ve lb agar üzerinde seyreltilmiş bakteriyel atık kaplama önce 10 saniye boyunca bakteriyel yükü ölçmek için.Görüntüleme optik sistemi kullanılarak elde edilen bu temsili görüntü, bu modelin tespit edilebilir parlaklık la sonuçverdiğini göstermektedir. Bu deneyde, enfeksiyon gün üç post aşılama doruğa ve biyolüminesans ve koloni sayıları hem dayalı yedi gün sonrası aşılama devam etti. Yaradan izole edilen bakterilerin kültürü, yara başına oluşan ölçülebilir koloni nin tespit edilen lüminesansla ilişkili olduğunu daha da göstermektedir.Enjeksiyondan hemen sonra ilk hızlı kilo kaybı olmasına rağmen, tuzlu enjeksiyonlar ve ek beslenme fareleri ilk ağırlıklarına geri getirebilir. Yaraların %50'sinin önemli ölçüde enfekte olacağı hesaplanan aşılama dozu, mililitre başına ikinci koloni oluşturan ünitelere yaklaşık 7.7 kat 10 olarak saptanmıştır. Mililitre başına dördüncü koloni oluşturan birimlere 10 kereden daha yüksek dozlar %100 enfeksiyon oranı sağlar.Pseudomonas aeruginosa için yeni potansiyel tedavileri araştırmak için yaralama ve aşılama prosedürlerinden sonra çeşitli topikal ve sistemik tedaviler uygulanabilir. Pseudomonas aeruginosa ve enfekte fareler ile tüm çalışmalar, araştırmacının kurumsal biyo güvenlik ve hayvan kullanım komitesi yönergelerine uygun olarak BSL-2 güvenlik önlemleri ile yapılmalıdır.

a-delayed-inoculation-model-chronic-pseudomonas-aeruginosa-wound

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Kaynak: de Vries, C. R. , et.al. Kronik Pseudomonas aeruginosa yara enfeksiyonunun gecikmiş aşılama modeli. J. Vis. Exp. (2020)Bu video, parlak bir film pansı ile kaplı iki tam kalınlıkta dorsal deri yarası taşıyan bir fareye parlayan Pseudomonas aeruginosa'nın gecikmeli aşılanmasını gösteriyor. Bu, biyofilm oluşumunu ve kronik enfeksiyonun oluşmasını kolaylaştırır. Düzenli biyolüminesans izleme, bakteri yükünün nicelendirilmesini ve enfeksiyon ilerlemesinin zamanla izlenmesini sağlar.

Kronik Pseudomonas aeruginosa cilt yarası enfeksiyonunun fare modeli geliştirilmesi 

Bu fare modelinde kalıcı, uzun vadeli kronik Pseudomonas aeruginosa enfeksiyonu kurmak için agar-boncuklar bir yöntem tarif eder.

Uzun Vadeli Kronik<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</emFarelerde&gt; Havayolu Enfeksiyon

Pseudomonas aeruginosa bakterisinin intratrakeal enjeksiyonu ile bir fare akciğer hasarı modeli geliştirdik. Bu model pnömoni sırasında akciğer hasarını taklit eder ve klinik olarak önemlidir.

Pseudomonas aeruginosa Kaynaklı Akciğer Hasarı Modeli

Konak-patojen etkileşimlerinin in vitro çalışması spesifik immün yanıtların karakterizasyonuna izin verirken, karmaşık yanıtların etkilerini gözlemlemek için in vivo modeller gereklidir. Candida albicans maruziyetini ve ardından Pseudomonas aeruginosa aracılı akciğer enfeksiyonunu kullanarak, ventilatörle ilişkili pnömoni patojenitesinde yer alan mikrobiyal etkileşimlerin bir fare modelini oluşturduk.

Mikrobiyal Toplulukları incelenmesi<em&gt; İn Vivo</em&gt;: Arası Ana aracılı Etkileşim Modeli<em&gt; Candida albicans</em&gt; Ve<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Airways

Burada gerçek zamanlı, non-invaziv, kollarındaki Pseudomonas aeruginosabiyofilm yara enfeksiyonları izleme için tüysüz fareler kullanan bir roman diyabetik fare modeli açıklar. Bu yöntem diğer bakteri ve genetiği değiştirilmiş mikroorganizmalar, çoklu türler biyofilmler, dahil olmak üzere enfeksiyon değerlendirmek ve antibiofilm stratejileri etkinliğini test etmek için adapte edilebilir.

Işık tarafa: In Vivo izleme bir diyabetik tüysüz fare modelinde kronik yaralarda Pseudomonas aeruginosa biyofilm enfeksiyonların

Burada tarif biz Candida albicans intradermal enjeksiyon sonra deri örnekleri histolojik ve moleküler analizi sağlayan bir protokol. Bu iletişim kuralı cilt yapısal bütünlüğünü korur ve doku-ikamet veya yeni alınan bağışıklık hücreleri gibi patojen dağıtım yerelleştirme için sağlar.

Derin Dermal enjeksiyon olarak bir Model Candida albicans deri enfeksiyonu histolojik analizler için

Kronik yaralar, tam kalınlıkta kutanöz bir yaradan sonra yüksek düzeyde oksidatif stres emilerek diyabetik fare modelindeki akut yaralardan gelişir. Yara katalaz ve glutatyon peroksidaz inhibitörleri ile tedavi edilir, cilt mikrobiyom mevcut bakteriler tarafından bozulmuş iyileşme ve biyofilm gelişimi ile sonuçlanan.

Diyabetik Farelerde Kronik Yaralar Oluşturma Protokolü

Tehlikeli patojenlerin neden olduğu periprostetik eklem enfeksiyonu (PEE) klinik ortopedide yaygındır. Mevcut hayvan modelleri, PJI'nin gerçek durumunu doğru bir şekilde simüle edemez. Burada, PJI için yeni terapötikler araştırmak ve geliştirmek için Candida albicans biyofilm ile ilişkili bir PJI fare modeli kurduk.

Farede Periprostetik Eklem Candida albicans Enfeksiyon Modeli

Antibiyotiklere dirençli kronik yaralar sağlık sistemi için büyük bir tehdittir. Biyofilm enfeksiyonları inatçı ve düşmancadır ve fonksiyonel yara kapanmasının yetersiz olmasına neden olabilir. Biyofilm ile enfekte tam kat kronik yaraların klinik olarak anlamlı bir domuz modelini sunuyoruz. Bu model, mekanik çalışmalar için olduğu kadar müdahaleleri test etmek için de güçlüdür.

Biyofilm Enfeksiyonu ve Görünmez Yaraların Domuz Modeli

Şu anda kronik bakteriyel enfeksiyonlara karşı ilaç taramasına uygun in vivo modellerin eksikliği vardır. Burada, zebra balığı larvalarında kalıcı bir enfeksiyon oluşturmak için bir Pseudomonas aeruginosa klinik izolatı ile yara enfeksiyonu için bir protokol açıklıyoruz.

Yaralı Zebra Balığı Larvalarında Kalıcı Pseudomonas aeruginosa Enfeksiyonunun Modellenmesi

Öğrenin, gecikmiş aşılama ile immün yetenekli farelerde kronik Pseudomonas aeruginosa yara enfeksiyonu modeli oluşturmayı. Bu yöntem bakteri patogenezini ve konak-patojen etkileşimlerini incelemek için değerlidir.

Kronik Pseudomonas aeruginosa Yara Enfeksiyonu Gecikmiş Aşılama Modeli

Daha fazla video keşfet