Akışkan Cihazların Mikroskopi ve Akış Sitometrisi ile Birleştirilmesi, Mekansal Ölçekler Arasında Gözenekli Ortamda Mikrobiyal Taşımayı İncelemek

Gözenekli sistemlerde bakterilerin taşınmasının incelenmesi kontaminasyon, hastalığın yayılması ve biyoremediasyon açısından önemlidir. Tek hücrede çalışan matematiksel modellerdeki bu deneyler için popülasyon ve mikrobiyal topluluk düzeyi gereklidir. Burada mikroakışkan cihazlar ve mikroskopi kullanarak bakteriyel taşıma çalışma araçları yanı sıra akış sitometri ile birlikte daha büyük cihazlar sinkometri sinoskopi sinatri sitometri ile birlikte.

Mikroakışkan cihazların mikroskopi ve akış sitometrisi ile birleşimi, farklı mekansal ölçeklerde bakteri taşıma fenomenlerini incelemek için çeşitli olanaklar sunar. Bu protokolü tam olarak incelemek için, mikroskopi, temel görüntü işleme, mikroakışkan cihazların tasarlanması ve akış sitometrisinde ustalaşma konusunda daha önce deneyim sahibi olması önerilmektedir. Bu videoda farklı mekansal ölçeklerde bakteri taşıma çalışma için iki yöntem açıklanmaktadır.

Mikroakışkan cihazlara dayanan ilk yöntem, tek tek hücreleri saymak için mikroskobun üzerine dayanır. Bu sistem gözenek ten tüm gözenekli sistem ölçeğine kadar birden fazla mekansal ölçekler arasında bakteriyel taşıma çalışma için kullanılabilir. İkinci yöntem, otomatik bir dispanser ve akış sitometrisi ile birleştiğinde daha büyük akışkan cihazlar kullanarak, tüm gözenekli sistemlerin ölçeğinde bakteriyel taşıma fenomeni incelemek için kullanılabilir.

Bu tür yöntemler laboratuvar ölçekli sütun çalışmalarının yanı sıra küçük saha araştırmalarında da kullanılabilir. Başlamak için, dairelerbir matris oluşan istenen gözenekli geometri tasarımı. Seçilen geometriye göre, standart SU-8 fotolitografikullanarak bir kalıp hazırlayın.

Temiz bir tek kullanımlık kapta ağırlık olarak elastomer% 90 kür ajan% 10 elastomer% 90 ekleyerek PDMS 50 gram hazırlayın ve temiz bir alet ile iki reaktifleri karıştırın. Çözünmüş hava ve kabarcıkları temizlemek için 30 dakika boyunca 100 milibarlık bir vakum uygulayın. Bir Petri kabına kalıp yerleştirin ve iki ve beş milimetre arasında istenilen yüksekliğe kalıp üzerine PDMS dökün.

Petri kabını bir kapakla kapatın ve en az dört saat boyunca 60 derecede tutun. Bundan sonra, mikroakışkan cihazın oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. Soğuduktan sonra PDMS'nin istenilen kısmını neşterle dikkatlice çıkarın.

PDMS kanalının alt kısmını geçici olarak bantla kapatın. 0,5 milimetre çapında puncher ile, bir giriş ve bir çıkış oluşturmak için kanalları delmek. Bandı PDMS kanalından çıkarın ve kanalı gözenekli tarafı yukarı bakacak şekilde yerleştirin.

Cam kaydırağı ve PDMS yüzeylerini oda sıcaklığında yaklaşık 45 saniye boyunca plazma ile tedavi edin. Önceden işlenmiş PDMS kanalını, önceden işlenmiş cam kaydıraktan ve 100 santigrat derecede 30 dakika sıcak bir plakaya yerleştirin, ardından mikroakışkan cihazı sıcak plakadan çıkarın ve oda sıcaklığına kadar soğutun. PDMS'den havayı çıkarmak için 30 dakika vakum uygulayın.

Gözenek bölmesi içeren tabanı üretmek için, temel PMMA tabakasından 0,5 milimetre kaldırmak ve kauçuk bir O-ring için 1,1 ila 1,1 milimetre büyüklüğünde bir oluk frezelemek için yüksek hassasiyetli mikro frezeleme kullanın. Akışkan cihazın üst kısmına giriş ve çıkış için iki dişli delik ve vidalar için 12 delik delin. Bu akışkan cihazın kapağı olarak hizmet vermektedir.

Akışkan cihazı temizledikten sonra, 12 dişli deliği kullanarak tabanı ve kapağı birbirine vidalayın. Mikroakışkanı vakumdan çıkarın ve mikroskop aşamasına yerleştirin. Motilite tampon ile doygunluk için şırınga pompası kullanın.

Brightfield mikroskobu veya faz kontrastını kullanarak, tek tek bakteri hücrelerini görselleştirmek ve gözlem kanalının merkezine odaklanmak için büyütmeyi ayarlayın. Işık yolu ayarlarını floresan mikroskobuyla değiştirin. Tek tek bakteri hücrelerini çözmek için netlemi ofset ve kameramaruz kalma süresi ile ayarlayın.

Bu durumda, 100 milisaniye. Daha sonra, bakteri süspansiyon içeren iki mililitrelik tüp içine giriş tüpü takın. Pompa yönünü tersine çevirin ve süspansiyonu dakikada bir mikrolitre lik bir akış hızında çekmeye başlayın.

Her dakika bir görüntü kaydederek tüm gözlem kanalının kesitini taz.raşıla. Görüntüleri istenilen yazılım platformuna aktarın. Hiçbir parçacık kaydedilmemişken arka planı ilk görüntülerin ortalaması olarak kaydedin.

Kamera gürültüsünü ve optik sapmayı gidermek için her görüntüden arka planı çıkarın. Görüntüleri ilgi çeken bir bölgeye kırpın. Hücre floresan piksel yoğunluğuna eşit bir eşik değeri belirleyin, böylece eşiğe göre daha büyük değerler bakteri hücrelerini içerir.

Her resimden eşik değerini çıkarmak için görüntü işlemeyi kullanın. Bakteri hücrelerinin bir değer alması için ortaya çıkan görüntüyü binarize edin, arka plan ise sıfır değerini alır. Pikseldeki en küçük bakteri hücre boyutundan daha küçük bir alana sahip piksel kümelerini kaldırın.

Kalan kümelerin toplam piksel sayısını elde etmek için binarized görüntüyü topleyin. Hücre sayısının tahminini elde etmek için piksel sayısını pikseldeki bir bakteri hücresinin ortalama boyutuna bölün. Sayıları mililitredeki parçacıklarda konsantrasyona dönüştürün.

Enjekte edilen bakteriyel süspansiyonkonsantrasyonu belirlemek için, bakteriyel süspansiyonu temiz bir mikroakışkan cihazın gözlem kanalına bir şırınga ile enjekte edin. Görüntüyü kaydedin ve daha önce gösterildiği gibi etkili bakteri konsantrasyonu hesaplayın. Etkili bakteri konsantrasyonu C0 ile atık bakteri konsantrasyonu C normalleştirerek ve C0 ve zaman üzerinde C çizerek atılım eğrileri görselleştirin.

Gözenekli matris ile taşınan bakterilerin yerel hızlarını ve yörüngelerini analiz etmek için mikroskop aşamasını ilgi çekici bir bölgeye taşıyın ve odağı mikroakışkan cihazın merkezine ayarlayın. Optik konfigürasyonu faz kontrastı veya floresan mikroskobu ile ayarlayın. Zaman atlamalı görüntüleri ve bakteriyel yer değiştirmeyi yakalayacak kadar kısa bir pozlama süresi kaydedin.

Bu durumda, 50 milisaniye. Resimleri, örneğin üç dakika gibi yeterli bir süre içinde kaydedin. Her görüntüdeki gürültüyü kaldırmak için, kaydedilen tüm görüntülerin toplamının ortalaması olan arka planı çıkarın.

Sayısal degradenin modülünü belirleyin ve maksimum değerine göre normalleştirin. Bakteri koordinatlarını ve görüntü edinme süresini üç sütunlu bir dosyaya bulup kaydedin. Kaydedilen verileri işlemek ve yörüngeleri hesaplamak için parçacık izleme çözümlemesi gerçekleştirin.

Biriktirme profilleri elde etmek için, önce tüm gözenekli kanalın kompozit bir görüntü kaydedin, yani arka plan, ve mikroakışkan cihaz yoluyla bakteriyel süspansiyon enjeksiyonu sonra. Bakteri enjeksiyonundan sonra kaydedilen görüntülerden arka planı çıkarın. Gözenekli kanalın x uzunluğunun transversal kesitleri boyunca bakteriyel floresan sinyalinin toplamı olarak d depozasyon profilini hesaplayın.

Gözenekli kanal uzunluğuna karşı yerel floresan sinyali olarak biriktirme profilini görselleştirin. Otomatik dağıtıcıyı kurmak için robotik dağıtıcıyı akışkan cihazın yakınına yerleştirin. Robot dağıtıcıyı BCNC çalıştıran bilgisayara bağlayın ve doğru iletişim bağlantı noktasını belirleyin.

BCNC'de, robot dağıtıcısını ana konuma döndürmek için ana ekran düğmesini tıklatın. Peristaltik pompayı 50 santimetre uzunluğunda, bir milimetre lik iç çaplı boru ve aynı boruyu kullanarak otomatik dağıtıcı ile çıkışı kullanarak girişle bağlayın. Akışkan cihaz ile pompa yetiştirme ortamı.

Robot dağıtıcısına sabitlenmiş çıkış borularına orta nın gelişine dikkat edin ve çıkışı toplayacak 96 kuyuluk bir plaka yerleştirin. Aynı zamanda, robot dağıtıcıetkinleştirin ve dakikada 0,2 mililitre akış hızında PMMA akışkan cihaz aracılığıyla bakteriyel süspansiyon enjekte. Birkaç gözenek hacmine eşdeğer bakteriyel süspansiyon enjekte edin.

Örneğin, akışkan cihazın hacminin 30 katı. Enjeksiyondan sonra, deney sonuna kadar steril yetiştirme ortamına geçin. 96 kuyulu bir plaka tamamlandıktan sonra, plakayı kapatın ve akış sitometri analizine kadar dört santigrat derecede saklayın.

Akış sitometrisi ile numuneleri analiz edin ve atık bakteri konsantrasyonu C0 ile atık bakteri konsantrasyonu C'yi normalleştirerek ve C0'yi c0'ye karşı zamana göre çizerek çığır açan eğrileri görselleştirin. Bu çalışmada, hem hareketli hem de hareketli olmayan Pseudomonas putida KT2440 kullanılarak, rastgele bir dizi sütuna sahip PDMS mikroakışkan cihazlarda sıralı deneyler yapılmıştır. Enjekte edilen hücrelerin konsantrasyonuna normalleştirilmiş atılım eğrileri ve gözenek ölçeğindeki bakteriyel yörüngeler burada gösterilmiştir.

PMMA'dan öğütülmüş büyük ölçekli akışkan cihazlarla deneyler de yapıldı. Hareketli ve hareketli olmayan Pseudomonas putida KT2440 düzenli aralıklı gözenekli matris içine enjekte edildi. Çarpıcı, biyofilm yoksun gözenekli bir ortamda, hareketli ve non-motile Pseudomonas putida KT2440 atılım eğrileri dayalı belirgin bir farklı ulaşım davranışı gösterdi.

Karmaşık bir akış biyofilm topluluğu ile 48 saat boyunca kolonize gözenekli bir matris olarak, hareketli ve non-motile Pseudomonas putida KT2440 arasındaki atılım eğrileri bu farklılıklar kayboldu. Bu sistemi akarsularda bakteri naklini incelemek için kullanıyoruz, ancak bu araçlar diğer mühendislik ve çevre sistemlerindeki bakteri taşıma fenomenlerini incelemek için kolayca ayarlanabilir. Sulu gözenekli ortam yoluyla bakteriyel taşıma birden fazla mekansal ölçekler üzerinde süreçleri kapsüllemek.

Burada sunulan metodoloji gözenek ölçeğinde bakterilerin yerel yer değiştirme tüm gözenekli ortamda mikroskobik taşıma bağlantı sağlar.