Name: Lipophilic Floresan Boyalar Kullanarak Drosophila Embriyonik Motor Nöronların Retrograd İzleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-12T16:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Öğrenin lipofilik floresan boyalarla Drosophila embriyonik motor nöronlarının retrograd izleme yöntemini. Bu teknik, nöronal morfojenez ve bağlantıları incelemek için değerli bir araçtır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz el yazması üzerinde yorum için Kamiyama Lab üyelerine teşekkür ederiz. Bu çalışma NIH R01 NS107558 (M.I., K.B., ve D.K.) tarafından desteklenmiştir.

1. Ekipman ve Sarf Malzemeleri
<ol><li>Embriyo toplamak ve yetişkinleri yumurtlamak için eğitmek için malzemeler<ol>
<li>50 mL'lik bir tüpü keserek ve kapakta bir delik açarak filtreleme aparatıhazırlayın ve tüp ile kapak arasında 100 μm 'lik(Malzeme Tablosu)gözenekli bir örgü filtre ayarlayın. NOT: Alternatif olarak, embriyo toplamanın filtrasyon basamaşlarında 100 μm(Malzeme Tablosu)gözenekli hücre süzgeci kullanılabilir.</li>
		<li>Listelenen talimatlara göre üzüm agar premix(Malzeme Tablosu)ile agar plakaları olun. Kısaca, 1 paket toz karışımını oda sıcaklığında 500 mL (RT, 23 °C) dH2O ve mikrodalga da çözünmüş karışımı iyice kaynatın. 70−75 °C'ye kadar soğuttuktan sonra karışımı Petri kaplarına (60 mm) dökün. Agar katılaştırıladıktan sonra plakaları 4 °C'de saklayın.</li>
		<li>Aktif kuru mayayı(Malzeme Tablosu)karıştırarak maya hamurunu hazırlayın ve bir macun kıvamında su layın ve 4 °C'de tutun.</li>
		<li>Yeterli hava akışı sağlayan yumurta toplama kafesleri (60 mm Petri kabı, Malzeme Tablosuiçin) kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Diseksiyon iğnelerinin ve boya enjeksiyon mikropipetlerinin hazırlanması<ol>
<li>0,6 mm iç çapı ve 1,2 mm dış çapı ile aynı kılcal borudan boya enjeksiyonmikropipet ve diseksiyon iğnesi hazırlayın(Malzeme Tablosu). 170 V maksimum çıkıştan(Malzeme Tablosu)%7 oranında bir mikropipet çekmecesi ile kılcal boruyu çekin ve uzunluğu ~0,4 cm'lik bir konikle keskin bir iğne oluşturun.</li>
		<li>Boya enjeksiyonu için, mikropipeti, aletin el kitabında tanımlanan bir kabarcık beveling tekniği ile bir mikropipet beveler(Malzeme Tablosu)ile ayarlayın.<ol>
<li>Kısacası, iğne ucunu 'sürükleyerek' su önlemek için bir ıslatma maddesi(Malzeme Tablosu)ile öğütücü ıslatın. İğneyi 25−30° de mikropipet kelepçesine yerleştirin ve ucu yarıçapın üçte ikisine indirin. Mikropipetin cam talaşlardan arındığından emin olmak için, borulu bir şırınga havayı iğneye doğru iterken iğneyi öğütün.</li>
			<li>Bir açıda oluşan mikropipetin dar açıklığı bulmak zor olduğu için, beveling sonra ucundaki açılış konumunu belirtmek için ince uçlu kalıcı marker ile mikropipet işaretleyin.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Embriyo Toplama Hazırlığı
<ol><li>Yetişkin sineklerin (20−40 vahşi tip Kton-S veya beyaz sinekler), erkek ve dişilerin, genç (<7 gün) ve ideal yumurta toplama için sağlıklı koşullarda muhafaza edilmesini sağlayın. NOT: Yumurta yumurtlamayı teşvik etmek için sinekler, her gün en az bir kez maya macunu ile süslenmiş agar tabaklarında yumurta toplamadan birkaç gün önce yumurta toplama kafesinde eğitilirler.</li>
</ol>3. Embriyo Evreleme
<ol><li>Sinekler bir gecede yumurtlamak için izin (ya da en az 15 saat) RT de embriyoları toplamak için 15 h AEL, yani, evre 1618, aCC ve RP3 motor nöronların dendritogenezi görüntülemek için. Sabah, yumurta ile plaka toplamak. NOT: 15 saat AEL'deki embriyolar 4 odacıklı ayrı bir bağırsak18olacaktır. Farklı aşamaları görüntüleme için kendi özel morfolojik kriterleri ve yaşlanma koşulları izleyin.</li>
	<li>Embriyoları toplamak için, 5 dakika boyunca% 50 çamaşır suyu ile plaka üzerine yatırılan yumurta dekorionate.</li>
	<li>Korolar temizlendikten sonra, embriyoları izole etmek için plakanın içeriğini filtrasyon aparatı veya hücre süzgecinden geçirin. Bir sıkma şişesi su kullanarak, plaka üzerinde kalan çamaşır suyunu seyreltin ve karışımı filtreye ayırarak mümkün olduğunca çok embriyo toplayın.</li>
	<li>Embriyoları filtrede 3−4x daha fazla suyla veya çamaşır suyu kokusu dağılına kadar yıkayın. Filtreyi cihazdan çıkarın ve embriyoları suyla başka bir temiz tabağa yıkayın. Embriyoların üzerinde olduğu yeni plakadan suyu çıkar.</li>
	<li>Bir dikdörtgen oluşturan, merkezinde vinil bant iki kat ile kaplayarak bir cam slayt hazırlayın. Jilet kullanarak banttan dikdörtgen bir havuz kesin. Havuzun üst ucuna doğru ince bir çift taraflı bant şeridi yerleştirin, burada embriyolar Şekil 1'degösterildiği gibi yerleştirilecektir.</li>
	<li>İnce şıklar kullanarak, 15 saat AEL'de 5−10 embriyoyu tek tek seçin ve sırt tarafı yukarı bakacak şekilde çift taraflı bandA yerleştirin. Embriyoları kurutmalardan korumak için böcek Ringer'ın salin19'unu diseksiyon havuzuna ekleyin (Şekil 1).</li>
</ol>4. Diseksiyon ve Boyama
<ol><li>Bir diseksiyon mikroskobu(Malzeme Tablosu)altında cam bir iğne kullanarak, onun arka dan ön ucuna yüzeyinde tek bir embriyonun orta hattı ile kesti. Daha sonra embriyoyu vitellin membranından banttan cama sürükleyin (Şekil 1'dekutulanır). Embriyonun iç dokularına zarar vermemeye dikkat edin.</li>
	<li>Epitel dokuları merkezden çevirin ve epidermal kenarı cam kaydıraktan yüzeye takın(Şekil 1,inset).</li>
	<li>~300 μm 'lik bir uç açıklığı olan tüpe bağlı bir iğne kullanmak (diseksiyonu iğnenin ince ucunu kırarak hazırlanır), dorsal uzunlamasına trakeal gövdeleri ve kalan bağırsakları ayırmak ve çıkarmak için havayı aspire etmek veya üflemek.</li>
	<li>Embriyoları 5 dakika lığına rt. Wash embriyoları PBS ile 3x yıkamak için fosfat tamponlu salin (PBS) % 4 paraformaldehit (PFA) kullanın.</li>
	<li>1 saat boyunca 200 μL PBS'de siyanin 3 boya (anti-HRP Cy3)(Malzeme Tablosu)ile konjuge 1 μL anti-horseradish peroksidaz antikor ile embriyoları lekelayın. NOT: Anti-HRP boya enjeksiyon için tercih lipophilic boyalar dayalı değiştirilebilir.</li>
</ol>5. Enjeksiyon Mikro-pipet dolum
<ol><li>Isı lipophilic boyalar (5 mg / mL DiO veya DiD, Malzeme Tablosu) için 60 °C etanol bir 1:10 karışımı: bitkisel yağ kullanmadan önce.</li>
	<li>Enjeksiyon mikropipeti için yağda çözünmüş bir boya kaydırağı hazırlayın. Mikropipeti kılcal tutucuya yerleştirin(Şekil 2, #1). Mikromanipülörü(Malzeme Tablosu)kullanarak, mikropipeti boya kaydırağının üzerinde olacak şekilde ayarlayın. Daha sonra, mikropipeti boyanın üzerine yerleştirmek için sahneyi ayarlayın(Şekil 2, #2).</li>
	<li>Mikropipeti doldurmak için bir mikroenjektör(Malzeme Tablosu)kullanın (Şekil 2, #3). Pi (enjeksiyon basıncı) 200−500 hPa (hektopascal), Ti (enjeksiyon süresi) 0,1−0,5 s ve Pc (kompanzasyon basıncı) ile 0 hPa arasında 5 dakika(Şekil 2, #4) arasında ayarlayarak boyayı mikropipette toplayın.</li>
	<li>Boya toplandıktan sonra boya kaydırağını çıkarın ve örneği mikroskop aşamasına yerleştirin. Daha sonra, pbs'nin kapiller etki ile kontaminasyonunu önlemek için mikropipeti numuneye indirmeden önce Pc'yi 20−60 hPa aralığına yükseltin.</li>
</ol>6. Nöronlara Boya Enjeksiyonu
<ol><li>10x objektif lens(Malzeme Tablosu)ile mikroskop kullanarak merkezinde embriyo bulmak ve embriyo ile mikropipet hizalamak. NOT: Boya damlacığının boyutu Pi veya mikropipet ucunun açılmasının boyutu değiştirilerek ayarlanabilir. Damlacık yaklaşık 1 kas genişliği 10−20 μm olmalıdır.</li>
	<li>Objektif lensi bir su daldırma 40x lens(Malzeme Tablosu)ile değiştirin ve embriyoyu görmek için lensi PBS'ye batırın.<ol>
<li>Anti-HRP Cy3 ile işaretlenmiş nöronal morfolojiyi kontrol etmek ve enjeksiyon bölgesini belirlemek için floresan mikroskobu kullanın.</li>
		<li>Enjeksiyon sırasında, boya damlacık görmek için brightfield mikroskobu kullanın. Embriyo odakta olduğunda, ilgi akson ucu ile nazik temas yapmak için mikropipet konumunu değiştirmek (örneğin, aCC, RP3).</li>
		<li>Boyayı anti-HRP Cy3 ile işaretlenmiş nöronları kullanarak, ACC veya RP3 'ün nöromüsküler kavşağında(Şekil 3)DiD veya DiO ile sağ karına (A2−A6) hemi segmentine bırakın. El kontrolünü kullanma (fare; Şekil 2, 5) boyayı bırakın ve mikromanipülatörile boyayı bıraktıktan sonra mikropipeti çıkarın ve bir sonraki enjeksiyon bölgesine geçin. NOT: Boşluk kavşakları aracılığıyla komşu hücrelere yayılan diğer boyaların (örneğin, Lucifer sarısı, kalsin) aksine, lipophilic boyalar hücre zarları ile ilişkilendirmek ve komşulara transfer olmaz. Boya damlacıknispeten büyük boyutu nedeniyle, ancak, bu teknik de ortak kasların etiketleme ile sonuçlanır (Şekil 3A).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Görüntülemeden önce boya damlatmadan sonra numuneyi 1 saat boyunca RT'ye yatırın. NOT: Protokol montajdan önce burada duraklatılabilir ve numune bir gecede 4 °C'de tutulabilir. Lipophilic boyalar da iyontoforez kullanılarak teslim edilebilir, bir hücre içi doğrudan birleştiğinde (DC) amplifikatör hazır ise20.</li>
</ol>7. Konfokal Mikroskopile Görüntüleme
<ol><li>Çift taraflı bandı ve vinil bandı çifenipler yardımıyla cam kaydıraktan çıkarın.</li>
	<li>Dört köşeye az miktarda vakum yağı(Malzeme Tablosu)ile bir kapak fişi (22 x 22 mm22 mm 2 No.1 kapak camı) hazırlayın ve hava kabarcıklarından kaçınarak numunenin üzerine dikkatlice yerleştirin. Görev sileceklerini kullanarak fazla PBS'yi kaldırın.</li>
	<li>Objektif lens ile numune arasındaki çalışma mesafesini ayarlamak için kapak fişini aşağı itin. Tamamen oje ile kapak kayma kenarları mühür.</li>
	<li>Bir konfokal mikroskop kullanarak 10x ve 100x büyütme görüntü.</li>
	<li>Mikroskoptan(Malzeme Tablosu)ham görüntüleri işlemek için ImageJ yazılımını kullanın. NOT: Gözlem en iyi görüntüler için montaj dan sonra 10 dakika içinde başlamalıdır. Aksi takdirde, RT, boya görüntüleme için istenmeyen arka plan oluşturarak enjeksiyon sitesine bitişik sitelere yayılır. Boyanın difüzyonu yavaşlatmak için numune 4 °C'de birkaç saat saklanabilir.</li>
</ol>

<ol><li>Arzan Zarin, A., Labrador, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+axon+guidance+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Motor axon guidance in Drosophila.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 85, 36-47 (2019).</li>
<li>Nose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neuromuscular+specificity+in+Drosophila%3A+novel+mechanisms+revealed+by+new+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Generation of neuromuscular specificity in Drosophila: novel mechanisms revealed by new technologies.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 5, 62(2012).</li>
<li>Kim, M. D., Wen, Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+and+organization+of+motor+neuron+dendrites+in+the+Drosophila+larva%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Patterning and organization of motor neuron dendrites in the Drosophila larva.</a> Developmental Biology. 336 (2), 213-221 (2009).</li>
<li>Manning, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+resource+for+manipulating+gene+expression+and+analyzing+cis-regulatory+modules+in+the+Drosophila+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A resource for manipulating gene expression and analyzing cis-regulatory modules in the Drosophila CNS.</a> Cell Reports. 2 (4), 1002-1013 (2012).</li>
<li>Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harvesting+and+preparing+Drosophila+embryos+for+electrophysiological+recording+and+other+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1347(2009).</li>
<li>Chen, K., Featherstone, D. E., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+recording+in+the+Drosophila+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological recording in the Drosophila embryo.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1348(2009).</li>
<li>Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+Patterning+in+the+Drosophila+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Temporal Patterning in the Drosophila CNS.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 33, 219-240 (2017).</li>
<li>Homem, C. C., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+neuroblasts%3A+a+model+for+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology.</a> Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).</li>
<li>Urbach, R., Technau, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroblast+formation+and+patterning+during+early+brain+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Neuroblast formation and patterning during early brain development in Drosophila.</a> Bioessays. 26 (7), 739-751 (2004).</li>
<li>Carrero-Martínez, F. A., Chiba, A. Cell Adhesion Molecules at the Drosophila Neuromuscular Junction. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCarrero-Mart%C3%ADnez%2C+FA+%22The+Sticky+Synapse%3A+Cell+Adhesion+Molecules+and+Their+Role+in+Synapse+Formation+and+Maintenance%22">The Sticky Synapse: Cell Adhesion Molecules and Their Role in Synapse Formation and Maintenance</a>. Umemori, H., Hortsch, M. , Springer. New York. 11-37 (2009).</li>
<li>Ritzenthaler, S., Suzuki, E., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postsynaptic+filopodia+in+muscle+cells+interact+with+innervating+motoneuron+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Postsynaptic filopodia in muscle cells interact with innervating motoneuron axons.</a> Nature Neuroscience. 3 (10), 1012-1017 (2000).</li>
<li>Kohsaka, H., Takasu, E., Nose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+induction+of+postsynaptic+molecular+assembly+by+the+cell+adhesion+molecule+Fasciclin2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">In vivo induction of postsynaptic molecular assembly by the cell adhesion molecule Fasciclin2.</a> Journal of Cell Biology. 179 (6), 1289-1300 (2007).</li>
<li>Kohsaka, H., Nose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+recognition+at+the+tips+of+postsynaptic+filopodia%3A+accumulation+and+function+of+Capricious%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Target recognition at the tips of postsynaptic filopodia: accumulation and function of Capricious.</a> Development. 136 (7), 1127-1135 (2009).</li>
<li>Landgraf, M., Bossing, T., Technau, G. M., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin%2C+location%2C+and+projections+of+the+embryonic+abdominal+motorneurons+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The origin, location, and projections of the embryonic abdominal motorneurons of Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 17 (24), 9642-9655 (1997).</li>
<li>Kamiyama, D., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+activation+patterns+of+Cdc42+GTPase+within+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Endogenous activation patterns of Cdc42 GTPase within Drosophila embryos.</a> Science. 324 (5932), 1338-1340 (2009).</li>
<li>Furrer, M. P., Vasenkova, I., Kamiyama, D., Rosado, Y., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slit+and+Robo+control+the+development+of+dendrites+in+Drosophila+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Slit and Robo control the development of dendrites in Drosophila CNS.</a> Development. 134 (21), 3795-3804 (2007).</li>
<li>Kamiyama, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+Dendritogenesis+Site+in+Drosophila+aCC+Motoneuron+by+Membrane+Enrichment+of+Pak1+through+Dscam1%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Specification of Dendritogenesis Site in Drosophila aCC Motoneuron by Membrane Enrichment of Pak1 through Dscam1.</a> Developmental Cell. 35 (1), 93-106 (2015).</li>
<li>Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCampos-Ortega%2C+JA+%22The+embryonic+development+of+Drosophila+melanogaster%22">The embryonic development of Drosophila melanogaster</a>. , Springer-Verlag. Berlin, Germany. (1985).</li>
<li>Drosophila Ringer's solution. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22">Cold Spring Harbor Protocols</a>. 2007 (4), (2007).</li>
<li>Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. -L., Whitington, P., Technau, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+of+single+cells+in+the+central+nervous+system+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Labeling of single cells in the central nervous system of Drosophila melanogaster.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50150(2013).</li>
<li>Fujioka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Even-skipped%2C+acting+as+a+repressor%2C+regulates+axonal+projections+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Even-skipped, acting as a repressor, regulates axonal projections in Drosophila.</a> Development. 130 (22), 5385-5400 (2003).</li>
<li>Sink, H., Rehm, E. J., Richstone, L., Bulls, Y. M., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((sidestep+encodes+a+target-derived+attractant+essential+for+motor+axon+guidance+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">sidestep encodes a target-derived attractant essential for motor axon guidance in Drosophila.</a> Cell. 105 (1), 57-67 (2001).</li>
<li>Furrer, M. P., Kim, S., Wolf, B., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robo+and+Frazzled%2FDCC+mediate+dendritic+guidance+at+the+CNS+midline%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Robo and Frazzled/DCC mediate dendritic guidance at the CNS midline.</a> Nature Neuroscience. 6 (3), 223-230 (2003).</li>
<li>Landgraf, M., Jeffrey, V., Fujioka, M., Jaynes, J. B., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+origins+of+a+motor+system%3A+motor+dendrites+form+a+myotopic+map+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Embryonic origins of a motor system: motor dendrites form a myotopic map in Drosophila.</a> PLoS Biology. 1 (2), 41(2003).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Nöronal morfolojiyi incelemek için boya etiketlemekullanımının genetik hücre etiketleme tekniklerine göre birçok avantajı vardır. Boya etiketleme tekniği, motor nöronların morfolojilerinin etiketlenmesi ve görüntülenmesi için gereken süreyi en aza indirebilir. Boya etiketleme işlemi 2 saatten az sürer ve nöronal projeksiyonların ana hatlarını tanımlamamızı sağladığından oldukça hızlıdır. Alternatif olarak, bir aCC maya GAL4 transkripsiyon faktörü ifade eden bir GAL4 hattı seçerek aCC motor nöron görselleştirmek ve yukarı...

Drosophila embriyonik motor nöron sistemi merkezi sinir sisteminin gelişiminin altında yatan mekanizmaları analiz etmek için güçlü bir deneysel model sunuyor (CNS)1,2,3. Motor nöron sistemi biyokimyasal, genetik, görüntüleme ve elektrofizyolojik tekniklere uygundur. Teknikler kullanılarak, genetik manipülasyonlar ve fonksiyonel analizler tek motor nöronlar düzeyinde yapılabilir2,4,5,6.
Sinir sisteminin erken gelişimi sırasında, nöroblastlar bölmek ve glia ve nöronların çok sayıda üretmek. Delaminasyon ve nöroblastların gen ekspresyonu profili arasındaki spatiotemporal ilişki daha önce ayrıntılı olarak araştırılmıştır7,8,9. Motor nöron sistemi durumunda, embriyonik nöromüsküler kavşak oluşumu (NMJ) kapsamlı aCC kullanılarak çalışılmıştır (ön köşe hücresi), RP2 (ham karides 2), ve RP5 motor nöronlar2,10. Örneğin, RP5 motor nöron bir doğmakta olan sinaptik kavşak formları, pre-sinaptik ve post-sinaptik filopodia11,12,13. Bu tür doğrudan hücresel iletişim NMJ oluşumunu başlatmak için hayati önem taşımaktadır. Periferik sinir dalları hakkında bildiklerimizin aksine, motor dendritlerin CNS içinde sinaptik bağlantıyı nasıl başlattığına dair bilgimiz hala ilkeldir.
Bu raporda, lipophilic boyaların mikropipet aracılı teslimatı ile embriyolarda motor nöronların retrograd etiketlemesağlayan bir teknik sokuldu. Bu teknik bize 38 motor nöronlar her 30 vücut duvarı kasları bir hemi segmentinde innerve izlemenizi sağlar 15 saat sonra yumurta yumurtlama (AEL)14. Bu tekniği kullanarak, grubumuz iyice çok sayıda kazanç-of-fonksiyon / fonksiyon kaybı alel15,16,17araştırdı. Biz son zamanlarda motor dendrite bağlantısı nın başlatılması sürücü moleküler mekanizmaları çözdük ve bir Dscam1-Dock-Pak etkileşimi aCC motor nöron dendrite outgrowth site tanımlar gösterdi17. Genel olarak, bu teknik vahşi tip veya mutant suşları herhangi bir embriyonik motor nöronların fenotipik analizi için uyarlanabilir, Drosophila sinir sisteminin fonksiyonel tasarımı içine yeni anlayışlar sağlamak için yeteneğimizi artırarak.

<table><tbody><tr><td>10x objektif lens</td><td>Nikon</td><td></td><td>Plan</td></tr><tr><td>40x suya daldırmalı lens</td><td>Nikon</td><td></td><td>NIR Apo Kılcal</td></tr><tr><td>boru</td><td>Frederick Haer & Co</td><td>27-31-1</td><td></td></tr><tr><td>Konfokal mikroskop</td><td>Andor</td><td>N/A</td><td>Dragonfly Eğirme diski konfokal ünite</td></tr><tr><td>Kapak camı</td><td>Corning</td><td></td><td>22x22 mm Kare #1</td></tr><tr><td>DiD</td><td>ThermoFisher</td><td>V22886</td><td></td></tr><tr><td>DiI</td><td>ThermoFisher</td><td>V22888</td><td></td></tr><tr><td>DiO</td><td>ThermoFisher</td><td>V22887</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon mikroskobu</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td>SMZ-U</td></tr><tr><td>Çift Taraflı Bant</td><td>Scotch</td><td>665</td><td></td></tr><tr><td>Dow Corning Yüksek Vakumlu Gres</td><td>Fisher Sci.</td><td>14-635-5D</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Yumurta toplama kafesi</td><td>FlyStuff</td><td>59-100</td><td></td></tr><tr><td>FemtoJet 5247</td><td>Eppendorf</td>, <td>FemtoJet 4i'yi durdurdu (Cat No. 5252000021)</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>Görüntü işleme yazılımı</td></tr><tr><td>Mikromanipülatör</td><td>Sutter</td><td>MP-225</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipet beveler</td><td>Sutter</td><td>BV-10-B</td><td></td></tr><tr><td>İğne çektirme</td><td>Narishige</td><td>PC-100</td><td></td></tr><tr><td>Nutri-Fly Üzüm Agar Tozu Premiks Paketleri</td><td>FlyStuff</td><td>47-102</td><td></td></tr><tr><td>Naylon Net</td><td>Filtre Kırlangıç</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit% 16 Çözelti, EM sınıfı</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>15710</td><td>Herhangi bir EM sınıfı</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Roche</td><td>11666789001</td><td>Sigmaaldrich'te satılır, kutulu 10x solüsyon</td></tr><tr><td>Photo-Flo 200</td><td>Kodak</td><td>146 4510</td><td>Islatıcı ajan</td></tr><tr><td>Dik floresan mikroskobu</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td>Eclipse Ci, LED ışık kaynağı ile</td></tr><tr><td>Vinil Elektrik</td><td>Bandı Scotch</td><td>6143</td><td></td></tr><tr><td>VWR Hücre Süzgeçleri</td><td>VWR</td><td>10199-659</td><td></td></tr><tr><td>Maya</td><td>FlyStuff</td><td>62-103</td><td>Aktif kuru maya (RED STAR)</td></tr></tbody></table>

lipophilic floresan boyalar kullanarak drosophila embriyonik motor nöronların retrograd İzleme

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

Biz Drosophilamotor nöronların retrograd etiketleme için bir teknik açıklar. Yağda çözünmüş lipophilic boya kullanıyoruz ve mikroenjektör tarafından embriyonik fileto hazırlığına küçük bir damlacık sıyoruz. Membranı damlacıkla temas eden her motor nöron daha sonra hızla etiketlenebilir. Bireysel motor nöronlar sürekli olarak etiketlenir ve ince yapısal detayların net bir şekilde görüntülenmesini sağlar. Lipophilic boyalar çeşitli renklerde gelir göz önüne alındığında, teknik de çok renkli etiketli komşu nöronlar almak için bir araç sağlar. Bu izleme tekniği bu nedenle Drosophilamotor nöron sisteminde nöronal morfogenez ve sinaptik bağlantı incelenmesi için yararlıdır.

ACC ve RP3 motor nöronların temsili bir görüntüsü Şekil 3C'de motor nöronların 15 saat AEL'de çok renkli etiketlemesini göstermek için gösterilmiştir. Dendritik morfolojileri embriyolar arasında büyük ölçüde değişmezdir. Anti-HRP antikorile elde edilen boyama deseni gri renkte gösterilmiştir. DiO veya DiD küçük bir damlacık kas NMJ yatırıldı 1 veya 6 /7, sırasıyla. Şekil 4, ilginin fenotipini nicel olarak ölçme yeteneğini göstermektedir. Biz vah...

Biz lipophilic floresan boyalar kullanarak Drosophila embriyonik motor nöronların retrograd izleme için bir yöntem açıklar.

Lipophilic Floresan Boyalar Kullanarak Drosophila Embriyonik Motor Nöronların Retrograd İzleme

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an ...

Bu protokolde açıklanan izleme tekniği nöronal morfogenezi çalışmamıza ve Drosophila'nın motor nöron sistemindeki bağlantıyı yakalamamıza yardımcı olur. Lipophilic boya hızla son derece yüksek yoğunluklu hücre zarının her parçasına yayılabilir. Bu nedenle protokolümüz etiketli bir nöronun yapılarını bulmaya etkin bir şekilde karar verir.Bir akson terminali enjeksiyon mikropipeti ile erişilebilir ise, bu teknik sinekler veya diğer organizmaların larva ve yetişkin aşamalarında herhangi bir nörona uygulanabilir. Numune üzerinde mikroenjektör hassas bir işlem izleme veya kullanma konusunda hiç deneyiminiz yoksa, zor layıcı olabilir. Embriyo anatomisi anlamak, diseksiyon veya dinjection yürütmek için araçların uygun porsiyonrehberlik ile yardımcı olacaktır.Başlamak için, hazırlamak ve düzen tüm embriyo toplama malzemeleri. 50 mililitrelik bir tüpü keserek ve kapakta bir delik açarak filtrasyon aparatını hazırlayın. Daha sonra tüp ve kapak arasında 100 mikrometre gözenekile bir örgü filtre ayarlayın.1.2 milimetre iç çapı ile aynı kılcal boru boya enjeksiyon mikropipet ve diseksiyon iğnesi hazırlayın. Bir mikropipet ile tüp çekin, puller 7% 170 volt maksimum çıkış uzunluğu yaklaşık 0,4 sa

retrograde-tracing-drosophila-embryonic-motor-neurons-using

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Biz sinek larvaları konfokal mikroskobu ile floresan boyalar kullanarak canlı bir roman Tersyüz doku hazırlanması Glia nöromüsküler sinapsların yapısal özellikleri nitelendirdi. Biz HRP için flüoresan primer antikor ile canlı nöron terminalleri etiketli ve floresan Dextrans perisynaptic alan görüntülendi.

Canlı görselleştirme Drosophila</emFloresan Boyalar> Glial nöromüsküler Kavşağı

Elektrofizyolojik Kayıt Drosophila Embriyo

Bu protokol, canlı diseksiyonu tartışıyor.

Drosophila Larvaların segmental Aksonlar içinde Sinaptik veziküller in vivo Görselleştirme

Bu video, bir floresan boya kullanarak channelrhodopsin eksprese eden Drosophila larvalarındaki nöromüsküler kavşaklarda sinaptik vezikül geri dönüşümünü incelemek için bir protokolü göstermektedir. Mavi ışık, channelrhodopsinleri aktive ederek kalsiyum akışına ve sinaptik vezikül ekzositozuna neden olur. Boya, nöronal membranlara entegre olur ve endositoz sırasında içselleştirilir, bu da floresanın artmasına neden olur. Daha fazla mavi ışık stimülasyonu, azaltılmış floresan ile gösterilen...

Drosophila Larvalarında Sinaptik Vezikül Geri Dönüşümü ve Floresan Boya Alımının Analizi

Kaynak: İnal, M. A. et. al., Lipofilik Floresan Boyalar Kullanılarak Drosophila Embriyonik Motor Nöronlarının Retrograd İzlemesi. J. Vis. Uzm.  (2020)Bu video, lipofilik boyalar kullanılarak Drosophila motor nöronlarının geriye dönük etiketleme yöntemini göstermektedir. Boya aksona girer, geriye doğru hareket eder ve nöronları yeşil olarak etiketleyerek morfolojilerinin ve projeksiyonlarının konfokal bir mikroskop altında ayrıntılı olarak görselleştirilmesini sağlar.

Floresan lipofilik boyalar kullanılarak Drosophila motor nöronlarının retrograd etiketlenmesi

Kaynak: Guan, W., et. al. Drosophila Yetişkin kütikülünden geçen bacak motor nöron aksonları. J. Vis. Exp. (2018) Bu video, Drosophila bacakların konfokal mikroskopi kullanılarak yeşil floresan protein eksprese eden motor nöronlarla görüntülenmesini göstermektedir. Bir lazer ve iki dedektör, GFP ve kütikül otofloresansını yakalar. Görüntüler, kanalları bölerek, otofloresan çıkararak ve bacak segmentindeki aksonları görselleştirmek için renkli bir kompozit görüntüde birleştirilerek işlenir.

Erişkin Bir Drosophila Bacağında Floresan İşaretli Motor Nöronların Görüntülenmesi

Bu çalışma, geç evre-16 Drosophila melanogaster embriyolarının motor nöron projeksiyonlarını görselleştirmek için standart bir immünohistokimya yöntemini ayrıntılarıyla anlatıyor . FasII antikoru ile lekelenmiş sabit embriyoların filleted hazırlığı, motor akson yol bulma ve sinirsel gelişim sırasında hedef tanıma için gerekli genlerin karakterize edilmesi için güçlü bir araç sağlar.

Embriyonik Motor Nöronlarının Aksonal Projeksiyon Paterninin Görselleştirilmesi<em&gt; Drosophila</em

Burada biz göstermek tek molekül fotoğraf-harekete geçirmek yerelleştirme mikroskobu canlı Drosophila melanogaster motor sinir terminal üzerinde yürütülen olabilir nasıl üçüncü larva biçim.

Vivo Tek molekül Drosophila Presynaptic Motor sinir Terminal izleme

Burada Drosophila Yetişkin bacaklar fiksasyon, montaj, görüntüleme ve sonrası görüntüleme adımları floresan bir protein ile aksonal hedefleme görselleştirmek için bir protokol açıklayın.

Drosophila bacak Motor Nöron aksonlar yetişkin kütikül aracılığıyla görselleştirmek

Erken Drosophila embriyosunda, birçok organel hareketlidir. Prensip olarak, belirli floresan problar aracılığıyla canlı olarak görüntülenebilirler, ancak yumurta kabuğu embriyoya doğrudan uygulamayı önler. Bu protokol, bu tür probların mikroenjeksiyon yoluyla nasıl tanıtılacağını ve daha sonra parçacık  görüntü velosimetrisi yoluyla toplu organel hareketinin nasıl analiz edileceğini açıklar.

Drosophila Embriyolarında Lipid İçeren Organellerin Sitoiskelete Bağımlı Ticaretinin Görselleştirilmesi

Burada, fotoreseptör membran proteinlerinin lokalizasyonu ve eGFP floresan kullanılarak Drosophila bileşik gözünde retinal dejenerasyonun değerlendirilmesi için non-invaziv yöntemler tanımlanmıştır.

eGFP Etiketli Proteinler Kullanarak Drosophila Fotoreseptör Hücrelerinde Membran Protein Kaçakçılığının İncelenmesi

Öğrenin lipofilik floresan boyalarla Drosophila embriyonik motor nöronlarının retrograd izleme yöntemini. Bu teknik, nöronal morfojenez ve bağlantıları incelemek için değerli bir araçtır.

Lipophilic Floresan Boyalar Kullanarak Drosophila Embriyonik Motor Nöronların Retrograd İzleme

Daha fazla video keşfet