Fare Embriyonik Hücrelerinin Çok katlı Tek Hücreli mRNA Sıralama Analizi

Tek hücreli mRNA dizilimi, biyolojik süreçleri tek hücre düzeyinde anlamak için yaygın olarak kullanılır. Çoklama stratejilerinin ortaya çıkışı, tek bir deneyde birden fazla örneğin profilini çıkarmasına izin vererek, maliyeti önemli ölçüde azaltarak ve toplu iş etkilerinden kaçınarak amplifikasyonlarını daha da genişletmiştir. Prosedürü gösteren Wei Feng, bir postdoc ve Andrew Przysinda, benim laboratuvar bir teknisyen olacaktır.

Saydıktan sonra, embriyonik gün 18.5 kalp odalarından izole hücreleri beş kez 10 beşinci aliquots bölün ve yıkama başına taze PBS ile hücreleri iki kez yıkayın. Numune başına 180 mikrolitre PBS'deki peletleri yeniden askıya alın ve her tüpe nazik karıştırma ile 20 mikrolitre çapa barkod stok çözeltisi ekleyin. Buz üzerinde beş dakikalık bir kuluçka sonra, yıkama başına% 1 sığır serum albumin ile takviye soğuk PBS bir mililitre ile üç kez yıkamadan önce buz üzerinde ek bir beş dakikalık kuluçka için nazik karıştırma ile her tüp için co-çapa barkod stok çözüm 20 mikrolitre ekleyin, sonra tüp başına bir 40 mikrometre hücresüz ile yeni tüpler içine örnekleri filtre.

Sayma sonra, bir yonga tutucu içine çip B monte, sonra satır bir kullanılmayan kuyulara bir% 50 gliserol çözeltisi 75 mikrolitre ekleyin, satır iki kullanılmayan kuyulara 40 mikrolitre, ve 280 mikrolitre satır üç kullanılmayan kuyulara. Burada prosedürü göstermek için bir eğitim çipi kullanıldığını unutmayın. Nazik pipetleme ile ana karışıma uygun hücre süspansiyon hacmini ve nükleaz içermeyen suyu ekleyin.

Kabarcıklar olmadan satır bir de örnek alt merkezine elde edilen hücre çözeltisi 75 mikrolitre ekleyin. Girdap jel boncuk 30 saniye boyunca yavaş yavaş kabarcıklar olmadan satır iki jel boncuk alt merkezine boncuk 40 mikrolitre eklemeden önce. Üç sıra halinde bölümleme yağının yanaklarından 280 mikrolitre bölümleme yağı ekleyin.

Contanın üzerine bastırmadan ve contanın ıslatılmasından kaçınmak için contayı yatay tutmadan contayı çipe takın. Monte edilen çipi krom denetleyiciye conta ile yükleyin ve krom tek hücreli B programını çalıştırın. Ekran eğitim çipi için krom eğitimi gösterir ama gerçek deneyler için ekran krom tek hücreli B.Program tamamlandığında, hemen çip ivedi ve conta atın görüntüler unutmayın.

45 derecelik bir açıyla kuyuları ortaya çıkarmak için kapağı geri katlayın ve tıkanıklık olmadığından emin olmak için sıvı seviyelerini kontrol edin. Yavaş yavaş iyi kurtarma en düşük noktalarından emülsiyon jel boncuk 100 mikrolitre aspire ve boncuk tekdüzelik kontrol edin. Emülsifiye boncukları yeni bir PCR tüpünün duvarından buza dağıtın ve tüpü ters transkripsiyon için bir termal döngüye yerleştirin.

CDNA'yı amplifikasyona hazırlamak için, numuneye oda sıcaklığında 125 mikrolitre geri kazanım maddesi ekleyin. Hiçbir opak sıvı gözlenmeli ve pipetleme veya girdap kaçının. Geri kazanım maddesini tüpün altından yavaşça çıkarmadan önce 60 saniye bekleyin ve numuneye 200 mikrolitre girdap boncuk temizleme karışımı ekleyin.

Pipet oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkadan önce karışımı 10 kez. Daha sonra, yüksek konumda bir mıknatıs üzerine örnekleri yerleştirin. Çözelti temizlendiğinde, süpernatant çıkarın ve pelet için% 80 etanol 200 mikrolitre ekleyin.

30 saniye sonra, etanol çıkarın ve iki kez daha yıkama tekrarlayın. Son yıkamadan sonra, numuneyi kısa bir süre santrifüj edin ve numunenin iki dakikadan daha az kurumasını sağlamak için tüpü mıknatısın üzerine düşük pozisyonda yerleştirin. Numune kuruduğunda, tüpü mıknatıstan çıkarın ve 35,5 mikrolitre taze hazırlanmış elüsyon çözeltisi ekleyin.

Oda sıcaklığında iki dakikalık bir kuluçkadan sonra, numunenin 35 mikrolitresini yeni bir tüp şeridine aktarmadan önce çözelti temize çıkıncaya kadar numuneyi mıknatısın üzerine yerleştirin. Lipid bazlı barkodlama stratejisini kullanarak cDNA amplifikasyonu için, 35 mikrolitrelik cDNA örneklerine kısa bir süre santrifüj den önce iyice karıştırılarak amplifikasyon reaksiyon karışımı ekleyin. Spinin sonunda, uygun cDNA amplifikasyon işlemini takiben numuneyi termal döngüye alın.

100 mikrolitre numuneye 120 mikrolitre seçip ve 100 mikrolitre ultrasaf su ekleyin ve elde edilen 0,6x seçicirekara 15 kez pipet ekleyin. Oda sıcaklığında beş dakikalık bir kuluçkadan sonra, çözelti netleşene kadar numuneyi mıknatısın üzerine yerleştirin. Barkodlu cDNA kitaplığı yapımı için süpernatant'ı 1,5 mililitrelik düşük bağlama tüpüne aktarın.

Supernatant içeriği barkodlu cDNA ve temel içeriği endojen cDNA monte olarak hem supernatants ve baz kaydetmek için unutmayın. Endojen cDNA'yı %80 etanol ile temizleyin ve DNA'yı 40 mikrolitre elüsyon tamponuyla temizleyin, sonra endojen bir transkript kitaplığı hazırlamadan önce endojen cDNA'nın kalite kontrol kontrolünü çalıştırın. CDNA konsantrasyonu kütüphane inşaatından önce ölçülmeli ve kalifiye olmalıdır.

Endojen cDNA ve barkod kütüphaneleri de dahil olmak üzere inşa edilmiş kütüphaneler de sıralamadan önce ölçülmeli ve kalifiye edilmelidir. Sıralamadan sonra, barkod ifadesi her bir hücrede çözümlenebilir. Örneğin, bu analizde sekiz farklı örnekteki hücreleri temsil eden bir barkod türünü benzersiz olarak ifade eden sekiz tek hücre grubu gözlenmiştir.

Buna ek olarak, bazı hücreler herhangi bir barkod ifade etmedi ve bu nedenle negatif hücreler olarak tanımlanan, diğer hücreler çift temsil eden iki farklı barkod ifade ederken. Tek hücre kullanılarak, hücresel heterojenite ve moleküler düzenlemeler hücre tipi ek gösterimi, yeni ve nadir hücre tipi tanımlama, anatomik zon karşılaştırmalı analiz ve hücre döngüsü faz ayırmaları gibi gen ontoloji yol analizi ile değerlendirilebilir. Eğer yapabilirseniz emülsiyon jel boncuk görüntü yararlıdır, bir görüntü prosedürü bu noktaya kadar başarılı olup olmadığını size söyleyecektir gibi.

Örnek çoklama, denemelerinizi tasarlamada büyük esneklik sağlar. Bu gösteriyi izledikten sonra, umarım kendi deneylerinizi başlatma konusunda daha emin olursunuz.