Xenopus laevis'te Nöronal Öncül Karakterizasyonu için Floresan Kalsiyum Görüntüleme ve Daha Sonra Yerinde Hibridizasyon

Bu protokol, kalsiyum aktivite modellerini tek hücre düzeyindegen ekspresyonu ile ilişkilendirmek için kullanılabilir ve araştırmacıların bu iki özellik arasındaki ilişkiler hakkında yeni soruları araştırmalarını sağlar. Tipik olarak tüm dokuları inceleyen önceki yaklaşımların aksine, tekniğimiz tek hücre seviyesine yakınlayarak kalsiyum aktivitesi ve gen ekspresyonu arasındaki hücre özerk ilişkilerini değerlendirmemizi sağlar. UV yaklaşık 30 dakika boyunca iki 35 milimetrelik plastik Petri yemekleri ve bir 35 milimetre hücre kültür çanak sterilize ile başlayın.

Laminar akış kaputunda çalışırken, her iki 50 mililitrelik plastik konik tüpler, bir UV sterilize Petri çanak ve UV steril hücre kültür çanak her biri için iki milimolar kalsiyum çözeltisi 10 mililitre ekleyin. Diğer UV sterilize Petri kabına iki mililitre kalsiyum ve magnezyumsuz çözelti ekleyin ve iki adet 100 milimetrelik plastik Petri kabını ve bir adet 35 milimetrelik plastik Petri kabını gentamisin ile takviye edilmiş 0,1 X MMR ile doldurun. Sonra% 70 etanol ile 60 milimetrelik plastik Petri çanak doldurun.

Diseksiyondan hemen önce, 0,01 gram kolaj nöz B'yi bir kalsiyum çözeltisi tüpüne iyice karıştırın. Yeni bir 60 milimetrelik plastik Petri çanak için çözüm ekleyin ve istenilen gelişim aşamasında embriyoları tanımlamak için bir diseksiyon mikroskop kullanın. MMR artı gentamisin içeren bir 100 milimetrelik plaka içine en az altı uygun embriyo taşımak için steril bir transfer pipet kullanın.

Daha sonra bir embriyoyu tutma plakasından mmr artı gentamisin'in ikinci 100 milimetrelik plakasına taşıyın ve bu diseksiyon plakasını mikroskop altına yerleştirin. Embriyo stabilize etmek için künt forceps bir çift kullanarak, dikkatle ince forceps bir çift ile embriyo çevreleyen vitellin membran soyma. Tüm membran çıkarıldığında, dorsal ve ventral bölgeleri ayırmak için ön arka eksen boyunca embriyo çimdik ince çaksilikler kullanın.

Numuneyi dikkatlice diseksiyon plakasına geri aktarmadan önce, dorsal kısmı 1-2 dakika boyunca 60 milimetrelik kolaj çözeltisine aktarmak için yeni steril transfer pipetini kullanın. Diseksiyonu tamamlamak için, ektodermin nöral dokusundan kalan tüm endodermal ve mezodermal kontaminasyonu dikkatlice çıkarın ve eksplantı 35 milimetrelik kalsiyum çözeltisine nazikçe aktarın. Üç eksper daha toplandığında, ekspertiz ve hava suyu arabirimi arasında herhangi bir temasından kaçınmak için ekspekte olan 4 bitkiyi 35 milimetrelik kalsiyum ve magnezyumiçermeyen çözeltiye aktarmak için bir P1000 mikropipeti kullanın.

Daha sonra yavaşça çanak girdap böylece tüm eksteseks plakanın ortasında küme ve dokuların ayrışması için izin oda sıcaklığında bir saat boyunca örnekleri kuluçka. Bu kuluçka sırasında, gentamisin ile MMR ikinci çanak son iki embriyo transferi, ve bu örnekler in rahatsız edilmeden geliştirmek için izin çanak kapağı. Kuluçka sonunda, 35 milimetrelik hücre kültürü çanak altına mikro-kurallı coverslip eklemek için süper tutkal kullanın ve ayrışmış explants toplamak için bir P100 mikropipet kullanın.

Pipeti hücre kültürü çanağının yüzeyine yakın sığ bir açıda tutarak, pipet ucunu ızgaranın köşesine içe bakacak şekilde yerleştirin ve hücre süspansiyonunu ızgaralı alan boyunca sıkıca dışarı atlayın. İdeal olarak, hücreler sıkı, yoğun bir kümeye yerleşirler. Hücrelerin oda sıcaklığında bir saat boyunca tabağa yapışmasını bekleyin.

Hücreler yerleşirken, kardeş kontrol embriyolarının gelişim evresini belirleyin ve kaydedin. Kuluçka sonunda, numune kabını ışık korumalı bir konuma taşıyın ve yemeğin kenarından 100 mikrolitre çözelti aspire edin. Bu çözeltiyi, numune kabına tam hacmi iade etmeden önce, yeni hazırlanmış fluo-4 Pluronic F127 asit çözeltisinin yedi mikrolitresini yukarı ve aşağı pipetleme ile karıştırın.

Karıştırmak ve alüminyum folyo ile plaka kapsayacak şekilde yavaşça girdap. Oda sıcaklığında bir saat sonra, kalsiyum çözeltisi taze iki milimolar taze üç mililitre ile eksplant kültür çanak supernatant bir mililitre değiştirin. Sonra üç mililitre supernatant'ı üç mililitre taze kalsiyum çözeltisi ile iki kez daha değiştirin.

Ekspertiz içinde kalsiyum aktivitesi görüntüleme için, örnek plakayı ortam ışığına maruz kalmaktan korunan ters bir konfokal mikroskobun aşamasına yerleştirin ve sonraki görüntüleme seanslarında aynı görüş alanının bulunabilmesi için plakanın ön noktasını etiketlemek için bir işaret kullanın. Mikroskop altında bir örnek bulmak için 10 ve 20 kez hedefleri kullanın ve hücre yoğun ama hücrelerin kümelenmiş veya tek tek ayırt etmek zor değil uygun bir görüş alanı seçin. Mikroskop odağı, ızgara yönetimindeki kapak kaymasının görünür olması için, tanımlanabilir bir sayı gerektiğinde çerçevede olana kadar orijinal görüş alanını değiştirerek ayarlayın.

Odakta ızgara kurallı kapak kayması ve odaktaki hücrelerle seçilen görüş alanının parlak alan görüntüsü ile seçilen görüş alanının parlak bir alan görüntüsünü elde edin. Izgaralı kapak ve görüş alanının net bir görüntüsü olmadan, daha sonra oluşturacağınız balık görüntüleriyle hücrelerinizi birlikte kaydedemezsiniz. Sonra 488 nanometre lazer ile örnekleri aydınlatmak.

İki saatlik bir görüntü için, görüntüyü elde etmek için yapılandırmayı çalıştırmadan önce, görüntüleme yapılandırmasını sekiz saniye aralıkla 3,93 saniyelik bir taramayı zaman diliminde 901 kare kaydetmek için değiştirin. Görüntüleme tamamlandıktan sonra, mikroskop aşamasından plakayı çıkarın ve kuluçka başlangıcında kardeş kontrol embriyolarının gelişim evresini kaydetmek için oda sıcaklığında iki saatlik kuluçka için 1X MEMFA bir mililitre ile kültür supernatant değiştirin. Bir deneyde kaydedilen tüm hücrelerin izlerini içeren bileşik bir çizimin görselleştirilmesi, toplu veya popülasyon ölçümlerinin daha nüanslı davranış modellerini gizleme derecesini ortaya koymaktadır.

Tek tek hücrenin kaydedilmiş profilleri izole edildiğinde, nöral progenitor hücrelerinin düzensiz spiking aktivite karakteristik örnekleri açıkça tespit edilebilir. Bu karmaşıklığı ölçmek için, bir ani tanımlamak için farklı parametreler de dahil olmak üzere farklı veri analizi yöntemleri uygulanabilir. Eğer plakalar kabaca işlenirse veya yıkarlar floresan sırasında yerinde hibridizasyon sırasında çok güçlü bir şekilde yapılırsa, hücreler plaka yüzeylerinden çıkarılabilir ve bu da hücrelerin görüntüler arasında eşleştirilmesini imkansız hale getirir.

Bu bozulma görüş alanındaki hücrelerin yalnızca bazılarını etkiliyorsa, görüntüiçindeki bazı hücreleri algılamak ve atamak yine de mümkün olabilir. Ancak, hibritleştirmenin dikkatle gerçekleştirildiği ve birkaç hücrenin kaybolduğu veya görüntüler arasında yeniden konumlandırıldığı bir deneyden maksimum veri elde edilir. Nöral progenitor marker genlerinin ekspresyonu ile kalsiyum aktivitesini harmanlayan deneylerin sonuçları, belirli kalsiyum aktivitesi kalıpları ile nöro-verici fenotipler arasında çok sayıda ilişki olduğunu ortaya çıkarabilir.

Bu verilerle, araştırmacılar bu dinamik kalsiyum desenleri ve gen ekspresyonu ile ilişkileri basit başak sayma ile sınırlı olmak yerine daha karmaşık özellikleri inceleyebilirsiniz.