Name: Kromatin İmmünenasyon ve Yüksek İş Kelejisi Kullanarak Salmonella Biyofilmde CsgD Düzenleyici Hedeflerin Keşfedilmesi (ChIP-seq) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 48 s
Description: Keşfedin, ChIP-seq yöntemiyle Salmonella biyofilmde CsgD düzenleyici hedeflerini belirleyin. Bu protokol, transkripsiyon faktörü bağlanmasını analiz ederek biyofilm oluşumu mekanizmalarını açıklar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma, Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi'nin (#2017-05737) AW'ye ve Jarislowsky Biyoteknoloji Kürsüsü'ne verdiği bir bağışla desteklenmiştir. MP, Saskatchewan Üniversitesi'nde Bulaşıcı Hastalıklar, Gıda Güvenliği ve Kamu Politikası (ITraP) Entegre Eğitim Programı aracılığıyla NSERC-CREATE bursu ile desteklenmiştir.
Yazarlar, dani Dale'e çekim ve kurgu için teşekkür etmek isterler.

1. Flask kültür hücre büyümesi
<ol><li>Dondurulmuş stoklardan, lb agar üzerinde streak Salmonella serovar Typhimurium suşları (100 mm Petri plaka 20 mL katı ortam) uygun antibiyotik ve kuluçka 37 °C 16-20 h izole koloniler elde etmek için.</li>
	<li>25 mm x 150 mm borosilikat kültür tüpünde uygun antibiyotik içeren 5 mL LB et suyu, 1.1 adımdan çizgi plakalardan 1-3 koloniile inoküle edin. 37 °C'de 7 saat boyunca 200 rpm'de titreyerek kuluçkaya yat.</li>
	<li>Spektrofotometre kullanarak OD600 et suyu kültürünü ölçün. PBS'de 4'te 1'lik bir kültür aliquot'u 2 mL cuvette seyreltin ve emiciliği 600 nm'de ölçün. Bu adımda en kritik faktörün büyüme zamanı olduğunu gördük. OD değerleri adım 1.4'te istenilen sayıda hücreyi sağlamak için kültürleri normalleştirmek için kullanılır.</li>
	<li>Uygun antibiyotik le 100 mL 100 mL içeren bir Erlenmeyer şişesine hücre kültürünün (yani ~109 hücre) 1.0 OD600 cilt eşdeğeri ekleyin. 28 °C'de 13 saat boyunca 200 rpm'de titreyerek kuluçkaya yat. Not: Biyofilm hücreleri birleştirilmiş pullar olarak görünür ve tek planktonik hücreler bulutlu ortamda bulunmaktadır.</li>
</ol>2. Hücresiz koşullu %1 tripton toplama
<ol><li>Hücre içermeyen koşullu % 1 tripton için şişe kültürü toplayın. Pipet bir santrifüj tüp eklemeden önce karıştırmak için kültür birkaç kez flask.</li>
	<li>10 °C'de 10 dakika boyunca 12.000 x g'de santrifüj ve tüm hücreleri peletleyin.</li>
	<li>0,2 μm filtre ünitesi, vakum filtresi içine decant supernatant ve yeni bir tüp içine dağıtmak. Not: Biyofilm agregaları geleneksel çözümlere (örneğin PBS) yapışır ve tüplerin ve pipet uçlarının kenarlarına yapışır. Daha kolay manipülasyon alabildiği için, başlangıçta biyofilmi taşımak için şartlı ortam (%1 tripton) kullanıyoruz ve medyada bulunabilecek protein çapraz bağlantı alt tabakalarını kaldırmak için çapraz bağlamadan hemen önce (adım 4.5) sıcak PBS kullanıyoruz.</li>
</ol>3. Biyofilm ve planktonik hücrelerin flask kültürlerinden ayrılması2
<ol><li>Steril 25 mL pipet kullanarak, 15 mL tüpler içine aliquot şişe kültürü. İki hücre türünü ayırmak için 2 dk için yavaş hızda santrifüj (210 x g)ayırın. Not: Biyofilm hücreleri tüpün alt kısmında gevşek bir pelet oluşturmalıdır</li>
	<li>Pipet supernatant iki 40 mL santrifüj tüpler içine planktonik hücreleri içeren daha sonra (adım 5). Pelet rahatsız etmemeye dikkat edin, kalan tüm sıvı çıkarın. Hücre türleri tüm şişe kültür medyasından ayrılana kadar tekrarlayın.</li>
</ol>4. Biyofilm agregalarının hazırlanması
Not: Biyofilm, ChIP için önerilen minimum başlangıç malzemesi olan 25 g DNA elde etmek için ıslak ağırlıkla hasat edilir. S Biyofilm Dönüşüm Faktörü (BCF) Tiphimurium 1.73 x 108 CFU/mg2'dir. Diğer biyofilm türlerini hazırlayan araştırmacıların, bu denklemi kullanarak 25 g DNA başlangıç materyali için gerekli biyofilm ağırlığını bulmak için kullanılan biyofilm birim ağırlığı başına hücre sayısını ampirik olarak tanımlamaları gerekecektir: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60736/60736eq1.jpg">
<ol><li>2 mL'lik bir kopma kapağını veya vidakapağını doğru şekilde tartın.</li>
	<li>1 mL klimalı triptobiofilm peletini yeniden askıya alın. Yeniden askıya alınan biyofilmi önceden tartılmış 2 mL snap kap veya vidalı kapak tüpüne taşıyın.</li>
	<li>20 °C'de 1 1 dk 11 000 x g için santrifüj</li>
	<li>Dikkatle tüp tüm supernatant çıkarın ve doğru tüp tartmak. Biyofilm ağırlığını bulmak için tüp ağırlığını biyofilm ile tüpün ağırlığından çıkarın. Hedef biyofilm ağırlığının ±'u olmalıdır.</li>
	<li>Kalan şartlı triptomu çıkarmak için hücreleri yıkayın. Peleti yeniden askıya almak için tüpe ve girdap lara 1 mL sıcak PBS ekleyin. 8 000 x g pelet biyofilm ve supernatant kaldırmak için 3 dakika santrifüj. Peleti yeniden askıya almak için tüp e ve girdabA 1 mL PBS ekleyin.</li>
</ol>5. Planktonik hücrelerin hazırlanması
<ol><li>Bir spektrofotometre kullanarak yavaş hızlı santrifüjden (adım 3.2) planktonik süpernatantın hacmini ve OD600'ü kaydedin</li>
	<li>6.0'ın son OD600'ü için gerekli hacmi hesaplayın: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/60736/60736eq2.jpg">
</li>
	<li>Santrifüjü 10 °C'ye kadar soğutun ve tortu planktonik hücreleri santrifüj (10.000 x g, 10 dk 10 °C)</li>
	<li>5.2 adımda hesaplanan PBS'nin son hacminde süpernatantı çıkarın ve hücre peletini yeniden askıya alın.</li>
	<li>OD600 planktonik hücreyi spektrofotometre kullanarak yeniden ölçün ve 6.0 OD600 planktonik hücrelerin hacmini 2 mL snap kap veya vida kapağı tüpüne dağıtın.</li>
	<li>PBS ile hacmi 1 mL'ye getirin.</li>
</ol>6. Homojenleştirici hücreler
<ol><li>Tüplerin her birine sterilize edilmiş 5 mm paslanmaz çelik boncuk ekleyin.</li>
	<li>30 Hz.'de 5 dakika boyunca bir mikser değirmeni kullanarak homojenleştirin.</li>
	<li>Homojenleşmiş hücreleri metal boncuktan kaçınarak yeni bir 1,5 mL tüpe aktarın. PBS ile hacmi 1 mL'ye getirin. Not: Giriş hücrelerini numaralandırmak için seri seyreltmeler gerçekleştirin ve son hücre numarasının istenilen veya öngörülen sayıya yakın olup olmadığını kontrol edin.</li>
</ol>7. Proteinlerin DNA'ya çapraz bağlanması
<ol><li>Taze formaldehiti numune tüplerine %1'lik son konsantrasyona dağıtın. Dönen bir tekerlek üzerinde oda sıcaklığında 30 dakika kuluçka. Dikkat: Formaldehit aşındırıcı, bir deri, göz, ve solunum tahriş edici, ve yanıcı. Duman kaputunu dağıt.</li>
	<li>Crosslinking durdurmak için 125 mM son konsantrasyonuna 1 M glisin ekleyin. Dönen bir tekerlek üzerinde oda sıcaklığında 5 dakika kuluçka.</li>
</ol>8. Aşırı crosslinker kaldırmak için hücreleri yıkama
<ol><li>Hücreleri 8.000 x g'de 3 dk boyunca tortulat ve süpernatant</li>
	<li>Peleti 20 μL 25x proteaz inhibitörleri ve 500 μL filtre sterilptetize pbs içinde yeniden askıya alın.</li>
	<li>8000 x g 3 dakika için santrifüj tüp ve supernatant çıkarın.</li>
</ol>9. Lysing hücreleri
<ol><li>600 μL Lysis tampon (Tablo 1'ebakın) peletre resuspend ve 10 dakika boyunca buz üzerinde kuluçka.</li>
	<li>Steril 15 mL'lik bir tüpe 1,4 mL IP seyreltme tamponu ekleyin (Tablo 1'ebakın) ve lysed hücreleri 15 mL tüpe taşıyın. Tüpü 1,5-2 saat buzda tutun ve yavaşça ve ara sıra girdap atın. Not: Bazı dirençli hücre malzemeleri tüplerde kalabilir. Ara sıra girdaplarla buz üzerinde uzun bir kuluçka dönemi malzemeyi parçalayacaktır. Geri kalanı sonication yoluyla parçalanmış olacak.</li>
</ol>10. DNA'yı sonication ile parçalama
<ol><li>15 mL'lik tüpü buzkabına yerleştirin ve 3 mm'lik sondayı tüpün içine yerleştirin.</li>
	<li>400 W'ın -40'ında 30 s'lik 5 sonication mermisi gerçekleştirin ve patlamalar arasında buz üzerinde 2 dk soğutun.</li>
	<li>Tortu çökelmiş malzemesantrifüj (8000 x g, 4 °C'de 10 dk). Supernatant'ı yeni bir tüpe aktarın.</li>
	<li>İsteğe bağlı olarak, 65 °C'de 30-60 dakika decrosslinking yapın ve uygun boyut parçalarını kontrol etmek için %2 agarose jel üzerinde çalışmadan önce 45 °C'de RNA ve proteini 30-60 dk sindirin. Not: Sondayı hücre lisatına batırın. Sonicating ve dinlenme sırasında buz üzerinde çözüm tutun. Sonicator sondası zonklarken tüpü çıkarmayın. Çözüm bulutlu ön sonication ve net post-sonication görünmelidir.</li>
</ol>11. İmmünpresipitating DNA-protein-antikor kompleksleri
<ol><li>Hazırlık<ol>
<li>İmmünenyağış için bir adet 1.35 mL aliquot ve giriş kontrolü olarak bir adet 200 μL aliquot dağıtın. Giriş kontrolünü -80 °C'de decrosslinking ve sindirim adımları yapılana kadar saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Primer antikorlu immünoprepitasyon<ol>
<li>1.35 μL aliquot saflaştırılmış proteine özgü primer antikor 10 g ekleyin. Bir gecede 4 °C'de dönen bir tekerlek üzerinde kuluçkaya yatırın. Not: Primer antikor monoklonal antikor, yüksek kaliteli poliklonal serum veya ticari epitop antikor (örn. anti-FLAG) olabilir.</li>
		<li>11.2.1 adımdan tüplere 50 μL Protein G manyetik boncuk ekleyin ve 4 °C'de 3 saat boyunca dönen bir tekerlek üzerinde kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>IP yıkama tamponu 1, IP yıkama tamponu 2 ve TE pH 8.0 'ı (Tablo 1'ebakın) bir buz kovasına yerleştirin. 65 °C'ye kadar sıcak elüs tamponu. Not: Elüsasyon tamponu içeren çözeltiyi buzüzerine koymayın.</li>
		<li>Protein G manyetik boncukları manyetik bir stand kullanarak tüplerin yan tarafına bağlayın</li>
		<li>Yıkama yapın: 750 μL soğuk IP yıkama tamponu 1 ile 2x yıkayın, 750 μL soğuk IP yıkama tamponu 2 ile 1x yıkayın ve pH 8.0'da 750 μL soğuk TE ile 2x yıkayın. Yıkıntılar sırasında tüpleri manyetik standda tutun.</li>
		<li>Her tüpe 450 μL IP Elüsyon tamponu ekleyin (Tablo 1'ebakın) ve 65 °C'de 30 dakika boyunca her 5 dakikada bir hafif girdap ile kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Bir manyetik stand kullanarak tüplerin yan boncuk bağlayın. Çözelti temizolana kadar en az 2 dk bekleyin.</li>
		<li>Temizlenmiş süpernatantı manyetik boncuk peletini rahatsız etmemeye dikkat edin, 1,5 mL'lik yeni bir tüpe dağıtın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>12. DNA-protein komplekslerinin decrosslinking ve sindirilmesi birlikte arındırıcı RNA ve protein
<ol><li>Her tüpe 0,3 M'lik son konsantrasyona 2 μg RNase A ve NaCl ekleyin.</li>
	<li>65 °C'de , ≥6 saat veya bir gecede kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Her tüpe 180 μg Proteinaz K ekleyerek protein sindirimini tamamlayın, ardından 45 °C'de 3-5 saat kuluçkaya yatırın.</li>
</ol>13. Kütüphane hazırlama ve sıralama
<ol><li>Manyetik boncuklar kullanarak DNA'yı arındırın Not: Manyetik boncuklar genellikle bakteri hücreleri ile ChIP sırasında kurtarılan DNA küçük miktarlarda izole etmek için tercih edilir.</li>
	<li>Seçili sıralama platformuyla uyumlu bir kit kullanarak kitaplıkları hazırlayın.</li>
	<li>Kitaplık konsantrasyonunu florometre ve geniş kapsamlı dsDNA kiti veya qRT-PCR kitaplık ölçüm kiti ile kontrol edin. Not: Deneyimlerimize göre florometre ölçümleri DNA konsantrasyonunu abartabilir.</li>
	<li>Havuz kitaplıkları, her kütüphane örneği için yeterli kapsama alanı için muhasebe. Salmonellaile Illumina sıralama için, biz 10-12 kütüphaneler havuzlu. Tris-HCl pH 8.0'ı 1 mM'lik son konsantrasyona ekleyin.</li>
	<li>Seçilen platformun özelliklerine göre sıralanır.</li>
</ol>

<ol><li>Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Biofilms%3A+A+Common+Cause+of+Persistent+Infections%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial Biofilms: A Common Cause of Persistent Infections.</a> Science. 284 (5418), 1318-1322 (1999).</li>
<li>MacKenzie, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bistable+Expression+of+CsgD+in+Salmonella+enterica+Serovar+Typhimurium+Connects+Virulence+to+Persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Bistable Expression of CsgD in Salmonella enterica Serovar Typhimurium Connects Virulence to Persistence.</a> Infection and Immunity. 83 (6), 2312-2326 (2015).</li>
<li>Grantcharova, N., Peters, V., Monteiro, C., Zakikhany, K., Römling, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bistable+expression+of+CsgD+in+biofilm+development+of+Salmonella+enterica+serovar+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Bistable expression of CsgD in biofilm development of Salmonella enterica serovar typhimurium.</a> Journal of Bacteriology. 192 (2), 456-466 (2010).</li>
<li>MacKenzie, K. D., Palmer, M. B., Köster, W. L., White, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examining+the+Link+between+Biofilm+Formation+and+the+Ability+of+Pathogenic+Salmonella+Strains+to+Colonize+Multiple+Host+Species%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Veterinary+Science%22%5BJournal%5D)">Examining the Link between Biofilm Formation and the Ability of Pathogenic Salmonella Strains to Colonize Multiple Host Species.</a> Frontiers in Veterinary Science. 4, 307(2017).</li>
<li>Steenackers, H., Hermans, K., Vanderleyden, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+biofilms%3A+an+overview+on+occurrence%2C+structure%2C+regulation+and+eradication%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Research+International%22%5BJournal%5D)">Salmonella biofilms: an overview on occurrence, structure, regulation and eradication.</a> Food Research International. 45 (2), 502-531 (2012).</li>
<li>Brombacher, E., Dorel, C., Zehnder, A. J. B., Landini, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+curli+biosynthesis+regulator+CsgD+co-ordinates+the+expression+of+both+positive+and+negative+determinants+for+biofilm+formation+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">The curli biosynthesis regulator CsgD co-ordinates the expression of both positive and negative determinants for biofilm formation in Escherichia coli.</a> Microbiology. 149, Pt 10 2847-2857 (2003).</li>
<li>Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq%3A+advantages+and+challenges+of+a+maturing+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (10), 669-680 (2009).</li>
<li>Wu, D. -Y., Bittencourt, D., Stallcup, M. R., Siegmund, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+differential+transcription+factor+binding+in+ChIP-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Identifying differential transcription factor binding in ChIP-seq.</a> Frontiers in Genetics. 6, 169(2015).</li>
<li>Valouev, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+transcription+factor+binding+sites+based+on+ChIP-Seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of transcription factor binding sites based on ChIP-Seq data.</a> Nature Methods. 5 (9), 829-834 (2008).</li>
<li>Lieb, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+of+protein-DNA+interactions+by+chromatin+immunoprecipitation+and+DNA+microarray+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping of protein-DNA interactions by chromatin immunoprecipitation and DNA microarray hybridization.</a> Methods in Molecular Biology. 224, Clifton, N.J. 99-109 (2003).</li>
<li>Robertson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+profiles+of+STAT1+DNA+association+using+chromatin+immunoprecipitation+and+massively+parallel+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing.</a> Nature Methods. 4 (8), 651-657 (2007).</li>
<li>Kim, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-resolution+map+of+active+promoters+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A high-resolution map of active promoters in the human genome.</a> Nature. 436 (7052), 876-880 (2005).</li>
<li>Dillon, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+the+H-NS+and+Sfh+regulatory+networks+in+Salmonella+Typhimurium+identifies+a+plasmid-encoded+transcription+silencing+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of the H-NS and Sfh regulatory networks in Salmonella Typhimurium identifies a plasmid-encoded transcription silencing mechanism.</a> Molecular Microbiology. 76 (5), 1250-1265 (2010).</li>
<li>Perkins, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+and+transcriptome+analysis+of+the+OmpR+regulon+of+Salmonella+enterica+serovars+Typhi+and+Typhimurium+reveals+accessory+genes+implicated+in+host+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq and transcriptome analysis of the OmpR regulon of Salmonella enterica serovars Typhi and Typhimurium reveals accessory genes implicated in host colonization.</a> Molecular Microbiology. 87 (3), 526-538 (2013).</li>
<li>Gu, D., Liu, H., Yang, Z., Zhang, Y., Wang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+Immunoprecipitation+Sequencing+Technology+Reveals+Global+Regulatory+Roles+of+Low-Cell-Density+Quorum-Sensing+Regulator+AphA+in+the+Pathogen+Vibrio+alginolyticus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Technology Reveals Global Regulatory Roles of Low-Cell-Density Quorum-Sensing Regulator AphA in the Pathogen Vibrio alginolyticus.</a> Journal of Bacteriology. 198 (21), 2985-2999 (2016).</li>
<li>Peano, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+Escherichia+coli+%CF%83%28S%29+core+regulon+by+Chromatin+Immunoprecipitation-sequencing+%28ChIP-seq%29+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Characterization of the Escherichia coli σ(S) core regulon by Chromatin Immunoprecipitation-sequencing (ChIP-seq) analysis.</a> Scientific Reports. 5 (1), 10469(2015).</li>
<li>Blasco, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+regulator+EspR+of+Mycobacterium+tuberculosis+is+a+nucleoid-associated+protein%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Virulence regulator EspR of Mycobacterium tuberculosis is a nucleoid-associated protein.</a> PLoS Pathogens. 8 (3), 1002621(2012).</li>
<li>Jones, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-Seq+and+RNA-Seq+reveal+an+AmrZ-mediated+mechanism+for+cyclic+di-GMP+synthesis+and+biofilm+development+by+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">ChIP-Seq and RNA-Seq reveal an AmrZ-mediated mechanism for cyclic di-GMP synthesis and biofilm development by Pseudomonas aeruginosa.</a> PLoS pathogens. 10 (3), 1003984(2014).</li>
<li>Sengupta, M., Jain, V., Wilkinson, B. J., Jayaswal, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+identifies+genes+under+direct+VraSR+regulation+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation identifies genes under direct VraSR regulation in Staphylococcus aureus.</a> Canadian Journal of Microbiology. 58 (6), 703-708 (2012).</li>
<li>Gill, A. Cross-linking chromatin immunoprecipitation (X-ChIP) protocol. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/x_CHip_protocol.pdf">https://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/x_CHip_protocol.pdf</a> (2017).</li>
<li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Research. 22 (9), 1813-1831 (2012).</li>
<li>MacKenzie, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+evolution+leading+to+impaired+biofilm+formation+in+invasive+Salmonella+strains%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Parallel evolution leading to impaired biofilm formation in invasive Salmonella strains.</a> PLoS Genetics. 15 (6), 1008233(2019).</li>
<li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model-based+analysis+of+ChIP-Seq+%28MACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biology. 9 (9), 137-139 (2008).</li>
<li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BEDTools%3A+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li>
<li>Thorvaldsdóttir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+Genomics+Viewer+%28IGV%29%3A+high-performance+genomics+data+visualization+and+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration.</a> Briefings in Bioinformatics. 14 (2), 178-192 (2013).</li>
<li>Schoppee Bortz, P. D., Wamhoff, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+%28ChIP%29%3A+revisiting+the+efficacy+of+sample+preparation%2C+sonication%2C+quantification+of+sheared+DNA%2C+and+analysis+via+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation (ChIP): revisiting the efficacy of sample preparation, sonication, quantification of sheared DNA, and analysis via PCR.</a> PloS One. 6 (10), 26015(2011).</li>
<li>Tolstorukov, M. Y., Kharchenko, P. V., Goldman, J. A., Kingston, R. E., Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+H2A.Z+nucleosome+organization+in+the+human+and+yeast+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of H2A.Z nucleosome organization in the human and yeast genomes.</a> Genome Research. 19 (6), 967-977 (2009).</li>
<li>Geertz, M., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+strategies+for+studying+transcription+factor-DNA+binding+specificities%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Functional+Genomics%22%5BJournal%5D)">Experimental strategies for studying transcription factor-DNA binding specificities.</a> Briefings in Functional Genomics. 9 (5-6), 362-373 (2010).</li>
<li>Mardis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq%3A+welcome+to+the+new+frontier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq: welcome to the new frontier.</a> Nature Methods. 4 (8), 613-614 (2007).</li>
<li>Lee, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulatory+networks+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulatory networks in Saccharomyces cerevisiae.</a> Science. 298 (5594), 799-804 (2002).</li>
<li>Wade, J. T., Struhl, K., Busby, S. J. W., Grainger, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analysis+of+protein-DNA+interactions+in+bacteria%3A+insights+into+transcription+and+chromosome+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Genomic analysis of protein-DNA interactions in bacteria: insights into transcription and chromosome organization.</a> Molecular Microbiology. 65 (1), 21-26 (2007).</li>
<li>Myers, K. S., Park, D. M., Beauchene, N. A., Kiley, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+bacterial+regulons+using+ChIP-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+%28San+Diego%2C+Calif%29%22%5BJournal%5D)">Defining bacterial regulons using ChIP-seq.</a> Methods (San Diego, Calif). 86, 80-88 (2015).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan.

Bu protokol, ana biyofilm düzenleyicisi CsgD'nin düzenleyici hedeflerini bulmak için Salmonella enterica serovar Typhimurium biyofilm ve planktonik hücrelerle ChIP-seq yapmak için bir teknik özetlerilmektedir. Biyofilm agregalarında yüksek seviyelerde ve planktonik hücrelerde düşük seviyelerde olan csgD'nin iki hücre tipinde iki stabilitesi nedeniyle diferansiyel bağlama bilgileri bekliyoruz2,3. Ancak, bu teknik aynı zamanda diğer bakteriyel transkripsiyon faktörleri, hücre tipleri, ya da büyüme koşulları uygulanabilir. Özellikle bu teknik, biyofilm hücrelerinin birim ağırlığı başına CFU için deneysel olarak belirlenmiş bir dönüşüm faktörü kullanılarak diğer bakteriyel biyofilmlere uyarlanabilir.
ChIP-seq sıralama yoluyla teknik hata amplifikasyon eğilimli olabilir; ancak, kritik adımlarda onay bu27önleyebilirsiniz. Primer antikor özgüllüğü sadece hedef transkripsiyon faktörünü ve immünoprediyağış sırasında kontrol edilen DNA'yı seçmek için önemlidir7. Bu deneyde, csgD genin 3' sonunda plazmid kodlanmış 3xFLAG etiketine kaynaşmış, CsgD22C-terminusuna karşılık gelen . CSGD'siz p3xFLAG plazmidi "kontrol" (S. Tiphimurium 14028 ,csgD + p3xFLAG). ENCODE kılavuzları ilgi proteinkarşı primer antikor ile immünoblots performans öneririz, ve ChIP suşları ve silme suşları lysates21. Transkripsiyon faktörü bağlama ve aşağı sıralama sonuçlarında değişkenliği azaltmak için büyüme koşullarının çoğaltmalar arasında tutarlı olduğundan emin olmak önemlidir. Bir inokül boyutları ve pre-inoculum büyüme koşulları tutarlı olduğundan emin olmak için dikkatli ise, şişe kültüründe biyofilm büyüme tutarlı4. Tüm biyofilm homojenizasyon dan sonra parçalanmış olduğunu onaylamak için önemlidir, reaktifler eşit erişim sağlamak için, özellikle formaldehit çapraz bağlayıcı, tüm hücrelere.
Çeşitli değişiklikler, araştırmacıların bu protokolü diğer DNA bağlayıcı proteinler, hücre tipleri, suşlar, büyüme koşulları veya laboratuvar ekipmanları için kullanmalarına olanak sağlayabilir. S dışındaki biyofilm oluşturan türler için kullanılırsa. Tiphimurium, biyofilm birim ağırlığı başına koloni oluşturan birimlerin dönüşüm faktörü biyofilm farklı miktarlarda hasat, iyice biyofilm homojenleştirme ve düşük biyofilm ağırlıkları doğru olmayabilir standart bir eğri oluşturmak için seri seyreltme ve plaka sayma gerçekleştirerek deneysel olarak belirlenmelidir2. Sonicator enerji transferi ve hücre tipi direnci farklı olabilir; bu nedenle, bir sonication tsay downstream kitaplık hazırlama ve sıralama11için gerekli parça boyutu aralığı üretecek sonication patlamaları sayısını bulmak için tavsiye edilir. Mikrokokal nükleaz ile kromatin parçalanması, doluluk bölgelerinin yüksek çözünürlüğü üreten sonication'a alternatiftir; ancak, bu yöntem parçalanma önyargı7,28tanıtabilir. DNA boyutu aralığı, alt kitaplık hazırlama kitlerine ve sıralama platformlarına bağlı olarak değiştirilebilir. Mikser değirmeni yerine diğer homojenizasyon yöntemleri kullanılabilir. Örneğin, bir cam doku homogenizer değiştirilebilir, ancak aerosolize veya tamamen biyofilm kırmak olabilir. Kontroller açısından, pre-immünpresipitatDNA post-sekans işleme ve analiz normalize edilebilir. Türlere uygun normal antikor serumu ile bir mock-IP kontrolü de13kontrol olarak kullanılabilir.
Araştırmacılar bir ChIP-seq deneyi göz önünde bulundurularak bu yöntemin sınırlamaları dikkate almalıdır. Diğer biyofilm tipleri için uyarlamak için önemli değişiklikler gerekebilir. Örneğin, Salmonella Typhimurium ile PBS biyofilm hemen resuspension biyofilm agregalarının ölçülebilir kaybına yol açar. Bakterilerdeki transkripsiyon faktörlerinin düzenleyici hedeflerini hedefleyen immünopresipitasyon çok az miktarda DNA'ya neden olabilir ve bu da daha sonraki adımlarda arınma ve algılama için bir meydan okumadır. Önyargı, kütüphane algılama sırasında kırpma ve aşağı işleme sırasında tanıtılabilir9. Buna ek olarak, bu yöntem transkripsiyon faktörü bağlama yanıt olarak in vivo ifade düzeyleri ortaya değildir. Biyoinformatik alanında çok az deneyimi olan araştırmacılar analiz boru hattı tarafından meydan olabilir. Bu yöntem zaman yoğun ve pahalı olabilir; ancak, sıralama maliyeti genellikle bir mikrodizi daha düşüktür ve teknolojik gelişmeler yapılmaya devam ettikçe zaman içinde azalmaktadır.
Literatürde birkaç yöntem bakteriler ile ChIP açıklamak, ve en bakteriyel deneyler basit bir büyüme durumu ile başlar13,14,15,17,18. Tek hücrelerle ChIP numune hazırlama basittir ve biyofilm agregaları ile ChIP numune hazırlama daha az zorluklar sunar. ChIP-seq gelince, üstel zenginleştirme (SELEX), elektroforetik hareketlilik kayması tahlilleri (EMSA), ChIP-chip, organizatör silme ve muhabir analizi tarafından ligandların sistematik evrimi de dahil olmak üzere cis-düzenleyici devre, çalışma önceki yöntemler tamamlanmıştır veya ChIP-seq29ile değiştirildi . ChIP-seq, ilerleyen teknolojiler ve sıralama nın kullanılabilirliği nedeniyle ChIP çipinyerini alıyor. Derin sıralama chip-chip11daha az başlangıç malzemesi ile daha düşük bağlayıcı afinite ve daha yüksek baz çifti çözünürlüğü ile siteleri tanımlayabilirsiniz veri büyük miktarlarda araştırmacılar sağlar,30. Yüksek kaliteli referans genomlara sahip organizmalardan elde edilen ChIP verilerinin analizi genellikle hızlı ve spesifiktir. Ayrıca, ChIP-seq tüm hücre tipleri, büyüme aşaması veya çevre koşullarında işgal olmayabilir silico öngörülen bağlama sitelerinde keşfetmek için kapsamlı bir yöntemdir31.
Gelecekte, bu protokol bakteriyel patogenezin, özellikle biyofilm oluşturan organizmaların anlaşılmasını kolaylaştırmak için kullanılabilir. Bu tekniğin geniş benimsenmesi ve yeni veri kümelerinin kullanılabilirliği, biyofilm oluşturan mikroorganizmalarda hücresel süreçleri kontrol etmek için birlikte lokalize protein gruplarını belirlemek için veri entegrasyonuna yol açabilir32. Buna ek olarak, ChIP-seq ve RNA-seq verileri düzenleyici sistem modelleri oluşturmak için entegre edilebilir33.

Bakteriyel biyofilmler, kendi kendine üretilen bir matris gömülü hücrelerin yapısal agregalar, desiccation dirençli, antibiyotikler, ve ev sahibi bağışıklık yanıtları1. Bu nedenle, kalıcı ve kronik enfeksiyonlara neden olur ve hayatta kalma ve bulaşma çözümleri nedeniyle araştırmacılara benzersiz zorluklar sunarlar. Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Tiphimurium) desiccation ve antibiyotiklere dirençli biyofilm agregalarının fenotipik heterojen popülasyonları ve çevresel strese maruz kaldığında saf kültürde virülans faktörlerini ifade eden planktonik hücreler (28 °C, besinlerisınırlayan)2 . Bu iki hücre tipi ana biyofilm regülatörü, CsgD3bistable ekspresyonu nedeniyle ortaya çıkar. Biz bu Salmonellaiçin bir bahis koruma stratejisi olabileceğini varsaydığımız varsayılmaktadır , planktonik hücreler kısa vadeli iletim katılmak ve biyofilm hücreleri yeni bir konak enfekte etmek için bir fırsat ortaya çıkana kadar çevrede uzun vadeli devam edebiliyoruz2,4. Csg operon ekspresyonunu kontrol eden düzenleyici unsurların çoğu5ile karakterize edilir. Ancak, dışında adrA ve csg operon6,CSGD birkaç düzenleyici hedefleri bilinmektedir. CsgD düzenleyici ağının belirlenmesi Salmonella yaşam döngüsünü ve biyofilmlerin iletimde oynadığı rolü daha iyi anlamamıza yardımcı olacaktır.
Chromatin immünopresidümünde yüksek iş yapma lı sekanslama (ChIP-seq) protein-DNA etkileşimlerinin genom çapında tanımlanması için güçlü bir in vivo tekniğidir ve transkripsiyon faktörleri, histon modifikasyonları veya nükleozomları içeren düzenleyici süreçler hakkında bilgi sağlar7. Yeni çalışmalar büyüme koşulları ve hücre tipleri arasında diferansiyel protein bağlanması değerlendirmek için bu tekniği kullandık8. Kromatin immünopresipitendinde (ChIP), etkileşen proteinlere sahip DNA parçaları hedef proteinlerin antikor seçimi ile zenginleştirilmiştir. Hücreler hasat edilir ve DNA bağlayıcı proteinler formaldehit çapraz bağlayıcı tedavisi ile in vivo DNA'ya bağlanır. Hücreler lysed, hücre içeriğini serbest, ve kromatin yaklaşık 200-600 bp parçaları7içine ayrılır. Hedef proteine bağlı DNA parçaları antikor kullanılarak immünopsipitated ve protein sindirim9takip de-crosslinking tarafından izole edilir. Bu DNA parçaları bir mikrodizi (ChIP-chip) veya derin sıralama ve genom dizisi10,11için haritalama ile hibridizasyon ile eşleşen protein bağlayıcı siteleri temsil eder. ChIP-chip deneyleri yeterli düzenleyici veri sağlamak rağmen, pahalı probların kullanımı nedeniyle sınırlıdır, yanı sıra hibridizasyon ve dizi önyargı12. ChIP-seq artan nükleotit çözünürlüğü ve kapsama alanı, geliştirilmiş sinyal-gürültü oranı ve ChIP-chip7ile karşılaştırıldığında daha az eser ile daha büyük bir dinamik aralığı vardır.
ChIP Salmonella serovar Typhimurium13Sfh ve OmpR regülasyon analiz etmek için kullanılmıştır,14, Vibrio alginolyticus15çoğunluk algılama AphA düzenleme, Escher RpoS düzenleme ichia coli16, Mycobacterium tuberculosisvirülans düzenleyici EspR düzenleme17, Pseudomonas aeruginosaAmrZ düzenleme ile potansiyel diguanylate siklazlar18, yanı sıra VraSR Staphylococcus aureus19yönetmelik. Tarif edilen bakteriyel ChIP-seq deneyleri sıvı ortamda büyüyen hücreler ve tek hücre şeklinde hasat ile başlar. Ancak, biyofilmlerin analizi ve buna karşılık gelen gen düzenlemesi, başarılı bir ChIP-seq protokolü oluşturmak için yeni bir dizi zorluğu temsil etmektedir. Bu protokolde, ChIP-seq CsgD, S diferansiyel düzenleyici hedefleri bulmak için kullanılır. Biyofilm ve planktonik hücre tiplerinde tiporium ana biyofilm regülatörü. Bu protokol, ChIP-seq için uygun miktarda biyofilm belirlemek, şişe kültüründen hasat biyofilm, biyofilm ve tek hücre kontrol örneklerini normalleştirmek, biyofilm homojenize ve komple immünopresitam immünopredimi belirlemek için kullanılan teknikleri tanımlar. Bu bakteriyel biyofilmlerde düzenleyici hedefleri incelemek için yararlı olacak ve birçok tür için adapte edilebilir.

<table><tbody><tr><td>Agaroz tozu</td><td>FroggaBio</td><td>A87-500G</td><td></td></tr><tr><td>Terazi (Explorer pro)</td><td>Ohaus</td><td>EP214</td><td></td></tr><tr><td>Masaüstü Santrifüj (8510R)</td><td>Eppendorf</td><td>022627023</td><td></td></tr><tr><td>Biyoanalizörü 2100</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>BR dsDNA kiti</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32850</td><td></td></tr><tr><td>ChIP Sınıfı Protein G Manyetik Boncuklar</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi</td><td>9006</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, EDTA İçermeyen Proteaz İnhibitörü Kokteyl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>COEDTAF-RO ROCHE</td><td></td></tr><tr><td>Konik tüp 15 mL</td><td>FroggaBio</td><td>TB15-500</td><td></td></tr><tr><td>Konik tüp 50 mL</td><td>FroggaBio</td><td>TB50-500</td><td></td></tr><tr><td>DC Protein Test Kiti II</td><td>BioRad</td><td>5000112</td><td></td></tr><tr><td>Tek Kullanımlık Küvet, 1,5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-127</td><td></td></tr><tr><td>Elektroforez ekipmanı (mini-PROTEAN)</td><td>Bio-Rad</td><td>1658000</td><td></td></tr><tr><td>Yer santrifüjü (Sorvall Evolution RC)</td><td>Thermo Scientific</td><td>728211</td><td></td></tr><tr><td>Florometre (Qubit 3.0)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549</td><td></td></tr><tr><td>GelRed&reg; Nükleik Asit Jel Lekesi 10 000x suda</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek Hassasiyetli DNA kiti</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>İnkübatör (sallama)</td><td>VWR</td><td>1570-ZZMFG</td><td></td></tr><tr><td>İnkübatör (Su banyosu sallama)</td><td>New Brunswick</td><td>G76D</td><td></td></tr><tr><td>LB ortamı</td><td>VWR</td><td>90000-808</td><td></td></tr><tr><td>Manyetik stand (DynaMag)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj (soğutmalı)</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj Tüpleri, 1.5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq Reaktif Kiti v3 (150 döngü)</td><td>Illumina</td><td>MS-102-3001</td><td></td></tr><tr><td>Mikser değirmeni</td><td>Retsch</td><td>MM400</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene 115 mL Filtre Üniteleri, Steril, 0.2 &; m gözenek boyutu</td><td>Thermo Scientific</td><td>73520-980</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Illumina</td><td>New England BioLabs</td> için Ultra DNA Kütüphanesi Hazırlık Kiti <td>E7370S</td><td></td></tr><tr><td>NGS Temizleme ve Boyut Manyetik boncukları seçin</td><td>Machery-Nagel</td><td>744970.5</td><td></td></tr><tr><td>Normal fare serumu</td><td>AbCam</td><td>ab188776</td><td></td></tr><tr><td>Şeffaf Kapaklı Petri Kapları (100 mm x 15 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Pipet kontrol cihazı</td><td>FroggaBio</td><td>MP001</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaz K</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM2542</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Saflaştırma Kiti</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Tavşan Anti-FLAG Poliklonal Antikor</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7425</td><td></td></tr><tr><td>RNase A (10 mg/mL; DNaz ve proteaz içermez)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Döner tekerlek</td><td>Kristal Teknolojileri & Endüstriler</td><td>TR 01A</td><td></td></tr><tr><td>Güvenli Kilitli Tüpler (2.0 mL, renksiz)</td><td>Eppendorf</td><td>22363344</td><td></td></tr><tr><td>Serolojik pipet 25 mL</td><td>FroggaBio</td><td>94024</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometre</td><td>Montreal Biotech Inc.</td><td>Libra S22</td><td></td></tr><tr><td>Paslanmaz Çelik Boncuklar, 5 mm</td><td>Qiagen</td><td>69989</td><td></td></tr><tr><td>Konik mikro uç 1/8" (3mm) Sonikatör probu</td><td>Sonics & Malzemeler, Inc.</td><td>630-0418</td><td></td></tr><tr><td>Tripton ortamı</td><td>VWR</td><td>90000-286</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasonik Sıvı İşlemci (Sonikatör)</td><td>Sonics & Malzemeler, Inc.</td><td>VC300</td><td></td></tr><tr><td>Vakum ekipmanı (Vacufuge plus)</td><td>Eppendorf</td><td>022820001</td><td></td></tr><tr><td>Su banyosu 1 (Lab-line aquabath)</td><td>Thermo Scientific</td><td>18000-1</td><td></td></tr><tr><td>Su banyosu 2 (Hassas)</td><td>Thermo Scientific</td><td>51221044</td><td></td></tr></tbody></table>

kromatin İmmünenasyon ve yüksek İş kelejisi kullanarak salmonella biyofilmde csgd düzenleyici hedeflerin keşfedilmesi (chip-seq)

Discovering CsgD Regulatory Targets in Salmonella Biofilm Using Chromatin Immunoprecipitation and High-Throughput Sequencing (ChIP-seq)

Kromatin immünopresidididial (ChIP-seq) transkripsiyon faktörlerinin düzenleyici hedeflerini, histon modifikasyonlarını ve dna ile ilişkili diğer proteinleri keşfetmek için kullanılabilecek bir tekniktir. ChIP-seq verileri, transkripsiyon faktörlerinin farklı çevre koşullarında veya hücre tiplerinde diferansiyel bağlanmasını bulmak için de kullanılabilir. Başlangıçta, ChIP bir mikrodizi (ChIP-chip) hibridizasyon yoluyla yapıldı; ancak, ChIP-seq teknolojik gelişmeler, sıralama için mali engelleri azaltarak ve yüksek kaliteli veri çıkışı büyük miktarlarda ile tercih edilen yöntem haline gelmiştir. Bu protokolde, kalıcı ve kronik enfeksiyonların önemli bir kaynağı olan bakteriyel biyofilmlerle ChIP-seq yapmanın teknikleri açıklanmıştır. ChIP-seq Salmonella enterica serovar Typhimurium biyofilm ve planktonik hücreler üzerinde yapılır, ana biyofilm regülatörü hedefleyen, CsgD, iki hücre tipinde diferansiyel bağlayıcılığı belirlemek için. Burada, hasat için uygun miktarda biyofilm göstermek, bir planktonik kontrol örneğine normalleştirme, çapraz bağlayıcı erişim için biyofilm homojenleştirme, ve yüksek kaliteli sıralama sonuçları elde etmek için rutin ChIP-seq adımları gerçekleştirerek.

Bakteriyel biyofilmden renktin immünopresidiplisi örneklerinin hazırlanması, Şekil 1'degösterildiği gibi birkaç adım içerir. Bunlar arasında şişe kültüründe biyofilm yetiştirmek, şartlı ortam toplamak, kontrol olarak yeterli miktarda biyofilm ve planktonik hücre toplamak, PBS'de hücreleri yıkamak, homojenizasyon, proteinleri DNA'ya bağlama, hücreleri lysing, dna'yı sonication ile parçalamak, uygun antikor lar ve protein G boncukları ile DNA'yı ayırmak, immünoppresipitated DNA'yı yıkamak ve elüt etmek ve kitaplık ve sökücük söktürücü için DNA'yı arındırmak yer almaktadır.
S. Biyofilm indükleyen koşullar altında sıvı kültüründe yetişen tiporium hücreleri çok hücreli biyofilm agregaları ve planktonik hücreler oluşturmak için fenotip geçiş uğrar. Bu popülasyon, daha yüksek diolanylate siklaz (DGC) ve biyofilm regülatörleri düzeylerini ifade eden yaklaşık @ biyofilm agregaları ve virülansla ilişkili genlerin daha yüksek düzeylerini ifade eden ` planktonik hücreler içerecektir2,4 (Şekil 2A). Bu protokolde, chip-seq ile transkripsiyon sitelerini karşılaştırmak için her iki hücre türünü de hasat etme yöntemini açıklıyoruz; ancak bu protokol diğer bakteri türlerinin oluşturduğu diğer biyofilm türlerine uyarlanabilir. Biyofilm agregaları ve planktonik hücreler, biyofilm peletleri ve planktonik hücreleri supernatant2'de bırakan yavaş hızlı santrifüj ile ayrılırlar (Şekil 2B). Hücre türleri daha sonra protokoldeki sonraki adımlar için ayrı ayrı işlenir.
ChIP-seq için önerilen DNA girişi miktarı 10-25 μg20'dir. S.'de. Tiphimurium flask kültürü, 30 mg biyofilm yaklaşık 25 μg DNA verir. Biyofilm agregaları proteinayağ agregaları bol miktarda hücre dışı materyale sahip olduğundan, bunun çapraz bağlanmanın verimliliğini etkilayacağını varsaydık. Eğer sadece farklı hücre tiplerini hücre sayısına göre normalleştirirsek, planktonik hücrelerin tedavisi immünoprediyağış için sunulan eşit olmayan miktarda çapraz bağlı ürünle sonuçlanabilir. 30 mg biyofilm ile eşleşen planktonik hücre materyalinin eşdeğer miktarını belirlemek için protein tözleri yapıldı(Şekil 3). 6.0 OD600 planktonik hücre 30 mg biyofilm ile eşleşecek şekilde hasat edildi.
Biyofilm agregaları öncelikle tüm hücrelere çapraz bağlantının eşit erişimini sağlamak için birbirinden ayrılmalıdır. Hücreleri homojenize etmenin en düzgün ve yüksek iş çıkışlı yolunun bir mikser değirmeni ve 5 mm paslanmaz çelik boncuk(Şekil 4A)kullandığını bulduk. Planktonik hücreler, ChIP-seq deneyindeki değişkenleri azaltmak için aynı şekilde tedavi edilir(Şekil 4B).
DNA sonication tarafından parçalanmış, çapraz bağlı ve RNase ve Proteinaz K ile tedavi edildikten sonra, bir görselleştirilmiş olabilir 2% agarose jel. Sonicated DNA agarose jel üzerinde bir yayma olarak görünen parçaların bir koleksiyon adi. Ortalama parça boyutu, artan sayıda sonication patlaması ile azalır (Şekil 5). Enerji transferi farklı sonicator birimleri için değişir, bu nedenle bir sonication testi daha az 1 kb ortalama DNA parçalamak için gerekli sonication patlamaları sayısını belirlemek için tavsiye edilir. ChIP-seq deneyimiz için 5 patlama seçtik.
ENCODE kılavuzları bir immünoblot21ile antikor hedef bağlama aktivitesinin onayını öneririz. Bu durumda antikorimizin özgüllüğünü ve bağlanma gücünü immünoblot ile tüm hücre lisatlarında ölçtük (Şekil 6). Antikorların CsgD-3xFLAG'a bağladığını doğruladık. anti-FLAG ve anti-CsgD sinyalleri beklenen molekül ağırlığı (28 kDa)22colocalize .
ChIP prosedürleri genellikle düşük konsantrasyonlarda DNA verir. Bu nedenle, kirletici maddeleri ortadan kaldıran ve DNA'nın yüksek oranda tutulan bir arıtma yöntemi seçilmiştir. Manyetik boncuk arınması kolon bazlı arınma üzerine seçilmiştir, çünkü düşük giriş konsantrasyonlarında ChIP DNA'sını daha iyi tutmuştur(Şekil 7) ve çıkarılan kirleticiler (veriler gösterilmemiştir).
DNA'nın başlangıç miktarlarının azalması nedeniyle, ChIP DNA'sının kütüphane hazırlanması seyreltilmiş adaptörler ve PCR zenginleştirme gerektirebilir. Sıralamadan önce, kitaplıklar, PCR zenginleştirmeden önce ve sonra doğru boyut dağılımını doğrulamak için Bioanalyzer izi ile görüntülenebilir(Şekil 8). Ayrıca, transkripsiyon faktörünün bilinen bir düzenleyici hedefi varsa, immünopprepititated ve sonicated input DNA'da bilinen hedef ve referans gen dizisi bolluğu arasında kıvrım değişimi (•Ct) karşılaştırArak bağlayıcı bölgelerin zenginleşmesini doğrulamak için qPCR kullanılmalıdır.
ChIP sıralama verileri kalite puanları atayarak, düşük kaliteli tabanları kırparak, ileri ve geri okumaları hizalayarak (eşleştirilmiş uç sıralamada), yüksek kaliteli referans genomuna monte edilerek, arka plan üzerinde zirveler bularak ve akış aşağı analizi yaparak analiz edilmelidir(Şekil 9A). Downstream analizi görselleştirme ve zirvelerin ek açıklama, biyolojik çoğaltma örnekleri ile tutarlılık ve motif analizi içermelidir ve koşullar veya hücre türleri arasında diferansiyel bağlama analizi ve bilinen yollardan gen ekspresyonu ile veri entegrasyonu içerebilir. Bizimki gibi ChIP-seq verileri için zirveler, sadece kat-değiştir ile değil, p değeri tayini ile arka planın önemli ölçüde üzerindeolaraktanımlanmalıdır . Son tahlilde, eşlenen okumalar referans genomun ek açıklamalarına göre görselleştirilmiştir (Şekil 9D). Kötü bir ChIP-seq sonucu arka plan üzerinde herhangi bir önemli zirveleri olmadan giriş-seq gibi görünür.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60736/60736fig1.jpg"> Şekil 1: Bakteriyel biyofilmler ile ChIP-seq adımlarıN Çizimi. Açıklanan prosedürde, S. Tiphimurium hücreleri 28 °C'de %1 Tripton şişe kültüründe sallayarak (1) yetiştirilir, yeterli miktarda biyofilm ve planktonik hücre toplamak için kullanılan biyofilm hücre tiplerinin (2) işlenmesi için hücre içermeyen koşullu ortam toplanır (3). Bu hücreler PBS ile yıkanır ve biyofilmi ayırmak için homojenize edilir (4). Proteinler formaldehit çapraz bağlantı lı DNA ile DNA'ya bağlanır ve hücreler hücre içeriğini serbest bırakmak için lysed edilirler (5). Hücre lysate'deki DNA sonication ile parçalanır (6). Hedef proteine bağlanan DNA, immünoprepitasyon yoluyla hedef proteine ve Protein G manyetik boncuklara bağlanan bir antikor ile seçilir (7). Seçilen DNA, Protein G manyetik boncuklarından (8) yıkanır ve eluted ve kütüphane hazırlama ve sıralama için saflaştırılır (9). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60736/60736fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60736/60736fig2.jpg"> Şekil 2: S eğitimi için in vitro flask modeli. Typhimurium biyofilm geliştirme. (A) S. 28 °C'de 13 saat için %1 tripton da yetiştirilen tipotriyum hücreleri, şişe kültürünün sıvı fazında biyofilm agregaları ve planktonik hücreler oluşturmak için fenotip geçişinden geçerler. (B) (A)'daki şişe kültüründeki biyofilm agregaları ve planktonik hücreler 2 dk için 210 x g santrifüj ile ayrılmıştır. Supernatant planktonik hücre preparatları için hasat edildi ve pelet biyofilm hücre preparatları için hasat edildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60736/60736fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60736/60736fig3a.jpg"> Şekil 3: S'den alınan planktonik hücreler ve biyofilm hücre örnekleri için toplam protein konsantrasyonları. Typhimurium flask kültürü. Kolorimetrik protein tahlilleri yapıldı ve BSA standart eğrisine göre protein miktarları 750 nm olarak ölçüldü. 4.0, 6.0 ve 8.0 OD600'de lysed planktonik hücre örneklerinin protein içeriği 30 mg biyofilm agregası ile karşılaştırıldı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60736/60736fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60736/60736fig4.jpg"> Şekil 4: S'den alınan hücre örneklerinin homojenizasyonu. Typhimurium biyofilm flask kültürleri. (A) PBS'de (solda) yeniden askıya alınan şişe kültüründen biyofilm agregaları 30 Hz'de 5 dakika (sağda) bir mikser değirmeni kullanılarak homojenleştirildi. (B) PBS'de yeniden askıya alınan şişe kültüründen planktonik hücreler, hücre tipi numuneler arasında tutarlılık sağlamak için 30 Hz'de 5 dk'da mikser frezesi ile işlendi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60736/60736fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60736/60736fig5a.jpg"> Şekil 5: ChIP öncesi hücre lisatları ile sonication tsay. Biyofilm agregası ve planktonik hücre örnekleri ayrıldı, homojenleştirildi, çapraz bağlandı ve lysed edildi. DNA-protein kompleksleri, DNA'yı daha küçük parçalara ayırmak için 30 s açıkve 2 dakika kapalı buzda 8 kez sonicated edildi. Sonicated lysate bir kısmı% 2 agarose jel ayrıldı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60736/60736fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60736/60736fig6a.jpg"> Şekil 6: ChIP-seq'da kullanılan anti-FLAG antikorlarının hedef bağlayıcı özgüllüğü. Antikor özgüllüğü, S'nin flask kültürlerinden hazırlanan tüm hücre lisatlarına karşı immünoblotlama ile değerlendirildi. Typhimurium suşları gösterildiği gibi. Strain (csgD + p3xFLAG/csgD/ csgD) ve WT biyofilm örnekleri şişelerden toplanan biyofilm agregalarını temsil ederken, gerinimcsgD ± p3xFLAG ve WT planktonik hücreler planktonik hücreleri temsil eder. Saflaştırılmış CsgD bir kontrol olarak yüklendi. Tüm hücre lisatları normalleştirildi, böylece her kulvarda 30 μg toplam protein analiz edildi. Soldaki sayılar, prestained molekül ağırlık belirteçlerinin boyutunu (kDa olarak) ifade eder. Üst leke için kullanılan primer antikor tavşan-anti-FLAG poliklonal antikor (Sigma-Aldrich #F7425), alt leke ise tavşan-anti-FLAG ile birlikte CsgD spesifik monoklonal antikor2ile inkübe edildi . Keçi anti-tavşan IgG (LiCor IRDye 680RD, 925-68071) ve keçi anti-fare IgG (LiCor IRDye 800CW, 925-32210) ikincil antikorlar olarak kullanıldı. Floresan sinyalleri Odyssey CLx görüntüleme sistemi ve Image Studio 4.0 yazılım paketi (Li-Cor Biosciences) kullanılarak görselleştirildi. Temsili görüntüler gösterilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60736/60736fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60736/60736fig7a.jpg"> Şekil 7: ChIP-seq deneylerinden kaynaklanan az miktarda DNA için kolon veya manyetik boncuk bazlı arınma stratejileri. Bilinen miktarda DNA örnekleri kolon bazlı kitler veya manyetik boncuklar kullanılarak saflaştırılmış ve eluat konsantrasyonu saflaştırma sonrası ölçüldü. Manyetik boncuklar düşük DNA düzeylerinde daha iyi iyileşme gösterdi, genellikle ChIP-seq protokolünün sonunda karşılaşılan düşük MIKTARDA DNA benzer, ancak NGS kütüphane hazırlama önce. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60736/60736fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60736/60736fig8.jpg"> Şekil 8: ChIP DNA preparatları ve sonraki kütüphaneler Bioanalyzer tarafından görselleştirildi. (A) Hücre lisisi ve sonication sonra genomik DNA ortalama parça boyutu &lt;1000 bp, 200-500 bp aralığında parçaların çoğunluğu ile. (B) Kütüphane hazırlığı için başlangıç malzemesi tespit altındaydı. (C) Adaptör ligasyonu ve PCR zenginleştirme kütüphane parçalarının amplifikasyonuna olanak sağlar. (D) Kötü bir kütüphane hazırlığı düşük DNA zirveleri, tek şekilli veya yüksek molekül ağırlıklı zirveleri veya yaklaşık 100 bp bol adaptör zirveleri <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60736/60736fig8large.jpg" target="_blank">vardır.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60736/60736fig9a.jpg"> Şekil 9: ChIP-seq verileri biyoinformatik araçlar kullanılarak analiz edilir ve genom tarayıcısında görselleştirilir. A. ChIP-seq verilerinin tipik biyoinformatik analizi için akış şeması. Biyofilm için ham okumalar(csgD süzme + p3xFLAG/csgD)ve planktonik hücreler(csgD + p3xFLAG) düşük kaliteli okuma ve adaptörler için temizlenmiş ve S.'yeeşlenmiştir. Typhimurium 14028s genomları (kromozom için NC_016856.1 ve plazmid için NC_016855.1) Bowtie2 (v2.3.3.1) tarafından varsayılan parametreleri23. MACS2 (v2.1.2) '-q 0.01 - nomodel' parametreleri ile zirveleri aramak için kullanıldı, test veri setleri ve planktonik olanlar kontrol olarak biyofilm kopyaları alarak24. MACS2 bdgcmp modülü daha '-m FE' parametreleri ile kat zenginleştirme parça oluşturmak için kullanılmıştır. Kat zenginleştirme parça ile önemli zirve dosyası bedtools / bedClip / bedGraphToBigWig25 kullanarak bir peruk dosyasına dönüştürülmüş ve entegre Genomik Görüntüleyici v2.5.126kullanarak referans genom görselleştirilmiş . Temsili zirveler gösterilir (kırmızı çubuklar). (B) Birden fazla tepe içeren ~40 kbp büyük bölge, atipik bir sonuç ama yine de potansiyel olarak değerlidir. (C) Bu daha tipik bir sonuçtur, iki önemli tepe bölgeleri gösteren. (D) C'de sol tepeyi yakınlaştırın, S bölgesine haritalama okumalarını gösterir. Typhimurium 14028s genom uspA ve uspBiçin farklı organizatörler içeren . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60736/60736fig9alarge.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Hücre lisis arabellekleri</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lysis arabelleği</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 mM Tris-HCl pH 8.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 mM EDTA</td>
		</tr>
<tr>
<td>%1 SDS</td>
		</tr>
<tr>
<td>proteaz inhibitörleri</td>
		</tr>
<tr>
<td>IP seyreltme tamponu</td>
		</tr>
<tr>
<td>20 mM Tris-HCl pH 8.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 mM EDTA</td>
		</tr>
<tr>
<td>150 mM NaCl</td>
		</tr>
<tr>
<td>%1 Triton X-100</td>
		</tr>
<tr>
<td>%0,01 SDS</td>
		</tr>
<tr>
<td>İmmünyağış tamponları</td>
		</tr>
<tr>
<td>IP yıkama tamponu 1</td>
		</tr>
<tr>
<td>20 mM Tris-HCl pH 8.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 mM EDTA</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 mM NaCl</td>
		</tr>
<tr>
<td>%1 Triton X-100</td>
		</tr>
<tr>
<td>%0,1 SDS</td>
		</tr>
<tr>
<td>IP yıkama tamponu 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 mM Tris-HCl pH 8.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>250 mM LiCl</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 mM EDTA</td>
		</tr>
<tr>
<td>%1 NP-40</td>
		</tr>
<tr>
<td>%1 deoksikolik asit</td>
		</tr>
<tr>
<td>TE (T10E1) pH 8.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 mM Tris-HCl</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 mM EDTA</td>
		</tr>
<tr>
<td>Elüsyon arabelleği</td>
		</tr>
<tr>
<td>%1 SDS</td>
		</tr>
<tr>
<td>100 mM NaHCO3</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1. Tampon tarifleri.

Kromatin immünopresididimi yeni nesil dizileme (ChIP-seq) ile birleştiğinde transkripsiyon faktörleri ile kontrol ettikleri genomik diziler arasındaki etkileşimleri kurmak için kullanılan bir yöntemdir. Bu protokol, salmonella enterica serovar Typhimurium bakteriyel biyofilm örnek olarak kullanarak, bakteriyel biyofilm ile ChIP-seq gerçekleştirmek için teknikleri özetliyor.

Kromatin İmmünenasyon ve Yüksek İş Kelejisi Kullanarak Salmonella Biyofilmde CsgD Düzenleyici Hedeflerin Keşfedilmesi (ChIP-seq)

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-seq) is a technique that can be used to discover the regulatory targets of transcription ...

Kromatin immünopresididiplasyon veya ChIP-seq takip, transkripsiyon faktörleri, histon modifikasyonları ve diğer DNA ile ilişkili proteinlerin düzenleyici hedefleri keşfetmek için kullanılabilecek bir tekniktir. ChIP-seq'da hücreler hasat edilir ve DNA bağlayıcı protein. formaldehit ile in vivo DNA'ya çapraz bağlanır.Hücreler lysed, hücre içeriği serbest ve kromatin daha az 1000 baz çiftleri, genellikle 200 ve 600 baz çiftleri arasında parçalar halinde ayrılır. Hedef proteinle etkileşime girilen DNA, antikor kullanılarak immünopsipitated ve de-crosslinking ile izole edilir. DNA protein çapraz bağları tersine çevrilir ve RNA ve protein sindirilir.DNA saflaştırılır, kütüphanelere dönüştürülür ve sıralanır. ChIP-seq verileri, transkripsiyon faktörlerinin farklı çevre koşullarında veya hücre tiplerinde diferansiyel bağlanmasını bulmak için de kullanılabilir. Başlangıçta, ChIP bir mikrodizi üzerinde hibridizasyon yoluyla yapıldı.Ancak, ChIP-sıralama teknolojik gelişmeler, sıralama için mali engelleri azaltarak ve büyük yüksek kaliteli veri çıkışı nedeniyle tercih edilen yöntem haline gelmiştir. Bu protokolde, kalıcı ve kronik enfeksiyonların önemli bir kaynağı olan bakteriyel biyofilmlerle ChIP-seq yapmanın tekniklerini göstereceğiz. ChIP-seq salmonella typhimurium biyofilm ve planktonik hücreler üzerinde yapılacak, ana biyofilm regülatörü hedefleyen, CSGD, iki hücre tipinde diferansiyel bağlama belirlemek için.Bu videoda, hasat için uygun biyofilm miktarını belirleme, planktonik kontrol örneğine normalleştirme, çapraz bağlantı için biyofilm homojenleştirme ve yüksek kaliteli sıralama sonuçları elde etmek için rutin ChIP-seq adımları gerçekleştirme tekniklerini göstereceğiz. Streak plaka salmonella enterica koloniler izole etmek ve 37 derece santigrat gecede bir LB agar plaka üzerinde bizim tiphimurium hizmet vermektedir. Beş mL LB suyu çizgi plaka bir ila üç kolonileri ile aşılamak ve yedi saat sallayarak veya büyüme günlük 37 derece santigrat inkübat.Şişe kültürünün optik yoğunluğunu 600 nanometrede bulun, bir spektrofotometre kullanarak ve bir OD 600 eşdeğer hücre kültürü veya dokuz hücreye 10 tane ekleyin. 28 derecede 13 saat boyunca titreyerek kuluçkaya yat. Biyofilm hücreleri birleştirilmiş pullar olarak görünür ve tek planktonik hücreler bulutlu ortamda bulunmaktadır.Biyofilm son derece dayanıklıdır ve tüplerve pipet uçlarının kenarlarına yapışır. Biz başlangıçta biyofilm taşımak için klimalı medya kullanın ve medyaprotein crosslinking yüzeyleri kaldırmak için crosslinking hemen önce sıcak PBS kullanın. Araştırmacılar biyofilm yeniden askıya almak için uygun bir çözüm bulmak gerekebilir.10 santigrat derece 10 dakika için 12, 000 G bir santrifüj tüp ve santrifüj şişe kültürü toplayın. Supernatant'ı 0,2 mikrometre filtre ünitesine ve vakum filtresine ayırın. Aliquot iki hücre türünü ayırmak için yavaş hızda tüpler ve santrifüj içine kültür şişe.Biyofilm hücreleri tüpün altındaki pelette, tek hücreler ise bulutlu süpernatanttadır. Pipet supernatant daha sonra için bir santrifüj tüpü içine planktonik hücreleri içeren. ChIP-seq deneyleri için 25 mikrogram DNA girişi önerilir.Bizim durumumuzda, 30 miligram biyofilm yaklaşık 25 mikrogram DNA verir. Biyofilm agregaları proteinayağ agregalarının bolmiktarda proteinasahip iler, çapraz bağlantı için rekabet eder ve immünopresidasyon için sunulan eşit olmayan çapraz bağlı ürünle sonuçlanabilir. Protein konsantrasyonu ile eşdeğer hücre materyalini belirlemek için bir protein teşp.Bu durumda, altı OD 600 planktonik hücreler biyofilm 30 miligram için bir kontrol olarak hasat edilir. Biyofilm ıslak ağırlıkta hasat edilir ve koloni tarım üniteleri biyofilm gösterilen dönüşüm faktörü kullanılarak bulunabilir. Araştırmacılar homojenizasyon ve damla seyreltme ile birlikte çalıştıkları biyofilm oluşturan türlerin dönüşüm faktörünü bulmaya teşvik edilmektedir.Biyofilm peletini bir mililitre lik koşullu triptona yeniden askıya alın ve önceden tartılmış iki mililitrelik bir kapak veya vidakapağı tüpüne geçin. 11,000 G.'de bir dakika santrifüj. Agregaların ağırlığını bulmak için tüp ağırlığını biyofilm ile tüpün ağırlığından çıkarın.Hedef biyofilm ağırlığının %10'u içinde olmalıdır. Biyofilm agregalarını yeniden askıya almak için bir mililitre PBS ve girdap ekleyin. Süpernatant'ı yavaş hızlı santrifüjden santrifüj tüplerine dağıtın.Bir spektrofotometre kullanarak planktonik hücrelerin optik yoğunluğunu 600 nanometre olarak ölçün ve altı od 600 son bir OD 600 için gerekli hacmi hesaplamak. Flora santrifüjünden 10 dereceye kadar serin ve Flora santrifüjünden oluşan planktonik hücreleri peletle. 10, 000 G'de 10 derecede 10 dakika santrifüj.Supernatant çıkarın ve PBS pelet yeniden askıya. Bir spektrofotometre kullanarak planktonik hücrelerin OD 600'ünü yeniden ölçün ve altı OD 600 planktonik hücrenin hacmini iki mililitrelik bir kapak veya vida kapağı tüpüne dağıtın. Çapraz bağlantının hücrelere erişebilmesi için biyofilm agregaları birbirinden ayrılmalıdır.Planktonik hücreler değişkenleri azaltmak için biyofilm hücreleri ile aynı şekilde tedavi edilir. Bir mikser fabrikasında metal boncuk ların kullanılması, biyofilmi ayırmak için cam doku homogenizers'den daha etkili olabilir. Aseptik, tüplerin her biri için bir sterilize metal boncuk ekleyin.30 Hertz beş dakika için bir mikser değirmeni kullanarak homojenize. Biyofilmin homojenleşmiş hücreleri 1,5 mililitrelik yeni bir tüpe aktarmadan önce parçalandığını doğrulamak için toplu tüpleri gözlemleyin. PBS ile bir mililitre ye hacmi getirin.Bu noktada, giriş hücrelerini saymak için damla seyreltme yapmak isteğe bağlıdır. Taze formaldehiti numune tüplerine yüzde bir nihai konsantrasyona dağıtın. Dönen bir tekerlek üzerinde oda sıcaklığında 30 dakika kuluçka.Çapraz bağlamayı söndürmek için 125 milimolar son konsantrasyonuna glisin ekleyin ve dönen bir tekerlekte oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatın. Hücreleri yıkamak ve fazla crosslinker kaldırmak için, 8, 000 G üç dakika santrifüj ve supernatant çıkarın. Proteaz inhibitörleri ve filtre sterilize 500 mikrolitre pelet yeniden askıya.600 mikrolitre likis tamponu içinde peleti yeniden askıya alın ve 10 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın. Kısmi lysate'yi 1,4 mililitre IP seyreltme tamponu içeren yeni bir tüpe taşıyın. Bir buçuk ila iki saat buzda tutun ve ara sıra girdap.Bazı dirençli malzemeler tüplerde kalabilir. Ancak, uzun bir kuluçka dönemi ve ara sıra girdap lar toplu maddeyi parçalayacak ve geri kalanı sonication sırasında bozulacaktır. Sonicator'u ayarla.15 mililitrelik tüpü buzkabına yerleştirin ve sondayı tüpün içine yerleştirin. Nabız 30 saniyelik beş sonication patlamaları için yüzde 20-40 ve sonication mermi arasında serin. Hücre lisate sonication önce bulutlu görünür ve sonication sonra net görünecektir.Çökelmiş malzemeyi çıkarmak için, 8,000 G'de 4 derecede 10 dakika santrifüj ve süpernatantı siyah peletten kaçınarak yeni bir tüpe dağıtın. Sonicator enerji transferi ve hücre tipi direnci bir sonication tsay downstream kütüphane hazırlama ve sıralama için gerekli parça boyutu aralığı üretecek sonication mermi sayısını bulmak için tavsiye edilir bu yüzden farklı olabilir. İmmünenyağış için 1.35 mililitrelik aliquot ve giriş DNA'sı olarak bir 200 mikrolitre aliquot içine sonicated DNA dağıtın.Giriş denetimini eksi 80 santigrat derecede, çapraz bağlama ve sindirme adımlarına kadar tutun. Hedef protein için özgüllüğünü sağlamak için antikorlar test ettikten sonra, immünopresidevar tüpleri antikor ekleyin ve dönen bir tekerlek üzerinde bir gecede dört derece santigrat de kuluçka. Protein G manyetik boncuk50 mikrolitre ekleyin ve üç saat boyunca dönen bir tekerlek üzerinde dört derece santigrat de kuluçka.Boncukları manyetik bir stand kullanarak tüplerin kenarlarına bağlayın ve yıkıntılar yapın. 750 mikrolitre soğuk IP yıkama tamponu ile iki kez yıkayın. Bir tanesini 750 mikrolitre soğuk IP yıkama tamponu ile yıkayın.PH 8'de 750 mikrolitre soğuk TE ile iki kez yıkayın. Yıyıkıyor sırasında tüpleri manyetik standda tutun. Her tüpe 450 mikrolitre IP elüsyon tamponu ekleyin ve her beş dakikada bir hafif girdapla 30 dakika boyunca 65 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.Bir manyetik stand kullanarak tüplerin kenarlarına boncuk bağlayın. Çözelti temizlenene kadar en az iki dakika bekleyin ve temizlenmiş çözeltiyi 1,5 mililitrelik yeni bir tüpe dağıtın. Çapraz bağlantıları tersine çevirmek ve RNA'yı sindirmek için, iki mikrogram RNase sekiz ekleyin ve her tüpteki 0,3 molar'ın son konsantrasyonuna sodyum klorür ekleyin.65 derecede altı saatten fazla veya bir gecede kuluçkaya yat. Proteini sindirmek için, her tüpe 180 mikrogram protein azk ekleyin ve 3-5 saat boyunca 45 derecede kuluçkaya yatırın. DNA'yı arındır.ChIP sırasında elde edilen az miktardaDNA'nın bakteri hücreleri ile izole edilmesi için manyetik boncuklar tercih edilir. Ancak, kolon bazlı veya fenilkloroform ekstraksiyon yeterli ChIP DNA kurtarabilir. Arınma sonrası, kütüphaneler seçilen sıralama platformu ile uyumlu bir kit kullanılarak saflaştırılmış ChIP DNA'sından hazırlanır.ChIP DNA kitaplıkları genellikle minimum sayıda bağdaştırıcı eklemeyi ve maksimum sayıda PCR amplifikasyon döngüsünü gerçekleştirmeyi gerektirir. Kitaplık boyutunu bir biyoanalizörle kontrol edin ve kitaplık konsantrasyonunu bir kübit veya QPCR kitaplık niceleme kitiyle kontrol edin. Kütüphaneleri birleştirin ve seçilen platformun belirtimine göre sıralamaya devam edin.ChIP-seq verilerinin analizi, taban kalitesinin puanlanmasını, düşük kaliteli bazların kırpılmasını, bir montaj okumasını referans genoma hizalamayı, zirveleri çağırmayı, zirveleri genlerle ilişkilendirmeyi ve aşırı temsil edilen bağlayıcı motifleri analiz etmeyi gerektirir. ChIP-seq verileri genellikle düşük bir arka plan seviyesine sahiptir. İmmünyağış hedeflenen protein tarafından kontrol edilen DNA zenginleştirilmiş olacak ve arka plan üzerinde en az iki kat zirveleri olarak görünecektir.Bu videoda salmonella biyofilm ve tek planktonik hücreler üzerinde ChIP-seq yapma yöntemlerini açıklamış ve bu da transkripsiyon faktörü tarafından kontrol edilen genlerde zenginleştirilmiş DNA'nın doruklarına ulaşmıştır. Doğadaki bakteri yaşamının büyük çoğunluğunun biyofilmlerde var olduğu düşünülmektedir ve insan hastalıklarının %40'A kadarının biyofilm ile ilişkili olduğu düşünülmektedir. Bu yüzden muazzam tıbbi ve ekonomik etkileri vardır.Ancak, biyofilm dayanıklı dır ve sayısallaştırmak, açmak ve işlemek daha zordur. Araştırmacılar, uygun miktarda biyofilm hasat etmek, biyofilm, lizis hücreleri, sonicate homojenize etmek, immünopresipitasyon gerçekleştirmek, diğer biyofilm oluşturan bakteri türlerinin DNA'sını arındırmak ve sıralamak için tanımladığımız ChIP-seq tekniklerini kullanabilirler.

discovering-csgd-regulatory-targets-salmonella-biofilm-using

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Sistematik, büyük ölçekli sentetik gen (bir gen ya da gen-epistasis) etkileşim ekranlar genetik ve fazlalık yolu çapraz konuşma keşfetmek için kullanılabilir. Burada, yüksek-throughput kantitatif sentetik genetik dizi tarama teknolojisi tarif eSGA biz epistatik ilişkileri durulaştırmada ve genetik etkileşim ağları keşfetmek için geliştirilen...

Bakteriyel Fonksiyonel Ağlar ve tanımında Haritalama<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Sentetik Genetik Diziler kullanarak

Bu video makalede, iki bileşenli bir sistem yanıt düzenleyici gen hedef ve birleştirme bölgelerini belirlemek için bir in vitro mikro-dizi göre bir yöntem açıklanır.

Bakteriyel için iki bileşenli Düzenleme Sistemleri Gen Hedefler belirlemek için DNA afinite-saflaştırılmış Chip (DAP-chip) Yöntem

Bu makalede, başarılı antibakteriyel ilaç keşfi ve bileşik testi için yeni bir güçlü bir araç sağlayarak, Pseudomonas aeruginosa siklik di-GMP hücresel seviyelerini işlemek için potansiyel yeteneği küçük moleküllerin büyük kütüphanelerinin taranması amacıyla kurulmuştur yüksek verimli deneyi anlatır.

Modüle c-di-GMP sinyal İşte Küçük Moleküller Tarama için Yüksek verim Kur kurulması<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Mikrokokal nükleaz (MNase) füzyon proteinleri ile genom çapında protein bağlama bölgelerinin haritalanması için bir kromatin immünopresipitasyon (ChIP) -orthogonal yöntem olan yüksek verimli sekanslama (ChEC-seq) ile birleşince, kromatin endojen bölünmeyi tarif ederiz.

ChEC-seq ile Protein-DNA Etkileşimlerinin Genom Boyunca Haritalandırılması<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Genlerin ve onların düzenleyici elemanlarının arasındaki fiziksel etkileşimleri tanımlaması zordur ama kromozom conformation yakalama yöntemleri tarafından kolaylaştırdı. Bu değişiklik 4C-seq protokolü için PCR önyargı yanında en aza indirgemek PCR şablonları aşırı amplifikasyon azaltır ve bir ek Restriksiyon enzimi Özet adım dahil ederek okur mappability en üst düzeye çıkarır.

Gen düzenleyici dizileri dairesel kromozom Conformation yeni nesil sıralama kullanarak yüksek üretilen iş tanımlaması yakalama (4C-seq)

Burada, gıda ve çevre microbiomes DNA örnekleri uyumlu algılama ve Salmonella quasimetagenomic sıralama yoluyla subtyping hazırlamak için bir iletişim kuralı mevcut. Kombine kullanım kültürü zenginleştirme, immunomagnetic ayrılık (IMS) ve birden çok deplasman amplifikasyon (MDA) Gıda ve çevre örnekleri Salmonella genomik DNA'ın etkili konsantrasyon sağlar.

Metagenomic yarı analiz Salmonella gıda ve çevre örnekleri

Mutagenesis site yönettiği belirli mutasyonların Deoksiribonükleik asit (DNA) tanıtmak için kullanılan bir tekniktir. Bu iletişim kuralı site yönettiği mutagenesis ile 2 adım nasıl açıklar ve ilgi herhangi bir DNA parçası geçerlidir yaklaşım 3 adımlı polimeraz zincir tepkimesi (PCR) dayalı.

Site yönettiği Mutagenesis in Vitro ve Escherichia Coli etkileşimlerde RNA ile örneği Vivo deneyler için

Bu protokol, insan mantar patojeni Candida albicans'ta nükleaz (CUT&amp;RUN) kullanarak hedefler altında bölünme ve salınım için deneysel bir yöntem ve veri analizi iş akışını açıklamaktadır.

Candida albicans'ta Transkripsiyon Faktörü-DNA Bağlanma Etkileşimlerinin Genom Çapında Profillenmesi: Kapsamlı Bir CUT&amp;RUN Yöntemi ve Veri Analizi İş Akışı

Bu makale, genetik kod genişlemesi (GCE) bölgesini kullanarak Salmonella salgılanan efektörlerini spesifik olarak etiketlemek ve doğrudan stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskobu (dSTORM) kullanarak HeLa hücrelerinde salgılanan proteinlerin hücre altı lokalizasyonunu görüntülemek için basit ve açık bir protokol sunmaktadır...

Genetik Kod Genişlemesi Kullanılarak Bakteriyel Salgılanan Proteinlerin Süper Çözünürlüklü Görüntülenmesi

Masaüstü cihazları kullanan tüm genom dizileme (WGS) stratejilerinin fizibilitesi, laboratuvar ortamında halk sağlığı ile ilgili her mikrobun genom sorgulamasını basitleştirmiştir. Bakteriyel WGS için iş akışının metodolojik bir uyarlaması tanımlanmıştır ve analiz için bir biyoinformatik boru hattı da sunulmuştur.

Oreochromis spp. Çiftliklerinden Türetilen Patojenik Bir Escherichia coli Suşunun Karakterizasyonu Tüm Genom Dizilimini Kullanarak

Keşfedin, ChIP-seq yöntemiyle Salmonella biyofilmde CsgD düzenleyici hedeflerini belirleyin. Bu protokol, transkripsiyon faktörü bağlanmasını analiz ederek biyofilm oluşumu mekanizmalarını açıklar.

Kromatin İmmünenasyon ve Yüksek İş Kelejisi Kullanarak Salmonella Biyofilmde CsgD Düzenleyici Hedeflerin Keşfedilmesi (ChIP-seq) (Video) | JoVE Journal

Kromatin İmmünenasyon ve Yüksek İş Kelejisi Kullanarak Salmonella Biyofilmde CsgD Düzenleyici Hedeflerin Keşfedilmesi (ChIP-seq)

Daha fazla video keşfet