Akışkan Cihazların Mikroskopi ve Akış Sitometrisi ile Birleştirilmesi, Mekansal Ölçekler Arasında Gözenekli Ortamda Mikrobiyal Taşımayı İncelemek
November 25th, 2020
Çığır açan eğriler (BTC'ler), gözenekli ortamda bakterilerin taşınmasını incelemek için etkili araçlardır. Burada, BTC'ler elde etmek için mikroskopik ve akış sitometrik sayma ile birlikte akışkan cihazlara dayalı araçlar sıyoruz.
Gözenekli sistemlerde bakterilerin taşınmasının incelenmesi kontaminasyon, hastalığın yayılması ve biyoremediasyon açısından önemlidir. Tek hücrede çalışan matematiksel modellerdeki bu deneyler için popülasyon ve mikrobiyal topluluk düzeyi gereklidir. Burada mikroakışkan cihazlar ve mikroskopi kullanarak bakteriyel taşıma çalışma araçları yanı sıra akış sitometri ile birlikte daha büyük cihazlar sinkometri sinoskopi sinatri sitometri ile birlikte.
Mikroakışkan cihazların mikroskopi ve akış sitometrisi ile birleşimi, farklı mekansal ölçeklerde bakteri taşıma fenomenlerini incelemek için çeşitli olanaklar sunar. Bu protokolü tam olarak incelemek için, mikroskopi, temel görüntü işleme, mikroakışkan cihazların tasarlanması ve akış sitometrisinde ustalaşma konusunda daha önce deneyim sahibi olması önerilmektedir. Bu videoda farklı mekansal ölçeklerde bakteri taşıma çalışma için iki yöntem açıklanmaktadır.
Mikroakışkan cihazlara dayanan ilk yöntem, tek tek hücreleri saymak için mikroskobun üzerine dayanır. Bu sistem gözenek ten tüm gözenekli sistem ölçeğine kadar birden fazla mekansal ölçekler arasında bakteriyel taşıma çalışma için kullanılabilir. İkinci yöntem, otomatik bir dispanser ve akış sitometrisi ile birleştiğinde daha büyük akışkan cihazlar kullanarak, tüm gözenekli sistemlerin ölçeğinde bakteriyel taşıma fenomeni incelemek için kullanılabilir.
Bu tür yöntemler laboratuvar ölçekli sütun çalışmalarının yanı sıra küçük saha araştırmalarında da kullanılabilir. Başlamak için, dairelerbir matris oluşan istenen gözenekli geometri tasarımı. Seçilen geometriye göre, standart SU-8 fotolitografikullanarak bir kalıp hazırlayın.
Temiz bir tek kullanımlık kapta ağırlık olarak elastomer% 90 kür ajan% 10 elastomer% 90 ekleyerek PDMS 50 gram hazırlayın ve temiz bir alet ile iki reaktifleri karıştırın. Çözünmüş hava ve kabarcıkları temizlemek için 30 dakika boyunca 100 milibarlık bir vakum uygulayın. Bir Petri kabına kalıp yerleştirin ve iki ve beş milimetre arasında istenilen yüksekliğe kalıp üzerine PDMS dökün.
Petri kabını bir kapakla kapatın ve en az dört saat boyunca 60 derecede tutun. Bundan sonra, mikroakışkan cihazın oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. Soğuduktan sonra PDMS'nin istenilen kısmını neşterle dikkatlice çıkarın.
PDMS kanalının alt kısmını geçici olarak bantla kapatın. 0,5 milimetre çapında puncher ile, bir giriş ve bir çıkış oluşturmak için kanalları delmek. Bandı PDMS kanalından çıkarın ve kanalı gözenekli tarafı yukarı bakacak şekilde yerleştirin.
Cam kaydırağı ve PDMS yüzeylerini oda sıcaklığında yaklaşık 45 saniye boyunca plazma ile tedavi edin. Önceden işlenmiş PDMS kanalını, önceden işlenmiş cam kaydıraktan ve 100 santigrat derecede 30 dakika sıcak bir plakaya yerleştirin, ardından mikroakışkan cihazı sıcak plakadan çıkarın ve oda sıcaklığına kadar soğutun. PDMS'den havayı çıkarmak için 30 dakika vakum uygulayın.
Gözenek bölmesi içeren tabanı üretmek için, temel PMMA tabakasından 0,5 milimetre kaldırmak ve kauçuk bir O-ring için 1,1 ila 1,1 milimetre büyüklüğünde bir oluk frezelemek için yüksek hassasiyetli mikro frezeleme kullanın. Akışkan cihazın üst kısmına giriş ve çıkış için iki dişli delik ve vidalar için 12 delik delin. Bu akışkan cihazın kapağı olarak hizmet vermektedir.
Akışkan cihazı temizledikten sonra, 12 dişli deliği kullanarak tabanı ve kapağı birbirine vidalayın. Mikroakışkanı vakumdan çıkarın ve mikroskop aşamasına yerleştirin. Motilite tampon ile doygunluk için şırınga pompası kullanın.
Brightfield mikroskobu veya faz kontrastını kullanarak, tek tek bakteri hücrelerini görselleştirmek ve gözlem kanalının merkezine odaklanmak için büyütmeyi ayarlayın. Işık yolu ayarlarını floresan mikroskobuyla değiştirin. Tek tek bakteri hücrelerini çözmek için netlemi ofset ve kameramaruz kalma süresi ile ayarlayın.
Bu durumda, 100 milisaniye. Daha sonra, bakteri süspansiyon içeren iki mililitrelik tüp içine giriş tüpü takın. Pompa yönünü tersine çevirin ve süspansiyonu dakikada bir mikrolitre lik bir akış hızında çekmeye başlayın.
Her dakika bir görüntü kaydederek tüm gözlem kanalının kesitini taz.raşıla. Görüntüleri istenilen yazılım platformuna aktarın. Hiçbir parçacık kaydedilmemişken arka planı ilk görüntülerin ortalaması olarak kaydedin.
Kamera gürültüsünü ve optik sapmayı gidermek için her görüntüden arka planı çıkarın. Görüntüleri ilgi çeken bir bölgeye kırpın. Hücre floresan piksel yoğunluğuna eşit bir eşik değeri belirleyin, böylece eşiğe göre daha büyük değerler bakteri hücrelerini içerir.
Her resimden eşik değerini çıkarmak için görüntü işlemeyi kullanın. Bakteri hücrelerinin bir değer alması için ortaya çıkan görüntüyü binarize edin, arka plan ise sıfır değerini alır. Pikseldeki en küçük bakteri hücre boyutundan daha küçük bir alana sahip piksel kümelerini kaldırın.
Kalan kümelerin toplam piksel sayısını elde etmek için binarized görüntüyü topleyin. Hücre sayısının tahminini elde etmek için piksel sayısını pikseldeki bir bakteri hücresinin ortalama boyutuna bölün. Sayıları mililitredeki parçacıklarda konsantrasyona dönüştürün.
Enjekte edilen bakteriyel süspansiyonkonsantrasyonu belirlemek için, bakteriyel süspansiyonu temiz bir mikroakışkan cihazın gözlem kanalına bir şırınga ile enjekte edin. Görüntüyü kaydedin ve daha önce gösterildiği gibi etkili bakteri konsantrasyonu hesaplayın. Etkili bakteri konsantrasyonu C0 ile atık bakteri konsantrasyonu C normalleştirerek ve C0 ve zaman üzerinde C çizerek atılım eğrileri görselleştirin.
Gözenekli matris ile taşınan bakterilerin yerel hızlarını ve yörüngelerini analiz etmek için mikroskop aşamasını ilgi çekici bir bölgeye taşıyın ve odağı mikroakışkan cihazın merkezine ayarlayın. Optik konfigürasyonu faz kontrastı veya floresan mikroskobu ile ayarlayın. Zaman atlamalı görüntüleri ve bakteriyel yer değiştirmeyi yakalayacak kadar kısa bir pozlama süresi kaydedin.
Bu durumda, 50 milisaniye. Resimleri, örneğin üç dakika gibi yeterli bir süre içinde kaydedin. Her görüntüdeki gürültüyü kaldırmak için, kaydedilen tüm görüntülerin toplamının ortalaması olan arka planı çıkarın.
Sayısal degradenin modülünü belirleyin ve maksimum değerine göre normalleştirin. Bakteri koordinatlarını ve görüntü edinme süresini üç sütunlu bir dosyaya bulup kaydedin. Kaydedilen verileri işlemek ve yörüngeleri hesaplamak için parçacık izleme çözümlemesi gerçekleştirin.
Biriktirme profilleri elde etmek için, önce tüm gözenekli kanalın kompozit bir görüntü kaydedin, yani arka plan, ve mikroakışkan cihaz yoluyla bakteriyel süspansiyon enjeksiyonu sonra. Bakteri enjeksiyonundan sonra kaydedilen görüntülerden arka planı çıkarın. Gözenekli kanalın x uzunluğunun transversal kesitleri boyunca bakteriyel floresan sinyalinin toplamı olarak d depozasyon profilini hesaplayın.
Gözenekli kanal uzunluğuna karşı yerel floresan sinyali olarak biriktirme profilini görselleştirin. Otomatik dağıtıcıyı kurmak için robotik dağıtıcıyı akışkan cihazın yakınına yerleştirin. Robot dağıtıcıyı BCNC çalıştıran bilgisayara bağlayın ve doğru iletişim bağlantı noktasını belirleyin.
BCNC'de, robot dağıtıcısını ana konuma döndürmek için ana ekran düğmesini tıklatın. Peristaltik pompayı 50 santimetre uzunluğunda, bir milimetre lik iç çaplı boru ve aynı boruyu kullanarak otomatik dağıtıcı ile çıkışı kullanarak girişle bağlayın. Akışkan cihaz ile pompa yetiştirme ortamı.
Robot dağıtıcısına sabitlenmiş çıkış borularına orta nın gelişine dikkat edin ve çıkışı toplayacak 96 kuyuluk bir plaka yerleştirin. Aynı zamanda, robot dağıtıcıetkinleştirin ve dakikada 0,2 mililitre akış hızında PMMA akışkan cihaz aracılığıyla bakteriyel süspansiyon enjekte. Birkaç gözenek hacmine eşdeğer bakteriyel süspansiyon enjekte edin.
Örneğin, akışkan cihazın hacminin 30 katı. Enjeksiyondan sonra, deney sonuna kadar steril yetiştirme ortamına geçin. 96 kuyulu bir plaka tamamlandıktan sonra, plakayı kapatın ve akış sitometri analizine kadar dört santigrat derecede saklayın.
Akış sitometrisi ile numuneleri analiz edin ve atık bakteri konsantrasyonu C0 ile atık bakteri konsantrasyonu C'yi normalleştirerek ve C0'yi c0'ye karşı zamana göre çizerek çığır açan eğrileri görselleştirin. Bu çalışmada, hem hareketli hem de hareketli olmayan Pseudomonas putida KT2440 kullanılarak, rastgele bir dizi sütuna sahip PDMS mikroakışkan cihazlarda sıralı deneyler yapılmıştır. Enjekte edilen hücrelerin konsantrasyonuna normalleştirilmiş atılım eğrileri ve gözenek ölçeğindeki bakteriyel yörüngeler burada gösterilmiştir.
PMMA'dan öğütülmüş büyük ölçekli akışkan cihazlarla deneyler de yapıldı. Hareketli ve hareketli olmayan Pseudomonas putida KT2440 düzenli aralıklı gözenekli matris içine enjekte edildi. Çarpıcı, biyofilm yoksun gözenekli bir ortamda, hareketli ve non-motile Pseudomonas putida KT2440 atılım eğrileri dayalı belirgin bir farklı ulaşım davranışı gösterdi.
Karmaşık bir akış biyofilm topluluğu ile 48 saat boyunca kolonize gözenekli bir matris olarak, hareketli ve non-motile Pseudomonas putida KT2440 arasındaki atılım eğrileri bu farklılıklar kayboldu. Bu sistemi akarsularda bakteri naklini incelemek için kullanıyoruz, ancak bu araçlar diğer mühendislik ve çevre sistemlerindeki bakteri taşıma fenomenlerini incelemek için kolayca ayarlanabilir. Sulu gözenekli ortam yoluyla bakteriyel taşıma birden fazla mekansal ölçekler üzerinde süreçleri kapsüllemek.
Burada sunulan metodoloji gözenek ölçeğinde bakterilerin yerel yer değiştirme tüm gözenekli ortamda mikroskobik taşıma bağlantı sağlar.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, mikroakışkan cihazlar, mikroskopi ve akış sitometri kullanılarak gözenekli ortamlarda bakteri taşınmasını incelemek için yenilikçi araçlar sunar. Bu yöntemler, araştırmacıların çeşitli uzamsal ölçeklerde taşınma fenomenlerini araştırmalarına olanak tanır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Mikrobiyoloji
- Çevre Bilimi
- Akışkanlar Dinamiği
Arka Plan
- Bakteri taşınmasının anlaşılması, kirlilik ve hastalık yayılmasını ele almak için kritik öneme sahiptir.
- Tek hücreli ve topluluk düzeyinde taşınma analiz etmek için matematiksel modellere ihtiyaç vardır.
- Mikroakışkan cihazlar, kontrollü ortamlarda bakteri davranışı çalışmasını geliştirir.
- Mikroskopi ve akış sitometrinin birleştirilmesi, bakteri dinamikleri hakkında kapsamlı bilgiler sağlar.
Çalışmanın Amacı
- Gözenekli sistemlerde bakteri taşınmasını incelemek için araçlar geliştirmek.
- Farklı uzamsal ölçeklerde taşınma fenomenlerini keşfetmek.
- Mikroskopi ve akış sitometri deneyimi olan araştırmacılar için bir protokol sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Kontrollü deneyler için mikroakışkan cihazlar.
- Bakteri hareketini görselleştirmek için mikroskopi.
- Bakteri popülasyonlarını kantitatif olarak belirlemek için akış sitometri.
- Taşınma dinamiklerini incelemek için tekniklerin entegrasyonu.
Ana Sonuçlar
- Geliştirilmiş araçlar kullanılarak bakteri taşınmasının başarılı gösterimi.
- Gözenekli ortamlarda bakteri davranışı hakkında bilgiler.
- Biyoremediasyon ve hastalık kontrolünde potansiyel uygulamalar.
- Mikrobiyal taşınma konusunda gelecekteki araştırmalar için bir çerçeve oluşturulması.
Sonuçlar
- Mikroakışkan, mikroskopi ve akış sitometri kombinasyonu, bakteri taşınmasını incelemek için etkilidir.
- Bu yöntemler, çeşitli ortamlarda mikrobiyal dinamiklerin anlaşılmasına yardımcı olabilir.
- Daha fazla araştırma, bu bulgulara dayanarak çevresel ve sağlıkla ilgili zorlukları ele alabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Understanding microbial transport in porous media is critical for predicting environmental contamination and informing bioremediation strategies. The described tools enable simultaneous measurement across spatial scales, supporting mechanism-based model development and improving predictive confidence in microbial behavior. This multi-scale approach aids in de-risking translational applications by linking pore-scale dynamics to system-level outcomes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of microbial transport hypotheses by visualizing individual cell trajectories and quantifying population-level breakthrough curves.
- Operational Value: Provides standardized, reproducible methods for assessing microbial motility and deposition in controlled porous matrices.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative effluent concentration data and deposition profiles for evaluating microbial transport under varying conditions.
- Operational Value: Supports assay standardization through automated dispensing and flow cytometry readouts, enabling scalable screening of microbial strains or environmental samples.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates mechanistic de-risking by linking pore-scale bacterial movement to macroscopic transport observables, improving model extrapolation.
- Operational Value: Enables cross-scale validation, supporting risk-adjusted decisions in preclinical development of microbial-based therapeutics or bioremediation agents.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates discovery-scale imaging with population-scale quantification, positioning it between early hypothesis testing and preclinical validation stages in microbial transport studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling direct observation of bacterial trajectories at the pore scale.
- Screening: Delivers assay-ready quantitative outputs such as normalized breakthrough curves and deposition profiles for comparing microbial strains or media conditions.
- Analytics: Provides statistical outputs including cell concentration calculations, trajectory analysis, and signal integration for comparative condition evaluation.
- Translational Research: Connects microscopic transport mechanisms to system-level behavior, supporting continuity from discovery to preclinical evaluation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for assessing microbial transport across diverse porous media, reducing redundant method development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in microbial transport modeling.
- Operational Value: Ensures reproducibility and scalability through standardized microfluidic fabrication and automated sampling workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing multi-scale data that reduce late-stage biological risk in microbial applications.
- Portfolio Impact: Enables risk-based prioritization of microbial candidates or bioremediation strategies through validated transport profiling.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic design, microscopy, image processing, and flow cytometry operation.
- Depends on access to plasma treatment systems, syringe pumps, automated dispensers, and fluorescence-capable microscopes.
- Necessitates cross-team standardization of image analysis thresholds and trajectory tracking protocols.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different porous media geometries or microbial species.
- Limited by the need for transparent matrices and fluorescent labeling, which may not reflect all natural conditions.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:57
Preparation of A Microfluidic Device in Polydimethylsiloxane (PDMS)
3:27
Preparation of a Fluidic Device in Poly(methyl methacrylate)(PMMA)
4:09
Analyze Bacterial Transport using PDMS Microfluidic Devices
5:10
Basic Image Processing
6:59
Analyze Bacterial Transport at the Pore Scale
8:08
Study Bacterial Filtration by Means of Deposition Profiles
8:51
Analyze Bacterial Transport using PMMA Fluidic Devices
10:33
Results: Motile and Nonmotile GFP-tagged P. putida KT2440
11:48
Conclusion
