Whitefly Dokularında Begomovirüslerin İmmünfloresan ve Kantitatif PCR ile Lokalizasyonu ve Nicel Olarak Ölçülmesi

Whitefly vektörlerinde virüsün mekansallığı ve miktarının açıklığa kavuşturulması begomovirüs-whitefly etkileşimlerinin anlaşılmasına ve ciddi begomoviral hastalıkların kontrol edilmesine yönelik yeni stratejilergeliştirilmesine yardımcı olabilir. Bu tekniğin avantajları, whitefly dokularını hızlı bir şekilde izole edebilsek, viral ve beyaz sinek proteinlerini birlikte yerelleştirebiliyor ve whitefly tüm vücutlarındaki ve virüsbulaşmış bitkilerdeki virüsleri ölçebiliyor olmamızdır. Uygun deneysel zaman noktasında, virüs edinimi nden sonra, buz anestezisi kadın beyaz sinekleri mikroskop slaytına bir damla PBS yerleştirin ve bir stereo mikroskop altında whitefly'ın karnını açmak için ince bir akupunktur iğnesi kullanın.

Midgut ayıklamak ve PBS bir toplama çanak içine midgut yerleştirmek için iğne kullanın. PSGs toplamak için, baş ın yanındaki dorsal taraftan toraks ta vücudu bölün ve toraks aracılığıyla bir iğne ile whitefly düzeltmek. İki tükürük bezleri vücuttan ayrılır ve PBS yeni bir çanak bezleri transfer kadar whitefly sallamak için ikinci bir iğne kullanın.

Yumurtalıkları toplamak için, tamamen karın açın ve diğer dokulardan yumurtalıkları ayırmak için bir iğne kullanın. Fazla dokuyu çıkarmak ve yumurtalıkları yeni bir PBS yemeğine aktarmak için bir pipet kullanın. Bir hemolenf örneği toplamak için, yeni bir mikroskop slayt üzerine PBS 10 mikrolitre ekleyin ve damlacık içine yeni bir whitefly yerleştirin.

Yavaşça karın bir delik yapmak için ince bir akupunktur iğnekullanın. Sonra tampon içine hemolenf serbest bırakmak ve sıvı sekiz mikrolitre örnek toplamak için karın hafif basınç uygulayın. Hasat edilen whitefly PSG, midgut veya yumurtalık dokularında TYLCV lokalizasyonunu görselleştirmek için, 15 ila 20 numuneyi bir cam 3,5 santimetre Petri kabına aktarın ve fazla tamponu aspire edin.

Yıkama başına bir mililitre taze TBS'de numuneleri üç kez iki dakika boyunca dikkatlice yıkamadan önce iki saat boyunca %4 paraformaldehit mililitresindeki dokuları düzeltin. Son yıkamadan sonra, sadece yıkama başına TBST bir mililitre ile gösterildiği gibi üç kez yıkamadan önce 30 dakika boyunca% 0.5 Triton X-100 bir mililitre ile permeabilize. Son yıkamadan sonra, oda sıcaklığında iki saat boyunca bir mililitre 1%sığır serum albumini ile nonspesifik bağlanmayı engelleyin ve gösterildiği gibi TBST'de üç yıkama işlemini takip edin.

Son yıkamadan sonra, hücreleri bir gecede ışıktan korunan dört santigrat derece ilgibirincil antikorları ile etiket. Ertesi sabah, ışıktan korunan oda sıcaklığında uygun ikincil antikorları eklemeden önce numuneleri TBST ile üç kez yıkayın. Kuluçka sonunda, midgutları üç kez yıkayın ve numuneleri temiz bir mikroskop slaytına aktarın.

Mümkün olduğunca çok tampon çıkarın ve bir coverslip ile montaj ve konfokal mikroskopi ile etiketli dokuları inceleyerek önce DAPI bir damla ile çekirdekleri leke. TYLCV sayısallaştırması için, hasat edilen whitefly doku örneklerini taze PBS'de 2-3 kez yıkayın ve 20 midgut, 20 PSG veya beş mikrolitre PBS'de bir yumurtalık, 25 mikrolitre likis çözeltisi içeren tek tek PCR tüplere aktarın. Her tüpe beş ila yedi iki milimetre çapında seramik boncuk ekleyin ve örnekleri bir homogenizer öğütün.

Yeni bir PCR tüpüiçine sekiz mikrolitre likit bir hemolenf örneği ekleyin ve iyice karıştırarak tüpe 10 mikrolitre likyon ekleyin. Tüm numuneleri 65 santigrat derecede bir saat kuluçkaya yatırın, ardından 100 santigrat derecede 10 dakikalık bir kuluçka ve kısa bir santrifüj. Daha sonra, kantitatif PCR şerit tüplerin şişelerine 18 mikrolitre ana karışım ekleyin ve her DNA örneğinden en az üç şişeye iki mikrolitre ekleyin.

Tüm numuneler yüklendiğinde, tüpleri kapatın ve her şişenin altındaki çözeltiyi tortulamak için santrifüjü kapatın. Şişeleri kantitatif PCR için gerçek zamanlı bir termal döngüye yükleyin, florofor boya olarak siber'i seçin ve örnek türü olarak bilinmez. Daha sonra her örnekteki göreceli viral DNA miktarının analizi için nicel verileri bir elektronik tabloya aktarın.

Burada, whitefly PSGs, midguts ve yumurtalıklarda DAPI boyama TYLCV temsili görüntüler gösterilir. Görüldüğü gibi, TVLCV yumurtalıklarda daha PSGs ve midguts içinde daha büyük bir birikimi göstermektedir. 24, 48 ve 72 saat boyunca TYLCV enfekte domates ile beslendikten sonra whitefly PSGs, midguts, hemolenf ve yumurtalıklarda virüsün sayısallaştırılması, satın alma erişim dönemindeki artışa doğrudan korelasyon halinde farklı whitefly dokularında virüs miktarının arttığını göstermektedir.

Ölü böcekler diseksiyon zorluk artacak gibi taze beyaz sinekler kullanmak en iyisidir. Bu prosedürü takiben, viral protein ekspresyonu ve viral ve vektör protein etkileşimleri ile ilgili ek soruları cevaplamak için batı lekeleme ve ko-immünoprepitasyon gibi diğer analizler de yapılabilir.