Name: Inguinal Subkutan Beyaz Yağ Dokusu (ISWAT) Transplantasyon Modeli Murine Adacıkları (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: Öğrenin, fare adacıklarını inguinal subkutan beyaz yağ dokusuna transplantasyon yöntemini. Bu teknik, Tip 1 diyabet tedavisinde klinik uygulama potansiyeli sunar ve kan şekeri izlemi ile histolojik analiz içerir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Çin Ulusal Temel Ar-Ge Programı (2017YFC1103704)Guangdong Eyaleti Yüksek Düzeyli Hastanelerin İnşaatı Için Özel Fonlar (2019), Shenzhen'deki Sanming Tıp Projesi (SZSM201412020), Yüksek Seviye Fonu'ndan gelen hibelerle desteklenmiştir. Shenzhen Tıbbi Disiplin İnşaatı (2016031638), Shenzhen Bilim ve Teknoloji Vakfı (JCJY20160229204849975, GJHZ201703141713575556), Shenzhen Sağlık ve Aile Planlama Komisyonu Vakfı (SZXJ2017021SZXJ2018059), Tıbbi Tıp Çin Guangdong Eyaleti Bilimsel Araştırma Vakfı (A2019218), Çin Doktora Sonrası Bilim Vakfı (2018M633218).

Bu protokoldeki tüm prosedürler Shenzhen İkinci Halk Hastanesi Etik İnceleme Komitesi hayvan refahı ilkelerini izledi. Adacık grefti alıcıları ve bağışçıları Guangdong Eyaleti Tıbbi Hayvan Merkezi'nden satın alınan 8 ila 10 haftalık C57BL/6 erkek farelerdi. Hasat edilen hücrelerin hasat, izolasyon, kültür veya idaresi işlemleri aseptik koşullarda gerçekleştirilmiştir.
1. Adacık hazırlama
<ol><li>Kollajenaz Tip V çalışma çözeltisi hazırlayın. Kollajenaz Tip V'yi tartın ve D-Hank'in tamponuyla 1 mg/mL'lik son konsantrasyona, 0,22 m şırınga tahrikli filtre ünitesi ve 60 mL şırınga ve buzda precool kullanarak filtre uygulayın. Her donör alıcı için 5 mL hacim gereklidir.</li>
	<li>Servikal çıkış la 10 haftalık C57BL/6 erkek fare (23 ± 2 g) ötenazi yapın ve farenin dış kısmını birkaç saniye liğine %75 etanol püskürtün. Bu arada, kollajenaz çözeltisi ile 5 mL şırınga doldurun ve bükme künt sivri perfüzyon iğnesi (32 G) ile şırınga iğnesini değiştirin.</li>
	<li>Donör fareyi, diseksiyon kapsamı nın altındaki bir buz torbasının üzerine supine pozisyonunda koyun, kasık bölgesinin derisinde düz sivri oftalmik makas kullanarak enine bir açıklık kesin ve cildi tamamen kafaya doğru eğdirin. Daha sonra kasık bölgesinden ksifoid sürecine V-kesi ile karın tamamen açın.</li>
	<li>Karaciğer ilerleyerek safra kesesi ve ortak safra kanalının tüm uzunluğu açığa. Sonra bir vasküler kelepçe ile ortak safra kanalının duodenal açılış kelepçe ve safra kesesi küçük bir açıklık kesti. NOT: Optimal iğne yerleştirilmesi karaciğer ve safra kesesi içine geri akışını önlemek için önemlidir.</li>
	<li>Adım 1.2 perfüzyon iğnesi kullanarak safra kesesi açılması ortak safra kanalı kanüle, sonra pankreas içine kollajenaz çözeltisi ~ 2 mL enjekte. Bundan sonra, bağırsak, mide ve dalak noninvaziv mikrotweezers iki çift kullanarak perfüzyon pankreas ayırmak ve buz üzerinde 50 mL konik tüp içine koyun. NOT: Tüm donör fareler için işlemi tekrarlayın. Üç ardışık perfüzyon pankreas (en fazla 40 dk dışında) her pankreas için kollajenaz çözeltisi 3 mL ile önceden doldurulmuş 50 mL konik tüp içine kombine edilebilir.</li>
	<li>50 mL konik tüpleriçine pankreas başına 100 μL DNase I (10 mg/mL) ekleyin ve 37 °C'de bir su banyosundaki pankreası 3-5 dk konik tüpleri sallayarak sindirin. NOT: Su banyosunda sindirim den önce doku ayırmak için 10 s aralıklarla güçlü 40x tüpleri çalkalayın ve sonra orta derecede sindirim sırasında tüpleri sallamak.</li>
	<li>Sindirimi engellemek için son 50 mL'lik bir stop çözeltisi (2,5 mg/mL BSA-HBSS çözeltisi) ekleyin ve tüpleri 4 °C'de 750 x g hıza santrifüj edin ve hızla durdurun.</li>
	<li>Supernatant dökün ve bsa-HBSS 15-25 mL yavaşça resuspend tarafından pelet 2x yıkayın. Nabız 1 dakika için adım 1.7 özetlenen aynı hız koşulları ile tüp santrifüj.</li>
	<li>Supernatant dökün ve 50 mL konik tüp içine üç konik tüplerin pelet havuz. Hetopaque-1119 toplam hacmi 10 mL pelet resuspend. Homojen bir şekilde karıştırın ve tüpün yan tarafına yavaşça boru tutarak 5 mL histopaque-1077 ve 5 mL HBSS ekleyin.</li>
	<li>4 °C'de 750 x g'de, 10 dk frensiz olarak numuneleri santrifüjde döndürün.</li>
	<li>Tek kullanımlık 5 mL Pasteur pipet kullanarak HBSS/histopaque-1077 arabirimindeki adacıkları 50 mL konik bir tüpe aspire edin, BSA-HBSS'yi 50 mL'lik son hacmine ekleyin ve 4 °C'de 750 x g'da darbe santrifüjünü ekleyin.</li>
	<li>Supernatant dökün ve BSA-HBSS 30 mL kullanarak adacıkları yıkayın. 4 °C'de 750 x g'de 1 dk santrifüj.</li>
	<li>Adacıkları tüp başına 30 mL kültür ortamı (%10 FBS-1%P/S-CMRL-1066) kullanarak yeniden askıya alın ve 10 cm çapında ışık geçirmez bir kültür kabına dökün. Stereomikroskop altında, 200 μL jel yükleme pipet uçları kullanarak, adacıkları morfolojilerine (yani küresel, beyaz) göre çözeltiden seçin. 10 mL kültür ortamı ile işlenmemiş bir hücre kültürü yemeğine koyun. NOT: İlk saflaştırılmış adacıkların saflığı ilk toplamadan sonra uygun değilse ikinci bir toplama yapılabilir.</li>
	<li>Hafif bir mikroskop altında dithizone boyama tarafından özenle seçilmiş adacıkların saflığını kontrol edin ve floresan mikroskop altında floresan disetat (FDA)-propidium iyodür (PI) boyama ile adacıkların canlılığını tespit edin.</li>
	<li>Kültür kültür ortamda izole adacıklar (adım 1.13 gibi) bir kuvöz de 37 °C, 95% hava-5% CO2 transplantasyon önce.</li>
</ol>2. ISWAT adacık nakli
<ol><li>8 haftalık erkek C57BL/6 farelerinde (22 ± 2 g) tek bir streptozotosin (STZ) enjeksiyonu ile diyabetinin indüklemesi. Gün -4, ~ 4-6 h için fareler hızlı, sonra 0.1 M sitrat tampon (pH 4.4) kullanarak% 2 STZ çözeltisi hazırlamak. Tartın, tampon da yeniden askıya alın ve farelere intraperitoneal olarak 180 mg/kg dozda enjekte edin. NOT: STZ çözeltisi kullanılmadan önce taze olarak hazırlanmalı ve ışık hassasiyeti nedeniyle alüminyum folyo ile kaplanmalıdır. 15-20 dakika içinde aktivite kaybedersiniz, çünkü hemen kullanılmalıdır.</li>
	<li>STZ enjekte edilen farelerin kaudal damarlarını delerek yaklaşık 10 günü -1 ve gün 0'da biraz kan toplayın ve bir test şeridi ve temel kan şekeri izleme cihazı kullanarak açlık dışı kan şekeri seviyesini ölçün. Ardışık 2 test gününün kan şekeri düzeyleri en az 20 mmol/L ise fareler adacık nakli alıcısı olarak kullanılacaktır.</li>
	<li>0. günde, tüm alıcı fareleri tartın ve işaretleyin. Her alıcıya 60 mg/kg pentobarbital sodyum intraperitoneal enjekte ederek anestezi. NOT: Anestezinin derinliğini kontrol etmek için bir parmak ucutu uygulayın. Alıcı farenin çekilme refleksi yoksa, anestezi seviyesi ameliyat için yeterlidir. Değilse, ek bir 10 mg / kg pentobarbital sodyum uygulayın. Kullanılan pentobarbital sodyum steril fizyolojik serum fizyolojik olarak %2 (m/v) konsantrasyonu ile seyreltildi.</li>
	<li>Hidrojeli -20 °C'lik bir dondurucudan çıkarın ve çözülmesini sağlamak için buzüzerinde tutun. Hidrojel 4-10 °C'de sıvıdır ve daha yüksek bir sıcaklıkta katılayacaktır.</li>
	<li>Her alıcı için steromikroskop altında steril 1,5 mL santrifüj tüp (adım 1.13 gibi) 200 μL kültür ortamına sahip ~450-500 adacık eşdeğerleri (IEQ) seçin ve transplantasyona hazır olana kadar buzda tutun.</li>
	<li>% 75 etanol kullanarak alıcının sol inguinal alan swab. Supine pozisyonda yerleştirin ve cerrahi bant kullanarak dört ekstremite düzeltmek. Elektrikli makaslarla cerrahi alanın etrafındaki tüyleri tıraş edin ve bölgeyi Iodophor ile temizler.</li>
	<li>Oftalmik makas ve noninvaziv mikrotweezers kullanarak bu alanda dikey bir deri kesi yapmak, ISWAT inferior epigastrik arter ve ven tanımlamak, ve damarların üzerinde küçük bir cep oluşturmak.</li>
	<li>Adacık tüpünü 200 x g'de 30 s'ye döndürün ve supernatant'ı mümkün olduğunca çıkarın. Tamamen çözülmüş hidrojel 20 μL aspire ve adacıklar ile tüp içine yükleyin. Adacıkları yavaşça askıya alın, kabarcıklardan kaçının.</li>
	<li>Tüpteki tüm adacık-hidrojel karışımını 200 μL pipet ucu yla alıcının cebine (adım 2.7) teslim edin. NOT: Bu işlem, biri invaziv olmayan mikrotweezerler kullanarak cebin kenarlarını almak için iki teknisyen, diğeri de adacık karışımını cebe teslim etmek için gereklidir.</li>
	<li>Adacıklar-hidrojel karışımı tamamen katılaşmış sonra transplantasyon sitesine 20 μL sefalosporin (~5-10 mg) ekleyin, sonra sürekli dikiş yöntemi ile kas ve cilt kapatmak için 5-0 cerrahi dikiş kullanın. NOT: Hidrojel vücut ısısı nedeniyle katılaşmak için yaklaşık 3 dakika gerekir.</li>
	<li>Alıcıyı temiz bir kafese yerleştirin ve termal ped kullanarak sıcak tutun. Alıcı tamamen iyileşip özerk olarak hareket etmeye başlayana kadar izlemeye devam edin. Daha sonra 0.1 mg/Kg dozuna göre steril fizyolojik salin intraperitoneally 0.03 mg/ml Buprenorfin uygulayın.</li>
	<li>Her alıcı fare için 2.3-2.11 adımlarını yineleyin.</li>
	<li>Alıcı farelerin açlık dışı kan şekeri düzeylerini (adım 2.2'deki gibi) ilk ay için haftada 3-4x, ondan sonra da haftada 1x ölçün.</li>
	<li>Takip sonunda (transplantasyondan 100 gün sonra), anestezi altında (adım 2.3'te olduğu gibi yapılır) 2.6.adımda açıklanan steril adımları takiben alıcılardan greft taşıyan ISWAT'ı dışarı çıkarır. İnsülin ve glukon ile hematoksilin ve eozin (H&E) boyama ve immünoffloresan için histolojik protokollere göre formalin ve paraformaldehit doku düzeltin.</li>
	<li>Sefalosporin ekleyin ve adım 2.10 gibi alıcıların kesi kapatın, sonra adım 2.11 gibi kurtarma için hazırlamak.</li>
</ol>

<ol><li>Cho, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IDF+Diabetes+Atlas%3A+Global+estimates+of+diabetes+prevalence+for+2017+and+projections+for+2045%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Research+and+Clinical+Practice%22%5BJournal%5D)">IDF Diabetes Atlas: Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045.</a> Diabetes Research and Clinical Practice. 138, 271-281 (2018).</li>
<li>Shapiro, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation+in+seven+patients+with+type+1+diabetes+mellitus+using+a+glucocorticoid-free+immunosuppressive+regimen%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen.</a> New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).</li>
<li>McCall, M., Shapiro, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Update on islet transplantation.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (7), 007823(2012).</li>
<li>Pathak, V., Pathak, N. M., O'Neill, C. L., Guduric-Fuchs, J., Medina, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapies+for+Type+1+Diabetes%3A+Current+Scenario+and+Future+Perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Medicine+Insights%3A+Endocrinology+and+Diabetes%22%5BJournal%5D)">Therapies for Type 1 Diabetes: Current Scenario and Future Perspectives.</a> Clinical Medicine Insights: Endocrinology and Diabetes. 12, 1179551419844521(2019).</li>
<li>Bottino, R., Knoll, M. F., Knoll, C. A., Bertera, S., Trucco, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Future+of+Islet+Transplantation+Is+Now%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Medicine+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">The Future of Islet Transplantation Is Now.</a> Frontiers in Medicine (Lausanne). 5, 202(2018).</li>
<li>Stokes, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+sites+for+human+and+murine+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Transplantation sites for human and murine islets.</a> Diabetologia. 60 (10), 1961-1971 (2017).</li>
<li>van der Windt, D. J., Echeverri, G. J., Ijzermans, J. N., Cooper, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+choice+of+anatomical+site+for+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">The choice of anatomical site for islet transplantation.</a> Cell Transplantation. 17 (9), 1005-1014 (2008).</li>
<li>Addison, P., Fatakhova, K., Rodriguez Rilo, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Considerations+for+an+Alternative+Site+of+Islet+Cell+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Diabetes+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Considerations for an Alternative Site of Islet Cell Transplantation.</a> Journal of Diabetes Science and Technology. , (2019).</li>
<li>Pepper, A. R., Bruni, A., Shapiro, A. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+islet+transplantation%3A+is+the+future+finally+now%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Organ+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Clinical islet transplantation: is the future finally now.</a> Current Opinion in Organ Transplantation. 23 (4), 428-439 (2018).</li>
<li>Bellin, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Similar+islet+function+in+islet+allotransplant+and+autotransplant+recipients%2C+despite+lower+islet+mass+in+autotransplants%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Similar islet function in islet allotransplant and autotransplant recipients, despite lower islet mass in autotransplants.</a> Transplantation. 91 (3), 367-372 (2011).</li>
<li>Bruni, A., Gala-Lopez, B., Pepper, A. R., Abualhassan, N. S., Shapiro, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+cell+transplantation+for+the+treatment+of+type+1+diabetes%3A+recent+advances+and+future+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%2C+Metabolic+Syndrome+and+Obesity%3A+Targets+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Islet cell transplantation for the treatment of type 1 diabetes: recent advances and future challenges.</a> Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 7, 211-223 (2014).</li>
<li>Smood, B., Bottino, R., Hara, H., Cooper, D. K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+the+renal+subcapsular+space+the+preferred+site+for+clinical+porcine+islet+xenotransplantation%3F+Review+article%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Surgery+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Is the renal subcapsular space the preferred site for clinical porcine islet xenotransplantation? Review article.</a> International Journal of Surgery and Medicine. 69, 100-107 (2019).</li>
<li>Luan, N. M., Iwata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+allogeneic+islet+graft+survival+in+prevascularized+subcutaneous+sites+without+immunosuppressive+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Long-term allogeneic islet graft survival in prevascularized subcutaneous sites without immunosuppressive treatment.</a> American Journal of Transplantation. 14 (7), 1533-1542 (2014).</li>
<li>Yasunami, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Subcutaneous+Site+of+Islet+Transplantation+Superior+to+the+Liver%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">A Novel Subcutaneous Site of Islet Transplantation Superior to the Liver.</a> Transplantation. 102 (6), 945-952 (2018).</li>
<li>Rajab, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation%3A+alternative+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Diabetes+Reports%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation: alternative sites.</a> Current Diabetes Reports. 10 (5), 332-337 (2010).</li>
<li>Ekser, B., Vagefi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Search+for+the+best+site+in+islet+xenotransplantation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Surgery+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Search for the best site in islet xenotransplantation.</a> International Journal of Surgery and Medicine. 70, 106-107 (2019).</li>
<li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+for+Islet+Transplantation+to+the+Omentum+in+Mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Method for Islet Transplantation to the Omentum in Mouse.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e57160(2019).</li>
<li>Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+mouse+pancreatic+islet+isolation+and+intracellular+cAMP+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), e50374(2014).</li>
<li>Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+murine+islet+isolation+and+subcapsular+kidney+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), e2096(2011).</li>
<li>Khatri, R., Hussmann, B., Rawat, D., Gurol, A. O., Linn, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraportal+Transplantation+of+Pancreatic+Islets+in+Mouse+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Intraportal Transplantation of Pancreatic Islets in Mouse Model.</a> Journal of Visualized Experiments. (135), e57559(2018).</li>
<li>Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+rodent+islet+isolation+and+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Procedures+Online%22%5BJournal%5D)">A practical guide to rodent islet isolation and assessment.</a> Biological Procedures Online. 11, 3-31 (2009).</li>
</ol>

Yazarlar çıkar çatışması bildirmez.

Pankreas adacık nakli T1DM tedavisi için umut verici bir tedavi yöntemidir. Bu tedavinin etkisi birçok faktörden etkilenir ve adacık implantasyonu için en uygun yeri seçmek son derece önemlidir. Adacık transplantasyonu için ideal anatomik alan aşağıdaki özelliklere sahip olmalıdır: basit transplantasyon, biyopsi ve greft alma işlemleri için erişilebilirlik; azaltılmış komplikasyonlar; kan şekeri kontrolünün yüksek başarı oranı; ve adacık greftlerinin uzun süreli hayatta kalma15,<sup cla...

Uluslararası Diyabet Federasyonu (IDF)1istatistiksel verilerine göre, tip 1 diabetes mellitus (T1DM) dünya çapında insidansı ve yaygınlığı hızla artmaktadır. Adacık transplantasyonu T1DM4tedavisinde en umut verici yaklaşımlardan biridir. Edmonton protokolü2 kullanılarak klinik adacık transplantasyonunda yapılan büyük atılım rapor edildiğinden, 5 yıl sonra T1DM alıcılarında adacık grefti sağkalım günümüzde yaklaşık %50'ye 3'e ulaşmaktadır.
Geçmişte deneysel adacık nakli için karaciğer, böbrek kapsülü, dalak, kas içi bölge, deri altı alan, kemik iliği ve omental kese gibi çeşitli transplantasyon bölgeleri incelenmiştir5,6,7. Yukarıdaki sitelerin bazıları klinik ortamlarda test edilmiştir8. Karaciğeriçine adacık nakli şu anda klinik uygulamada en yaygın kullanılan yöntem olmaya devam etmesine rağmen9, Bu siteyi kullanırken ele alınması gereken birkaç önemli sorunlar vardır. Örneğin, anlık kan aracılı inflamatuar reaksiyon (IBMIR) ve kötü oksijenasyon kaynağı10,11 ve nasıl gerekirse adacık greftleri almak için neden nakledilen adacıkların erken kaybını azaltmak için nasıl, onlar yaygın karaciğerde lokalize çünkü. Böbrek kapsülü kemirgen alıcıları için ideal bir yer olabilir. Ancak, sıkı böbrek kapsülü insanlarda yeterli allojenik adacıkların nakli sınırlar, klinik olarak kullanılan yüksek saflaştırılmış domuz adacık preparatları nedeniyle adacık ksenotransplantasyon için daha iyi bir uyum olabilir rağmen5,12. Bu nedenle adacık nakli için daha uygun bir alan arayışı devam etmektedir.
Deri altı alan erişilebilirliği nedeniyle adacık nakli için klinik olarak uygulanabilir bir alan olarak kullanılabilir. Ancak, subkutan alana adacık nakli verimliliği son derece düşüktür, böylece hiperglisemi ters adacıkların nispeten çok sayıda gerektiren13. Son zamanlarda, bir Japon araştırma ekibi ISWAT bulundu, karaciğer ile karşılaştırıldığında bir murine modelinde adacık nakli için üstün yeni bir deri altı site14. ISWAT epigastrik arter ve ven içerir, bu nedenle zengin kan akımı adacık greft revaskülarizasyon sağlayabilir. Bu yazıda, ISWAT'taki singenik murine adacıklarını onarmak için bir bodrum membran matris hidrojeli kullanılarak kolay bir implantasyon yöntemi öneriyoruz. Bu protokol adacık nakli için etkili olduğunu kanıtlıyor.

<table><tbody><tr><td>0.22 &mu; m Şırınga Tahrikli Filtre</td><td>Ünitesi Merck Millipore</td><td>SLHV033RB</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL santrifüj tüpü</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Pastör pipeti</td><td>JingAn Biological, Çin</td><td>J00085</td><td></td></tr><tr><td>5 mL şırınga</td><td>Szboon, Çin</td><td>20170829</td><td></td></tr><tr><td>50 mL konik tüp</td><td>Corning</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>5-0 cerrahi sütür</td><td>sh-Jinhuan, Çin</td><td>CR537</td><td></td></tr><tr><td>60 mL şırınga</td><td>Szboon, Çin</td><td>20170623</td><td></td></tr><tr><td>%75 Etanol</td><td>LIRCON, Çin</td><td>9180527</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 eşek anti-fare IgG (H + L)</td> <td>Invitrogen</td><td>A21202</td><td>Seyreltme (1:200)</td></tr> <tr><td>anti-fare Glukagon antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab10988</td><td>Seyreltme (1:100)</td></tr> <tr><td>anti-fare insülin antikoru</td><td>Hücresi Sinyalizasyon Teknolojisi</td><td>3014s</td><td>Seyreltme (1:100)</td></tr> <tr><td>künt uçlu perfüzyon iğnesi</td><td>Oloey, Çin</td><td>005</td><td>32G, sarı</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Meilune, Çin</td><td>MB4219</td><td></td></tr><tr><td>C57BL / 6 Fareler</td><td>Guangdong Eyaleti Tıbbi Hayvan</td><td></td> Merkezi <td>8 ~ 10 hafta</td></tr><tr><td>hücre kültürü kabı</td><td>BIOFIL, Çin</td><td>TCD000100</td><td>Genel, İşlenmemiş, 87,8 mm çap</td></tr><tr><td>santrifüj</td><td>Thermo Scientific</td><td>ST16R</td><td></td></tr><tr><td>sefalosporin</td><td>Lukang medikal, Çin</td><td>150303</td><td></td></tr><tr><td>CMRL-1066</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0422</td><td></td></tr><tr><td>Codos Evcil Hayvan Kesme</td><td>Makinesi Szcodos, Çin</td><td>CP-8000</td><td></td></tr><tr><td>kollajenaz Tip V</td><td>Sigma</td><td>C9262</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Termo Balıkçı</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>D-hank'in tamponu</td><td>Coolaber, Çin</td><td>PM5140-10</td><td></td></tr><tr><td>ditizon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5130</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4263</td><td></td></tr><tr><td>Eozin boyama ortamı</td><td>Beyotime Biotech, Çin</td><td>C0109</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GE Sağlık Yaşam Bilimleri</td><td>SH30084</td><td></td></tr><tr><td>floresein diasetat (FDA)</td> <td>Thermo Fisher</td><td>F1303</td><td></td></tr><tr><td>floresan mikroskobu</td><td>Leica</td><td>DMIL</td><td></td></tr><tr><td>jel yüklemeli pipet uçları</td><td>Corning</td><td>CLS4884</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Coolaber, Çin</td><td>PM5150-10</td><td></td></tr><tr><td>hematoksilen boyama ortamı</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi</td><td>14166S</td><td></td></tr><tr><td>HISTOPAQUE-1077</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RNBG0522</td><td></td></tr><tr><td>HISTOPAQUE-1119</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RNBG0536</td><td></td></tr><tr><td>Hidrojel</td><td>BD Biosciences</td><td>356234</td><td>Bodrum Membran</td></tr><tr><td>Matrisi İyodofor</td><td>LIRCON, Çin</td><td>5190313</td><td></td></tr><tr><td>ışık geçirmez kültür kabı</td><td>DVS, Çin</td><td>AN-5058548</td><td>kendi kendine yapılan, siyah boya püskürtülmüş cam tabak</td></tr><tr><td>Tıbbi Yapışkan Bant</td><td>Cofoe, Çin</td><td>K12001</td><td></td></tr><tr><td>non-invaziv mikrocımbız</td><td>RWD Life Science</td><td>F11033-11 ve F12016-15</td><td></td></tr><tr><td>Tek Dokunuşla ultra kolay Temel kan şekeri izleme sistemi</td><td>Johnson & Johnson</td><td>33391713</td><td></td></tr><tr><td>oftalmik makas</td><td>RWD Life Science</td><td>S12012-12 ve S11001-08</td><td></td></tr><tr><td>P/S (penisilin / streptomisin)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>pentobarbital sodyum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-010</td><td></td></tr><tr><td>Propidium iyodür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>STZ (streptozotosin)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0130</td><td></td></tr><tr><td>Test Şeridi</td><td>GenUltimate</td><td>100-50</td><td></td></tr><tr><td>TRITC-konjuge Keçi anti-Tavşan IgG (H + L)</td> <td>proteintech</td><td>SA00007-2</td><td>Seyreltme (1:200)</td></tr> <tr><td>vasküler kelepçe</td><td>RWD Yaşam Bilimleri</td><td>R31006-04</td><td></td></tr></tbody></table>

inguinal subkutan beyaz yağ dokusu (iswat) transplantasyon modeli murine adacıkları

Inguinal Subcutaneous White Adipose Tissue (ISWAT) Transplantation Model of Murine Islets

Pankreas adacık nakli tip 1 diyabet için köklü bir tedavi yöntemidir. Böbrek kapsülü kemirgen modellerinde adacık nakli için en sık kullanılan yerdir. Ancak, sıkı böbrek kapsülü büyük hayvanlarda ve insanlarda yeterli adacıkların naklini sınırlar. Yeni bir deri altı alan olan inguinal subkutan beyaz yağ dokusunun (ISWAT) adacık nakli için potansiyel olarak değerli bir yer olduğu bulunmuştur. Bu site diğer deri altı alanlarda daha iyi kan akımı vardır. Ayrıca, ISWAT böbrek kapsülü daha büyük bir adacık kütlesi barındırır, ve içine nakli basittir. Bu makale, sinjenik diyabetik fare alıcılarının ISWAT bölgesinde fare adacık izolasyonu ve transplantasyon prosedürünü açıklamaktadır. Bu protokol kullanılarak, murine pankreas adacıkları standart kollajenaz sindirim tarafından izole edildi ve bir bazal membran matris hidrojel ISWAT sitesinde safamına adacıklar sabitleme için kullanılmıştır. Alıcı farelerin kan şekeri düzeyleri 100 günden fazla izlendi. Adacık greftleri histolojik analiz için transplantasyon dan sonra 100. Bu el yazmasında açıklanan ISWAT sitesinde adacık nakli protokolü basit ve etkilidir.

Bu protokolde iki işlem uygulanmaktadır: iswat bölgesine mürin adacık hazırlama ve adacık nakli. İlk işlemde, Tip V kollajenaz çözeltisi ile perfüzyon ve sindirilme, Histopaque-1119 ve Histopaque-1077 ile arındırılması ve ek bir el toplama adımı ndan sonra, izole edilmiş rüri adacıkları transplantasyon için yeterince saf olacaktır (Şekil 1'degösterildiği gibi) ve yüksek canlılığa sahip izole adacıklar transplantasyon için kullanılacaktır (Şekil 2'degösterildiği ...

Bu protokolde inguinal subkutan beyaz yağ dokusuna murine adacık izolasyonu ve transplantasyon yöntemi tanımlanmıştır. İzole syngeneic murine adacıkları bir murine alıcı içine bir bodrum membran hidrojel kullanılarak nakledilir. Alıcıların kan şekeri düzeyi izlenir ve adacık greftlerinin histoloji analizi yapılır.

Inguinal Subkutan Beyaz Yağ Dokusu (ISWAT) Transplantasyon Modeli Murine Adacıkları

Pancreatic islet transplantation is a well-established therapeutic treatment for type 1 diabetes. The kidney capsule is the most commonly used site for ...

Adacık transplantasyonu Tip I diabetes mellitus tedavisinde en umut verici yaklaşımlardan biridir. Adacık nakli için uygun bir yer arayışı devam ediyor. Inguinal subkutan beyaz yağ dokusuna adacık nakli klinik etkileri olabilecek basit ama etkili bir yöntemdir.Bu işlemin kliniğe ekstrapolasyonu Tip I diyabethastaları için bir tedavi gelişmesine yol açabilir. Bu yöntem, lingual'ın adacık engraftment için ideal bir yer olmadığı belirlendiği için klinik adacık transplantasyonu hakkında bilgi verebilir. Bu dikkatle prosedürün her adımı, pankreas sindirim gibi özellikle önemli adımları takip etmek önemlidir.Görsel gösteri, adacık izolasyonu ve dönüşümün nasıl yapılacağını daha iyi belirlemek için bu teknikte yeni araştırmacılara yardımcı olacaktır. Adacık hasat için, ilk sprey 10 haftalık C57 siyah altı fare kürk 75% etanol ile, ve taze hazırlanmış kollajenaz çözeltisi ile beş mililitreşşöyyuz doldurun. Şırıngayı 32 kalibrelik bükme künt sivri perfüzyon iğnesi ile donatın ve fareyi bir buz torbasının üzerine supine pozisyonunda yerleştirin.Kasık bölgesinin derisinde enine bir açıklık yapmak için düz sivri oftalmik makas kullanın ve hayvanın kafasına doğru kesi uzatmak. Tamamen ksifoid sürecine kasık bölgesinden bir V-kesi ile karın açık, ve safra kesesi ve ortak safra kanalının tüm uzunluğu ortaya çıkarmak için karaciğer hareket. Sonra ortak safra kanalının duodenal açılış kapatmak ve safra kesesi küçük bir açıklık kesmek için bir vasküler kelepçe kullanın.Daha önce hazırlanmış perfüzyon iğnesi ile açılış yoluyla ortak safra kanalı kanüle, ve pankreas içine kollajenaz çözeltisi yaklaşık iki mililitre enjekte. Tüm kollajenaz teslim edildiğinde, bağırsak, mide ve dalak perfüzyon pankreas ayırmak için noninvaziv mikro cımbız iki çift kullanın ve buz üzerinde 50 mililitrelik konik tüp içine pankreas yerleştirin. Tüm örnekler toplandığında, 50 mililitretüpler için pankreas başına Dnase I 100 mikrolitre ekleyin ve şiddetle orta sallayarak üç ila beş dakika boyunca 37 derece santigrat su banyosu içine dokuları yerleştirmeden önce 10 saniyelik bir süre içinde her tüp yaklaşık 40 kez sallamak.Kuluçka sonunda, sindirim tutuklamak için Stop Solution 50 mililitre son hacmi kadar ekleyin. Ve darbe hızla santrifüj durdurmadan önce 4 santigrat derece 750 kez G bir hıza tüpler santrifüj. Süpernatasyonları attıktan sonra, peletleri sadece gösterildiği gibi yıkama başına 15-25 mililitre Stop Solüsyonu'nda iki kez yıkayın.İkinci yıkamadan sonra, yeni 50 mililitrekonik tüpler içine tüp başına havuz üç pelet. Ve Histopaque 1119 on mililitre toplam hacminde pankreas hücreleri resuspend. Sonra dikkatle her tüpün yan aşağı Histopaque 1077 beş mililitre ekleyin, HBSS beş mililitre takip.Hücreleri santrifüje göre ayırın ve HBSS Histopaque 1077 arabirimindeki adacıkları toplamak için beş mililitrelik Pasteur pipeti kullanın. Adacıkları yeni bir 50 mililitrelik konik tüpte, darbe santrifüjü için 50 mililitrelik Stop Solution'ın son hacminde birleştirin ve süpernatant'ı atın. Bir dakika santrifüj için taze Stop Solution 30 mililitre pelet resuspend ve kültür ortamı 30 mililitre adacıklar resuspend.Adacıkları tüp başına 10 santimetrelik ışık geçirmez bir kültür çanağı haline getirin. Ve tabağı stereo mikroskobun altına yerleştirin. 200 mikrolitre jel yükleme pipet uçları kullanarak, el çözüm beyaz küresel adacıklar seçin.Adacıklar hasat edilirken 10 mililitre kültür ortamı içeren işlenmemiş bir hücre kültür yemeğine yerleştirilmesi. Hafif bir mikroskop altında dithizone boyama tarafından seçilen el adacıklarının saflığını kontrol edin. Ve floresan mikroskop altında floresan diasetat propidium iyodür boyama tarafından adacıkların canlılığını tespit edin.Daha sonra kültür taze kültür ortamda izole adacıklar 37 santigrat derece% 95 hava ve% 5 karbondioksit nakli kadar. Diyabet indüksiyonundan sonra üç ve dört gün başlayarak, her streptozotosin enjekte edilen sekiz haftalık erkek C57 siyah altı farenin kaudal damarını delerek her alıcı hayvandan kan örneği almak için .m.Her farenin açlık olmayan kan şekeri seviyesini belirlemek için temel bir kan şekeri izleme aleti kullanın ve sonra bireysel test şeritler üzerine kan ekleyin. Bir hayvan iki gün üst üste litre başına en az 20 milimol kan şekeri seviyesini gösterdiğinde, tartın ve alıcı fare işareti ve anestezi hayvanlarda pedal refleks yanıt eksikliği onaylamak. Erimesi için eksi 20 santigrat dereceden bir hidrojel deposu yerleştirin.Ve alıcı başına 450 ila 500 adacık eşdeğerini, buz üzerindeki tüp başına 200 mikrolitre orta madde içeren steril 1,5 mililitrelik centrifuge tüpüne aktarın. Alıcının sol inguinal alanını %75 etanol ile temizle ve fareyi supine pozisyonuna getirin. Cerrahi bant ile uzuvları düzeltmek ve cerrahi site nin etrafında saç kaldırmak için makası kullanın.Cerrahi bölgeyi iyodophor ile temizler ve dezenfekte edilmiş deride dikey bir kesi yapın. ISWAT içinde inferior epigastrik arter ve ven tanımlayın ve damarların üzerinde küçük bir cep oluşturmak. Santrifüj ile adacıkları tortulayın ve mümkün olduğunca çok supernatant çıkarın.Her tüpe 20 mikrolitre çözülmüş hidrojel ekleyin ve kabarcıklardan kaçınmaya özen tarak adacıkları yavaşça askıya alın. Homojen bir süspansiyon elde edildiğinde, bir tüpten cebe tüm adacık hidrojel karışımını dikkatlice iletmek için 200 mikrolitrelik pipet ucu kullanın. Hidrojel tamamen katılaşmış olduğunda, transplantasyon bölgesine 20 mikrolitre sefalosporin ekleyin ve kas ve deriyi 5-0 sürekli cerrahi dikişle kapatın.Daha sonra alıcıyı tam bir işe gelene kadar izleyerek termal ped üzerinde temiz bir kafese yerleştirin. Gösterildiği gibi murine adacık işleme sonra, izole murine adacıkları transplantasyon için yeterince saf olacaktır. Transplantasyon için sadece yüksek canlılığa sahip izole adacıklar kullanılmalıdır.Adacık greftlerinin hidrojel ile iyice karıştırılmasından sonra greft ISWAT bölgesine yerleştirilmesi mümkündür. ISWAT içine transplantasyon yaklaşık bir ay sonra, adacık greftler ters hiperglisemi ise alıcı farelerin vücut ağırlığı giderek artar. Transplantasyondan 100 gün sonra greftlerin çıkarılması a.m 10:00'da ani bir artışa neden olabilir.açlık olmayan kan şekeri düzeyi. Şu anda histolojik analiz, adacık greftlerinin bozulmadığını ortaya koymaktadır. İnsülin ve glukagon immünofloresan boyama, nakledilen adacıkların da transplantasyon sonrası 100 gün sonra fonksiyonel olduğunu göstermektedir.Profused pankreas hücrelerini çok sağlam sallamak için dikkatli olun ya da başka elde edilen adacıkların yeteneği tehlikeye olacaktır. İzole adacıklar, izole transplantasyonun inüinal subkutan beyaz yağ dokusuna etkilerini karşılaştırmak için böbrek kapsülü altına nakledilebilir. Prosedür karaciğer dışında diğer sitelere adacık nakli klinik çalışmaların başlatılması nı katacak.

inguinal-subcutaneous-white-adipose-tissue-iswat-transplantation

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Izole adacık transplantasyonu tip 1 şeker hastalığı için potansiyel bir tedavi olarak öne sürülmüştür. Burada, fare pancreata adacıkları izole, ve böbrek subkapsüler alan nakli için bir yöntem açıklanmaktadır.

Murin Islet İzolasyon ve subkapsüler Böbrek Nakli Bir Yöntem

Bu protokol, murine iz izolasyonunu ve bir desellularize iskele üzerine tohumlamayı gösterir. İskele destekli adacıklar streptozotosin (STZ) ile indüklenen diyabetik farelerin epididimal yağ yastığı içine nakledildi. Isletler nakil alanından kurtuldu ve hiperglisemik durumu tersine çevirdi.

Diyabetik Farenin Epididimal Yağ Tabağında Iskelelerin İskele Destekli Nakli

Beyaz Yağ dokusundan (WAT) farmakolojik geliştirme ve metabolik çalışmalar engelleyen onun geçerli birincil kültür modelleri içinde önemli eksiklikleri vardır. Burada, bir yağ microphysiological sistem tarafından sandviç WAT levha stromal hücreler arasında üretmek için bir protokol mevcut. Bu yapıyı birincil WAT kültür için istikrarlı ve uyarlanabilir bir platform sağlar.

İnsan yağı için bir Microphysiologic Platform: beyaz yağ dokusu sandviç

Bu makalede, alıcı hayvanların interscapular beyaz yağ yastığı içine donör sıçan meme epitel hücreleri greft bir transplantasyon yöntemi açıklanmaktadır. Bu yöntem, meme epitel gelişimi üzerindeki konak ve/veya donör etkilerini incelemek ve ön temizleme ihtiyacını ortadan kaldırmak ve böylece bu tekniğin kullanışlılığını genişletmek için kullanılabilir.

Interscapular Beyaz Yağ Ped içine Rat Mammary Epitel Hücre Nakli

Bu yağ kaplı adacık nakli yöntemi, intraperitoneal boşlukta engrafe adacıkların tespiti için uygundur. Özellikle, biyobağlayıcı ajanların kullanılmasını veya dikiş atılmasını gerektirmez.

Epididim Beyaz Yağ Dokusu Kullanılarak Yağ Kaplı Adacık Nakli

Mikro-PET/MR görüntüleme tabanlı bir yaklaşım kullanılarak farelerde termojenik yağ depolarının fonksiyonel görüntülenmesi ve kantitasyonu.

[18F]FDG Micro-PET/MR Görüntüleme Kullanılarak Farelerde Kahverengi ve Bej Yağ Dokularının Görselleştirilmesi ve Ölçülmesi

Bu protokol, bej yağ biyolojisini araştırmak için adeno ilişkili virüse (AAV) alternatif bir strateji olarak adipositlerde (AdipoSPH) CRISPR SunTag-p65-HSF1 (SPH) kullanımını sunmaktadır. Endojen Prdm16 genini hedef alan AAV taşıyan sgRNA'nın in vivo enjeksiyonu, bej yağ gelişimini indüklemek ve termojenik gen programını geliştirmek için yeterlidir.

CRISPR SunTag-p65-HSF1 Aktivasyon Sistemi Kullanılarak Bej Yağ Biyolojisi ve Metabolizmasının İncelenmesi

Bu protokol, preadipositleri elde etmek ve in vitro adiposit diferansiyasyonunu sağlamak için stromal vasküler fraksiyonun (SVF) murin yağ dokusundan yarı otomatik izolasyonunu tanımlar. Kollajenaz sindirimi için bir doku ayrıştırıcısı kullanmak deneysel varyasyonu azaltır ve tekrarlanabilirliği arttırır.

Bir Doku Dissosiyatör Kullanarak Stromal Vasküler Fraksiyonun Murin Beyaz Yağ Dokusundan Yarı Otomatik İzolasyonu

Burada, diyabetik ve obez BTBR farelerinde böbrek fonksiyonlarını iyileştirirken kısırlığı, obeziteyi ve hiperglisemiyi tersine çevirmek için umut verici bir strateji sunan beyaz ve kahverengi bir yağ dokusu nakli protokolü sunuyoruz.

Beyaz ve Kahverengi Yağ Greftleri: Siyah ve Ten Rengi Brachyury (BTBR) Obez Farelerde Üreme, Metabolik ve Böbrek Eksikliklerini Düzeltmeye Yönelik Bir Yaklaşım

Fare ve sıçanlarda barsak mezenter arter kaskad rahim dokusundaki otomatik nakli endometriozis cerrahi indüksiyon açıklaması.

Uterus Doku Otomatik nakli Cerrahi indüklenen Endometriozis Fare Modeli

Öğrenin, fare adacıklarını inguinal subkutan beyaz yağ dokusuna transplantasyon yöntemini. Bu teknik, Tip 1 diyabet tedavisinde klinik uygulama potansiyeli sunar ve kan şekeri izlemi ile histolojik analiz içerir.

Inguinal Subkutan Beyaz Yağ Dokusu (ISWAT) Transplantasyon Modeli Murine Adacıkları

Daha fazla video keşfet