Gen Ekspresyonu Profilleme için Modifiye Yöntemi ile Tahıl Tohumlarından Yüksek Kaliteli Transkripsiyon Verilerinin Elde Edilmesi

Bu mikrodizi hibridizasyon yöntemi bilinen bir genom ile bir organizmadan örnekleri çok sayıda karşılaştırmak için yararlıdır. Yüksek iş elde etme sıralaması yaklaşımıyla karşılaştırıldığında, bu yöntemle oluşturulan veri miktarının kullanımı çok daha kolaydır ve daha da zorlaşır, daha uygun maliyetli bir şekilde analiz edilebilir. Prosedürü gösteren Dr.Christiane Seiler Gatersleben IPK de Rosis araştırma grubunda çalışan bir doktora sonrası bilim adamı olacaktır.

Gen ekspresyonu hibridizasyon kitini kullanarak mikrodizi hibridizasyonunu gerçekleştirmeden önce, üreticinin özelliklerine göre 10X blokaj maddesi hazırlayın ve 200 mikrolitre hacimde elde edilen engelleme maddesini aliquot layın. Ardından, bloke edici maddeyi kullanıma kadar eksi 20 derecede saklayın. Mikrodizi hibridizasyonunun olduğu gün, buz üzerindeki 10X bloke edici maddenin 200 mikrolitrelik bir kısmını eritin ve melezleme fırınını 65 santigrat dereceye ve Bir ısı bloğunu 60 santigrat dereceye ısıtın.

Üretici tarafından açıklandığı gibi her numune için parçalanma karışımını hazırlayın ve numuneleri bir girdap üzerinde hafifçe karıştırın. Girdap sonra, kısaca 60 derece Santigrat ısı bloğunda tam 30 dakika kuluçkadan önce bir mikrocentrifuge örnekleri aşağı spin. Kuluçka sonunda, 2X gen ekspresyonu hibridizasyon tamponu 25 mikrolitre ile parçalanma durdurmadan önce hemen bir dakika buz üzerinde her tüp serin, tüp başına dakika başına yüksek devrimler.

Nazik pipetleme ile karıştırın, herhangi bir kabarcıktanıtmak için büyük özen, ve ortam oda sıcaklığında tüpler santrifüj. Spinsonunda hemen buz tüm tüpleri yerleştirin ve mümkün olduğunca çabuk mikrodizi slayt içine her örnek yükleyin. Daha sonra, yavaş yavaş her conta iyi merkezine her hibridizasyon karışımı 44 mikrolitre dağıtmak, kabarcıklar tanıtmak önlemek için özen, ve herhangi bir kullanılmayan kuyulara hibridizasyon tampon 44 mikrolitre ekleyin.

Mikrodizi kaydırağini hemen conta kaydırağının üzerine doğru yönde yerleştirin, sıvı dökülmemeye özen söyleyin ve hibridizasyon tertibatını sıkıca kapatın. Sabit hava kabarcıklarının eksikliğini doğrulamak için montajı döndürün ve hibridizasyon odası montajını hibridizasyon fırını rotatoruna yerleştirin. Dönüş hızını dakikada 10 devire ayarlayın, sonra melezlemeye tam 17 saat boyunca 65 derecede nisbeten başlayın.

Numuneler melezlenirken, tablolarda belirtildiği gibi uygun yıkama arabelleklerinde üç yıkama kabı nı hazırlayın. Tam 17 saatlik hibridizasyondan sonra, tüy bırakmayan kağıtla kaplı bir laboratuvar tezgahındaki bir melezleme odasını sökün ve bir mikrodizi sandviçini, tampondaki tüm kaydırağı batırmadan eğimli bir pozisyonda bakan mikrodizi barkodu yla yıkama tamponu içeren bir tabağa aktarın. Forceps kullanarak, iki cam slayt ayırın ve conta yavaşça mikrodizi slayt üzerinde sıkı bir kavrama tutarken yemeğin altına damla izin.

Yavaşça havaya en az maruz kalma ile çanak iki mikrodizi raf içine hemen transferi için mikrodizi slayt yana kaldırın. Sekiz kaydırağınızda raf boyunca eşit olarak yerleştirildiğinde, raf tutucusunu takın ve tüm çanak iki kurulumu manyetik karıştırıcıya aktarın. Kurulumu tam olarak bir dakika boyunca hafifçe karıştırın.

Örnekler karıştırılırken, 37 santigrat derecekasyondan üçüncü tabağı ikinci bir manyetik karıştırıcıya aktarın. Sonra yavaşça kabarcıklar oluşturmadan üç çanak 37 derece santigrat yıkama tampon iki ekleyin. Karıştırma kuluçka sonunda, yavaşça ve yavaşça çanak üç slayt raf aktarın ve raf tutucu kaldırın.

Tam bir dakika karıştırdıktan sonra, yavaşça ve yavaşça çanak slayt rafkaldırmak ve dikkatle her slayt her iki tarafı kuru, kurutulur gibi bir slayt kutusuna yerleştirerek tiftik serbest kağıt kullanın. Slaytların 15 dakika kurumasını sağladıktan sonra, her mikrodizi slaytını barkod yukarı bakacak şekilde bir slayt tutucuya aktarın ve monte edilmiş slayt tutucuları barkod numarasına göre taramalı bir atlıkarıncaya ve sıraya yükleyin. Ardından, slaytları hemen tarayın.

Bu şekilde, RNA çıkarma kalitesini test etmek için bir çalışma dan temsili bir sonuç gösterilir. Arpa yaprakları gibi düşük nişasta içeriği örneklerinin tipik analizlerinde kloroplastlardan gelen ek ribozomal RNA bantları belirgindir. Arpa tohumu gibi yüksek nişasta içeriği örnekleri, sergi 18 ve 28S ribozomal RNA.

Kloroplast ribozomal RNA nedeniyle yaprak numuneleri gibi yeşil bitki dokuları için otomatik RNA bütünlüğü sayı değerinin hesaplanamayabileceğini unutmayın. Bu temsili analizde, özelleştirilmiş arpa mikrodizi çipine RNA hazırlama ve hibridizasyon gösterilmiştir. Izgara, yonganın her köşesinden elde edilen sinyallerin bir örneğini gösterir, buna arka plan ve kalibrasyon için kullanılan okuma noktalarında ani artış da dahildir.

Histogram, ilgili sinyal yoğunluklarına sahip saptanabilir noktasapasyonunu gösterir. Görüldüğü gibi, başarılı bir hibridizasyon sadece küçük aykırı geniş bir Gauss şeklinde eğri verir. Burada gösterilen tespit sinyalleri için kalite kontrol raporudur.

Melezleştirilmiş slayt için değerler sütun iki verilir ve kabul edilebilir değerler aralığı sütun dört gösterilir. Bu yöntem, genom hakkında önemli bilgilerin mevcut olduğu herhangi bir organizma için kurulmuş herhangi bir deneysel kurulumu ele almak için kullanılabilir. Laboratuvarımızda bu tekniğin kullanılması, büyüme stresinin indüksiyonu sonrasında pirinç ve arpadaki transkripsiyondeğişiklikleri karşılaştırmamızı ve analiz etmemizi sağladı.