Tek Hücretranskripsiyonel Profillerini Analiz Etmek Için Lazer Yakalama Mikrodisseksive Mikroakışkan QPCR'nin Birleştirilmesi: Opioid Bağımlılığına Sistem Biyolojisi Yaklaşımı

Bu tek hücre düzeyinde gen ekspresyonunu anlamak için son derece doğru ve uygun maliyetli bir yöntemdir. Bu tekniğin en büyük avantajı, 96 numuneyi tek bir toplu iş parçasına sığdırabiliyor olmamızdır. Bu yüksek sayıdaki örnek, anatomik özgüllükte hücresel subfenottipleri belirlememizi sağlar.

Bu yöntemin boru hattı herhangi bir biyolojik sorun, herhangi bir sistem, herhangi bir doku, hastalık veya başka bir rahatsızlık, herhangi bir fonksiyon bireysel nöronlar veya diğer hücre türlerinin bireysel hücresel yanıt olarak bilgi almak için uygulanabilir. Ve sonra daha ileri gidip bu hücre yanıtlarının anatomik bir mimariye sahip olup olmadığını sına. Doku toplama kutusundan beyin çıkarın ve cryostat chuck üzerine yerleştirin.

Düz cam slaytlar üzerine 10 mikron bölümleri montaj eritme tarafından amigdala veya diğer tercih edilen beyin bölgesinin merkezi çekirdeğini içeren 10 mikron bölüm toplamak. Cam slaytları hemen kuru buz üzerinde kalan metal bir tavaya yerleştirin. Beyin kesitli slaytları en kısa zamanda eksi 80 derecelik bir dondurucuya koyun.

Bir etanol ve ksilen dehidratasyon serisi gerçekleştirmek için, ilk 30 saniye boyunca% 75 etanol içine slaytlar daldırma. Hemen sonra, 30 saniye boyunca% 95 etanol slaytlar daldırma. Sonra 30 saniye boyunca% 100 etanol içine slaytlar daldırma.

Son olarak, slaytları doğrudan %100 etanollü ikinci bir kap içine 30 saniye boyunca batırın. Etanol dehidratasyon serisinin ardından, bir dakika için taze dökülen ksilene içine slaytlar daldırma. Hemen sonra, slaytları metin protokolünde açıklandığı gibi kurutmadan önce dört dakika boyunca ikinci bir ksilene kabına batırın.

Lekeli hücre tipini ve çekirdeğini ilgi bölgesindeki tanımlamak için floresan kullanın. Tek hücreli havuzlu örnekleri yapıyorsanız bir hücre veya birden çok hücre seçin. Lazer yakalama mikrodizeksiyon veya LCM yazılımı kullanarak ilgi hücreleri işaretleyin.

LCM kapağını dilimin üzerine ilgi bölgesine yerleştirin ve LCM kapağı yapıştırıcısını metin protokolünde açıklandığı gibi seçili tek hücrenin alanı üzerinde eritin. LCM yazılım araçlarını kullanarak analiz için toplanacak hücreleri seçin. Seçilen hücreler sıçan beyin atlası ve bregma dayalı amigdala merkezi çekirdeğinin anatomik alanda olmalıdır.

Hücreler bitişik lekeli çekirdeklerden en az üç mikron olmalıdır. Sonra tanımlanan tek hücreleri toplamak için kızılötesi lazer ateş. Kapağı QC istasyonuna yerleştirin ve yalnızca istenen hücrelerin seçildiğinden emin olmak için kapağı görüntüleyin.

Diğer hücreler yanlışlıkla seçilirse, kapak QC istasyonunda kalırken istenmeyen hücreleri yok etmek için ultraviyole lazer kullanılabilir. Anatomik özgüllüğünü belgelemek için hücrenin toplandığı doku bölümünün fotoğrafını çekin. Bir referans olarak bir sıçan beyin atlası kullanarak uygunsa bregma gelen dilimin mesafekaydedin.

LCM kapağını QC istasyonundan çıkarın ve numune çıkarma cihazını takın. Daha sonra pipet 5.5 mikrolitre likte arabellek numuneüzerine. Ekstraksiyon cihazını 0,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin ve 75 derecede 15 dakika sıcak bir tabağa yerleştirin.

Numuneyi ve lisis tamponu düşük hızda 30 saniye boyunca aşağı doğru çevirin ve toplanan numuneyi eksi 80 derecelik bir dondurucuya yerleştirin. Dinamik bir dizi yongası için tek hücreli mRNA'nın ön amplifikasyonunu gerçekleştirmek için, ilk olarak yeni 96 x 96 PCR plakanın her kuyuya beş mikrolitre 5X VILO ekleyin. LCM tek hücreli örnekleri eksi 80 santigrat dereceden çıkarın ve kısa bir süre çözülmesine izin verin.

Düşük hızda santrifüjden sonra, pcr plakasına 5,5 mikrolitre lysed tek hücreli numune ekleyin ve her numuneyi kendi kuyununa ekleyin. PCR plakasını numunelerle birlikte termocycler'a ve 65 santigrat derecede bir buçuk dakika ısıya yerleştirin. Sonra 1, 300 kez g ve dört derece santigrat bir dakika için plaka spin ve buz üzerinde plaka yerleştirin.

Her kuyuya 10X cDNA sentezi ana karışımı, T4 Gene 32 Protein ve DNA süspansiyon tamponu ekleyin. Örnek plaka bir olan PCR plakayı termocycler'a yerleştirin ve metin protokolünde ayrıntılı olarak çalıştırın. Döngüden sonra, 96 kuyulu PCR plakaher kuyuya Taq polimeraz çözeltisi dokuz mikrolitre ekleyin.

Dokuz mikrolitre, 7,5 mikrolitre Taq polimeraz ana karışımı ve 1,5 mikrolitre astar havuzundan oluşur. Şimdi, PCR plakasını termocycler'a yerleştirin ve metin protokolünde ayrıntılı olarak belirtilen ön amplifikasyon programını çalıştırın. Ön amplifikasyon protokolünü takiben, 96 kuyulu PCR plakadaki her kuyuya altı mikrolitre eksonekleaz çözeltisi ekleyin.

Ekoneksiklesola çözeltisi 0.6 mikrolitre 10X eksonekleaz-bir reaksiyon tamponu, 1.2 mikrolitre eksonekle-bir ve 4.2 mikrolitre DNA süspansiyon tamponundan oluşur. PCR plakasını termocycler'a yerleştirin ve metin protokolünde listelenen programı çalıştırın. Son olarak, örnek plaka bir her kuyuya TE tampon 54 mikrolitre ekleyin.

PCR plakayı 1, 300 kez g'de beş dakika döndürün. Hemen bir sonraki adıma devam ederseniz dört santigrat derecede saklayın. Örnek plaka iki olan yeni 96 kuyulu PCR plakasında, beş mikrolitre DNA bağlayıcı boya ve ana karışım çözeltisi ekleyin.

Örnek plaka iki ilgili kuyulara örnek plaka bir önceden güçlendirilmiş örneklerüç mikrolitre ekleyin. PCR plakasını 1, 300 kez g'de döndürün ve sonra plakayı buza koyun. İkinci olarak ikinci bir ataşme plakası olan yeni 96 kuyulu PCR plakasında, her kuyuya beş mikrolitre adet ar-ge yükleme çözeltisi ekleyin.

Asa yükleme çözeltisi 3,75 mikrolitre 2X GE istihal yükleme reaktifi ve kuyu başına 1,25 mikrolitre DNA süspansiyon tamponundan oluşur. Daha sonra 10 mikromolar qPCR astar 2.5 mikrolitre ekleyin onun karşılık gelen iyi de saymak plaka iki. PCR plakayı 1, 300 kez g'de beş dakika döndürün.

Dinamik dizi yongasını yüklemek ve çalıştırmak için, önce çipi kontrol hattı sıvısıyla asallayın. Ardından çipi bir IFC denetleyicih HX'e yerleştirin ve prime 136X komut dosyasını çalıştırın. 96 by 96 dinamik dizi yongasındaki ilgili numune kuyularına örnek plaka ikiden altı mikrolitre ekleyin.

Şimdi, 96 by 96 dinamik dizi çipindeki ilgili sayis kuyularına ikinci sayak plakadan altı mikrolitre ekleyin. 96 by 96 dinamik dizi çipinin kuyularında hava kabarcıklarını patlatmak için iğneleri kullanın. Daha sonra çipi IFC denetleyiciHX'e yerleştirin ve yük karışımı nı 136X komut dosyası çalıştırın.

Ardından, ifc denetleyici HX'ten çipi çıkarın. 96'ya 96 dinamik dizi yongasını mikroakışkan RT-qPCR platformuna yerleştirin ve GE hızlı 96 by 96 PCR protokolünü çalıştırın. Tek hücrelerin seçimi hem görsel hem de moleküler olarak doğrulandı. Hücre toplamadan önce hücresel morfoloji sigörüldü.

Burada amigdala merkezi çekirdeğini içeren hemisected sıçan ön beyni ile bir slayt temsili görüntüler. Sonraki görüntüler, transkripsiyon analizi için tek hücre seçimi ve dokudan çıkarılmasını göstermektedir. Moleküler olarak, hücre tipine özgü belirteçler kendi hücre tiplerinde artmış ekspresyon gösterdi.

Özellikle nöronlarda, mikrogliada Maf ve astrositlerde Gfap'ta NeuN ekspresyonunun arttığı gözlendi. Isı haritası, 40 test edilmiş gendeki tüm örneklerin ifadesini gösterir. Satırlar çekme biriktir, sayılar örnek kümeleri ve sütunlar genler olduğunu gösterir.

Çok değişkenli analiz yöntemleri, çekilme grubundaki astrositlerin en çok etkilenen hücre tipi olduğunu göstermektedir. Diğer çalışmalar bağlamında bu verilere dayanarak, astrositler opioid çekilmesi sırasında amigdalanın merkezi çekirdeğinde inflamasyonda önemli bir rol oynamaktadır. Bu teknik hakkında hatırlanması gereken en önemli şey hava kabarcıkları sayısını sınırlamak için uygun pipetleme kullanmaktır.

Bu deneylerden elde edilen transkripsiyonel bulgular, aynı dokuda immünoresans veya Batı lekesi gibi protein ölçüm yöntemleri kullanılarak doğrulanabilir.