Name: Koşullu Cas9 Stabilizasyonunu Kullanarak Gen fonksiyonlarını değerlendirmek için Yeni Bir Araç Seti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Öğrenin, Shield-1 ile koşullu Cas9 stabilizasyonunu kullanarak CRISPR-Cas9 gen düzenleme yöntemini. Bu teknik, düşük off-target etki ve hücre toksisitesi ile esansiyel genleri ve tümör hayatta kalma genlerini karakterize etmeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Laboratuvarımızın önceki üyelerine ve bilim insanı Serif Şentürk'e önceki çalışmalarından dolayı teşekkür ediyoruz. Danilo Segovia'ya bu makaleyi eleştirel bir şekilde okuduğu için teşekkür ederiz. Bu çalışma Swim Across America ve National Cancer Institute Cancer Target Discovery and Development Center programı tarafından mümkün ve desteklendi.

1. DD-Cas9 vektör
<ol><li>Addgene'den DD-Cas9 vektörü (dolgu sırası ve Venüs (EDCPV), Plasmid 90085 ile DD-Cas9 vektörü edinin. NOT: Bu, EFS organizatörü DD-Cas9 transkripsiyonunu sürerken tek kılavuz RNA (sgRNA) transkripsiyonunu yönlendiren bir U6 promotörüne sahip bir lentiviral DD-Cas9 plazmididir. DYKDDDDK dizisi (bayrak etiketi), Cas9'un C terminalsinde ve ardından DD-Cas9 ve modifiye floresan protein Venüs'ü (mVenus) ayıran 2A kendinden yarıklı peptitte (P2A) bulunur.</li>
</ol>2. Küçük kılavuz RNA (sgRNA) tasarımı
<ol><li>Belirli bir genomik bölgeyi hedef alan birkaç algoritmadan birini kullanarak DD-Cas9 vektörüne klonlanacak küçük kılavuz RNA (sgRNA) tasarlayın. NOT: Hedef dışı efektleri azaltmak için web sitesini kullanarak en yüksek puana sahip sgRNA dizilerini seçin: http://crispr.mit.edu.</li>
	<li>Tam bir sgRNA yapmak için sgRNA dizisi başına iki oligonükleotid tasarlayın ve sipariş edin. NOT: Plazmid BsmBI enzimi tarafından sindirileceğinden, sgRNA dizisine BsmBI sindirim çıkıntıları ekleyerek ileriyi ve ters oligonükleotidleri tasarlayın. Tablo 1'denşablonu kullanın.</li>
</ol>3. sgRNA'nın lentiviral DD-Cas9 vektörüne klonlanması
<ol><li>Kısıtlama enzim sindirim reaksiyonunda alkali fosfataz (FastAP) kullanarak DD-Cas9 plazmidinin 5′-uçlarını defosforille edin. NOT: Vektörler ligasyon sırasında özellikle tek bir kısıtlama enzimi tarafından doğrusallaştırıldıklarında yeniden daireselleştirebilirler. Vektörün yeniden daireselleşmemesini sağlamak için, doğrudan sindirim reaksiyonuna fosfataz ekleyerek plazmidi de-fosforilize edin.<ol>
<li>5 μg DD-Cas9 plazmid karışımı hazırlayarak plazmidi BsmBI enzimi ile defosforilize edin ve sindirin, 6 μL sindirme tamponu (10x), 0,6 μL DTT (100 mM), 3 μL BsmBI, 3 μL FastAP, 60 μL'yi toplam reaksiyon hacmi yapmak için 60 μL'ye kadar çekirdeksiz su ekleyin. NOT: Sonunda karışıma BsmBI enzimini ve FastAP'ı ekleyin.</li>
		<li>Karışımı 37 °C ısı bloğunda veya termositte 30 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sindirilmiş DD-Cas9 plazmidini arındırın.<ol>
<li>Eksik sindirilmiş plazmid ve enzim izlerini gidermek için% 0.8 DNA agarose jeli hazırlayın. Daha iyi ayırma için daha geniş bir jel tarak kullanın ve jeli 90 V'ta çalıştırın.</li>
		<li>360-365 nm UV ışığı altındaki bantları görselleştirin ve daha büyük plazmid bandını jelden kesin. Dolguya karşılık gelen 2 kb'lık parçayı atın.</li>
		<li>Ticari jel temizleme kiti kullanarak büyük kesim jel bandını arındırın ve üreticinin talimatlarına uyun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sindirilmiş DD-Cas9 plazmid ile ligat tavlanmış oligolar.<ol>
<li>Fosforilit ve tavlama sgRNA oligos.<ol>
<li>1 μL T4 Ligasyon Tamponu (10x), 1 μL Oligo 1 (100 μM), 1 μL Oligo 2 (100 μM), 6,5 μL çekirdeksiz su karışımını hazırlayın. Son olarak, 0,5 μL T4 PNK ekleyin. Bu reaksiyonun toplam hacmi 10 μL'dir.</li>
			<li>Reaksiyon karışımını termosikle aşağıdaki koşullarla ekleyin: 30 dakika için 37 °C, 5 dakika için 95 °C ve ardından 5 °C/ dk hızıyla 25 °C'ye kadar rampa. NOT: Oligonükleotidler ligasyona konulmadan önce PNK ısı inaktive edilmelidir, aksi takdirde PNK vektörü fosforilize eder. Fosforilasyon adımı ve tavlama adımı bir termosikler içinde birlikte gerçekleştirilir. Ligasyonun gerçekleşmesi için sgRNA oligonükleotidlerine 5' fosfatın eklendiği fosforilasyon adımı gereklidir.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Ligate DD-Cas9 sindirilmiş plazmid ve sgRNA oligos.<ol>
<li>Tavlanmış oligoları çekirdeksiz suda 1:200'e kadar seyreltin ve ligasyon reaksiyonunda 50 ng plazmid DNA kullanın. NOT: Kesici uç entegrasyonunu teşvik etmek için 6 kesici ucun molar oranını kullanın: 1 vektör veya molar oranını hesaplamak için bir ligasyon hesaplayıcısı kullanın: http://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation.</li>
			<li>Ligasyon reaksiyon karışımını hazırlayın: 50 ng sindirilmiş ve saflaştırılmış DD-Cas9 vektörü, uygun hacimde seyreltilmiş tavlanmış oligo, 1 μL T4 Ligasyon Tamponu (10x), 1 μL T4 DNA Ligaz, 10 μL'ye kadar nükleaz içermeyen su reaksiyonun toplam hacmini elde etmek için 10 μL μL.</li>
			<li>"Yüksek konsantrasyon" ligase kullanıyorsanız, reaksiyonu oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatırın. Aksi takdirde, oda sıcaklığında 2 saat kuluçkaya ya da daha yüksek bir ligasyon verimi elde etmek için bir gecede 16 °C'de kuluçkaya yatırın. NOT: 65 °C'deki standart T4 DNA Ligase'i 20 dakika kullanıyorsanız ısı devre dışı bırakın. Ligase master karışımları kullanıyorsanız ısı inaktive etmeyin.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Bakteriyel dönüşüm
<ol><li>Oda sıcaklığında önceden ılık 10 cm LB-ampisilin agar plakaları.</li>
	<li>Buz üzerinde 50 μL "One shot Stbl3" yetkin bakteri hücrelerini çözün.</li>
	<li>50 μL yetkin bakteri hücrelerine 2-3 μL ligasyon karışımı ekleyin ve tüpün altını 4 kez parmakla vurarak hafifçe karıştırın. 30 dakika boyunca buzda kuluçkaya yaslanın.</li>
	<li>Bir zamanlayıcı kullanarak hücreleri tam olarak 42 °C'de 40 saniye boyunca ısı şokuna alın. Buz üzerindeki bakteri hücrelerini 5 dakika soğutun.</li>
	<li>Bakteri hücrelerine antibiyotiksiz 500 μL SOC ortam ekleyin ve 45 dakika boyunca 250 rpm'de, 37 °C'de sallanan inkübatörde yetiştirin.</li>
	<li>100 μL dönüştürülmüş bakteriyi önceden ılık LB-ampisilin plakalara yayın ve 37 °C'de bir gecede kuluçkaya yayın.</li>
</ol>5. Ligated plazmid mini / maxi-prep
<ol><li>Maxi/mini hazırlık başlangıç kültürü hazırlayın.<ol>
<li>Ertesi gün tek bir bakteri klonu seçin ve ampisilin içeren 8 mL LB ortam ile bir başlangıç kültürünü aşıla.</li>
		<li>Titreyen inkübatördeki bakterileri 250 rpm, 37 °C'de 10-12 saat boyunca büyütün.</li>
		<li>Mini hazırlık için 3-5 mL bakteri kullanın veya maxi-prep için başlangıç kültürü olarak kullanın. Bakteri kültürü oranında % 100 gliserol ekleyerek bakterilerin geri kalanını bakteriyel gliserol stoku olarak kullanın:gliserol 1:1'dir. NOT: Burada, mini hazırlık prosedürünü açıklayacağız.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mini hazırlık prosedürü<ol>
<li>1 dakika boyunca 12.000 x g'da 3-5 mL bakteri hücresi ve santrifüj hasat edin.</li>
		<li>Bakteri hücrelerinin peletini RNase A içeren ve 4 °C'de depolanan 200 μL P1 tamponu ile yeniden depolar.</li>
		<li>200 μL tampon P2 ekleyin ve sıvı netleşene kadar tüpü 10 kez ters çevirerek hafifçe karıştırın.</li>
		<li>300 μL tampon P3 ekleyin ve tüpü 10 kez ters çevirerek karıştırın. Sıvı bulanıklaşacak. Numuneleri 10 dakika boyunca 12.000 x g'da santrifüjleme ile hemen devam edin.</li>
		<li>1 dakika boyunca 12.000 x g'da spin sütununa ve santrifüje net bir süpernatant aktarın. Akışa geç. NOT: Süpernatantın açıklığa kavuştukğından emin olun. Parçacıklar spin sütununu tıkayabilir ve sütun etkinliğini azaltabilir.</li>
		<li>1 dakika boyunca 12.000 x g'da 400 μL PD tampon ve santrifüj ekleyin. Akışa geç.</li>
		<li>Spin sütununu ve santrifüjü 1 dakika boyunca 12.000 x g'da yıkamak için 600 μL PW tampon ekleyin. Akışa geç.</li>
		<li>Tampon kalıntılarını gidermek için spin sütununu 3 dakika boyunca en yüksek hızda tekrar santrifüjlayın. Akışı atın ve 2 dakika bekletin.</li>
		<li>Spin sütununu yeni bir tüpe yerleştirin ve 50 μL elution tamponu ekleyin. 5 dakika kuluçkaya yatır ve 2 dakika en yüksek hızda santrifüj.</li>
		<li>SgRNA kesici uç (ng/μL) ile saflaştırılmış DD-Cas9 plazmid konsantrasyonunu ölçmek için nanodrop cihazını kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>SgRNA klonlamayı DD-Cas9 plazmidinin DNA dizilimi ile doğrulayın. Tablo 2'dekiU6 astar sırasını kullanın.</li>
</ol>6. Lentiviral hazırlık
<ol><li>HEK293T ambalaj hücrelerini transfection için hazırlayın.<ol>
<li>10.geçişe kadar sağlıklı HEK293T kullanın ve 10 cm doku kültürü plakası başına 1-2 x10 6 hücre yoğunluğunda eşit olarak tohumlayın. %10 filtreli Fetal Sığır Serumu (FBS) ile 10 mL Glikoz Dulbecco Modifiye Kartal Orta (DMEM) kullanın. Doku kültürü inkübatöründeki hücreleri20 saat boyunca% 5 CO 2 ve 37 ° C'de kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Ertesi gün, hücrelerin brightfield mikroskopisi ile% 70 izdiah ulaştığından ve plaka boyunca eşit olarak dağıldıklarını onaylayın. Son hacmi 10 mL olan transfectiondan 1 saat önce ortamları hücrelere değiştirin. NOT: Medyada antibiyotik ve antimycotics bulunmamalıdır.</li>
		<li>2 tüpün karışımını 500 μL sıcak ortamla hazırlayın (örneğin, OptiMEM).<ol>
<li>Sıcak 500 μL ortam içeren tüp 1'e 25 μL transfeksiyon reaktifi ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
			<li>Bu arada, klonlanmış sgRNA içeren 3,5 μg DD-Cas9, ambalaj plazmidi (psPAX2) içeren 6 μg ve zarf plazmidinin (pMD2.G) 3 μg'sını içeren tüp 2'ye 500 μL ortama plazmid karışımı hazırlayın.</li>
			<li>Bir transfeksiyon karışımı oluşturmak için tüp 1'i tüp 2 ile karıştırın ve oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
			<li>Kan nakli karışımını HEK293T hücrelerine bırakın ve doku kültürü inkübatöründe bir gecede% 5 CO2 ve 37 ° C'de inkübatör plakası.</li>
			<li>18 saat sonra, transfeksiyon reaktifini çıkarmak için ortamı %10 FBS ile 10 mL taze DMEM'e dikkatlice değiştirin. Sonraki 48 saat kuluçkaya yatır.</li>
			<li>48 saat sonra, süpernatantı 10 mL şırıng ile toplayın ve 0,45 μm filtreden geçirin.</li>
			<li>Aliquot ve virüs süpernatant -80 °C saklayın.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Akış sitometrisi ile virüs titresinin ve transdüksiyon etkinliğinin belirlenmesi
<ol><li>HEK293T hücrelerini 5 x 105 hücreli/ kuyulu 6 kuyulu bir tabağa tohumla. İki 6 kuyu plakasına tohum hücreleri. Ertesi gün saymak için bir tabak kullanın.</li>
	<li>İnkübatördeki plakaları 37 °C, %95 nem, %5 CO2'de bir gecede kuluçkaya yatırarak ertesi gün %50-60 izdiah eder.</li>
	<li>Ertesi gün, 6 kuyudaki hücreleri saymak için 6 kuyu plakalarından birini kullanın.</li>
	<li>Seri seyreltmeyi gerçekleştirmek için kullanılacak virüs aliquotunu çözün ve 8 μg / mL polibren reaktif ekleyin.</li>
	<li>Virüsün seri seyreltilmesi için %10 FBS ile DMEM hazırlayın ve 8 μg/mL polibren reaktif ekleyin.</li>
	<li>Polibren içeren ortamda lentivirüs 1 x 10 -1 ila 1 x10 -4 arasında 2 mL on kat seri seyreltme hazırlayın.</li>
	<li>Medyayı 6 kuyu plakasından çıkarın ve kuyulara 1 mL viral seyreltme ekleyin. Bir kuyuda medya ile negatif kontrol olarak, bir kuyuda ise %100 virüs bırakın.</li>
	<li>24 saat boyunca inkübatörde virüsle hücreleri kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Ertesi gün, virüslü medyayı 6 kuyu plakalarından çıkarın ve% 10 FBS ile 2 mL taze DMEM için değiştirin. Hücreleri 48-72 saat kuluçkaya yatır. Her gün floresan mikroskop kullanarak GFP'ye dikkat edin.</li>
	<li>48-72 saat sonra hücreleri ayırın ve MACS arabelleğine yeniden biriktirin.</li>
	<li>GFP ifadesinin yüzdesini belirlemek için bir akış sayacı kullanın.</li>
	<li>Aşağıdaki formülü kullanarak virüs titresini hesaplayın: TU/mL = (Dönüştürülen hücre sayısı x Yüzde floresan x Seyreltme Faktörü)/(mL'de Transdüksiyon Hacmi)</li>
</ol>8. Hedef hücrelerin lentiviral transdüksiyon
<ol><li>İlgi çekici hücre hattını 10 cm'lik bir plakaya plakala ve ertesi gün% 50-60 izdiah ulaşmak için gece boyunca kuluçkaya yatırın. NOT: DD-Cas9 ve iki bağımsız RPA3 gen sgRNA'yı ifade eden A549 hücre hattını kullandık. Renilla kontrolü ile vektörü ifade eden A549 hücre hattını da kullandık. Bu hücreleri 2 x 103hücre/cm2 yoğunluğunda tohumladık ve ertesi gün % 50-60 izdiah etmek için bir gecede 37 °C, %95 nem, %5 CO2'de kuluçkaya yatırdık. %10 filtrelenmiş FBS ile RPMI ortam kullandık. Aşağıdaki gibi sonraki adımlarla devam ettik:</li>
	<li>Ertesi gün, hücrelere 10 mL toplam kültür ortamında 500-2000 μL virüs partikülleri bulaştırın. Viral medyayı 24 saat kuluçkaya yatır.</li>
	<li>Ertesi gün, viral ortamı kültür ortamına değiştirin ve akış sitometrisi kullanarak GFP pozitif hücrelerinin yüzdesini belirleyin.</li>
	<li>GFP pozitif hücrelerini FACS hücre sıralama veya bleomiscin seçimi kullanarak seçin.</li>
	<li>Pozitif olarak seçilen hücreleri genişletin ve bir stoğu dondurun.</li>
</ol>9. Cas9 aracılı gen düzenlemesinin koşullu indüksiyonu
<ol><li>Plaka pozitif olarak seçilen hücreler enfeksiyondan 24 saat sonra ve çevrilmemiş hücreler ayrı ayrı 12 kuyu plakasına. Hücreler takılana kadar bekleyin ve ortamı 200 nM Shield-1 içeren hücre kültürü ortamına değiştirin. Plakalardaki ortamı transdüklenmiş ve çevrilmemiş hücrelerle değiştirin ve plaka başına 2 kuyuyu negatif kontrol olarak normal ortamla bırakın.</li>
	<li>Shield-1'i kuyulara ekledikten sonra her kuyudan farklı zaman noktalarında proteinleri kuluçkaya yatırın ve çıkarın: zaman 0, 2 saat, 6 saat, 12 saat, 24 saat, 48 saat ve 72 saat.</li>
	<li>Ardından Shield-1 ile medyayı kuyuların geri kalanından çıkarın ve normal hücre ortamı için değiştirin.</li>
	<li>Ortamı değiştirdikten sonra proteinleri 2 saat, 6 saat ve 12 saat bu kuyulardan toplayın.</li>
	<li>Batı blot analizi ile dengelenmiş DD-Cas9 protein regülasyonunun geri döndürülebilirliğini ve hızlılığını ligandının eklenmesinden ve geri çekilmesinden sonra görselleştirin, Shield-1. Proteinleri görselleştirmek için DYKDDDDK Etiketine yönelik antikor ve örneğin beta-tubulin için bir kontrol antikor hedeflemesi kullanın.</li>
	<li>Batı Blot analizi tarafından gözlenen doz-tepki eğrisi ile En uygun Shield-1 dozunu belirleyin.</li>
</ol>10. Gen düzenlemenin doğrulanması
NOT: Akış sitometri analizi ve bleomisin seçim işaretçisi gibi GFP ifade tahlilleri yalnızca başarılı CRISPR reaktif iletimini onaylar, ancak istenen sıranın başarıyla hedef olup olmadığını belirlemez. CRISPR deneyi ile başarılı gen hedeflemesini doğrulamak için en yaygın tahliller Sanger DNA dizilimi, Yeni nesil dizileme, Surveyor Nuclease Tahlil, Ayrışma (TIDE) Testi ile Indels'in İzi veya batı leke analizi16,17,18 'dir.
<ol><li>Pozitif olarak seçilen hücreleri plakala ve ortamı ortam içeren 200 nM Shield-1'e değiştirin. Hücreleri 5 gün boyunca kuluçkaya yatırarak, her 3 günde bir Shield-1 ile ortamları değiştirir.</li>
	<li>Shield-1 tarafından DD-Cas9 indüksiyondan 5 gün sonra yukarıda belirtilen doğrulama tekniklerini kullanın.</li>
</ol>

<ol><li>Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJinek%2C+M+%22Science%22">Science</a>. 337, New York, N.Y. 816-821 (2012).</li>
<li>Al-Attar, S., Westra, E. R., van der Oost, J., Brouns, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clustered+regularly+interspaced+short+palindromic+repeats+%28CRISPRs%29%3A+the+hallmark+of+an+ingenious+antiviral+defense+mechanism+in+prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPRs): the hallmark of an ingenious antiviral defense mechanism in prokaryotes.</a> Biological Chemistry. 392, 277-289 (2011).</li>
<li>Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+applications+of+CRISPR-Cas9+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering.</a> Cell. 157, 1262-1278 (2014).</li>
<li>Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMali%2C+P+%22Science%22">Science</a>. 339, New York, N.Y. 823-826 (2013).</li>
<li>Barrangou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+CRISPR-Cas9+genome+engineering%3A+lessons+learned+from+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Advances in CRISPR-Cas9 genome engineering: lessons learned from RNA interference.</a> Nucleic Acids Research. 43, 3407-3419 (2015).</li>
<li>Zhang, J., Chen, L., Zhang, J., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+Inducible+CRISPR%2FCas+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Computational+and+Structural+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Drug Inducible CRISPR/Cas Systems.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. , (2019).</li>
<li>Wade, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+Silencing+Using+the+CRISPR-Cas9+System%3A+A+Review+of+the+Benefits+and+Challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">High-Throughput Silencing Using the CRISPR-Cas9 System: A Review of the Benefits and Challenges.</a> Journal of Biomolecular Screening. 20, 1027-1039 (2015).</li>
<li>Egeler, E. L., Urner, L. M., Rakhit, R., Liu, C. W., Wandless, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand-switchable+substrates+for+a+ubiquitin-proteasome+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ligand-switchable substrates for a ubiquitin-proteasome system.</a> Journal of Biological Chemistry. 286, 31328-31336 (2011).</li>
<li>Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+easy+and+efficient+inducible+CRISPR%2FCas9+platform+with+improved+specificity+for+multiple+gene+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">An easy and efficient inducible CRISPR/Cas9 platform with improved specificity for multiple gene targeting.</a> Nucleic Acids Research. 44, 149(2016).</li>
<li>Oakes, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+engineering+hotspots+identifies+an+allosteric+CRISPR-Cas9+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Profiling of engineering hotspots identifies an allosteric CRISPR-Cas9 switch.</a> Nature Biotechnology. 34, 646-651 (2016).</li>
<li>Kamiyama, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+protein+tagging+in+cells+with+split+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein.</a> Nature Communications. 7, 11046(2016).</li>
<li>Roper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genome+editing+and+organoid+transplantation+models+of+colorectal+cancer+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">In vivo genome editing and organoid transplantation models of colorectal cancer and metastasis.</a> Nature Biotechnology. 35, 569(2017).</li>
<li>Chu, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+progress+with+FKBP-derived+destabilizing+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+%26+Medicinal+Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">Recent progress with FKBP-derived destabilizing domains.</a> Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 18 (22), 5941-5944 (2008).</li>
<li>Banaszynski, L. A., Sellmyer, M. A., Contag, C. H., Wandless, T. J., Thorne, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+control+of+protein+stability+and+function+in+living+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chemical control of protein stability and function in living mice.</a> Nature Medicine. 14, 1123-1127 (2008).</li>
<li>Banaszynski, L. A., Chen, L. C., Maynard-Smith, L. A., Ooi, A. G., Wandless, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid%2C+reversible%2C+and+tunable+method+to+regulate+protein+function+in+living+cells+using+synthetic+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A rapid, reversible, and tunable method to regulate protein function in living cells using synthetic small molecules.</a> Cell. 126, 995-1004 (2006).</li>
<li>Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Survey+of+Validation+Strategies+for+CRISPR-Cas9+Editing%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A Survey of Validation Strategies for CRISPR-Cas9 Editing.</a> Scientific Reports. 8, 888(2018).</li>
<li>Hua, Y., Wang, C., Huang, J., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+efficient+method+for+CRISPR%2FCas9-induced+mutant+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">A simple and efficient method for CRISPR/Cas9-induced mutant screening.</a> Journal of Genetics and Genomics. 44 (4), 207-213 (2017).</li>
<li>Guschin, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+general+assay+for+monitoring+endogenous+gene+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification.</a> Methods in Molecular Biology. 649, 247-256 (2010).</li>
<li>Senturk, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+tunable+method+to+temporally+control+gene+editing+based+on+conditional+Cas9+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Rapid and tunable method to temporally control gene editing based on conditional Cas9 stabilization.</a> Nature Communications. 8, 14370(2017).</li>
<li>McJunkin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+suppression+of+an+essential+gene+in+adult+mice+using+transgenic+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Reversible suppression of an essential gene in adult mice using transgenic RNA interference.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 7113(2011).</li>
<li>Davis, K. M., Pattanayak, V., Thompson, D. B., Zuris, J. A., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule-triggered+Cas9+protein+with+improved+genome-editing+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Small molecule-triggered Cas9 protein with improved genome-editing specificity.</a> Nature Chemical Biology. 11, 316-318 (2015).</li>
<li>Dow, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+in+vivo+genome+editing+with+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9.</a> Nature Biotechnology. 33, 390-394 (2015).</li>
<li>Wright, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+a+split-Cas9+enzyme+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Rational design of a split-Cas9 enzyme complex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 2984-2989 (2015).</li>
<li>Albrecht, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Lentiviral+Packaging+Mixes+and+Producer+Cell+Lines+for+RNAi+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Comparison of Lentiviral Packaging Mixes and Producer Cell Lines for RNAi Applications.</a> Molecular Biotechnology. 57, 499-505 (2015).</li>
<li>Froschauer, A., Kube, L., Kegler, A., Rieger, C., Gutzeit, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tunable+Protein+Stabilization+In+Vivo+Mediated+by+Shield-1+in+Transgenic+Medaka%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Tunable Protein Stabilization In Vivo Mediated by Shield-1 in Transgenic Medaka.</a> PLOS One. , (2015).</li>
<li>Sellmyer, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+context+affects+levels+of+a+chemically+dependent+destabilizing+domain%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Intracellular context affects levels of a chemically dependent destabilizing domain.</a> PLOS One. 7 (9), 43297(2012).</li>
<li>Iwamoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+chemical+method+to+regulate+protein+stability+in+the+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">A general chemical method to regulate protein stability in the mammalian central nervous system.</a> Chemistry & Biology. 17 (9), 981-988 (2010).</li>
<li>Tai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Destabilizing+domains+mediate+reversible+transgene+expression+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Destabilizing domains mediate reversible transgene expression in the brain.</a> PLOS One. 7 (9), 46269(2012).</li>
<li>Auffenberg, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+and+reversible+inhibition+of+neurons+and+circuits+by+small+molecule+induced+potassium+channel+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Remote and reversible inhibition of neurons and circuits by small molecule induced potassium channel stabilization.</a> Scientific Reports. 6, 19293(2016).</li>
</ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

CRISPR/Cas9 teknolojisi, genomları işlevsel olarak sorgulama yeteneğinde devrim yaptı2. Bununla birlikte, genlerin inaktivasyonu genellikle hücre öldürücülüğü, fonksiyonel eksiklikler ve gelişimsel kusurlarla sonuçlanır ve gen fonksiyonlarını incelemek için bu tür yaklaşımların yararını sınırlar7. Ayrıca, Cas9'un kesin ifadesi toksisiteye ve hedef dışı etkilerin üretilmesine neden olabilir6. CRISPR-Cas9 tabanlı genom düzenleme teknolojilerini zamansa...

"Kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrarlarla ilişkili protein 9" anlamına gelen CRISPR-Cas9 ilk olarak bakteri adaptif bağışıklık 1,2üzerine yapılan çalışmaların bir parçası olarak keşfedilmiştir. Bugün CRISPR/Cas9 programlanabilir gen düzenleme için en tanınmış araç haline gelmiştir ve transkripsiyonel ve epigenetik modülasyonlara izin vermek için sistemin farklı yinelemeleri geliştirilmiştir3. Bu teknoloji, DNA4'ünhemen hemen her dizisinin son derece hassas genetik manipülasyonu sağlar.
Herhangi bir CRISPR gen düzenlemesinin temel bileşenleri özelleştirilebilir bir kılavuz RNA dizisi ve Cas9 çekirdeği5'tir. RNA kılavuzu, DNA'daki hedef tamamlayıcı diziye bağlanır ve Cas9 çekirdeğini genom3,4'tebelirli bir noktada çift iplikçik kırılması gerçekleştirmeye yönlendirir. Elde edilen bölünme bölgesi daha sonra homolog olmayan son birleştirme (NHEJ) veya homolojiye yönelik onarım (HDR) ile onarılır ve bunun sonucunda hedeflenen DNA dizisi5'tekideğişikliklerin tanıtılması .
CRISPR/Cas9 tabanlı gen düzenlemenin kullanımı kolaydır ve önceki gen düzenleme tekniklerine kıyasla nispeten ucuzdurve2,4,5sistemlerinin çokluğunda hem verimli hem de sağlam olduğu kanıtlanmıştır. Yine de, sistem bazı sınırlamalar sunar. Cas9'un constitutive ifadesinin genellikle hedef dışı sayısı ve yüksek hücre toksisitesi4, 6,7,8ile sonuç olduğu gösterilmiştir. Ek olarak, temel ve hücre sağkalım genlerinin Cas9 tarafından eşgüdümlü olarak hedeflleştirilmesi, hücre ölümünün kinetik çalışmaları gibi belirli türde fonksiyonel çalışmaları yapma yeteneğinden uzaklaştırır7.
Tet-ON ve Tet-Off9gibi6sorunlarını gidermek için farklı indükleyici veya koşullu kontrollü CRISPR-Cas9 araçları geliştirilmiştir; bölgeye özgü rekombinasyon10; kimyasal nedenli yakınlık11; intein bağımlı birleştirme3; ve 4-Hidroksikomoxifen Östrojen Reseptörü (ER) bazlı nükleer lokalizasyon sistemleri12. Genel olarak, bu prosedürlerin çoğu (intein birleştirme ve kimyasal olarak indüklenen yakınlık bölme sistemleri) geri dönüşümlü kontrol sunmaz, ilaç tedavisine (Tet-On/Off sistemi) çok yavaş bir kinetik yanıt sunmaz veya yüksek verimli manipülasyona uygun değildir6.
Bu sınırlamaları gidermek için sadece hızlı ve sağlam zamansal kontrollü gen düzenleme sağlamakla kalmayıp aynı zamanda yüksek verimli gen manipülasyonu için izlenebilirlik, ayarlanabilirlik ve amenability sağlayan yeni bir araç seti geliştirdik. Bu yeni teknoloji hücre hatlarında, organoidlerde ve hayvan modellerinde kullanılabilir. Sistemimiz, Cas9 ile kaynaştığında, hızlı bozulmasına neden olan tasarlanmış bir etki alanına dayanmaktadır. Bununla birlikte, son derece seçici, toksik olmayan, hücre geçirgen küçük bir molekülle hızla stabilize edilebilir. Daha spesifik olarak, insan FKBP12 mutantını Cas9'a "istikrarsızlaştırıcı etki alanı" (DD) olarak tasarladık, memeli hücrelerinde ifade edildiğinde Cas9'u her yerde bulunan-proteazom sistemi aracılığıyla hızlı ve konsutif bozulma için işaretledik13. DD sentetik ligand, Shield-1 DD konformasyonunu stabilize edebilir, böylece DD'ye (Cas9 gibi) kaynaşmış proteinlerin çok verimli bir şekilde bozulmasını önleyebilir ve hızlı bir kinetik yanıt14,15. Not olarak, Shield-1 mutant FKBP12'ye vahşi tip muadilinden daha sıkı üç büyüklük sırasına bağlanır14.
DD-Cas9/Shield-1 çifti, mitokondri metabolizmasında önemli bir rol oynayan CypD genini koşullu olarak hedef alarak daha önce gösterdiğimiz gibi, kültürlü hücrelerde ve hayvan modellerinde temel genlerin sistematik olarak tanımlanmasını ve karakterizasyonunu incelemek için kullanılabilir; EGFR, onkojenik dönüşümde önemli bir oyuncu; ve Tp53, DNA hasar tepkisinde merkezi bir gen. Zamansal ve şartlı kontrollü gen düzenlemeye ek olarak, yöntemin bir başka avantajı DD-Cas9'un stabilizasyonunun transkripsiyondan bağımsız olmasıdır. Bu özellik, aynı promotör altında, izlenebilir belirteçlerin yanı sıra östrojen reseptörüne bağımlı rekombinaz, CREERgibi rekombinazların birlikte ifadesini sağlar. Bu çalışmada, yöntemimizin tüp bebek olarak nasıl başarıyla kullanılabileceğini gösteriyoruz, örneğin DNA replikasyon geni RPA3'ü koşullu olarak hedeflemek için.

<table><tbody><tr><td>100mM DTT</td><td>Thermosfisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10X FastDigest tampon</td><td>Thermosfisher</td><td>B64</td><td></td></tr><tr><td>10X T4 Ligasyon Tamponu</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>kolorimetrik BCA kiti</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, yüksek glikoz, glutaMax</td><td>Thermo Fisher</td><td>10566024</td><td></td></tr><tr><td>FastAP</td><td>Thermosfisher</td><td>EF0654</td><td></td></tr><tr><td>FastDigest BsmBI</td><td>Thermosfisher</td><td>FD0454</td><td></td></tr><tr><td>Bayrak [M2] fare mAb</td><td>Sigma</td><td>F1804-50UG</td><td></td></tr><tr><td>Genomik DNA ekstraksiyon kiti</td><td>Macherey Nagel</td><td>740952.1</td><td></td></tr><tr><td>lipofektamin 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Yüksek Sadakatli DNA Polimeraz</td><td>NEB</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>oligonükleotidler</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>polibren</td><td>Sigma Aldrich</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR & Jel Temizleme Kiti</td><td>Qiagen</td><td>28506</td><td></td></tr><tr><td>ikincil antikorlar</td><td>LICOR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shield-1</td><td>Cheminpharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stbl3 yetkin bakteri hücreleri</td><td>Thermofisher</td><td>C737303</td><td></td></tr><tr><td>SURVEYOR Mutasyon Tespit Kiti</td><td>Transgenomik/IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 PNK</td><td>NEB</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA Polimeraz</td><td>NEB</td><td>M0273S</td><td></td></tr><tr><td>&alfa;-tübülin [DM1A] fare mAb</td><td>Millipore</td><td>CP06-100UG</td><td></td></tr></tbody></table>

koşullu cas9 stabilizasyonunu kullanarak gen fonksiyonlarını değerlendirmek için yeni bir araç seti

A New Toolkit for Evaluating Gene Functions using Conditional Cas9 Stabilization

Kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrar- (CRISPR-) ilişkili protein 9 (CRISPR/Cas9) teknolojisi, genomda doğru ve hedefli modifikasyonlar yapmak için yaygın bir laboratuvar aracı haline gelmiştir. Muazzam popülaritesi ve hızlı yayılımı, öncekilere kıyasla kolay kullanımına ve doğruluğuna atfedilmektedir. Ancak, sistemin constitutive aktivasyonu sınırlı uygulamalara sahiptir. Bu yazıda, CAS9 proteininin koşullu stabilizasyonuna dayalı CRISPR/Cas9 aktivitesinin zamansal kontrolüne izin veren yeni bir yöntem açıklanmaktadır. Rapamycin bağlayıcı protein FKBP12'nin mühendislikteki bir mutantını Cas9'a (DD-Cas9) eritmek, Cas9'un hızlı bir şekilde bozulmasını sağlar ve bu da bir FKBP12 sentetik ligandının (Shield-1) varlığıyla stabilize edilebilir. Diğer indüklenebilir yöntemlerin aksine, bu sistem, ikinci genin koşullu düzenlenmesi olmadan, DD-Cas9'u başka bir ilgi geni ile birlikte ifade etmek için bi-cistronic sistemler üretmek için kolayca uyarlanabilir. Bu yöntem, izlenebilir sistemlerin üretilmesinin yanı sıra Cas9 çekirdeği tarafından hedeflenen alellerin paralel, bağımsız manipülasyonunu sağlar. Bu yöntemin platformu, temel genlerin sistematik olarak tanımlanması ve karakterizasyonu ve in vitro ve in vivo ortamlarda genlerin fonksiyonel etkileşimlerinin sorgulanması için kullanılabilir.

Cas9'un koşullu ifadesini etkinleştirmek için, sgRNA'yı kurucu olarak ifade etmek için U6 tahrikli bir promotörden ve DD-Cas9 füzyon proteininin ekspresyonunu yönlendirmek için bir EF-1α çekirdek promotöründen oluşan çift lentiviral vektör yapısı geliştirdik (Şekil 1A)19. Sistemin sağlamlığını ve verimliliğini göstermek için bir paradigma olarak, akciğer karsinomatöz A549 hücre hattını lentiviral yapı ile transdükledik. Ligand Shield-1...

Burada, shield-1 adlı küçük molekül altında düzenli olarak kümelenmiş kısa palindromik tekrar- (CRISPR-) ilişkili protein 9'un (Cas9) zamansal ve koşullu stabilizasyonuna dayanan bir genom düzenleme aracı tarif ediyoruz. Yöntem kültürlü hücreler ve hayvan modelleri için kullanılabilir.

Koşullu Cas9 Stabilizasyonunu Kullanarak Gen fonksiyonlarını değerlendirmek için Yeni Bir Araç Seti

The clustered regularly interspaced short palindromic repeat- (CRISPR-) associated protein 9 (CRISPR/Cas9) technology has become a prevalent laboratory ...

Bu yöntem, Shield-1 adlı küçük bir molekül altında hızlı, sıcaklık kontrollü CRISPR-Cas9 gen düzenleme sağlar. Ayrıca Cas9'un konsitülatif aktivasyonu ile karşılaştırırken daha az hedef dışı etki, daha düşük hücre toksisitesi ve ayrıca daha yüksek dahili kontrollü gen düzenleme sunar. Bu parçacığın ana avantajı, tümör sağkalım genlerinin yanı sıra temel genlerin karakterizasyonu için kullanılabilmesidir.DD-Cas9'un istikrarsızlaştırılması ifadesinden bağımsızdır ve bu, ilgi geninin aynı organizatör altında birlikte ifade edilmesine izin verir. Bu yöntem in vivo ve in vitro çalışmalara kolayca uygulanabilir. Shield-1 ayrıca kan-beyin bariyerine de nüfuz edebilir, bu da beyin gelişiminde rol oynayan genleri incelemeyi kolaylaştırır.%10 filtreli FBS ile 10 mililitre glikoz DMEM kullanarak 10 santimetre doku kültürü plakası başına bir ila iki milyon hücre yoğunluğunda sağlıklı HEK293T hücrelerini eşit olarak tohumlar. Doku kültürü inkübatöründeki hücreleri 20 saat boyunca %5 karbondioksit ve 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, hücrelerin brightfield mikroskopisi ile% 70 izdiah ulaştığından ve plaka boyunca eşit olarak dağıldığını onaylayın.Transeksiyondan bir saat önce medyayı 10 mililitrelik son hacimle değiştirin. 500 mikrolitre sıcak ortam ile iki tüp hazırlayın. Tüp bire 25 mikrolitre transfeksiyon reaktifi ekleyin ve oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatırın.Diğer tüpe plazmid karışımı ekleyin. Bir transfeksiyon karışımı oluşturmak için tüp bir ile tüp iki karıştırın ve 20 dakika boyunca oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın. Transfeksiyon karışımını HEK293T hücrelerine damla yönünde ekleyin ve plakayı doku kültürü inkübatörüne inkübatöre ekleyin.18 saat sonra, transfeksiyon reaktifini çıkarmak için ortamı %10 FBS ile 10 mililitre taze DMEM'e dikkatlice değiştirin. Önümüzdeki 48 saat boyunca hücreleri kuluçkaya yatır. 48 saat sonra, süpernatant 10 mililitre şırınga ile toplayın ve 0.45 mikrometre filtreden geçirin.Aliquot virüs süpernatant ve eksi 80 santigrat derecede saklayın. Virüs titresini belirlemek için, iki altı kuyu plakasına kuyu başına 5 milyon HEK293T hücresi tohumlayın. Her iki plakayı da 37 santigrat derecede ve bir gecede% 5 karbondioksit ile kuluçkaya yatırarak% 50 ila% 60 izdiah eder.Ertesi gün, altı kuyudaki hücreleri saymak için altı kuyu plakalarından birini kullanın. Seri seyreltmeyi gerçekleştirmek ve mililitre polibren reaktifi başına sekiz mikrogram eklemek için kullanılacak virüs aliquotunu çözün, virüsün seri seyreltilmesi için% 10 FBS ile DMEM hazırlayın ve polibren reaktifini ekleyin. Polibren içeren ortamda lentivirüs 0.1 ila 0.0001 arasında iki mililitre on kat seri seyreltme hazırlayın.Medyayı altı kuyu plakasından çıkarın ve kuyulara bir mililitre viral seyreltme ekleyin, bir kuyuyu medya ile tek başına negatif kontrol ve bir kuyuyu% 100 virüs ile bırakın. Hücreleri 24 saat kuluçkaya yatır. Ertesi gün, virüsle birlikte medyayı altı kuyu plakalarından çıkarın ve% 10 FBS ile iki mililitre taze DMEM'e değiştirin.Hücreleri 48 ila 72 saat kuluçkaya yatırarak GFP'yi her gün floresan mikroskopla gözlemler. 48 ila 72 saat sonra, hücreleri ayırın ve maksimum arabellekte yeniden biriktirin. GFP ifadesinin yüzdesini belirlemek ve metin el yazmasında verilen formülü kullanarak virüs titresini hesaplamak için bir akış sitometresi kullanın.10 santimetrelik bir plakaya ilgi hücre hattını plakala ve %50 ila %60'lık bir izdiah süresine ulaşmak için gece boyunca kuluçkaya yatırın, ardından hücrelere 10 mililitrelik toplam kültür ortamında 500 ila 2.000 mikrolitre virüs parçacığı bulaştırın. Viral medyayı 24 saat kuluçkaya yatır. Ertesi gün, viral ortamı kültür ortamı olarak değiştirin ve akış sitometrisi kullanarak GFP pozitif hücrelerinin yüzdesini belirleyin.Hücre sıralama için BD FACSAria II kullanarak GFP pozitif hücrelerini seçin. Pozitif olarak seçilen hücreleri genişletin ve stoğu dondurun. Pozitif olarak seçilen hücreleri ve çevrilmemiş hücreleri enfeksiyondan 24 saat sonra, 12 kuyulu plakalarda ayrı ayrı plakalayın.Hücreler takılana kadar bekleyin ve ortamı 200 nanomolar Shield-1 içeren hücre kültürü ortamına değiştirin. Plakalardaki ortamı transdüklenmiş ve çevrilmemiş hücrelerle değiştirin ve plaka başına iki kuyuyu negatif kontrol olarak normal ortamla bırakın. Kuyulara Shield-1 ekledikten sonra her kuyudan sıfır, iki, altı, 12, 24, 48 ve 72 saat içinde proteinleri inkübte edin ve çıkarın.Ardından Shield-1 ile medyayı kuyuların geri kalanından çıkarın ve normal hücre ortamı için değiştirin. Medyayı değiştirdikten 2, 6 ve 12 saat sonra bu kuyulardan proteinleri toplayın. Cas9 proteininin indüksiyonu, Shield-1'in varlığına veya yokluğuna rağmen, transdüklenmiş hücreler ve araç arasında benzer ifade seviyeleri ile doğrulandı.Shield-1 ile tedaviden iki saat sonra transdüklenmiş A549 hücre hattında Cas9 ekspresyonunun yeterli indüksiyonu vardır, bu da Shield-1'in çekilmesinden sonraki altı ila 12 saat içinde ihmal edilebilir hale gelir. Shield-1 tedavi edilen transdüklenmiş A549 hücreleri, tükenen RPA3 proteinine karşı bir antikor kullanılarak immünblotting ile doğrulanan Rinella örneğini etkilemeden 48 saat sonra sayı olarak azaldı. Gen düzenleme inversiyonu veya indel mutasyonları eksper nükleaz tahlilleri kullanılarak doğrulandı.Tasarlanan lentivirüs vektör yapısı, aynı EF-1a promotörü altında başka bir ilgi geni taşıyan bir bicistronic sistemiydi. Enfekte hücrelerin izini sürmek için modifiye edilmiş bir floresan protein olan P2A eklendi. Araçta ve A549 transdüklenmiş hücrelerde DD-Cas9 ekspresykülü ve Shield-1 tedavisinden bağımsız olarak mVenus proteininin ekspresykülü gözlendi.DD-Cas9 vektörü ile hücre hattının verimli bir şekilde transdüksiyonu, sağlıklı HEK293T hücrelerine sahip olmak ve düşük geçiş sayılarını kullanmak için hız sınırlayıcı adımlardan biridir. DD-Cas9 plazmid, ambalaj plazmidi ve zarf plazmidi arasındaki oranın optimizasyonu optimal transfeksiyon için çok önemlidir. Ama bunun yanında, DD-Cas9 hedef hücrelerini stabilize etmek için gereken Shield-1 miktarı da dikkatli olmanız gereken bir şeydir.Cre plazmidli DD-Cas9 da mevcuttur ve Cre-lox sistemine dayanan in vivo çalışmalarda genetik etkileşimleri incelemek için kullanılabilir.

a-new-toolkit-for-evaluating-gene-functions-using-conditional-cas9

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Geliştirici aktivitenin deneysel doğrulamasına en iyi fonksiyon kaybı analizi ile yaklaşılır. Burada, hibrit bir genom (Mus musculus129 x Mus castaneus) içeren F1 ES hücrelerinde gen transkripsiyonunun alele özgü regülasyonunu incelemek için CRISPR/Cas9 aracılı delesyon kullanan etkili bir protokol sunulmaktadır.

Yaratma CRISPR / Cas9 aracılığı monoallelik Delesyonlar Fare Embriyonik Kök Hücreleri Artırıcı Fonksiyonu Eğitim için

Floresan polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) jel elektroforezi kılcal çiftler burada tarif edilen genotipleme tekniği, nükleaz aracılı nakavt klonları yüksek verimli genotipleme için izin verir. Diğer Genotipleme teknikleri karşılaştığı sınırlamaları ortadan ve dizileme yöntemleri maliyet açısından daha etkilidir.

CRISPR genotipine bir Floresan PCR kılcal jel elektroforezi Tekniği / yüksek verimli bir Format Nakavt Mutants Cas9 aracılı

Somatik hücre dizilerini genetik olarak manipüle etme becerisindeki son gelişmeler, temel ve uygulamalı araştırmalar için büyük potansiyele sahiptir. Burada, CRISPR / Cas9'un ürettiği nakavt üretimi ve seçilebilir işaretlerin kullanılıp kullanılmadığı memeli hücre hatlarında tarama için iki yaklaşım sunuyoruz.

Memeli Hücrelerinde CRISPR / Cas9 aracılı Gen Knockout&#39;larının Seçime Bağlı ve Bağımsız Üretimi

Bu iletişim kuralı iş akışı sistemi onarıma memeli hücrelerinde noktası mutasyonların düzenleme CRISPR/Cas9-tabanlı bir gen özetliyor. Burada, gen Indel oluşumu hedef sitesindeki ölçmek için detaylı bir follow-on deneysel stratejisi ile düzenleme bir Kombinatorik yaklaşım kullanın — özünde, yerinde mutagenesis analiz.

Yerinde mutagenisitesinin CRISPR/Cas9 ve SsODN insan hücrelerinde tarafından katalize nokta mutasyon onarım bir fonksiyonu olarak incelemek için standart bir metodoloji

CRISPR/Cas9 kullanarak hedeflenen gen düzenleme büyük ölçüde anlayış genlerin biyolojik fonksiyonların kolaylaştırdı. Burada, biz oncogenic faaliyetlerini incelemek için model calreticulin mutasyonların sitokin bağımlı hematopoetik hücreler için CRISPR/Cas9 metodoloji kullanmaktadır.

CRISPR/Cas9 kullanarak Gene sitokin bağımlı hematopoetik hücreler Mutant Calreticulin Oncogenic etkinliğini araştırmak için düzenleme

CRISPR-Cas9 teknolojisi, memeli lerin genomunu herhangi bir hücre tipinde tam olarak dizmek için etkili bir yöntem sağlar ve genom çapında genetik ekranlar gerçekleştirmek için yeni bir araç tır. Havuzlu genom genişliğindeCRISPR-Cas9 ekranlarının başarılı bir şekilde performans alabildikleri adımları tartışan ayrıntılı bir protokol burada verilmiştir.

Memeli Hücrelerinde Havuzlu CRISPR Tabanlı Genetik Ekranlar

Hematopoetik kök ve ata hücrelerinin (HSPC) CRISPR/Cas9 sistemi tarafından hematopoetik sisteme özgü gen modifikasyonları ile fare model sistemlerini hızla geliştirmek için yüksek verimli genom düzenlemesi için protokoller tanımlanmıştır.

Hastalık Modellerinde Hematopoetik Hücrelerin İncelemi için Lentiviral CRISPR/Cas9-Aracılı Genom Düzenleme

Bu protokol, insan pluripotent kök hücrelerinde CRISPR-CAS9 kullanılarak tanımlanmış heterozigot veya homozigot nükleotid değişikliklerinin oluşumunu kolaylaştıracak bir yöntem sağlar.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinde CRISPR-CAS9 Kullanılarak Tanımlanmış Genomik Modifikasyonların Üretimi

Bu protokolün amacı, C. elegans genomunun monte edilmiş ribonikleoprotein kompleksleri ve tarama için dpy-10 co-CRISPR işaretleyicisi kullanılarak sorunsuz CRISPR/Cas9 düzenlemesini sağlamaktır. Bu protokol, C. elegans'ta eklemeler, silmeler, gen değiştirmeleri ve kodon ikameleri de dahil olmak üzere çeşitli genetik değişiklikler yapmak için kullanılabilir.

CRISPR/Cas9 C. elegans rbm-3.2 Geninin dpy-10 Co-CRISPR Tarama İşaretçisi ve Monte Edilmiş Ribonikleoprotein Kompleksleri kullanılarak düzenlenmesi.

Burada sunulan sgRNA / CAS9 endonükleaz ve CD4 promotörünün yakınındaki çift iplikçik kopması onarımı ile ilişkili mutasyonları tanımlamak için kullanılabilecek yeni nesil dizileme protokolüdür.

CD4 promotörünün yakınında CAS9 kaynaklı çift iplikçik kopmasının onarımıyla ilişkili mutasyonları tanımlamak için yeni nesil dizilemenin kullanılması

Bu protokol, fare meme bezinde paralel in vivo gen nakavt ve aktivasyon çalışmalarını mümkün kılan ölçeklenebilir bir intraduktal CRISPR tarama yaklaşımını tanımlar.

Fare Meme Bezinde Gen Nakavt ve Aktivasyonun Paraleli In Vivo Taraması

Öğrenin, Shield-1 ile koşullu Cas9 stabilizasyonunu kullanarak CRISPR-Cas9 gen düzenleme yöntemini. Bu teknik, düşük off-target etki ve hücre toksisitesi ile esansiyel genleri ve tümör hayatta kalma genlerini karakterize etmeyi sağlar.

Koşullu Cas9 Stabilizasyonunu Kullanarak Gen fonksiyonlarını değerlendirmek için Yeni Bir Araç Seti

Daha fazla video keşfet