Inguinal Subkutan Beyaz Yağ Dokusu (ISWAT) Transplantasyon Modeli Murine Adacıkları

Adacık transplantasyonu Tip I diabetes mellitus tedavisinde en umut verici yaklaşımlardan biridir. Adacık nakli için uygun bir yer arayışı devam ediyor. Inguinal subkutan beyaz yağ dokusuna adacık nakli klinik etkileri olabilecek basit ama etkili bir yöntemdir.

Bu işlemin kliniğe ekstrapolasyonu Tip I diyabethastaları için bir tedavi gelişmesine yol açabilir. Bu yöntem, lingual'ın adacık engraftment için ideal bir yer olmadığı belirlendiği için klinik adacık transplantasyonu hakkında bilgi verebilir. Bu dikkatle prosedürün her adımı, pankreas sindirim gibi özellikle önemli adımları takip etmek önemlidir.

Görsel gösteri, adacık izolasyonu ve dönüşümün nasıl yapılacağını daha iyi belirlemek için bu teknikte yeni araştırmacılara yardımcı olacaktır. Adacık hasat için, ilk sprey 10 haftalık C57 siyah altı fare kürk 75% etanol ile, ve taze hazırlanmış kollajenaz çözeltisi ile beş mililitreşşöyyuz doldurun. Şırıngayı 32 kalibrelik bükme künt sivri perfüzyon iğnesi ile donatın ve fareyi bir buz torbasının üzerine supine pozisyonunda yerleştirin.

Kasık bölgesinin derisinde enine bir açıklık yapmak için düz sivri oftalmik makas kullanın ve hayvanın kafasına doğru kesi uzatmak. Tamamen ksifoid sürecine kasık bölgesinden bir V-kesi ile karın açık, ve safra kesesi ve ortak safra kanalının tüm uzunluğu ortaya çıkarmak için karaciğer hareket. Sonra ortak safra kanalının duodenal açılış kapatmak ve safra kesesi küçük bir açıklık kesmek için bir vasküler kelepçe kullanın.

Daha önce hazırlanmış perfüzyon iğnesi ile açılış yoluyla ortak safra kanalı kanüle, ve pankreas içine kollajenaz çözeltisi yaklaşık iki mililitre enjekte. Tüm kollajenaz teslim edildiğinde, bağırsak, mide ve dalak perfüzyon pankreas ayırmak için noninvaziv mikro cımbız iki çift kullanın ve buz üzerinde 50 mililitrelik konik tüp içine pankreas yerleştirin. Tüm örnekler toplandığında, 50 mililitretüpler için pankreas başına Dnase I 100 mikrolitre ekleyin ve şiddetle orta sallayarak üç ila beş dakika boyunca 37 derece santigrat su banyosu içine dokuları yerleştirmeden önce 10 saniyelik bir süre içinde her tüp yaklaşık 40 kez sallamak.

Kuluçka sonunda, sindirim tutuklamak için Stop Solution 50 mililitre son hacmi kadar ekleyin. Ve darbe hızla santrifüj durdurmadan önce 4 santigrat derece 750 kez G bir hıza tüpler santrifüj. Süpernatasyonları attıktan sonra, peletleri sadece gösterildiği gibi yıkama başına 15-25 mililitre Stop Solüsyonu'nda iki kez yıkayın.

İkinci yıkamadan sonra, yeni 50 mililitrekonik tüpler içine tüp başına havuz üç pelet. Ve Histopaque 1119 on mililitre toplam hacminde pankreas hücreleri resuspend. Sonra dikkatle her tüpün yan aşağı Histopaque 1077 beş mililitre ekleyin, HBSS beş mililitre takip.

Hücreleri santrifüje göre ayırın ve HBSS Histopaque 1077 arabirimindeki adacıkları toplamak için beş mililitrelik Pasteur pipeti kullanın. Adacıkları yeni bir 50 mililitrelik konik tüpte, darbe santrifüjü için 50 mililitrelik Stop Solution'ın son hacminde birleştirin ve süpernatant'ı atın. Bir dakika santrifüj için taze Stop Solution 30 mililitre pelet resuspend ve kültür ortamı 30 mililitre adacıklar resuspend.

Adacıkları tüp başına 10 santimetrelik ışık geçirmez bir kültür çanağı haline getirin. Ve tabağı stereo mikroskobun altına yerleştirin. 200 mikrolitre jel yükleme pipet uçları kullanarak, el çözüm beyaz küresel adacıklar seçin.

Adacıklar hasat edilirken 10 mililitre kültür ortamı içeren işlenmemiş bir hücre kültür yemeğine yerleştirilmesi. Hafif bir mikroskop altında dithizone boyama tarafından seçilen el adacıklarının saflığını kontrol edin. Ve floresan mikroskop altında floresan diasetat propidium iyodür boyama tarafından adacıkların canlılığını tespit edin.

Daha sonra kültür taze kültür ortamda izole adacıklar 37 santigrat derece% 95 hava ve% 5 karbondioksit nakli kadar. Diyabet indüksiyonundan sonra üç ve dört gün başlayarak, her streptozotosin enjekte edilen sekiz haftalık erkek C57 siyah altı farenin kaudal damarını delerek her alıcı hayvandan kan örneği almak için .m.

Her farenin açlık olmayan kan şekeri seviyesini belirlemek için temel bir kan şekeri izleme aleti kullanın ve sonra bireysel test şeritler üzerine kan ekleyin. Bir hayvan iki gün üst üste litre başına en az 20 milimol kan şekeri seviyesini gösterdiğinde, tartın ve alıcı fare işareti ve anestezi hayvanlarda pedal refleks yanıt eksikliği onaylamak. Erimesi için eksi 20 santigrat dereceden bir hidrojel deposu yerleştirin.

Ve alıcı başına 450 ila 500 adacık eşdeğerini, buz üzerindeki tüp başına 200 mikrolitre orta madde içeren steril 1,5 mililitrelik centrifuge tüpüne aktarın. Alıcının sol inguinal alanını %75 etanol ile temizle ve fareyi supine pozisyonuna getirin. Cerrahi bant ile uzuvları düzeltmek ve cerrahi site nin etrafında saç kaldırmak için makası kullanın.

Cerrahi bölgeyi iyodophor ile temizler ve dezenfekte edilmiş deride dikey bir kesi yapın. ISWAT içinde inferior epigastrik arter ve ven tanımlayın ve damarların üzerinde küçük bir cep oluşturmak. Santrifüj ile adacıkları tortulayın ve mümkün olduğunca çok supernatant çıkarın.

Her tüpe 20 mikrolitre çözülmüş hidrojel ekleyin ve kabarcıklardan kaçınmaya özen tarak adacıkları yavaşça askıya alın. Homojen bir süspansiyon elde edildiğinde, bir tüpten cebe tüm adacık hidrojel karışımını dikkatlice iletmek için 200 mikrolitrelik pipet ucu kullanın. Hidrojel tamamen katılaşmış olduğunda, transplantasyon bölgesine 20 mikrolitre sefalosporin ekleyin ve kas ve deriyi 5-0 sürekli cerrahi dikişle kapatın.

Daha sonra alıcıyı tam bir işe gelene kadar izleyerek termal ped üzerinde temiz bir kafese yerleştirin. Gösterildiği gibi murine adacık işleme sonra, izole murine adacıkları transplantasyon için yeterince saf olacaktır. Transplantasyon için sadece yüksek canlılığa sahip izole adacıklar kullanılmalıdır.

Adacık greftlerinin hidrojel ile iyice karıştırılmasından sonra greft ISWAT bölgesine yerleştirilmesi mümkündür. ISWAT içine transplantasyon yaklaşık bir ay sonra, adacık greftler ters hiperglisemi ise alıcı farelerin vücut ağırlığı giderek artar. Transplantasyondan 100 gün sonra greftlerin çıkarılması a.m 10:00'da ani bir artışa neden olabilir.

açlık olmayan kan şekeri düzeyi. Şu anda histolojik analiz, adacık greftlerinin bozulmadığını ortaya koymaktadır. İnsülin ve glukagon immünofloresan boyama, nakledilen adacıkların da transplantasyon sonrası 100 gün sonra fonksiyonel olduğunu göstermektedir.

Profused pankreas hücrelerini çok sağlam sallamak için dikkatli olun ya da başka elde edilen adacıkların yeteneği tehlikeye olacaktır. İzole adacıklar, izole transplantasyonun inüinal subkutan beyaz yağ dokusuna etkilerini karşılaştırmak için böbrek kapsülü altına nakledilebilir. Prosedür karaciğer dışında diğer sitelere adacık nakli klinik çalışmaların başlatılması nı katacak.