Tam İşlenmiş Rekombinant KRAS4b: Farnesile ve Metillenmiş Proteini Yalıtma ve Karakterize Etme
16 Ocak 2020
Prenilasyon periferik membran bağlayıcı proteinler üzerinde önemli bir değişikliktir. Böcek hücreleri, protein-protein ve protein-lipid etkileşimlerinin biyofiziksel ölçümlerini sağlayan miktarlarda farnesile tedavüle ve karboksimetilatlanmış KRAS4b üretmek için manipüle edilebilir.
Protokolümüz, yüksek verimde düzgün işlenmiş KRAS'lerin izolasyona ve ayrılmasına olanak sağlar. Otantik osuruklu ve karboksimetillenmiş KRAS üretimi, tıpkı memeli hücrelerinde olduğu gibi zarlarında KRAS olan deneylericra etmeyi mümkün kılar. Protokolün yüksek verimi onu önceki çalışmalarından ayırır.
Biz genellikle ifade malzemenin litre başına protein 3-5 miligram arındırmak. Bu bize biyofiziksel ve yapısal biyoloji deneyleri çeşitli yürütmek için izin verir. KRAS kanserlerin% 20 ve pankreas kanserlerinde% 90 mutasyona uğrar.
Yani otantik işlenmiş protein üretmek için bir protokole sahip olmak, kanser hücrelerinin zarında olduğu gibi gerçek proteini inceleyebilmeniz için ilaç ekranları geliştirmek için oldukça yararlıdır. Bu protokol aynı zamanda farnesile tedve tam olarak hücrelerde işlenmiş diğer proteinlerin incelenmesi için de çok yararlıdır. Ve bu yüzden, tek yapmanız gereken KRAS'ı ilgi proteiniyle takas etmek ve baculovirüse koymak.
Kritik adımlar katyon değişimi kromatografisi etrafında olanlar. Uygun kolon kullanarak ve protein düşük tuz tampon içinde zaman sınırlayan başarı için gereklidir. Yağışın bir kar küresi türü olmadığınıanlamak, protokole yeni katılanlara rehberlik eder.
Bu, katyon değişim sütunu yükünü birden çok küçük yüke bölme gereksinimi gösterilerek güçlendirilmiştir. Hücreleri lysing sonra, lysate açıklığa kavuşturulması, ve IMAC ile hedef protein arındırıcı, SDS sayfası ve Coomassie boyama kullanarak protein fraksiyonları analiz. Havuz tepe fraksiyonları ve dört santigrat derece tampon D iki litre karşı bir gecede havuz diyaliz.
Ertesi gün, diyaliz den örnek çıkarın ve herhangi bir çökelti kaldırmak için 10 dakika boyunca 4.000 kez g santrifüj. Son diyalizve açıklık örneği genellikle hala puslu dur, ancak daha fazla işleme gerek kalmadan CEX sütununa uygulanabilir. Tampon G üç sütun hacimleri ile yıkayarak 20 mililitre katyon değişim sütunu hazırlayın, sonra tampon F.Next üç sütun hacimleri ile, tampon E 20 mililitre ekleyerek 100 milimolar son sodyum klorür konsantrasyonu için diyaliz numune20 mililitre seyreltmek ve değişim sütununa örnek uygulayın.
Numunenin küçük bir miktarının tek seferde seyreltilmesi çok önemlidir ve seyreltilmiş numuneler, proteinin yağışını sınırlamak için seyreltildikten hemen sonra kolona uygulanmalıdır. Önceki seyreltme yükün sonuna yaklaştıkça, kolona taze seyreltilmiş numune yüklemeye devam edin. Ardından, genellikle üç sütun hacmi gerektiren arabellek F ile sütunu taban çizgisi emici 280'e yıkayın.
Tampon F'den %65 tampon G'ye kadar 400 mililitrelik degradeile kolondaki proteini, elüent'i altı mililitre kesirlerde toplayarak elüent'i toplayın. Degrade tamamlandıktan sonra, %65 tampon G.SDS sayfası ve Coomassie Blue leke analizinin yanı sıra kromatogramın UV izini kontrol eden pozitif kesirleri seçin. Daha sonra proteini birleştirin ve el yazması talimatlara göre His6 TEV proteaz ile sindirin.
Sindirim ve diyalizden sonra, proteini dakikada üç mililitre tampon A ile dengelenir 20 mililitrelik IMAC sütununa yükleyin. Bu kromatografi sırasında yedi mililitre fraksiyonları toplamak ve tampon A üç sütun hacmi toplam veya taban çizgisi absorbans ulaşıncaya kadar sütun yıkayın. Tampon C'nin beş sütun hacim gradyanı ile hedef proteini %0'dan %10'a kadar eve alın ve yedi mililitre fraksiyon toplayın.
Ardından Pozitif kesirleri SDS sayfası ile tanımlayın. SDS sayfası ile analiz edildiğinde, açıklık lısat füzyon proteinhis6-MBP-tev-KRAS4b karşılık gelen yaklaşık 65 kilodalton göç karanlık bir bant içermelidir. Ortak ifade FNTAb 48 kilodaltons göç eder.
Proteoziz derecesini azaltır ve tam olarak işlenmiş protein zenginleştirir, çünkü arıtma içinde CEX adım önemlidir, ancak protokolün en karmaşık parçasıdır. Bu adımdan tipik bir sonuç KRAS4b-FMe ile belirgin bir tepe üç vardır, ancak elüsasyon profilleri değişken olabilir. ESIMS kullanılarak yapılan sağlam kütle analizi proteinlerin kesin moleküler kütlesini ve böylelikle farnesilasyon veya karboksimetilasyonun göreceli oranını doğrular.
Tipik son kuralar bazı saptanabilir KRAS4b-FARN içermekle birlikte, bu oran bu analizden en yüksek yükseklik açısından %15'ten daha azdı. KRAS4b'nin GSYİh'ya bağlı kütlesini belirlemek için yerli kitle analizi kullanılmıştır. Örnek çözücü, doğal kompleksin bozulmadan kalmasını sağlayan daha yumuşak bir iyonizasyon sağlamak için amonyum asetat ile değiştirildi.
KRAS4b-FMe ve lipozomların etkileşimi yüzey plazmon rezonansı ile ölçüldü ve KRAS4b-FMe'nin membranlara bağlanması için farneslasyon ve karboksimetilasyonu doğrulamak için gereklidir. Beklendiği gibi, KRAS4b-FMe işlenmemiş KRAS4b vermedi ise lipozomlar bağlı. Proteinin düşük tuza maruz kalma süresini en aza indirmek, protokolün verimi etkileyen en kritik tek yönüdür.
Protein sadece kısa bir süre tampon E.The protein seyreltme aşağıdaki bu düşük tuz konsantrasyonu olan protein lipozomlar veya nanodiskler gibi membran mimetikler kullanan biyofiziksel deneyler çeşitli için hangi lipidler KRAS ile etkileşime araştırmak için kullanılabilir. Bu verileri kullanarak, KRAS'ın hücrenin plazma zarı yla nasıl etkileştiğini tahmin etmeye başlayabiliriz. Saflaştırılmış KRAS-FMe kullanarak, meslektaşlarımız kras'ın karmaşık x-ışını kristal yapısını bu proteinin farneslü ve metillenmiş formuna özgü bir şaperonla çözmeyi başardılar.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, protein etkileşimlerinin biyofiziksel ölçümlerini sağlayan farnesile edilmiş ve karboksimetilenmiş KRAS'ın yüksek verimli üretimi için bir protokol sunmaktadır. Yöntem, uygun şekilde işlenmiş KRAS'ın izolasyonunu sağlayarak, memeli hücre koşullarını taklit eden deneyleri kolaylaştırır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Biyokimya
- Yapısal Biyoloji
- Hücre Biyolojisi
Arka Plan
- KRAS, hücre sinyalinde yer alan kritik bir proteindir.
- KRAS'taki mutasyonlar, özellikle pankreas kanseri gibi çeşitli kanserlerde yaygındır.
- Farnesilasyon, KRAS'ın zar lokalizasyonu ve işlevi için gereklidir.
- Mevcut KRAS üretim yöntemlerinin verim ve orijinalliğinde sınırlamaları vardır.
Çalışmanın Amacı
- Farnesile edilmiş ve karboksimetilenmiş KRAS'ın yüksek verimlerini üretmek için bir protokol geliştirmek.
- KRAS ile zar benzeri bir ortamda biyofiziksel ve yapısal biyoloji deneylerini sağlamak.
- KRAS üretiminin önceki yöntemlerini geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Böcek hücrelerinden KRAS'ın izolasyonu ve saflaştırılması.
- Protein modifikasyonlarının karakterizasyonu.
- Protein veriminin kantitatif ölçümü.
- Protein etkileşimlerini incelemek için biyofiziksel tahliller.
Ana Sonuçlar
- Protokol, ekspresyon malzemesi başına üç ila beş miligram KRAS verimi sağlar.
- Deneylere uygun olarak doğru şekilde modifiye edilmiş KRAS'ın başarılı bir şekilde üretilmesi.
- Çeşitli biyofiziksel deneyler yapma kabiliyetinin gösterilmesi.
- Kanser araştırmalarında KRAS'ın öneminin vurgulanması.
Sonuçlar
- Geliştirilen protokol, KRAS üretimi için güvenilir bir yöntem sağlar.
- Yüksek verimler, kapsamlı deneysel uygulamaları kolaylaştırır.
- Bu çalışma, KRAS'ın kanser biyolojideki rolünü anlamaya katkıda bulunur.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Producing authentically processed KRAS4b enables physiologically relevant studies of oncogenic signaling and membrane interactions. High-yield purification supports scalable biophysical and structural assays for target validation. This approach de-risks downstream drug discovery by providing a disease-relevant system that mimics native KRAS membrane localization and function.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of KRAS4b membrane association and effector binding in a fully processed state.
- Operational Value: Provides homogeneous protein for consistent biophysical readouts in target engagement studies.
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by validating farnesylation and carboxymethylation as prerequisites for plasma membrane localization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates validated KRAS4b-FMe for liposome-based binding assays using surface plasmon resonance.
- Operational Value: Delivers milligram-scale yields suitable for high-throughput screening campaign inputs.
- Scientific Value: Enables preparation of membrane mimetics to study lipid specificity and compound effects on KRAS-membrane interactions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates structural biology efforts, such as X-ray crystallography of KRAS4b in complex with farnesylation-specific chaperones.
- Operational Value: Yields nucleotide-bound KRAS4b-GDP complexes confirmed by native mass spectrometry for mechanistic studies.
- Scientific Value: Supports translational biomarker alignment by linking post-translational processing to oncogenic signaling competence.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to preclinical workflows by supplying authentic KRAS4b for hypothesis testing, assay development, and structural validation.
- Discovery Biology: Supports functional validation of KRAS4b effectors and GTPase cycling in a membrane-competent format.
- Screening: Enables liposome-based SPR assays to measure compound-induced changes in KRAS-membrane affinity.
- Analytics: Uses intact and native mass spectrometry to confirm farnesylation, carboxymethylation, and nucleotide binding status.
- Translational Research: Connects post-translational processing to membrane localization, a key determinant of KRAS signaling output.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other CAAX-box proteins via baculovirus swap, enabling platform-wide application across prenylated target families.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target behavior through physiologically accurate post-translational modification.
- Operational Value: High-yield purification (3–5 mg/L) reduces material bottlenecks for extensive experimental campaigns.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing false negatives in membrane-dependent assays.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of KRAS-targeted modalities based on authentic target engagement data.
Implementation Considerations
- Expertise in baculovirus expression and insect cell culture is required for recombinant protein production.
- Cation exchange chromatography demands precise buffer gradients and split-loading to prevent precipitation and proteolysis.
- Standardization across teams relies on consistent dialysis, clarification, and fraction analysis via SDS-PAGE and UV tracing.
- Adaptation to other prenylated proteins requires optimization of IMAC and CEX conditions based on protein-specific properties.
- Practical limitations include sensitivity to low-salt exposure during purification, which impacts yield and necessitates rapid processing.
