İnsan Kan Akışını Taklit Eden Akış Döngüsü Modelinde Kanla Temas Eden İmplantların Hemokomuuyum Testi

Bu protokol, Uluslararası Standart Organizasyon yönergelerine göre kanla temas eden cihazların hemouyumluluk araştırması için bir model sunmaktadır. Bu model, trombotik olaylar için düşük arka plan ve antikoagülanların düşük konsantrasyonu kan parametresinin geniş bir analizini sağladığından, implanta karşılık gelen fizyolojik koşulları taklit etmek için idealdir. Hemokompatiyi değerlendirmek için basit bir yol sağladığından, bu yöntem biyomalzeme araştırmaları için idealdir.

Ayrıca klinik öncesi çalışmalarda da kullanılabilir. Heparin yüklemesi için ilk olarak 5.000 uluslararası üniteyi seyreltilmemiş heparin ünitelerini %0,9 sodyum klorür ile karıştırarak mililitre heparin konsantrasyonu başına 15 uluslararası birim elde edin. Daha sonra, üç nötr monovette santigrat ve donör başına üç ayrılmış monovettes seyreltilmiş heparin çözeltisi 900 mikrolitre ekleyin ve dört santigrat derece heparin yüklü monovettes saklayın.

Kan örneği toplamadan 30 dakika önce monovetteleri oda sıcaklığına yerleştirin. Monovettes ısındığında, tek bir plastik konteyner içine her donör tüm 27 mililitre kan havuzlama önce donör başına üç monovettes her içine kan dokuz mililitre toplamak. Akış halkasını hazırlamak için, nörovasküler lazer kesim implantı ile durum başına en az bir tüp yükleyin ve her tüpün bir ucunu %0,9 sodyum klorür dolu bir rezervuara yerleştirin.

Boşaltılmış bir tüpü rezervuara yerleştirin ve tüm tüpleri pompa başına bağlayın. Daha sonra her tüpün diğer ucunu bir ölçüm silindirine takın ve ölçüm silindirindeki dolgu seviyesini kontrol ederken bir zamanlayıcı kullanarak peristaltik pompanın ayarlarını dakikada 150 mililitrelik bir akış hızına ayarlayın. Hemokomupati testi için, her tüpü altı mililitre kanla doldurmak için 12 mililitrelik bir şırınga kullanın.

Bir devre oluşturduktan sonra, tüpleri sıkıca kapatmak ve tüpleri 37 derece lik bir su banyosuna yerleştirmek için 0,5 santimetre uzunluğunda silikon bağlantı borusu kullanın. O zaman 60 dakikalık tüpü çalıştırın. Tam kan sayımı analizi için, edta içeren tek monovettes perfüzyon sonra her tüpten perfüzyon kan 1.2 mililitre veya kan mililitre ekleyin.

Monovetteleri beş kez dikkatlice ters çevirin ve her numunenin kan sayımı analizi için şişeleri bir kan analizörüne yükleyin. Analizin sonunda, 15-60 dakika buz üzerinde monovettes yerleştirin. Sitrat plazma toplama için, sitrat içeren monovetteleri 1,4 mililitre, perfüzyonsuz veya perfüzyonlu kanla doldurun ve her monovette'yi beş kez dikkatlice ters çevirin.

Plazmayı santrifüj le ayırın ve plazma fraksiyonunun üç 250 mikrolitrelik aliquot'unu tek tek 1,5 mililitrelik reaksiyon tüplerine aktarın. Daha sonra plazma örneklerini sıvı nitrojenle dondurun ve analizlerine kadar eksi 20 derecede saklayın. EDTA plazma toplama için, kan sayımı ölçümü nden sonra dört santigrat derece kuluçka sonra, santrifüj ile plazma ayırın ve bireysel 1.5 mililitre reaksiyon tüpleri içine plazma fraksiyonu üç 250 mikrolitre aliquots transfer.

Daha sonra eksi 20 santigrat depolama için sıvı nitrojen plazma örnekleri dondurun. CTAD plazma toplama için, CTAD içeren monovetteleri 2,7 mililitre taze çekilmiş veya perfüzyon kanla doldurun ve tüpleri beş kez dikkatlice ters çevirin. Monovetteleri santrifüj ile plazmayı toplamadan önce 15-60 dakika buz üzerine yerleştirin.

Her orta plazma fraksiyonunun 700 mikrolitresini tek tek 1,5 mililitrelik reaksiyon tüplerine aktarın ve dolu reaksiyon tüplerini tekrar santrifüj edin. Daha sonra orta fraksiyonun iki 100 mikrolitrelik aliquot'ünü tek tek 1,5 mililitrelik reaksiyon tüplerine aktarın ve tüpleri eksi 20 santigrat derecede depolamaları için sıvı nitrojen cinsinden dondurun. Sitrat plazma örneklerindeki TAT düzeylerini ölçmek için, 96 kuyulu düz alt plakanın her kuyuya 50 mikrolitre ELISA numune tamponu ve 50 mikrolitre plazma standardı, plazma kontrolü ve seyreltilmemiş plazma numunelerini plakanın uygun kuyularına ekleyin.

Plakayı mühürledikten sonra, numuneleri 37 derecede 15 dakika boyunca hafif çetreleyerek kuluçkaya yatırın. Kuluçka sonunda, her kuyuya 100 mikrolitre peroksidaz anti-insan TAT antikor eklemeden önce tabağı her kuyuda 300 mikrolitre yıkama çözeltisi ile üç kez yıkayın. Sallayarak 37 derece santigrat bir 15 dakikalık kuluçka sonra, iyi başına taze yıkama çözeltisi 300 mikrolitre ile plaka üç kez yıkayın.

Son yıkamadan sonra, oda sıcaklığında 30 dakikalık bir kuluçka için kuyu başına 100 mikrolitre taze hazırlanmış kromojen çözeltiekleyin. Kuluçka sonunda, her kuyuya 100 mikrolitre stop çözeltisi ekleyin ve her numunenin TAT konsantrasyonunu hesaplamak için standart eğri verilerini kullanarak 490 ila 500 nanometrelik bir fotometredeki optik yoğunluğu okuyun. İmplantları taramalı elektron mikroskobu için hazırlamak için, implantları tüplerden çıkarmak için forseps kullanın ve her implantı yıkama başına üç kez temizlenin.

Son yıkamadan sonra, implantları bir gecede kalsiyum ve magnezyum olmadan PBS'de %2 glutaraldehit içeren tek tek kaplarda saklayın. Ertesi sabah, implantları pbs konteynerlerinde 10 dakika kuluçkaya yatırın ve implantları konsantrasyon başına 10 dakika boyunca artan etanol konsantrasyonlarında susuz bırakın. Kan toplama ve perfüzyondan hemen sonra beyaz veya kırmızı kan hücrelerinin sayısında veya hematokrit değerlerinde herhangi bir değişiklik saptanmaz.

Ancak akış döngüsü sistemi içinde perfüzyon sonrası hemoglobin düzeylerinde bir azalma saptanır. Trombosit sayılarında da azalma gözlenir, bu da boru içinde kaplamasız bir stent bulunduğunda artar. Özellikle, kan bir fibrin-heparin kaplı stent ile inkübe edildiğinde bu kaybı azalır.

TAT kompleks konsantrasyonu perfüzyona yanıt olarak hafif çetrene artar. Çıplak metal bir stent eklendiğinde ise, TAT'da anlamlı bir artış saptanır ve pıhtılaşma sisteminin derin bir aktivasyonunu gösterir. Fibrin-heparin kaplı stent kullanımı bu aktivasyonu önler.

Perfüzyon kaplamasız veya fibrin-heparin kaplı stent varlığından etkilenmez iltifat kaskad artan bir aktivasyon yol açar. Benzer şekilde nötrofil granülositler de polimorfonükleer nötrofil elastaz düzeylerinin nicelleştirilmesi ile kanıtlandıkça aktive edilir. Elektron mikroskobu tarama ile görselleştirme fibrin-heparin kaplı stentler gözlenmez perfüzyon sonrası kaplamasız stent yüzeyinde kan hücreleri ve proteinlerin yoğun bir ağ varlığını ortaya koymaktadır.

Kanın numune almak için dahil etme kriterlerini karşıladığını doğrulamak ve mümkün olduğunca çabuk yeni çekilmiş kan kullanmak son derece önemlidir. İnsan kanı kan yoluyla bulaşan virüsler ve diğer ajanlar içerebilir ve enfeksiyon riski taşır, bu nedenle örnekleri işlerken her zaman uygun PPE'yi taktığından emin olun.