Name: Akışkan Cihazların Mikroskopi ve Akış Sitometrisi ile Birleştirilmesi, Mekansal Ölçekler Arasında Gözenekli Ortamda Mikrobiyal Taşımayı İncelemek (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 32 s
Description: Keşfedin, mikroakışkan cihazlar, mikroskopi ve akış sitometrisi kullanarak gözenekli ortamda bakteri taşımasını incelemek için geliştirilen yenilikçi yöntemleri. Bu teknikler, farklı mekansal ölçeklerde mikrobiyal dinamikleri anlamanıza yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz robotik dağıtıcı ve dispenser.py komut kurulumu ile Antoine Wiedmer yardım kabul ediyoruz.

1. Bakteri kültürü koşulları
<ol><li>Bir laminar akış kaputu altında çalışmak, GFP etiketli Pseudomonas putida KT2440 (1 × 107 mL-1, -80 °C'de depolanan gliserol stokunun 100 μL'sini kullanarak Luria-Bertani (LB) ortamının 5 mL'ini aşılamak için kullanın. Bir gecede 250 rpm'de sallayarak 30 °C'de kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Ertesi gün, 5 mL LB orta ve 5h (üstel faz) için aynı koşullar altında kuluçka gece kültürünün 100 μL yeniden askıya. 2 mL'lik bir tüpe 1 mL aliquot numune alın, oda sıcaklığına (~15 dk) ve santrifüje (5 dk için 2300 x g) soğumasını bekleyin.</li>
	<li>Supernatant çıkarın ve pelet için 1 mL motilite tampon ekleyin. Girdap kısaca örnek homojenize etmek. Seyreltmek istenilen hücre konsantrasyonuna ulaşmak için, örneğin, 5 x 105 mL-1.</li>
	<li>Akarsulardan elde edilenler gibi doğal toplulukları içeren deneyler için seçici olmayan bir yetiştirme ortamı hazırlayın. Örneğin, steril filtreli ve otoklavlı akarsu suyu veya karmaşık bir karbon kaynağı (LB orta) ile değiştirilmiş yapay bir akarsu suyu ortamı kullanın.</li>
</ol>2. Polidimetilsiloksane (PDMS) mikroakışkan bir cihazın hazırlanması
<ol><li>Yarıçap büyüklüğü ve merkez koordinatları ile tanımlanan, daire matrisinden (akış için geçirimsiz engel olan) bilgisayar destekli taslak (CAD) yazılımı18ile istenilen gözenekli geometriyi tasarlayın. NOT: Şekil 1A'darandomize tane ve gözenek boyutlarına sahip gözenekli geometri örneği verilmiştir. Çıkışa yakın engelleri olmayan bir gözlem kanalı BTC'lerin edinimi kolaylaştırır.</li>
	<li>Seçilen geometriye göre, standart SU-8-fotolitografi18kullanarak bir kalıp hazırlayın. NOT: Alternatif olarak, kalıplar da özel mikrofabrikasyon tesisinden sipariş edilebilir. Yatay düzlemde heterojen sıvı akışı elde etmek için, ortalama gözenek boğaz boyutu olarak büyüklük aynı sırada mikroakışkan odası kalınlığı tasarımı önemlidir. Ancak, mikroakışkan cihazın boyutlarının mikroskop altında gözlem için uygun olduğundan emin olun (örn. mikroskop slaytları üzerinde çalışın).</li>
	<li><li> </li><li> </li><li> </li><li></li><li><li><li> </li></ol><ol><li> </li><li> </li><li> </li><li><li></ol><ol><li><li><li><li> </li><li><li> </li><li> </li></ol><ol><li><li><li><li></li><li></ol><ol><li><li><li><li><li> </li><li><li><li><li><li></li><li></li><li></li></ol><ol><li><li> </li><li> </li><li><li><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60701/60701eq1v2.jpg" style="opacity: 0.9;"> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/60701/60701eq2v2.jpg"> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/60701/60701eq3v2.jpg"></li><li><li><li></li></ol><ol><li></li><li><li><li><li></ol><ol><li> </li><li><li></li><li><li> </li><li><li> </li><li></ol>

<ol><li>Stevik, K., Aa, K., Ausland, G., Fredrik Hanssen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retention+and+removal+of+pathogenic+bacteria+in+wastewater+percolating+through+porous+media%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Research%22%5BJournal%5D)">Retention and removal of pathogenic bacteria in wastewater percolating through porous media: a review.</a> Water Research. 38 (6), 1355-1367 (2004).</li>
<li>Ribet, D., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+bacterial+pathogens+colonize+their+hosts+and+invade+deeper+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Infection%22%5BJournal%5D)">How bacterial pathogens colonize their hosts and invade deeper tissues.</a> Microbes and Infection. 17 (3), 173-183 (2015).</li>
<li>Ginn, T. R., Wood, B. D., Nelson, K. E., Scheibe, T. D., Murphy, E. M., Clement, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processes+in+microbial+transport+in+the+natural+subsurface%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Water+Resources%22%5BJournal%5D)">Processes in microbial transport in the natural subsurface.</a> Advances in Water Resources. 25 (8), 1017-1042 (2002).</li>
<li>Tufenkji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+microbial+transport+in+porous+media%3A+Traditional+approaches+and+recent+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Water+Resources%22%5BJournal%5D)">Modeling microbial transport in porous media: Traditional approaches and recent developments.</a> Advances in Water Resources. 30 (6-7), 1455-1469 (2007).</li>
<li>Foppen, J. W., Van, M. H., Schijven, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+and+modelling+straining+of+Escherichia+coli+in+saturated+porous+media%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+contaminant+hydrology%22%5BJournal%5D)">Measuring and modelling straining of Escherichia coli in saturated porous media.</a> Journal of contaminant hydrology. 93 (1-4), 236-254 (2007).</li>
<li>Battin, T. J., Besemer, K., Bengtsson, M. M., Romani, A. M., Packmann, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ecology+and+biogeochemistry+of+stream+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The ecology and biogeochemistry of stream biofilms.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (4), 251-263 (2016).</li>
<li>Scheidweiler, D., Peter, H., Pramateftaki, P., Anna, P., de Battin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+biophysical+underpinnings+to+the+success+of+multispecies+biofilms+in+porous+environments%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">Unraveling the biophysical underpinnings to the success of multispecies biofilms in porous environments.</a> The ISME Journal. 1, (2019).</li>
<li>Carrel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms+in+3D+porous+media%3A+Delineating+the+influence+of+the+pore+network+geometry%2C+flow+and+mass+transfer+on+biofilm+development%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Research%22%5BJournal%5D)">Biofilms in 3D porous media: Delineating the influence of the pore network geometry, flow and mass transfer on biofilm development.</a> Water Research. 134, 280-291 (2018).</li>
<li>Bhattacharjee, T., Datta, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+hopping+and+trapping+in+porous+media%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Bacterial hopping and trapping in porous media.</a> Nature Communications. 10 (1), 2075(2019).</li>
<li>Scheidweiler, D., Miele, F., Peter, H., Battin, T. J., de Anna, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trait-specific+dispersal+of+bacteria+in+heterogeneous+porous+environments%3A+from+pore+to+porous+medium+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+The+Royal+Society+Interface%22%5BJournal%5D)">Trait-specific dispersal of bacteria in heterogeneous porous environments: from pore to porous medium scale.</a> Journal of The Royal Society Interface. 17 (164), 20200046(2020).</li>
<li>Morales, V. L., Parlange, J. Y., Steenhuis, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+preferential+flow+paths+perpetuated+by+microbial+activity+in+the+soil+matrix%3F+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hydrology%22%5BJournal%5D)">Are preferential flow paths perpetuated by microbial activity in the soil matrix? A review.</a> Journal of Hydrology. 393 (1), 29-36 (2010).</li>
<li>Creppy, A., Clément, E., Douarche, C., D'Angelo, M. V., Auradou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+motility+on+the+transport+of+bacteria+populations+through+a+porous+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Fluids%22%5BJournal%5D)">Effect of motility on the transport of bacteria populations through a porous medium.</a> Physical Review Fluids. 4 (1), 013102(2019).</li>
<li>Camesano, T. A., Logan, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+Fluid+Velocity+and+Cell+Concentration+on+the+Transport+of+Motile+and+Nonmotile+Bacteria+in+Porous+Media%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Influence of Fluid Velocity and Cell Concentration on the Transport of Motile and Nonmotile Bacteria in Porous Media.</a> Environmental Science & Technology. 32 (11), 1699-1708 (1998).</li>
<li>Lutterodt, G., Basnet, M., Foppen, J. W. A., Uhlenbrook, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+surface+characteristics+on+the+transport+of+multiple+Escherichia+coli+isolates+in+large+scale+columns+of+quartz+sand%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Research%22%5BJournal%5D)">The effect of surface characteristics on the transport of multiple Escherichia coli isolates in large scale columns of quartz sand.</a> Water Research. 43 (3), 595-604 (2009).</li>
<li>Bozorg, A., Gates, I. D., Sen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+biofilm+on+bacterial+transport+and+deposition+in+porous+media%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Contaminant+Hydrology%22%5BJournal%5D)">Impact of biofilm on bacterial transport and deposition in porous media.</a> Journal of Contaminant Hydrology. 183 (Supplement C), 109-120 (2015).</li>
<li>Long, T., Ford, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Transverse+Migration+of+Bacteria+by+Chemotaxis+in+a+Porous+T-Sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Enhanced Transverse Migration of Bacteria by Chemotaxis in a Porous T-Sensor.</a> Environmental Science & Technology. 43 (5), 1546-1552 (2009).</li>
<li>Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+Expanding+the+Frontiers+of+Microbial+Ecology%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Microfluidics Expanding the Frontiers of Microbial Ecology.</a> Annual Review of Biophysics. 43 (1), 65-91 (2014).</li>
<li>Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+Lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Materials+Science%22%5BJournal%5D)">Soft Lithography.</a> Annual Review of Materials Science. 28 (1), 153-184 (1998).</li>
<li>Crocker, J. C., Grier, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+Digital+Video+Microscopy+for+Colloidal+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Colloid+and+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Methods of Digital Video Microscopy for Colloidal Studies.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 179 (1), 298-310 (1996).</li>
<li>del Giorgio, P. A., Bird, D. F., Prairie, Y. T., Planas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+determination+of+bacterial+abundance+in+lake+plankton+with+the+green+nucleic+acid+stain+SYTO+13%5BTitle%5D)+AND+%22Limnology+and+Oceanography%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric determination of bacterial abundance in lake plankton with the green nucleic acid stain SYTO 13.</a> Limnology and Oceanography. 41 (4), 783-789 (1996).</li>
</ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ediyor.

Burada mikropların tek hücreli ve popülasyon düzeyinde gözenekli sistemler le taşınmasını incelemek için iki araç öneriyoruz. BTC modelleme sat›nal›n›zla›ş fenomenlerinin incelenmesi, ekosistem ölçeklerinde patojenlerin veya kirleticilerin yay›nt›s›na dair de›f bilgiler sa›rken, laboratuvar deneylerinden saha koşla›ma kadar ölçeklendirme de zorluklar› hala mevcutolmuştur. Burada açıklanan araçlar, araştırmacıların gözenekli ortamlarda taşınması için ilgili mikropların ekolojik stratejilerini daha iyi anlamak için mekansa...

Gözenekli medya yoluyla mikropların taşınmasını anlamayı amaçlayan çalışmalar esas olarak kontaminasyon endişeleri tarafından tahrik edilmiştir1, hastalık iletimi2 ve biyoremediasyon3. Bu bağlamda bakteriler çoğunlukla taşımamodellerinde 4 partikül olarak ele alınmış ve filtrasyon, gerilme, yerçekimsel yerleşme veya biyofilmlerden yeniden mobilizasyon gibi süreçler mikropların elde tutulması veya taşınmasının sürücüleri olarak tanımlanmıştır5. Ancak, gözenekli manzaralar aracılığıyla bakterilerin taşınması incelenmesi de bu karmaşık ortamlarda başarılarını destekleyen ekolojik stratejiler hakkında bizi bilgilendirebilir. Ancak, bu yeni deneyler ve matematiksel modeller tek hücre, nüfus veya mikrobiyal topluluk düzeyinde çalışma gerektirir.
Akarsu ve nehirlerin hiporomakkuşağında bulunanlar gibi doğal gözenekli ortamlar, biyofilm oluşturan mikropların çeşitli toplulukları tarafından yoğun bir şekilde kolonize edilmektedir6. Biyofilmler sıvı faz7,8bakteri akışı ve böylece taşıma ve dağılım değiştirmek yapılar oluşturur. Gözenek ölçeğinde bakterilerin taşınması gözenekli matris ve hareketlilik ile ilgili dağılım kısıtlı alan durumu bağlıdır daha az yoğun nüfuslu alanlarda kaynaklar için azaltılmış rekabet yoluyla bireysel fitness artırmak için etkili bir yol olabilir. Öte yandan, hareketli bakteriler de gözenekli matris daha izole bölgelere ulaşabilir ve bu alanların genişletilmiş keşif hareketli popülasyonlar için ekolojik fırsatlar sağlayabilir10. Daha büyük mekansal ölçeklerde, biyofilm büyümesi de gözeneklerin (kısmi) tıkanmasına ve böylece, daha kanalize ve heterojen akış koşullarının kurulmasına yol açan akış yollarını yönlendirir11. Bu besin temini ve dağılım kapasitesi, frekans ve mesafe için sonuçları vardır. Tercihli akış, örneğin, sözde "hızlı parça" üretebilir ve hareketli bakteriler bu parça12boyunca yerel akış daha yüksek hızlara ulaşabilirsiniz. Bu, yeni habitatların keşfini artırmanın etkili bir yoludur.
Çeşitli araçlar gözenekli ortamda hareketli ve hareketli olmayan bakterilerin (ve parçacıkların) taşınması çalışmaları için kendilerini boşuna. Sayısal modeller uygulamalar için önemli büyük tahmin kapasiteleri var, ancak genellikle doğal varsayımlar ile sınırlıdır4. Laboratuvar ölçekli deneyler13,14 atılım eğrisi ile birlikte (BTC) modelleme verim15yapışma için bakteri hücre yüzey özelliklerinin önemi önemli anlayışlar sağlamıştır. Tipik olarak, BTC'ler (yani, sabit bir yerde parçacık konsantrasyonu kez serisi) sabit oranlı salınımlar ve deneysel cihazın çıkışında hücre numaralarının ölçümü yoluyla elde edilir. Bu bağlamda, BTC'ler gözenekli matristeki bakterilerin advection-dispersiyon dinamiklerini yansıtır lar ve ek için bir lavabo terimi ile genişletilebilirler. Ancak, BTC'lerin tek başına modelilmesi, taşıma işlemleri için gözenekli substrat veya biyofilmin mekansal organizasyonunun rolünü çözmez. Dağılım veya biriktirme profilleri gibi diğer makroskopik gözlemlenebilirlerin mekansal dağılım veya korunan parçacıklar veya büyüyen topluluklar hakkında önemli bilgiler sağladığı kanıtlanmıştır. Mikroakışkanmikroskop araştırma9,,12,16tarafından gözenekli ortamda taşıma eğitimi sağlayan bir teknolojidir , ve son bir çalışma dışında10, deneysel sistemler genellikle çözünürlük tek bir uzunluk ölçeğine kısıtlanır, yani, gözenek ölçeği veya tüm akışkan cihaz ölçeği.
Burada, farklı ölçeklerde gözenekli manzaralarda hareketli ve hareketli olmayan bakterilerin taşınması nı incelemek için bir dizi kombine yöntem sıyoruz. Gözenek ölçeğinde bakteriyel taşıma gözlemlerini BTC analizi ile daha büyük ölçekte ki bilgilerle birleştiriyoruz. Polidimethylsiloxane (PDMS) kullanılarak yumuşak litografiden üretilen mikroakışkan cihazlar biyo-uyumludur, çeşitli kimyasallara karşı dayanıklıdır, düşük maliyetlerle çoğaltılabilirliğe izin verir ve mikroskobik gözlem için kritik olan düşük otofloresans ın yanı sıra mükemmel optik saydamlık sağlar. PDMS'ye dayalı mikroakışkanlar daha önce basit kanallarda mikropların taşınması nı incelemek için kullanılmıştır17 veya daha karmaşık geometriler12. Ancak, tipik olarak mikroakışkan deneyler kısa vadeli ufuklara odaklanır ve canlı hücrelerin epi-floresan mikroskobik gözlemi genellikle genetiği değiştirilmiş suşlarla sınırlıdır (örn. GFP etiketli suşlar). Burada, pdms tabanlı mikroakışkan cihazları kullanarak, akış sitometrisi ile birlikte poli (metil metakrilat) (PMMA, pleksiglas olarak da bilinir) imal edilen daha büyük cihazlar la birlikte bakteriyel taşımayı incelemek için araçlar salıyoruz. PDMS ve PMMA gaz geçirgenliği ve yüzey özellikleri açısından farklılık gösterir, böylece bakteriyel taşıma yı incelemek için tamamlayıcı fırsatlar sunar. Mikroakışkan cihaz daha kontrollü bir ortam sağlarken, daha büyük cihaz uzun süre ler boyunca deneylere veya doğal bakteri topluluklarına izin verir. PDMS tabanlı mikroakışkan cihazda BTC elde etmek için özel bir alanda yüksek zamansal çözünürlükte mikroskobik sayma kullanılır. PMMA tabanlı cihazdan BTC modellemeiçin hücre sayımları elde etmek için, akış sitometrisi ile birlikte kendi kendine inşa edilmiş otomatik sıvı dağıtıcısı salıyoruz. Bu kurulumda, hücreler akışkan cihazı geçer ve ardışık olarak 96 kuyu plakasına dağıtılır. Zamansal çözünürlük doğru dağıtılabilir minimum hacim ve böylece akışkan cihaz aracılığıyla orta akış hızı ile sınırlıdır. Kuyularda fiksatif büyümeyi önler ve aşağı akış akışı-sitometrik numaralandırma için DNA boyama kolaylaştırır. Taşıma deneyleri sırasında bakteri üremesini önlemek için minimal bir ortam (motilite tamponu olarak adlandırılır) kullanırız.
Farklı ölçeklerde akışkan cihazların hazırlanmasına yönelik protokoller hazır olduğundan, bu tür cihazları üretme tekniklerini kısaca tanıtıyoruz ve btc'leri kaydetmek için deneysel prosedürlere odaklanıyoruz. Benzer şekilde, mikropların akış sitometrik numaralandırması için çeşitli rutinler mevcuttur ve kullanıcılar akış sitometrisi tarafından elde edilen sonuçları yorumlamak için uzman bilgiye ihtiyaç duyarlar. Floresan etiketli hücrelerin BTC'lerini kaydetmek için mikroskobik görüntüleme ile birlikte mikroakışkan cihazların yeni kullanımını rapor ediyoruz. Gözenek ölçeğinde, yerel hızlar ve yörüngeler görüntü işleme yoluyla elde edilir. Ayrıca, bir pmma tabanlı akışkan cihaz akışı-sitometrik sayma ile birlikte gözenekli ortamlarda hareketli ve non-motile hücrelerin bakteriyel taşıma gözlemlemek için bir yerli akım biyofilm tarafından kolonize olduğunu göstermektedir.

<table><tbody><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elastomer Sylgard 184</td><td>Dowsil</td><td>101697</td><td></td></tr><tr><td>Akış sitometresi NovoCyte</td><td>Acea</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>Sigma</td><td></td><td>https://www.makeblock.com/project/xy-plotter-robot-kit</td></tr><tr><td>LB et suyu</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sıvı dağıtıcı, XY Plotter Robot Kiti</td><td>makeblock</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Axio Görüntüleyici</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop AxioZoom v16</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop slaytları, 75 mm ve kez; 25 mm</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Minipuls 3 peristaltik pompa</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plazma bağlayıcı Corona SB</td><td>Kara Delik Laboratuvarı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Potasyum fosfat</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Şırınga pompası New Era NE 4000</td><td>New Era</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Syto 13 Yeşil Floresan Nükleik Asit Leke</td><td>Moleküler Problar, Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tygon boru</td><td>Ismatec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>WF31SA üniversal freze makinesi</td><td>Mikron</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

akışkan cihazların mikroskopi ve akış sitometrisi ile birleştirilmesi, mekansal Ölçekler arasında gözenekli ortamda mikrobiyal taşımayı İncelemek

Combining Fluidic Devices with Microscopy and Flow Cytometry to Study Microbial Transport in Porous Media Across Spatial Scales

Mikroorganizmaların gözenekli ortamda taşınması, dağılması ve birikintisi anlamak hidrodinamik, ekoloji ve çevre mühendisliği gibi çeşitli konuları içeren karmaşık bir bilimsel görevdir. Farklı mekansal ölçeklerde gözenekli ortamlarda bakteri taşımacılığının modellanması, bakteri taşımacılığının sonuçlarını daha iyi tahmin etmek için önemlidir, ancak mevcut modeller genellikle laboratuvardan saha koşullarına kadar büyük ölçekte başarısız olur. Burada, gözenekli ortamda iki mekansal ölçekte bakteri naklini incelemek için deneysel araçlar sıyoruz. Bu araçların amacı, şeffaf gözenekli matrislere enjekte edilen bakterilerin makroskopik gözlemlenebilirlerini (çığır açan eğriler veya biriktirme profilleri gibi) elde etmektir. Küçük ölçekte (10-1000 μm), mikroakışkan cihazlar optik video-mikroskopi ve görüntü işleme ile buluşarak çığır açan eğriler elde eder ve aynı zamanda gözenek ölçeğinde tek tek bakteri hücrelerini izler. Daha büyük ölçekte, akış sitometri atılım eğrileri elde etmek için kendi kendine yapılmış bir robot dağıtıcı ile birleştirilir. Bakterilerin akarsuların hiporomakkuşağı gibi karmaşık gözenekli ortamda nasıl taşındığını daha iyi anlamak için bu araçların yararını gösteriyoruz. Bu araçlar ölçekler arasında eşzamanlı ölçümler sağladığından, yükseltme için kritik öneme yönelik mekanizma tabanlı modellerin önünü açıyorlar. Bu araçların uygulanması sadece yeni biyoremediasyon uygulamalarının geliştirilmesine katkıda bulunmakla kalmamış, aynı zamanda gözenekli yüzeyleri kolonize eden mikroorganizmaların ekolojik stratejilerine de yeni bir ışık tutabilir.

Sunulan iş akışının işlevselliğini göstermek için, biyoremediasyon ve biyoteknoloji için önemli olan bir gram negatif hareketli bakteri olan genetiği değiştirilmiş Pseudomonas putida KT2440 kullanarak deneyler yaptık. GFP üretimini ifade eden bu suş genetiği değiştirilmiş sürümleri ticari olarak mevcuttur. P. putida KT2440'ın hareketli olmayan bir türü dürbün için ilgili yapısal ve düzenleyici genlerden yoksundur. Hem, hareketli ve non-motile GFP etiketli P. putida</...

Çığır açan eğriler (BTC'ler), gözenekli ortamda bakterilerin taşınmasını incelemek için etkili araçlardır. Burada, BTC'ler elde etmek için mikroskopik ve akış sitometrik sayma ile birlikte akışkan cihazlara dayalı araçlar sıyoruz.

Akışkan Cihazların Mikroskopi ve Akış Sitometrisi ile Birleştirilmesi, Mekansal Ölçekler Arasında Gözenekli Ortamda Mikrobiyal Taşımayı İncelemek

Understanding the transport, dispersion and deposition of microorganisms in porous media is a complex scientific task comprising topics as diverse as ...

Gözenekli sistemlerde bakterilerin taşınmasının incelenmesi kontaminasyon, hastalığın yayılması ve biyoremediasyon açısından önemlidir. Tek hücrede çalışan matematiksel modellerdeki bu deneyler için popülasyon ve mikrobiyal topluluk düzeyi gereklidir. Burada mikroakışkan cihazlar ve mikroskopi kullanarak bakteriyel taşıma çalışma araçları yanı sıra akış sitometri ile birlikte daha büyük cihazlar sinkometri sinoskopi sinatri sitometri ile birlikte.Mikroakışkan cihazların mikroskopi ve akış sitometrisi ile birleşimi, farklı mekansal ölçeklerde bakteri taşıma fenomenlerini incelemek için çeşitli olanaklar sunar. Bu protokolü tam olarak incelemek için, mikroskopi, temel görüntü işleme, mikroakışkan cihazların tasarlanması ve akış sitometrisinde ustalaşma konusunda daha önce deneyim sahibi olması önerilmektedir. Bu videoda farklı mekansal ölçeklerde bakteri taşıma çalışma için iki yöntem açıklanmaktadır.Mikroakışkan cihazlara dayanan ilk yöntem, tek tek hücreleri saymak için mikroskobun üzerine dayanır. Bu sistem gözenek ten tüm gözenekli sistem ölçeğine kadar birden fazla mekansal ölçekler arasında bakteriyel taşıma çalışma için kullanılabilir. İkinci yöntem, otomatik bir dispanser ve akış sitometrisi ile birleştiğinde daha büyük akışkan cihazlar kullanarak, tüm gözenekli sistemlerin ölçeğinde bakteriyel taşıma fenomeni incelemek için kullanılabilir.Bu tür yöntemler laboratuvar ölçekli sütun çalışmalarının yanı sıra küçük saha araştırmalarında da kullanılabilir. Başlamak için, dairelerbir matris oluşan istenen gözenekli geometri tasarımı. Seçilen geometriye göre, standart SU-8 fotolitografikullanarak bir kalıp hazırlayın.Temiz bir tek kullanımlık kapta ağırlık olarak elastomer% 90 kür ajan% 10 elastomer% 90 ekleyerek PDMS 50 gram hazırlayın ve temiz bir alet ile iki reaktifleri karıştırın. Çözünmüş hava ve kabarcıkları temizlemek için 30 dakika boyunca 100 milibarlık bir vakum uygulayın. Bir Petri kabına kalıp yerleştirin ve iki ve beş milimetre arasında istenilen yüksekliğe kalıp üzerine PDMS dökün.Petri kabını bir kapakla kapatın ve en az dört saat boyunca 60 derecede tutun. Bundan sonra, mikroakışkan cihazın oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. Soğuduktan sonra PDMS'nin istenilen kısmını neşterle dikkatlice çıkarın.PDMS kanalının alt kısmını geçici olarak bantla kapatın. 0,5 milimetre çapında puncher ile, bir giriş ve bir çıkış oluşturmak için kanalları delmek. Bandı PDMS kanalından çıkarın ve kanalı gözenekli tarafı yukarı bakacak şekilde yerleştirin.Cam kaydırağı ve PDMS yüzeylerini oda sıcaklığında yaklaşık 45 saniye boyunca plazma ile tedavi edin. Önceden işlenmiş PDMS kanalını, önceden işlenmiş cam kaydıraktan ve 100 santigrat derecede 30 dakika sıcak bir plakaya yerleştirin, ardından mikroakışkan cihazı sıcak plakadan çıkarın ve oda sıcaklığına kadar soğutun. PDMS'den havayı çıkarmak için 30 dakika vakum uygulayın.Gözenek bölmesi içeren tabanı üretmek için, temel PMMA tabakasından 0,5 milimetre kaldırmak ve kauçuk bir O-ring için 1,1 ila 1,1 milimetre büyüklüğünde bir oluk frezelemek için yüksek hassasiyetli mikro frezeleme kullanın. Akışkan cihazın üst kısmına giriş ve çıkış için iki dişli delik ve vidalar için 12 delik delin. Bu akışkan cihazın kapağı olarak hizmet vermektedir.Akışkan cihazı temizledikten sonra, 12 dişli deliği kullanarak tabanı ve kapağı birbirine vidalayın. Mikroakışkanı vakumdan çıkarın ve mikroskop aşamasına yerleştirin. Motilite tampon ile doygunluk için şırınga pompası kullanın.Brightfield mikroskobu veya faz kontrastını kullanarak, tek tek bakteri hücrelerini görselleştirmek ve gözlem kanalının merkezine odaklanmak için büyütmeyi ayarlayın. Işık yolu ayarlarını floresan mikroskobuyla değiştirin. Tek tek bakteri hücrelerini çözmek için netlemi ofset ve kameramaruz kalma süresi ile ayarlayın.Bu durumda, 100 milisaniye. Daha sonra, bakteri süspansiyon içeren iki mililitrelik tüp içine giriş tüpü takın. Pompa yönünü tersine çevirin ve süspansiyonu dakikada bir mikrolitre lik bir akış hızında çekmeye başlayın.Her dakika bir görüntü kaydederek tüm gözlem kanalının kesitini taz.raşıla. Görüntüleri istenilen yazılım platformuna aktarın. Hiçbir parçacık kaydedilmemişken arka planı ilk görüntülerin ortalaması olarak kaydedin.Kamera gürültüsünü ve optik sapmayı gidermek için her görüntüden arka planı çıkarın. Görüntüleri ilgi çeken bir bölgeye kırpın. Hücre floresan piksel yoğunluğuna eşit bir eşik değeri belirleyin, böylece eşiğe göre daha büyük değerler bakteri hücrelerini içerir.Her resimden eşik değerini çıkarmak için görüntü işlemeyi kullanın. Bakteri hücrelerinin bir değer alması için ortaya çıkan görüntüyü binarize edin, arka plan ise sıfır değerini alır. Pikseldeki en küçük bakteri hücre boyutundan daha küçük bir alana sahip piksel kümelerini kaldırın.Kalan kümelerin toplam piksel sayısını elde etmek için binarized görüntüyü topleyin. Hücre sayısının tahminini elde etmek için piksel sayısını pikseldeki bir bakteri hücresinin ortalama boyutuna bölün. Sayıları mililitredeki parçacıklarda konsantrasyona dönüştürün.Enjekte edilen bakteriyel süspansiyonkonsantrasyonu belirlemek için, bakteriyel süspansiyonu temiz bir mikroakışkan cihazın gözlem kanalına bir şırınga ile enjekte edin. Görüntüyü kaydedin ve daha önce gösterildiği gibi etkili bakteri konsantrasyonu hesaplayın. Etkili bakteri konsantrasyonu C0 ile atık bakteri konsantrasyonu C normalleştirerek ve C0 ve zaman üzerinde C çizerek atılım eğrileri görselleştirin.Gözenekli matris ile taşınan bakterilerin yerel hızlarını ve yörüngelerini analiz etmek için mikroskop aşamasını ilgi çekici bir bölgeye taşıyın ve odağı mikroakışkan cihazın merkezine ayarlayın. Optik konfigürasyonu faz kontrastı veya floresan mikroskobu ile ayarlayın. Zaman atlamalı görüntüleri ve bakteriyel yer değiştirmeyi yakalayacak kadar kısa bir pozlama süresi kaydedin.Bu durumda, 50 milisaniye. Resimleri, örneğin üç dakika gibi yeterli bir süre içinde kaydedin. Her görüntüdeki gürültüyü kaldırmak için, kaydedilen tüm görüntülerin toplamının ortalaması olan arka planı çıkarın.Sayısal degradenin modülünü belirleyin ve maksimum değerine göre normalleştirin. Bakteri koordinatlarını ve görüntü edinme süresini üç sütunlu bir dosyaya bulup kaydedin. Kaydedilen verileri işlemek ve yörüngeleri hesaplamak için parçacık izleme çözümlemesi gerçekleştirin.Biriktirme profilleri elde etmek için, önce tüm gözenekli kanalın kompozit bir görüntü kaydedin, yani arka plan, ve mikroakışkan cihaz yoluyla bakteriyel süspansiyon enjeksiyonu sonra. Bakteri enjeksiyonundan sonra kaydedilen görüntülerden arka planı çıkarın. Gözenekli kanalın x uzunluğunun transversal kesitleri boyunca bakteriyel floresan sinyalinin toplamı olarak d depozasyon profilini hesaplayın.Gözenekli kanal uzunluğuna karşı yerel floresan sinyali olarak biriktirme profilini görselleştirin. Otomatik dağıtıcıyı kurmak için robotik dağıtıcıyı akışkan cihazın yakınına yerleştirin. Robot dağıtıcıyı BCNC çalıştıran bilgisayara bağlayın ve doğru iletişim bağlantı noktasını belirleyin.BCNC'de, robot dağıtıcısını ana konuma döndürmek için ana ekran düğmesini tıklatın. Peristaltik pompayı 50 santimetre uzunluğunda, bir milimetre lik iç çaplı boru ve aynı boruyu kullanarak otomatik dağıtıcı ile çıkışı kullanarak girişle bağlayın. Akışkan cihaz ile pompa yetiştirme ortamı.Robot dağıtıcısına sabitlenmiş çıkış borularına orta nın gelişine dikkat edin ve çıkışı toplayacak 96 kuyuluk bir plaka yerleştirin. Aynı zamanda, robot dağıtıcıetkinleştirin ve dakikada 0,2 mililitre akış hızında PMMA akışkan cihaz aracılığıyla bakteriyel süspansiyon enjekte. Birkaç gözenek hacmine eşdeğer bakteriyel süspansiyon enjekte edin.Örneğin, akışkan cihazın hacminin 30 katı. Enjeksiyondan sonra, deney sonuna kadar steril yetiştirme ortamına geçin. 96 kuyulu bir plaka tamamlandıktan sonra, plakayı kapatın ve akış sitometri analizine kadar dört santigrat derecede saklayın.Akış sitometrisi ile numuneleri analiz edin ve atık bakteri konsantrasyonu C0 ile atık bakteri konsantrasyonu C'yi normalleştirerek ve C0'yi c0'ye karşı zamana göre çizerek çığır açan eğrileri görselleştirin. Bu çalışmada, hem hareketli hem de hareketli olmayan Pseudomonas putida KT2440 kullanılarak, rastgele bir dizi sütuna sahip PDMS mikroakışkan cihazlarda sıralı deneyler yapılmıştır. Enjekte edilen hücrelerin konsantrasyonuna normalleştirilmiş atılım eğrileri ve gözenek ölçeğindeki bakteriyel yörüngeler burada gösterilmiştir.PMMA'dan öğütülmüş büyük ölçekli akışkan cihazlarla deneyler de yapıldı. Hareketli ve hareketli olmayan Pseudomonas putida KT2440 düzenli aralıklı gözenekli matris içine enjekte edildi. Çarpıcı, biyofilm yoksun gözenekli bir ortamda, hareketli ve non-motile Pseudomonas putida KT2440 atılım eğrileri dayalı belirgin bir farklı ulaşım davranışı gösterdi.Karmaşık bir akış biyofilm topluluğu ile 48 saat boyunca kolonize gözenekli bir matris olarak, hareketli ve non-motile Pseudomonas putida KT2440 arasındaki atılım eğrileri bu farklılıklar kayboldu. Bu sistemi akarsularda bakteri naklini incelemek için kullanıyoruz, ancak bu araçlar diğer mühendislik ve çevre sistemlerindeki bakteri taşıma fenomenlerini incelemek için kolayca ayarlanabilir. Sulu gözenekli ortam yoluyla bakteriyel taşıma birden fazla mekansal ölçekler üzerinde süreçleri kapsüllemek.Burada sunulan metodoloji gözenek ölçeğinde bakterilerin yerel yer değiştirme tüm gözenekli ortamda mikroskobik taşıma bağlantı sağlar.

combining-fluidic-devices-with-microscopy-flow-cytometry-to-study

Research

JoVE Journal

Environment

Çevre

Mikroakışkan cihazlar gerçek zamanlı olarak ve uygun fiziksel ölçeklerde karmaşık doğal süreçler görselleştirmek için kullanılabilir. Biz yeraltı bakteri büyüme ve taşımacılık eğitimi için doğal gözenekli ortamın temel özellikleri taklit basit bir mikroakışkan cihaz geliştirdik.

Gözenekli Ortam Mikrobiyal Ulaştırma incelenmesi için basit mikroakışkan Sistemleri: Mikrodünya Pencere

Kaynak: Scheidweiler, D. ve diğerleri. Akışkan Cihazların Mikroskopi ve Akış Sitometrisi ile Birleştirilerek Gözenekli Ortamlarda Mikrobiyal Taşınımı Mekansal Ölçeklerde İncelemek. J. Vis. Exp. (2020).Bu video, rastgele düzenlenmiş sütunlardan oluşan gözenekli bir matriks aracılığıyla bakteri hareketliliğini ölçmek için mikrofluidik bir cihazın kullanıldığını gösteriyor. Fluoresan etiketli bakteriler cihaza dahil edilir, gözenekli matriksin içinden gözlem kanalına ilerlerken mikroskopi ile...

Mikrofluidik Cihaz Kullanarak Bakteriyel Hareketliliğin Değerlendirilmesi

Kaynak: Kurz, D. L. ve diğerleri. Gözenekli ortamlarda biyotıkanmayı incelemek için mikrofluidik platform. J. Vis. Exp. (2022)Video, biyofilm oluşumunu incelemek için mikrofluidik cihazın kullanıldığını gösteriyor. Mikrokanala bakteriyel bir süspansiyon getirilir ve ardından biyofilm gelişimi için kuluçka yapılır. Akış daha sonra yeniden başlatılır ve basınç izleme ile görüntüleme kullanılarak biyofilm oluşumu ve gözenek tıkanıklığı zamanla tespit edilir.

Biyofilm oluşumu sırasında gerçek zamanlı görüntüleme ve basınç takibi için mikrofluidik bir cihaz

Biz kompakt ve maliyet-etkin opto-akışkan ekleri kullanarak bir cep telefonu üzerinde floresan mikroskop ve görüntüleme flow sitometri araçlarının entegrasyonu bizim son sonuçlarını gözden geçirin. Bu cep telefonu tabanlı mikro-analiz cihazları gibi kaynakların sınırlı olduğu ortamlarda, örneğin su örneklerinin yüksek verimli tarama yanı sıra çeşitli hücre sayım görevleri yapmak gibi, sitometrik analizi için yararlı olabilir.

Bir Cep telefonu ile ilgili Geniş alan Floresan Mikroskopi ve Floresan Görüntüleme Flow Sitometri

Biyofilmlerin çevreleriyle karmaşık etkileşimleri vardır. Biyofilm-çevre etkileşimlerini kapsamlı bir şekilde araştırmak için, burada biyofilm gelişimi için heterojen kimyasal ortam oluşturmak, yerel akış hızını ölçmek ve biyofilm kolonileri içinde ve çevresinde kütle taşınmasını analiz etmek için bir dizi yöntem sunuyoruz.

Biyofilm ve Habitat Heterojen Eş-geliştirme karakterize Yöntemleri

Birden mikroakışkan kanallarda parçacıkların algılama ve boyutlandırma multipleks için, kod bölmeli çoklu erişim (CDMA) ile rezistif darbe algılama (RPS) birleştiren entegre bir yüzey elektrot ağı ile mikroakışkan platformu göstermektedir.

Parçacıkların Mekansal Takip için Çoklanmış Elektronik Algılama ile mikroakışkan Platformu

Gelişimkolektif hücre göçü, yara iyileşmesi, ve kanser metastazı genellikle büyüme faktörleri veya sinyal moleküllerinin gradyanları tarafından yönlendirilir. Burada açıklanan bir mikroakışkan sistem ve biyokimyasal gradyan altında kolektif göç mekaniği ölçmek için nasıl bir gösteri ile çekiş mikroskobu birleştiren deneysel bir sistemdir.

Kemotaktik Kolektif Göç için Mikroakışkanlarla Entegre Çekiş Mikroskobu

Toprağın opaklığı nedeniyle, kurucu mikroplar arasındaki etkileşimler hücresel çözünürlükle kolayca görselleştirilemez. Burada, mantar-mikrobiyal etkileşimleri araştırmak için yeni fırsatlar sunan iki mikroakışkan araç sunulmaktadır. Cihazlar çok yönlü ve kullanımı kolaydır, bu da hücresel düzeyde yüksek mekansal zamansal kontrol ve yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlar.

Hücresel Düzeyde Mantar-Mikrobiyal Etkileşimleri Probalamak için Mikroakışkan Araçlar

Mevcut protokol, yüksek çözünürlüklü mikroskopi görüntülemeyi eşzamanlı basınç farkı ölçümleriyle birleştirerek yarı-2D gözenekli ortamlarda biyofilm gelişimini incelemek için mikroakışkan bir platformu tanımlamaktadır. Platform, gözenekli ortamlardaki gözenek boyutunun ve sıvı akış hızlarının biyotıkanma üzerindeki etkisini ölçer.

Gözenekli Ortamlarda Biyotıkanıklığı İncelemek için Mikroakışkan Bir Platform

Bu protokol, görüntüleme akış sitometrisi kullanarak mikrobiyal otoagregasyonu ölçmek için kantitatif bir yaklaşımı tanımlar.

Mikrobiyal otoagregasyonu incelemek için görüntüleme akışı sitometrisi

Bu protokol, mikrotübül polimer mekaniğini araştırmak için uygun bir mikroakışkan cihazın tasarımını ve üretimini detaylandırır. Mikrofabrikasyon, otomatik akış kontrolü ve hesaplamalı modelleme tekniklerinin sentezi, hücresel hücre iskeletini in vitro olarak araştırmak için ideal olan esnek bir sistem sağlar.

Mikrotübül Polimer Mekaniğinin İncelenmesi için Mikroakışkan Tabanlı Bir Yaklaşımın Geliştirilmesi

Keşfedin, mikroakışkan cihazlar, mikroskopi ve akış sitometrisi kullanarak gözenekli ortamda bakteri taşımasını incelemek için geliştirilen yenilikçi yöntemleri. Bu teknikler, farklı mekansal ölçeklerde mikrobiyal dinamikleri anlamanıza yardımcı olur.

Akışkan Cihazların Mikroskopi ve Akış Sitometrisi ile Birleştirilmesi, Mekansal Ölçekler Arasında Gözenekli Ortamda Mikrobiyal Taşımayı İncelemek (Video) | JoVE Journal

Akışkan Cihazların Mikroskopi ve Akış Sitometrisi ile Birleştirilmesi, Mekansal Ölçekler Arasında Gözenekli Ortamda Mikrobiyal Taşımayı İncelemek

Daha fazla video keşfet