Gastrointestinal Organoidlerin Genetik Mühendisliği için Evrensel ve Etkili Elektroporasyon Protokolü

Bu yöntem organoidler gibi 3D hücre kültürlerinin verimli transfeksiyon sağlar. Genetik mühendisliğinin çeşitli uygulamaları kolaylaşabilir. Protokol evrenseldir ve bir gün içinde gerçekleştirilebilir.

Kapsamlı bir hazırlık veya özel, maliyet yoğun elektroporasyon tamponlar gerekmez. Bu transfeksiyon yöntemi tümör ve sağlıklı organoidlerde gösterilmiştir, ancak spheroidlere ve 2D hücre kültürüne de ayarlanabilir. Bu protokolü ilk kez gerçekleştiriyorsanız, organoidlerin bireysel çoğalması ve ayrışmaya tepkileri nedeniyle dikkatli bir şekilde ele alabilmesi önemlidir.

Tüm işlem sırasında mikroskobik olarak izleyin. Elektroporasyon sonrası tohumlama için 37 derecede 48 kuyulu plakaları önceden ısıtarak başlayın, sonra el yazması yönlere göre bazal ve organoid kültüre özgü ortamlar hazırlayın. 48 kuyuluk bir plaka içinde elektroporasyon numunesi başına beş kuyu organoid yetiştirin, kuyu başına 10 mikromolar Y-27632 ile 230 mikrolitre dissosilasyon reaktifi hazırlayın.

Organoidleri mikroskop altında izleyin. Kültür ortamını kuyulardan çıkarın ve organoidleri hazırlanan ayrışma karışımında mekanik olarak ayrıştırın. Bir 15 mililitrelik tüp içine elektroporasyon örnek başına havuz beş kuyu.

10 ila 15 hücrekümeleri meydana gelene kadar, girdap ve 5 ila 15 dakika boyunca tüp içeriğini karıştırın mikroskop ile ayrışma kontrol. Antibiyotik olmadan bazal orta 10 mililitre kadar ekleyerek sindirim durdurun. Tüpü 450 kez g'de beş dakika santrifüj edin, süpernatant'ı atın ve hücreleri dört mililitre elektroporasyon tamponuyla iki kez yıkayın.

Santrifüj ve her yıkamadan sonra supernatant atın. Yıkarsonra, 30 mikrogram plazmid DNA ile 100 mikrolitre elektroporasyon tamponunda organoid peleti yeniden askıya alın. Bir elektroporasyon cuvette içine tam DNA-organoid karışımı dağıtın.

Hava kabarcıkları önlemek için emin olun. Metin el yazmasında açıklandığı gibi elektroporasyon parametrelerini ayarlayın ve hücreleri yavaşça karıştırmak için bir parmakla cuvette dokunun. Cuvette'i cuvette odasına yerleştirin ve empedans değerini not etmek için elektroporatörüzerindeki empedans düğmesine basın.

Elektroporasyon programını başlatmak ve görüntülenen akımların, gerilimlerin ve enerjilerin değerlerini kontrol etmek için Başlat düğmesine basın. Elektroporasyondan sonra, hemen hücrelere antibiyotik olmadan kültür ortamı 500 mikrolitre ekleyin ve yukarı ve aşağı borulama tarafından karıştırın. Yeni bir 15 mililitrelik tüp içine örnek aktarın ve kalan hücreleri toplamak için bazal orta ile cuvette durulayın, sonra 40 dakika oda sıcaklığında hücreleri kuluçka.

Hücreleri 450 kez g'de beş dakika santrifüj edin ve süpernatant'ı atın. 100 mikrolitre bodrum matrisinde peleti yeniden askıya alın ve önceden ısıtılmış 48 kuyuluk bir plakada 20 mikrolitrelik tohum damlası. Polimerizasyon için 37 santigrat derecede 10 dakika boyunca plaka kuluçka ve iyi başına Y-27632 ve CHIR99021 ile takviye kültür orta 250 mikrolitre ekleyin.

Transfeksiyon verimliliğini belirlemek için, 24 ila 48 saat sonra mikroskop altında transfeksiyon kontrolündefloresans kontrol edin. FACS analizi için, daha önce açıklandığı gibi hücreleri hasat ve tek hücreler mevcut olana kadar 10 ila 20 dakika sindirmek. 10 mililitreps PBS ekleyin ve beş dakika boyunca 450 kez g hücreleri santrifüj, sonra aspire ve supernatant atın.

Canlı hücreler için ayrımcılık yapmak için, PBS bir mililitre pelet resuspend ve uygun bir antikor veya propidium iyodür ekleyin. Hücreleri dokunarak hafifçe karıştırın ve karanlıkta 30 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra hücreleri 10 mililitre PBS ile yıkayın, sonra santrifüj edin ve süpernatantı atın.

Hücre peletini 200 mikrolitre PBS'de yeniden askıya alın ve süspansiyonu 100 mikrometrelik bir süzgeçten FACS tüpüne süzün. Hücreleri uygun gating stratejisini kullanarak bir FACS makinesi yle analiz edin ve transfeksiyon verimliliğini belirleyin. Dört farklı kanser varlığına ait organoidler, 30 mikrogram küçük plazmid veya büyük plazmid kullanılarak en az üç kez elektroporated edildi.

Elektroporasyondan 48 saat sonra akış sitometrisi ile analiz edildiler ve hücre şekli, tek hücreler, canlı hücreler ve eGFP ekspresyonu için geçitli olarak ele geçirildiler. Dört organoid varlıkta da küçük plazmid büyük olandan daha yüksek verimlilikle transfekte direnilmiştir. PDAC organoidlerinde %92.1 GFP pozitif hücrelerile küçük plazmidin en verimli transfeksiyonuna ulaşıldı, büyük plazmid %46.7 verimlilikle transpereste iken büyük plazmid ortalama verim %53.4 ile CRC organoidlerine daha verimli bir şekilde aktarıldı, küçük plazmid ortalama verimlilik le transfeced edildi 84.3%Transfect için en zor varlık mide kanseri organoidleri vardı , her iki plazmid için en düşük transfeksiyon verimliliği gösterdi.

Konseptin kanıtı olarak, insan normal mide organoidleri Cas9, GFP ve TP53'ü hedefleyen 2sgRAs için plazmid kodlaması ile elektroporated edildi. Klonlar Nutlin3 yönetimi tarafından seçildi ve TP53 nakavt alel lerinin sıralanması ile doğrulandı. İnsan mide organoidlerinde de gösterdiğimiz gibi, etkili elektroporasyon, farklı hastalıkların modellenebilmesi için organoid kültürlerin nakavt veya knockin gibi çeşitli CRISPR Cas9 baz manipülasyonlarına olanak sağlar.