Name: Flag-Biotin Tandem Arınma Aracılı Çapraz Bağlama ve İmmünopits Ile Protein-RNA Etkileşimlerinin Transkripsiyon-Geniş Profilleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Öğrenin, Fbio CLIP-seq yöntemiyle memeli hücrelerde RNA bağlayıcı proteinlerin ve RNA hedeflerinin geniş profillemesini. Bu izotop içermeyen yöntem, SDS-PAGE olmadan doğrudan protein bağlı RNA'ları verimli şekilde tespit eder.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Hibe desteği Çin Ulusal Temel Araştırma Programı (2017YFA0504204, 2018YFA0107604), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (31630095) ve Tsinghua Üniversitesi Yaşam Bilimleri Merkezi'nden destek almaktadır.

1. Hücre hattı yapımı
<ol><li>Bir PiggyBac vektör pPiggyBac-FLAG-bio-[cDNA ilgi]-(Hygromycin-dirençli) plazmid içine ilgi gen klon bir FLAG-biotin epitop13taşıyan,21 bir FLAG-biotin etiketi rbp erimiş ifade etmek(FBRBP).</li>
	<li>BirA enzimini ifade eden bir hücre hattına pBase vektörü ile vektörü ifade eden FBRBP'yi Cotransfect22. NOT: Bu çalışmada, FBRBP geni entegre bir BirA ekspresyon vektörü21taşıyan fare embriyonik kök hücrelerine (mESCs) geçirilmiştir. Alternatif olarak, FBRBP ifade vektörü pBase ve pPiggyBac-BirA-V5 ile birlikte hücrelere cotransfected olabilir.</li>
	<li>MESC'deki hücreleri jelatinize yemeklerde büyütün ve 37 °C'de %5 CO2'de mES kültür ortamında(Malzeme Tablosu)koruyun. Higromisin b (100 μg/mL) ile transfected hücreleri seçin 1 hafta.</li>
	<li>İlaç seçiminden sonra, SDS yükleme tamponu(Tablo 1)ile hasat hücreleri ve sırasıyla flag antikor ve streptavidin-HRP ile genin etiketlenmesi ve ekspresyonu onaylamak için Batı leke23 kullanın.</li>
</ol>2. Çapraz bağlama
<ol><li>Plaka ~3 x 106 mES hücreleri 10 cm plaka 1 gün önce böylece hücreler hasat edildiğinde % 70−90 biraraya büyür (~ 5−10 milyon hücre örnek başına).</li>
	<li>Ortamı vakumla çıkarın. Hücreleri oda sıcaklığında 2 dakika (RT) için %0,25 tripsin-EDTA ile tedavi edin ve trypsini 4 mL taze mESC ortamı ile söndürün. Hücreleri 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. 4 °C'de 3 dk 3 00 x g'da hücreleri santrifüj le aşağı çevirin ve süpernatantı çıkarın.</li>
	<li>4 mL soğuk PBS ile hücreleri askıya alın ve çapraz bağlama için hücreleri 10 cm plakaya geri plakalayın. Hücreleri 254 nm UV ışığı ile radyasyonla birbirine bağla (UV çapraz bağlantıcihazını 400 mJ/cm2parametreye göre ayarlayın). NOT: Hücre monolayers için, hücreler trypsin tedavisinden önce doğrudan plaka üzerinde UV ışığı ile çapraz bağlantılı olabilir.</li>
	<li>Çapraz bağlı hücreleri 15 mL'lik bir tüpe aktarın. 4 °C'de 3 dk 3 00 x g'da santrifüj ile aşağı doğru çevirin ve süpernatantı çıkarın. NOT: Çapraz bağlı hücre peleti kullanıma kadar -80 °C'de saklanabilir.</li>
</ol>3. Hücre lisat hazırlığı
<ol><li>1 mM DTT, 1 mM PMSF, 1/500 proteaz inhibitörü kokteyli ve 400 U/mL RNase inhibitörü ile taze olarak desteklenen 500 μL yıkama tamponu A(Tablo 1)içeren hücreleri lyse. Hücreleri 1,5 mL'lik bir RNase içermeyen tüpe aktarın. Hücreleri 30−60 dk boyunca bir rotor üzerinde 4 °C'de hafif bir dönüşle kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>10 dakika boyunca 37 °C'de 30 μL DNase I ile lysate'yi tedavi edin. 0,5 M EDTA 4 μL ekleyerek reaksiyonu durdurun. Çözünmez peleti 4 °C'de 20 dakika boyunca 12.000 x g aşağı doğru çevirin ve supernatant'ı 1,5 mL'lik yeni bir önceden soğutulmuş tüpe aktarın. NOT: Hemen kullanım için, buz üzerinde tutun. Süpernatant hemen kullanılmayacaksa, kullanıma kadar -80 °C'de saklayın.</li>
</ol>4. BAYRAK boncuk hazırlama
<ol><li>Taze 1,5 mL'lik bir tüpe numune başına 40 μL bulamaç FLAG boncukekleyin.</li>
	<li>Boncukları 0,5 mL buz gibi yıkama tamponu A ile hızlıca yıkayın ve 4 °C'de 2 dakika boyunca 3.000 x g aşağı doğru döndürün.</li>
	<li>Adım 4.2'yi bir kez tekrarlayın. 4 °C'de 2 dk için 3.000 x g ile boncukaşağı çevirin. Arabelleği dar uçlu pipet ucuyla dikkatlice çıkarın. Boncukları çıkarmaktan kaçının.</li>
</ol>5. İmmünyağış
<ol><li>Hücre lisatını 3.2.adımdan önceden dengelendirilmiş BAYRAK boncuklarına aktarın. Tüm numuneleri 4 °C'de bir silindir çalkalayıcıüzerinde hafifçe döndürün. BAYRAK boncuklarını 2−4 saat veya bir gecede lysate ile kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>3.000 x g 2 dakika boncuk santrifüj ve supernatant kaldırın.</li>
	<li>Boncukları 0,5 mL önceden soğutulmuş yıkama tamponu A'yı 4 °C'de bir rotatörde 5 dakika kuluçka ya da 2 dk için 3.000 x g ile çevirin ve süpernatantı çıkarın. Yıkama 1x tekrarlayın.</li>
	<li>Adım 5.3'te açıklandığı gibi 2x yıkamayı önceden soğutulmuş yıkama tamponu B 0,5 mL ile tekrarlayın(Tablo 1).</li>
</ol>6. 3x BAYRAK peptid ile elüsyon
<ol><li>1 mg 3x FLAG peptidini 5 mL yıkama tamponu A ile 200 ng/mL'lik son konsantrasyona eriterek 3x FLAG elüsyonu çözeltisini hazırlayın.</li>
	<li>2 dk için 3.000 x g ile adım 5.4 bayrak boncuk aşağı spin. Supernatant dikkatle çıkarın. Supernatant çoğu dar bir uç pipet ucu kullanılarak kaldırılır emin olun.</li>
	<li>Her numuneye 200 μL 3x FLAG elüsasyon çözeltisi ekleyin. Numuneleri 4 °C'de 30 dk hafif bir dönüşle kuluçkaya yatırın. 3.000 x g2 dakika için BAYRAK boncuk aşağı spin . Supernatants'ı taze tüplere aktarın.</li>
	<li>6.2 ve 6.3 adımlarında açıklandığı gibi elütion 2x'i tekrarlayın ve eluentleri bir araya getirin. FLAG-IP'nin verimliliğini kontrol etmek için batı leke analizi veya gümüş boyama için elüentlerin %5'inden tasarruf edin.</li>
</ol>7. Streptavidin boncuk hazırlama
<ol><li>Her numune için 50 μL streptavidin boncuk bulamacı hazırlayın. 30 s için bir manyetik stand ile boncuk toplamak ve bir pipet ucu ile supernatant kaldırın.</li>
	<li>Boncukları 0,5 mL buz gibi yıkama tamponu A ile hızlıbir şekilde yıkayın ve 30 s'lik manyetik standla boncukları toplayın.</li>
	<li>Yıkama 1x tekrarlayın. Yıkamadan sonra supernatant çıkarın.</li>
</ol>8. Biotin afinite arınma
<ol><li>Havuzlu eluentleri adım 6.4'ten streptavidin boncuklarına 7.3 adımdan aktarın ve numuneleri 4 °C'de 1−3 saat veya bir gece boyunca hafifçe döndürün.</li>
	<li>30 s için bir manyetik stand ile boncuk toplamak ve supernatant kaldırın. Boncukları 5 dakika boyunca RT'de hafif çetreleyerek 500 μL yıkama tamponc(Tablo 1)ile yıkayın.</li>
	<li>Manyetik standı ile boncuk toplamak ve supernatant kaldırın. 5 dakika BOYUNCA RT'de dönerek boncukları 500 μL yıkama tamponu D(Tablo 1)ile yıkayın.</li>
	<li>Manyetik standı ile boncuk toplamak ve supernatant kaldırın. Boncukları 500 μL buz gibi PNK tamponuyla hızlıca yıkayın (Tablo 1).</li>
</ol>9. Kısmi RNA sindirimi
<ol><li>MNase reaksiyon arabelleği ile MNase 105kat seyreltme olun (Tablo 1). Her numuneye 100 μL MNase çözeltisi ekleyin. 10 dakika boyunca 1.200 rpm (5 s run, 30 s stop) olarak ayarlanmış bir termal karıştırıcı ile 37 °C'deki boncukları girdaplayın, 30 s'lik manyetik standla boncukları toplayın ve süpernatantı çıkarın. NOT: MNase konsantrasyonu farklı RNA bağlayıcı proteinler için optimize edilmelidir. RNA'ları 30−50 nt parçalara sığdırabilen (son kitaplığın ekleme boyutuna göre belirlenir) MNase konsantrasyonu en uygun uymaktadır.</li>
	<li>Boncukları 2x'i 500 μL buz gibi PNK+EGTA tamponuile hızlıca yıkayın (Tablo 1). Bir manyetik stand ile boncuk toplamak ve her yıkama adımı arasında supernatant kaldırın.</li>
	<li>Boncukları 2x 500 μL yıkama tamponcuğu C ile 5 dakika boyunca RT'de hafif çetren olarak yıkayın. Daha sonra boncukları 500 μL buz gibi PNK tamponuyla hızlıca yıkayın.</li>
</ol>10. RNA'nın fosforilasyonunun bozulması
<ol><li>Bir buzağı bağırsağı fosfataz (CIP) reaksiyon karışımı ile 8 μL 10x CIP tampon(Tablo Malzemeler), 3 μL CIP enzimve 69 ° L su yapın. Reaksiyon başına toplam hacim 80 μL'dir.</li>
	<li>Bir manyetik stand ile boncuk toplamak ve tampon kaldırın. Boncuklara CIP reaksiyon karışımını ekleyin. 10 dk için 1.200 rpm (5 s run, 30 s stop) ayarlanmış bir termal karıştırıcı ile 37 °C'de boncuk girdap.</li>
	<li>Boncukları 500 μL buz gibi PNK+EGTA tamponuyla hızlıca yıkayın. Boncukları 500 μL buz gibi PNK tamponuyla hızlıca yıkayın.</li>
</ol>11. 3' bağlayıcı ligasyonu
<ol><li>4 μL 20 μM 3' linker, 4 μL 10x T4 RNA ligaz tamponu, 4 μL %50 PEG8000, 2 μL T4 RNA ligase 2 (kesilmiş) ve 26 μL su ile 3' linker karışımı yapın. Reaksiyon başına toplam hacim 40 μL'dir.</li>
	<li>Bir manyetik stand ile adım 10.3 boncuk toplamak ve tampon kaldırın. Boncuklara 3' linker ligation karışımından 40 μL ekleyin. 16 °C'de 16 °C'de 1.200 rpm (5 s run, 30 s stop) olarak ayarlanmış bir termal mikser ile 3 saat veya bir gecede boncukları girdap.</li>
	<li>Boncukları 500 μL buz gibi PNK+EGTA tamponuyla hızlıca yıkayın. Boncukları 500 μL buz gibi PNK tamponuyla hızlıca yıkayın.</li>
</ol>12. PNK tedavisi
<ol><li>4 μL 10x PNK tamponu, 2 μL T4 PNK enzimi, 1 0 mM ATP ve 33 μL su ile PNK karışımı yapın. Reaksiyon başına toplam hacim 40 μL'dir.</li>
	<li>Bir manyetik stand ile boncuk toplamak ve tampon kaldırın. Boncuklara 40 μL PNK karışımı ekleyin. 10 dk için 1.200 rpm (5 s run, 30 s stop) ayarlanmış bir termal karıştırıcı ile 37 °C'de boncukları yavaşça girdap.</li>
	<li>Boncukları 500 μL buz gibi PNK+EGTA tamponu ile hızlıca yıkayın.</li>
	<li>Boncukları 500 μL buz gibi PNK tamponu yla hızlıca yıkayın. İmmünoenjin verimliliğini doğrulamak için boncukların %5'ini Batı veya gümüş boyama analizine ayırın.</li>
</ol>13. RNA yalıtımı
<ol><li>Bir manyetik stand ile adım 12.4 boncuk toplamak ve tampon kaldırın. Proteinaz K sindirim tampon200 μL ekleyin (Tablo 1). 37 °C'de 30 dk boncukları 1.200 rpm (5 s run, 30 s stop) olarak ayarlanmış bir termal mikser ile girdap. Manyetik boncukları izole edin ve deney için süpernatant'ı alın.</li>
	<li>Adım 13.1'den itibaren supernatant'a 400 μL RNA izolasyon reaktifi(Malzeme Tablosu)ekleyin, iyice karıştırın ve 5 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın. Kloroform 80 μL ekleyin ve iyice karıştırın ve sonra 5 dakika buz üzerinde kuluçka. 10 dk 4 °C için 12.000 x g ile aşağı doğru çevirin. NOT: Bu adım kimyasal bir başlık içinde yapılmalıdır.</li>
	<li>Supernatant alın (~ 500 μL) ve izopropanol iki cilt ekleyin:etanol karışımı (1:1), 3 M sodyum asetat 1/10 hacmi (pH = 5.5), ve glikojen 1 μL. -20 °C'de 2 saat dondurun. 20 dk için 12.000 x g ile 4 °C'de santrifüj.</li>
	<li>Pelet 2x buz gibi% 70 etanol ile yıkayın. 5 dk için 12.000 x g ile 4 °C'de pelet aşağı çevirin. Supernatant çıkarın ve pelet kuru. RNA'ları 5 μL'lik RNase içermeyen H2O'da çözün.</li>
</ol>14. 5' RNA bağlayıcı ligasyonu
<ol><li>1 μL 10x T4 RNA ligaz tamponu, 0,5 μL BSA (1 μg/μL), 1 00 mM ATP, 1 μL RNa sinhibitör ve 0,5 μL T4 RNA ligaz ile 5'l'lik RNA ligasyon karışımı yapın. Reaksiyon başına toplam hacim 4 μL'dir.</li>
	<li>RNA'ya 1μL 5' 20 μM RNA bağlantı sını 13.4 adımdan ekleyin, 70 °C'de 2 dakika ısıtarak RNA'yı dennature yapın ve hemen buz üzerinde soğuyun.</li>
	<li>Adım 14.2'den Itibaren RNA'ya 5' RNA ligasyon karışımını ekleyin. Bir gecede 16 °C'de kuluçkaya yatırın.</li>
</ol>15. Ters transkripsiyon
<ol><li>Bölüm 13'te açıklandığı gibi RNA'ları arındırın ve RNA'yı 11,5 μL RNase içermeyen su ile eritin.</li>
	<li>Saflaştırılmış RNA'ya 1 μL 10 μM ters transkripsiyon astarı, 70 °C'de 2 dk ısı ekleyin ve hemen buz üzerinde soğuyun.</li>
	<li>4 μL 5x ters transkripsiyon tamponu, 1 0 mM dNTPs 1 μL, 0,1 M DTT 1L, RNase inhibitörü 1 μL ve 0,5 μL ters transkripsiyon(Malzeme Tablosu)ile ters transkripsiyon karışımı yapın. Reaksiyon başına toplam hacim 7.5 μL'dir.</li>
	<li>RNA'ya 7,5 μL ters transkripsiyon karışımı ekleyin, 50 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın ve 10 dk boyunca 70 °C'de kuluçka ya da reaksiyonu durdurun. 4 °C'de bırakın.</li>
</ol>16. PCR amplifikasyon
<ol><li>15 μL 2x PCR ana karışımı(Malzeme Tablosu),15.4 adımdan 5 μL cDNA, 10 μM ileri astar 1(Tablo 2), 0,6 μL 10 μM ters astar 1 (Tablo 2) ve 8.8 μL H2O ile PCR amplifikasyon karışımı yapın. Toplam hacim 30 μL'dir.</li>
	<li>CDNA'yı aşağıdaki ayarlarla yükseltin: 98 °C 30 s, 98 °C 10 s, 60 °C 30 s, 72 °C 30 s (15−20 devir için 2−4 tekrar adımları), 72 °C 2 dk ve 4 °C'de tutun. PCR ürününü %2−3 agarose jel üzerinde çalıştırın. ~100−150 bp'nin DNA'sını kesin, jel ekstraksiyon kiti(Malzeme Tablosu)ile DNA ayıklayın ve 20 μL su ile DNA'yı eleyin.</li>
	<li>Saflaştırılmış PCR ürününün 3 μL'sini alın, ileri astar 2(Tablo 2) ve ters astar 2 (indeks astarı) ile yükseltin; Tablo 2) dizin dizilerini tanıtmak için beş döngü için adım 16.2'de açıklandığı gibi. 16.2 adımda açıklandığı gibi PCR ürün arındırın.</li>
	<li>Kitaplığı yüksek iş dizisi sıralama platformuyla sırala.</li>
</ol>17. Biyoinformatik analizi
<ol><li>Daha önce açıklandığı gibi ticari programları kullanarak veri analizi gerçekleştirin8.</li>
</ol>

<ol><li>Kim, B., Jeong, K., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+Mapping+of+DROSHA+Cleavage+Sites+on+Primary+MicroRNAs+and+Noncanonical+Substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide Mapping of DROSHA Cleavage Sites on Primary MicroRNAs and Noncanonical Substrates.</a> Molecular Cell. 66 (2), 258-269 (2017).</li>
<li>Guallar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-dependent+chromatin+targeting+of+TET2+for+endogenous+retrovirus+control+in+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">RNA-dependent chromatin targeting of TET2 for endogenous retrovirus control in pluripotent stem cells.</a> Nature Genetics. 50 (3), 443-451 (2018).</li>
<li>Holmqvist, E., Li, L., Bischler, T., Barquist, L., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Maps+of+ProQ+Binding+In+Vivo+Reveal+Target+Recognition+via+RNA+Structure+and+Stability+Control+at+mRNA+3%27+Ends%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Global Maps of ProQ Binding In Vivo Reveal Target Recognition via RNA Structure and Stability Control at mRNA 3' Ends.</a> Molecular Cell. 70 (5), 971-982 (2018).</li>
<li>Wei, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RBFox2+Binds+Nascent+RNA+to+Globally+Regulate+Polycomb+Complex+2+Targeting+in+Mammalian+Genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">RBFox2 Binds Nascent RNA to Globally Regulate Polycomb Complex 2 Targeting in Mammalian Genomes.</a> Molecular Cell. 62 (6), 875-889 (2016).</li>
<li>Kim, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+PARP-1+by+snoRNAs+Controls+Ribosome+Biogenesis+and+Cell+Growth+via+the+RNA+Helicase+DDX21%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Activation of PARP-1 by snoRNAs Controls Ribosome Biogenesis and Cell Growth via the RNA Helicase DDX21.</a> Molecular Cell. 75 (6), 1270-1285 (2019).</li>
<li>Yao, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nascent+Pre-rRNA+Sorting+via+Phase+Separation+Drives+the+Assembly+of+Dense+Fibrillar+Components+in+the+Human+Nucleolus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Nascent Pre-rRNA Sorting via Phase Separation Drives the Assembly of Dense Fibrillar Components in the Human Nucleolus.</a> Molecular Cell. 76 (5), 767-783 (2019).</li>
<li>Licatalosi, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HITS-CLIP+yields+genome-wide+insights+into+brain+alternative+RNA+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing.</a> Nature. 456 (7221), 464-469 (2008).</li>
<li>Moore, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+Argonaute+and+conventional+RNA-binding+protein+interactions+with+RNA+at+single-nucleotide+resolution+using+HITS-CLIP+and+CIMS+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Mapping Argonaute and conventional RNA-binding protein interactions with RNA at single-nucleotide resolution using HITS-CLIP and CIMS analysis.</a> Nature Protocols. 9 (2), 263-293 (2014).</li>
<li>Konig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iCLIP--transcriptome-wide+mapping+of+protein-RNA+interactions+with+individual+nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">iCLIP--transcriptome-wide mapping of protein-RNA interactions with individual nucleotide resolution.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), e2638(2011).</li>
<li>Zarnegar, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((irCLIP+platform+for+efficient+characterization+of+protein-RNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">irCLIP platform for efficient characterization of protein-RNA interactions.</a> Nature Methods. 13 (6), 489-492 (2016).</li>
<li>Van Nostrand, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+transcriptome-wide+discovery+of+RNA-binding+protein+binding+sites+with+enhanced+CLIP+%28eCLIP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP).</a> Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).</li>
<li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAR-CliP--a+method+to+identify+transcriptome-wide+the+binding+sites+of+RNA+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">PAR-CliP--a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins.</a> Journal of Visualized Experiments. (41), e2034(2010).</li>
<li>de Boer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+biotinylation+and+single-step+purification+of+tagged+transcription+factors+in+mammalian+cells+and+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Efficient biotinylation and single-step purification of tagged transcription factors in mammalian cells and transgenic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7480-7485 (2003).</li>
<li>Bi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Targets+Ribogenesis+Factor+WDR43+to+Chromatin+for+Transcription+and+Pluripotency+Control%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">RNA Targets Ribogenesis Factor WDR43 to Chromatin for Transcription and Pluripotency Control.</a> Molecular Cell. 75 (1), 102-116 (2019).</li>
<li>Heo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TUT4+in+concert+with+Lin28+suppresses+microRNA+biogenesis+through+pre-microRNA+uridylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TUT4 in concert with Lin28 suppresses microRNA biogenesis through pre-microRNA uridylation.</a> Cell. 138 (4), 696-708 (2009).</li>
<li>Cho, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LIN28A+Is+a+Suppressor+of+ER-Associated+Translation+in+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">LIN28A Is a Suppressor of ER-Associated Translation in Embryonic Stem Cells.</a> Cell. 151 (4), 765-777 (2012).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).</li>
<li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+specific+roles+for+the+ribosome+biogenesis+factor+Wdr43+in+zebrafish+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Tissue specific roles for the ribosome biogenesis factor Wdr43 in zebrafish development.</a> PLoS Genetics. 10 (1), 1004074(2014).</li>
<li>Wilbert, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LIN28+binds+messenger+RNAs+at+GGAGA+motifs+and+regulates+splicing+factor+abundance%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">LIN28 binds messenger RNAs at GGAGA motifs and regulates splicing factor abundance.</a> Molecular Cell. 48 (2), 195-206 (2012).</li>
<li>Hunziker, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UtpA+and+UtpB+chaperone+nascent+pre-ribosomal+RNA+and+U3+snoRNA+to+initiate+eukaryotic+ribosome+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">UtpA and UtpB chaperone nascent pre-ribosomal RNA and U3 snoRNA to initiate eukaryotic ribosome assembly.</a> Nature Communications. 7, 12090(2016).</li>
<li>Kim, J., Cantor, A. B., Orkin, S. H., Wang, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+in+vivo+biotinylation+to+study+protein-protein+and+protein-DNA+interactions+in+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Use of in vivo biotinylation to study protein-protein and protein-DNA interactions in mouse embryonic stem cells.</a> Nature Protocols. 4 (4), 506-517 (2009).</li>
<li>Li, Z., Michael, I. P., Zhou, D., Nagy, A., Rini, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+piggyBac+transposon-based+mammalian+cell+expression+system+for+inducible+protein+production%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Simple piggyBac transposon-based mammalian cell expression system for inducible protein production.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), 5004-5009 (2013).</li>
<li>Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Western+Blot%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The Western Blot.</a> Methods in Molecular Biology. 1318, 87-96 (2015).</li>
<li>Aktas, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DHX9+suppresses+RNA+processing+defects+originating+from+the+Alu+invasion+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">DHX9 suppresses RNA processing defects originating from the Alu invasion of the human genome.</a> Nature. 544 (7648), 115-119 (2017).</li>
<li>Xu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Crosslinking+Immunoprecipitation+%28eCLIP%29+Method+for+Efficient+Identification+of+Protein-bound+RNA+in+Mouse+Testis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Enhanced Crosslinking Immunoprecipitation (eCLIP) Method for Efficient Identification of Protein-bound RNA in Mouse Testis.</a> Journal of Visualized Experiments. (147), e59681(2019).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Burada, protein-RNA komplekslerinin tandem arınmasını gerçekleştirmek için FLAG-biotin çift etiketleme sisteminden yararlanarak FbioCLIP-seq adı verilen değiştirilmiş bir CLIP-seq yöntemini tanıtıyoruz. FLAG-biotin çift etiketleme sistemi protein-protein ve protein-DNA etkileşimleri13,21belirlenmesinde güçlü olduğu gösterilmiştir. Burada, bu sistemin proteinlerle etkileşime girerken RNA'ları tanımlamada yüksek özgüllüğünü ve rahatlığını gösteriyoruz. T...

RNA ve RNA bağlayıcı proteinler (RRB' ler) birleştirme, çeviri, ribozom biyogenez, epigenetik regülasyon ve hücre kaderi geçişi1,2,3,4,5,6gibi çeşitli hücresel süreçleri kontrol eder. Bu süreçlerin hassas mekanizmaları RNA'ların ve RRB'lerin eşsiz mekansal ve zamansal düzenlemesine bağlıdır. Bu nedenle, rna regülasyonunu moleküler düzeyde anlama yolunda önemli bir adım, RP'lerin bağlayıcı bölgeleri hakkındaki konumsal bilgileri ortaya çıkarmaktır.
Bir strateji çapraz bağlama ve immünoprepitasyon olarak anılacaktır (CLIP-seq)uvçapraz bağlantı ile protein-RNA etkileşimleri yakalamak için geliştirilmiştir ilgi protein immünopreside ani 7. Metodolojinin en önemli özelliği, Bir RNA bağlayıcı protein ve doğrudan bağlı RNA molekülleri arasında kovalent çapraz bağlantıların indüksiyonudur (~ 1 şiçinde) UV ışınlama8. RBP ayak izleri, genellikle 30−60 nt çözünürlüğe sahip CLIP etiket kümeleme ve tepe arama ile belirlenebilir. Alternatif olarak, CLIP'in ters transkripsiyon adımı, tek nükleotid çözünürlükte RNA'larda protein bağlama sitelerinin tanımlanmasına olanak tanıyan çapraz bağlama sitelerine indels (eklemeler veya silmeler) veya ikamelere yol açabilir. Novoalign ve CIMS gibi boru hatları CLIP-seq8yüksek iş bölümü sekanslama sonuçlarının analizi için geliştirilmiştir. Çeşitli modifiye CLIP-seq yöntemleri de önerilmiştir, bireysel nükleotit çözünürlük çapraz bağlama ve immünoprepitasyon dahil (iCLIP), gelişmiş CLIP (eCLIP), irCLIP, ve fotoaktipabl ribonükleoside gelişmiş çapraz bağlama ve immünopredi (PAR-CLIP)9,10,11,12.
RRB'lerin çalışmasında geleneksel CLIP-seq yöntemlerinin yaygın kullanımına rağmen, CLIP yöntemlerinin çeşitli dezavantajları vardır. İlk olarak, sıkıcı denatüre jel elektroforez ve membran transferi prosedürü bilgi kaybına yol açabilir, ve sınırlı dizi karmaşıklığına neden. İkinci olarak, proteine özgü antikor bazlı CLIP yöntemi tek bir hedef protein yerine bir protein kompleksini aşağı çekebilir, bu da saflaştırılmış RP'lerden yanlış pozitif protein-RNA etkileşimlerine yol açabilir. Dördüncü olarak, geleneksel CLIP yöntemi proteine bağlı RNA'ları etiketlemek için radiolabeled ATP gerektirir.
Streptavidin biyotinylated proteinlere yüksek yakınlık belirli proteinler veya protein kompleksleri arındırmak için çok güçlü bir yaklaşım yapar. Memeli hücrelerinde ektonik olarak ifade edilen bakteriyel BirA biotin ligaz ile yapay peptit dizilimini taşıyan proteinlerin verimli biyotinylation vivo biotin arıtma gerçekleştirmek için etkili bir strateji yapar13. Biz modifiye CLIP-seq yöntemi FbioCLIP-seq (FLAG-Biotin aracılı Cross-lmürekkep ve benmmuno p recipitation yüksek iş itme takip) FLAG-biotin etiket tandem arıtma14 kullanarak geliştirdi (Şekil 1). Tandem arınma ve sıkı yıkama koşulları sayesinde, hemen hemen tüm etkileşen RRB'ler çıkarılır (Şekil 2). Sıkı yıkama koşulları, emek yoğun ve teknik açıdan zorlu olan SDS-PAGE ve membran transferinin de atlatılmasına olanak sağlar. Ve eCLIP ve irCLIP benzer, FbioCLIP-seq yöntemi izotop-free. Jel çalışan ve transfer adımları atlayarak bilgi kaybını önler, otantik protein-RNA etkileşimleri bozulmadan tutar ve kütüphane karmaşıklığını artırır. Ayrıca, etiketleme sisteminin yüksek verimlilik yüksek kaliteli antikorlar mevcut olmadan RbPs için iyi bir seçim yapar.
Burada memeli hücreleri için FbioCLIP-seq protokolü adım adım açıklamasını salıyoruz. Kısaca, hücreler çapraz bağlı 254 nm UV, hücre lysis ve FLAG immünopresipitasyon takip (FLAG-IP). Daha sonra, protein-RNA kompleksleri biotin afinite yakalama ile daha da saflaştırılır ve RNA'lar MNase ile kısmi sindirim ile parçalanır. Daha sonra proteine bağlı RNA fosforilasyona ve 3' linker ile bağlanır. RNA PNK ile fosforlandırıldıktan ve proteinaz K sindirimi ile eluted sonra 5' RNA bağlayıcı eklenir. Ters transkripsiyondan sonra, proteine bağlı RNA sinyalleri PCR ile yükseltilir ve agarose jel saflaştırma ile saflaştırılır. Fbio CLIP-seq sonucunu örneklemek için iki RRB seçildi. LIN28 mikroRNA olgunlaşma, protein çevirisi ve hücre yeniden programlama15,16,17dahil iyi karakterize RNA bağlayıcı proteindir. WDR43 ribozom biyogenez, ökaryotik transkripsiyon ve embriyonik kök hücre pluripotency kontrol koordine etmek için düşünülen bir WD40 etki alanı içeren protein14,18. CLIP-seq ile LIN28 için daha önce bildirilen sonuçlarla tutarlı olarak, FbioCLIP-seq mikroRNA mir-let7g ve mRNA'larda "GGAG" motifleri üzerinde LIN28'in bağlayıcı alanlarını ortaya çıkarır16,19 (Şekil 3). WDR43 FbioCLIP-seq ayrıca WDR43'ün bağlayıcı tercihini 5' harici transkripsiyonlu spacers (5'-ETS) öncesi rRNA'lar20 (Şekil 4)ile belirlemİştir. Bu sonuçlar FbioCLIP-seq yönteminin güvenilirliğini doğrular.

<table><tbody><tr><td>< güçlü > Ekipman< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>UV çapraz bağlayıcı</td><td>UVP</td><td>HL-2000 HybrilLinker</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > Afinite Arıtma Boncukları< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>BAYRAK ÖNLEYİCİ boncuklar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2220</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin boncuk</td><td>Invitrogen</td><td>112.06D</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><güçlü >Reaktifler< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Gibco</td><td>70013032</td><td></td></tr><tr><td>3 M NaOAc</td><td>Ambion</td><td>AM9740</td><td></td></tr><tr><td>3 x FLAG peptit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4799</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6559</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür (CaCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>CIP</td><td>NEB</td><td>M0290S</td><td>CIP tamponu aynı pakettedir.</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Jel arıtma kiti</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Glikojen</td><td>Ambion</td><td>AM9510</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum klorür (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>449172</td><td></td></tr><tr><td>MNase</td><td>NEB</td><td>M0247S</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Amresco</td><td>M158-500ML</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10837091001</td><td></td></tr><tr><td>Porteinase K</td><td>TAKARA</td><td>9033</td><td></td></tr><tr><td>Proteaz inhibitör kokteyli</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>Q5 Yüksek Sadakatli 2X Master Mix</td><td>NEB</td><td>0492S</td><td></td></tr><tr><td>ters trancriptase ( SupperScriptIII)</td><td>İnvitrojen</td><td>18080093</td><td></td></tr><tr><td>RNA izolasyon reaktifi (Trizol)</td><td>İnvitrojen</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>RNaz İnhibitörü</td><td>ThermoFisher</td><td>EO0381</td><td></td></tr><tr><td>RNaseOUT</td><td>Invitrogen</td><td>10777019</td><td></td></tr><tr><td>RQ1 Dnase</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1614363</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum deoksikolat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>T4 PNK</td><td>NEB</td><td>M0201S</td><td>PNK tamponu aynı pakettedir.</td></tr><tr><td>T4 RNA ligaları</td>, <td>ThermoFisher</td><td>EL0021</td>, <td>T4 RNA ligaz tamponu ve BSA aynı paket içindedir.</td></tr><tr><td>T4 RNA ligaz2, kesik</td><td>NEB</td><td>M0242S</td><td>T4 RNA ligaz tamponu ve %50 PEG aynı pakettedir.</td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA</td><td>ThermoFisher</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>Üre</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208884</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><güçlü>mESC kültür ortamı< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM (% 80)</td><td>Gibco</td><td>11965126</td><td></td></tr><tr><td>2-Merkaptoetanol</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>FCS (% 15)</td><td>Hyclone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glutamax (%1)</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>LIF</td><td></td><td></td><td>saflaştırılmış rekombinant protein; 10.000 kat seyreltme</td></tr><tr><td>NEAA (%1)</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Nükleosit karışımı (%1)</td><td>Millipore</td><td>ES-008-D</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin (%1)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA jel ekstraksiyon kiti</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td></td></tr></tbody></table>

flag-biotin tandem arınma aracılı Çapraz bağlama ve İmmünopits ile protein-rna etkileşimlerinin transkripsiyon-geniş profilleme

Transcriptome-Wide Profiling of Protein-RNA Interactions by Cross-Linking and Immunoprecipitation Mediated by FLAG-Biotin Tandem Purification

RNA ve RNA bağlayıcı proteinler (RRB' ler) birden fazla biyolojik işlemi kontrol eder. RNA'ların ve RRB'lerin mekansal ve zamansal düzenlemesi bu süreçlerin hassas bir şekilde düzenlenmesinin temelini oluşturur. ENdojen protein-RNA etkileşimlerini UV çapraz bağlanması ve ardından immünoprepitasyon ile yakalamak için CLIP-seq (çapraz bağlama ve immünopredimasyon) adı verilen bir strateji geliştirilmiştir. RBP çalışmasında konvansiyonel CLIP-seq yönteminin yaygın kullanımına rağmen, CLIP yöntemi yüksek kaliteli antikorların bulunabilirliği, saflaştırılmış RP'lerden potansiyel kirleticimaddeler, izotop manipülasyongereksinimi ve sıkıcı bir deneysel işlem sırasında potansiyel bilgi kaybı ile sınırlıdır. Burada FLAG-biotin etiketi tandem arınma kullanarak FbioCLIP-seq adlı değiştirilmiş bir CLIP-seq yöntemi ni tanımlıyoruz. Tandem arınma ve sıkı yıkama koşulları sayesinde, hemen hemen tüm etkileşen RNA bağlayıcı proteinler kaldırılır. Böylece, dolaylı olarak bu copurified RbPs aracılık rna'lar da azalır. FbioCLIP-seq metodumuz, sds-PAGE ve membran transfer prosedürleri olmadan doğrudan proteine bağlı RNA'ların izotopsuz ve proteine özgü antikorsuz bir şekilde etkin bir şekilde algılanmasını sağlar.

FbioCLIP-seq prosedürünün şematik gösterimi Şekil 1'degösterilmiştir. FLAG aracılı veya streptavidin aracılı tek adımlı arınma ile karşılaştırıldığında, FLAG-biotin tandem saflaştırma, dolaylı protein-RNA etkileşimlerinin kontaminasyonunu önleyerek hemen hemen tüm saflaştırılmış proteinleri ortadan kaldırmış(Şekil 2). LIN28 ve WDR43 için FbioCLIP-seq için temsili sonuçlar Şekil 3 ve Şekil 4...

Burada, memeli hücrelerinde RNA bağlayıcı proteinlerin (RRB) RNA hedeflerini belirlemek için FLAG-biotin tandem saflaştırma ile FbioCLIP-seq adı verilen değiştirilmiş bir CLIP-seq protokolü salıyoruz.

Flag-Biotin Tandem Arınma Aracılı Çapraz Bağlama ve İmmünopits Ile Protein-RNA Etkileşimlerinin Transkripsiyon-Geniş Profilleme

RNA and RNA-binding proteins (RBPs) control multiple biological processes. The spatial and temporal arrangement of RNAs and RBPs underlies the delicate ...

Sadece ve sadece bağlayıcı proteinler birden fazla biyolojik işlemi kontrol eder. Bu FLAG-Biotin CLIP-seq yöntemi, dolayısıyla küresel memeli hücrelerinde RNA ve RRB'lerin özel ve zamansal düzenleme profilini. Bu yöntem, SDS-PAGE ve membran transfer prosedürleri olmadan doğrudan proteine bağlı RNA'ların etkin bir şekilde algılanmasını sağlar.Geleneksel CLIP-seq ile karşılaştırıldığında izotop içermez ve proteine özgü antikor gerektirmez. Yaklaşık 3 milyon fare embriyonik KÖK hücresini 10 santimetrelik bir plakaya kapayarak ve bir gecede kuluçkaya yatarak başlayın. Ertesi gün, bir vakum ile orta çıkarın ve oda sıcaklığında iki dakika boyunca% 0.25 tripsin EDTA iki mililitre ile hücreleri tedavi.Dört mililitre taze MESC ortamı ile tripsini söndürün ve hücreleri 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Daha sonra, onları 300 kez G'de dört santigrat derecede üç dakika santrifüj edin ve süpernatantı çıkarın. Hücreleri dört mililitre soğuk PBS'de askıya alın ve çapraz bağlama için 10 santimetrelik plakaya geri aktarın.Hücreleri 254 nanometreLIK UV ışığıyla yayan, sonra çapraz bağlı hücreleri 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Bu hücreleri 300 kez G'de dört santigrat derecede üç dakika boyunca aşağı çevirin, sonra süpernatant'ı çıkarın ve el yazması talimatlara göre hazırlanan 500 mikrolitre Tampon A ile hücreleri inceleyin. Hücreleri RNAse içermeyen 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve 30 ila 60 dakika boyunca hafif bir dönüşle dört santigrat derecede kuluçkaya yatırın.10 dakika boyunca 37 santigrat derecede 30 mikrolitre DNAse 1 ile lysate tedavi edin. Daha sonra, 0,5 molar EDTA dört mikrolitre ekleyerek reaksiyonu durdurun. Çözünmez peleti 12,000 kez G'yi 4 santigrat derecede 20 dakika santrifüj ederek aşağı doğru çevirin ve süpernatant'ı soğutulmuş 1,5 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın.Hücre lisatını önceden dengelenmiş BAYRAK boncuklarına aktarın ve numuneyi iki ila dört saat dönerken dört santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra boncukları 3000 kez G'de iki dakika santrifüj edin ve süpernatantı çıkarın. Örneğe 500 mikrolitre Tampon A ekleyin ve 4 santigrat derecede beş dakika kuluçkaya yatırın, sonra boncukları aşağı çevirin ve süpernatantı çıkarın.Tampon A ile yıkamayı tekrarlayın, ardından önceden soğutulmuş Tampon B.To üç X FLAG peptidile elite, metin el yazmasında açıklandığı gibi elüsülasyon çözeltisini hazırlayın ve FLAG boncuklarını aşağı doğru döndürün. Supernatant'ı dar uçlu pipet ucuyla çıkarın ve her numuneye üç X FLAG elüsyon çözeltisinin 200 mikrolitresini ekleyin. Numuneleri 4 santigrat derecede 30 dakika boyunca hafif bir dönüşle kuluçkaya yatırın.Sonra 3000 kez G.Transfer yeni bir tüp için boncuk iki dakika aşağı spin ve iki kez elüsyon tekrarlayın. FLAG immünopresipitenjinin verimliliğini kontrol etmek için batı leke analizi veya gümüş boyama için elüentlerin %5'ini kaydedin. Hazırlanan streptavidin boncuklar için çekilen eluents aktarın ve bir ila üç saat veya bir gecede dört derece santigrat hafifçe örnekleri döndürün.Sonra, manyetik bir stand üzerinde boncuk toplamak ve supernatant kaldırın. Boncukları 500 mikrolitre Tampon C ile iki kez yıkayın ve yıkama başına beş dakika hafif bir dönüş le yıkayın. Daha sonra, boncukları 500 mikrolitre Tampon D ile iki kez, 500 mikrolitre buz gibi PNK tamponuyla iki kez yıkayın, manyetik standdaki boncukları toplayıp yıkamalar arasındaki süpernatantı temizler.Kısmi RNA sindirimi gerçekleştirmek için, her numuneye 100 mikrolitre MNA çözeltisi ekleyin ve 10 dakika termal mikserle 37 santigrat derecede ayarlanan girdap. 30 saniye boyunca bir manyetik stand ile boncuk toplamak ve supernatant kaldırın. Daha sonra, el yazması yönergelerine göre PNK-EDTA arabelleği, Arabellek C ve PNK arabelleği ile yıkayın.Manyetik stand ile boncuk toplamak ve tampon kaldırın. Daha sonra, CIP reaksiyon karışımı ekleyin ve 10 dakika boyunca bir termal karıştırıcı ile 37 santigrat derece boncuk girdap. Boncukları 500 mikrolitre buz gibi PNK EDTA tamponuyla iki kez hızlıca yıkayın ve ardından 500 mikrolitre buz gibi PNK tamponu ile iki yıkama yapın.Yıkar sonra, boncuk üç prime linker ligation karışımı 40 mikrolitre ekleyin ve üç saat veya bir gecede bir termal karıştırıcı ile 16 derece santigrat onları girdap. Bağlantının müttefiklere verimli bir şekilde bağlanması bu deney için çok önemlidir. Bunlar ligasyon sırasında çökelti olmadığından emin olmak için zaman zaman reaksiyon tüpü kontrol edin.Kuluçkadan sonra, PNK EDTA ve PNK tamponları ile yıkar, boncukkarışık PNK 40 mikrolitre ekleyin ve 10 dakika termal karıştırıcı ile 37 santigrat derece onları girdap. Boncukları PNK EDTA ve PNK arabellekleriyle yıkayın, ardından metin el yazmasında açıklandığı gibi RNA yalıtımı ile devam edin. FLAG aracılı veya streptavidin aracılı bir adım afinite saflaştırma ile karşılaştırıldığında, FLAG-Biotin tandem arıtma hemen hemen tüm çekirdek saflaştırılmış proteinler kaldırıldı, dolaylı protein RNA etkileşimlerinin kontaminasyon kaçınarak.LIN28 ve WDR43, Fbio CLIP-seq fare embriyonik KÖK hücreleri kullanılarak yapıldı. Lin28 ve WDR43 için toplamda yaklaşık 7,7 milyon ve 2,2 milyon benzersiz okuma alındı. Parça görünümlerinin karşılaştırılması RN45 öncesi rRNA locusundaki farklı bağlama desenleri gösterir.LIN28, Fbio CLIP-seq tarafından pre-let7-g RNA GGA G motifi üzerinde çapraz bağlantılı siteler veya tanımlanır. Ayrıca bağlayıcı bölgelerde zenginleştirilmiş RNA motifleri ve mutasyona uğramış nükleotitlerin farklı mutasyon türlerindeki yüzdesi belirlendi. LIN28'in gen nükleotitine bağlanmayı tercih ettiğini gösteriyor.Saat 22:00'de, bu protokol, immünopresidasyonun verimliliğini doğrulamak ve proteinin sadece komplekslerinin başarıyla saflaştırıldığından emin olmak için önemlidir.

transcriptome-wide-profiling-protein-rna-interactions-cross-linking

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

RNA transkript trans etkili RNA bağlayıcı proteinler (RBPs) çok sayıda aracılığı ile geniş posttranskripsiyonel düzenlemeye tabidir. Burada hassas ve transcriptome geniş bir ölçekte RBPs, RNA bağlayıcı siteleri tanımlamak için genellenememektedir bir yöntem mevcut.

PAR-Klip - RNA Cilt Proteinler Transcriptome geniş Cilt Siteleri Belirlemek Amacıyla Bir Yöntem

Transkript RNA bağlayıcı proteinlerin mekansal düzenleme, post-transkripsiyonel regülasyonunda önemli bir belirleyicisidir. Bu nedenle, bir RNA bağlayıcı protein bağlama bölgeleri hassas genom haritalama sağlar bireysel nükleotid çözünürlük UV crosslinking ve immunoprecipitation (iCLIP) geliştirdi.

iCLIP - Bireysel Nükleotid Çözünürlük protein-RNA Etkileşimleri Transcriptome geniş Haritalama

Biz, LC-MS / MS sistemi kullanılarak coregulatory etkileşimi proteinlerinin saflaştırılması için bir yöntem oluşturmuştur.

LC-MS / MS Analizi Nükleer kofaktör ile etkileşimde proteinlerin yüksek verimli belirlenmesi için bir protein Hazırlama Yöntemi

Burada, intramoleküler ve molekül içi RNA-RNA etkileşimlerinin in vivo genom geneli haritalamasını mümkün kılan P soralen çapraz bağlanmış, L ve s seçilmiş H zincirlerinin (SPLASH) eşitliğinin yöntemini ayrıntılı olarak açıklıyoruz. SPLASH maya, bakteri ve insanlar dahil olmak üzere organizmaların RNA etkileşimlerini incelemek için kullanılabilir.

RNA-RNA Etkileşmelerini Biyotinlenmiş Psooren Kullanarak Küresel Olarak Haritalama

Burada, Arabidopsis thaliana yaprak mezofil protoplastlarına uygulanan bir etkileşimli yakalama protokolünü sunuyoruz. Bu yöntem kritik olarak in vivo UV çapraz bağlanmaya dayanır ve fizyolojik bir ortamdan bitki mRNA'ya bağlanan proteinlerin izole edilmesine ve tanımlanmasına izin verir.

Bitki Protoplastlarından mRNA İnteraktom Yakalama

Her iki kodlama ve kodlamayan bağlayıcı proteinler tanımlamak için tıklatın Kimya destekli RNA-interactome yakalama (CARIC) strateji uygulamak için detaylı bir protokol RNA'ların sunulur.

Yakalama ve tıklama Kimya destekli RNA-interactome kullanarak RNA bağlanıcı proteinler tanımlaması (CARIC) strateji yakalama

Burada, endojen RNA bağlayıcı siteleri veya RNA: protein (RNP) kompleksler "ayak izleri" mammalin hücrelerden zenginleştirmek için bir protokol sunuyoruz. Bu yaklaşım RNP alt paketleri iki immünoprecipitations içerir ve bu nedenle tandem RNA immünopresipitasyon dubbed (ripit).

RNA 'nın ayak Izleri tanımlaması: proteinli kompleksleri RNA Immunoprecipitation ile tandem sonra sıralamayı (RIPiT-seq)

cDNA'nın kinetik çapraz bağlanması ve analizi, canlı hücrelerdeki protein-RNA etkileşimlerinin dinamiklerinin yüksek zamansal çözünürlükte araştırılmasını sağlayan bir yöntemdir. Burada protokol, maya hücrelerinin büyümesi, UV çapraz bağlama, hasat, protein saflaştırma ve yeni nesil dizileme kütüphanesi hazırlama adımları dahil olmak üzere ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.

χCRAC Kullanarak Yüksek Zamansal Çözünürlükte Protein-RNA Etkileşim Dinamiğinin İn Vivo İzlenmesi

Ko-translasyonel etkileşimler, yeni zincir modifikasyonlarında, hedeflemede, katlamada ve montaj yollarında çok önemli bir rol oynamaktadır. Burada, ökaryot Saccharomyces cerevisiae modelinde bu etkileşimlerin in vivo, doğrudan analizi için bir yöntem olan Seçici Ribozom Profillemeyi açıklıyoruz.

Ko-Translasyonel Etkileşim Ağlarının Seçici Ribozom Profilleme ile Küresel Tanımlanması

Burada, insan hücrelerinden toplam protein ekstraktını, biyotinile RNA ile kaplanmış streptavidin boncuklarını ve kütle spektrometri analizini kullanarak, spesifik RNA dizilerinin protein interaktörlerini ortaya çıkarmak, ölçmek ve doğrulamak için optimize edilmiş bir in vitro yöntem sunuyoruz.

Kısa Biyotinile RNA Kullanan RNA Bağlayıcı Proteinlerin Optimize Edilmiş Kantitatif Aşağı Çekme Analizi

Öğrenin, Fbio CLIP-seq yöntemiyle memeli hücrelerde RNA bağlayıcı proteinlerin ve RNA hedeflerinin geniş profillemesini. Bu izotop içermeyen yöntem, SDS-PAGE olmadan doğrudan protein bağlı RNA'ları verimli şekilde tespit eder.

Flag-Biotin Tandem Arınma Aracılı Çapraz Bağlama ve İmmünopits Ile Protein-RNA Etkileşimlerinin Transkripsiyon-Geniş Profilleme

Daha fazla video keşfet