Kromatin İmmünenasyon ve Yüksek İş Kelejisi Kullanarak Salmonella Biyofilmde CsgD Düzenleyici Hedeflerin Keşfedilmesi (ChIP-seq)

Kromatin immünopresididiplasyon veya ChIP-seq takip, transkripsiyon faktörleri, histon modifikasyonları ve diğer DNA ile ilişkili proteinlerin düzenleyici hedefleri keşfetmek için kullanılabilecek bir tekniktir. ChIP-seq'da hücreler hasat edilir ve DNA bağlayıcı protein. formaldehit ile in vivo DNA'ya çapraz bağlanır.

Hücreler lysed, hücre içeriği serbest ve kromatin daha az 1000 baz çiftleri, genellikle 200 ve 600 baz çiftleri arasında parçalar halinde ayrılır. Hedef proteinle etkileşime girilen DNA, antikor kullanılarak immünopsipitated ve de-crosslinking ile izole edilir. DNA protein çapraz bağları tersine çevrilir ve RNA ve protein sindirilir.

DNA saflaştırılır, kütüphanelere dönüştürülür ve sıralanır. ChIP-seq verileri, transkripsiyon faktörlerinin farklı çevre koşullarında veya hücre tiplerinde diferansiyel bağlanmasını bulmak için de kullanılabilir. Başlangıçta, ChIP bir mikrodizi üzerinde hibridizasyon yoluyla yapıldı.

Ancak, ChIP-sıralama teknolojik gelişmeler, sıralama için mali engelleri azaltarak ve büyük yüksek kaliteli veri çıkışı nedeniyle tercih edilen yöntem haline gelmiştir. Bu protokolde, kalıcı ve kronik enfeksiyonların önemli bir kaynağı olan bakteriyel biyofilmlerle ChIP-seq yapmanın tekniklerini göstereceğiz. ChIP-seq salmonella typhimurium biyofilm ve planktonik hücreler üzerinde yapılacak, ana biyofilm regülatörü hedefleyen, CSGD, iki hücre tipinde diferansiyel bağlama belirlemek için.

Bu videoda, hasat için uygun biyofilm miktarını belirleme, planktonik kontrol örneğine normalleştirme, çapraz bağlantı için biyofilm homojenleştirme ve yüksek kaliteli sıralama sonuçları elde etmek için rutin ChIP-seq adımları gerçekleştirme tekniklerini göstereceğiz. Streak plaka salmonella enterica koloniler izole etmek ve 37 derece santigrat gecede bir LB agar plaka üzerinde bizim tiphimurium hizmet vermektedir. Beş mL LB suyu çizgi plaka bir ila üç kolonileri ile aşılamak ve yedi saat sallayarak veya büyüme günlük 37 derece santigrat inkübat.

Şişe kültürünün optik yoğunluğunu 600 nanometrede bulun, bir spektrofotometre kullanarak ve bir OD 600 eşdeğer hücre kültürü veya dokuz hücreye 10 tane ekleyin. 28 derecede 13 saat boyunca titreyerek kuluçkaya yat. Biyofilm hücreleri birleştirilmiş pullar olarak görünür ve tek planktonik hücreler bulutlu ortamda bulunmaktadır.

Biyofilm son derece dayanıklıdır ve tüplerve pipet uçlarının kenarlarına yapışır. Biz başlangıçta biyofilm taşımak için klimalı medya kullanın ve medyaprotein crosslinking yüzeyleri kaldırmak için crosslinking hemen önce sıcak PBS kullanın. Araştırmacılar biyofilm yeniden askıya almak için uygun bir çözüm bulmak gerekebilir.

10 santigrat derece 10 dakika için 12, 000 G bir santrifüj tüp ve santrifüj şişe kültürü toplayın. Supernatant'ı 0,2 mikrometre filtre ünitesine ve vakum filtresine ayırın. Aliquot iki hücre türünü ayırmak için yavaş hızda tüpler ve santrifüj içine kültür şişe.

Biyofilm hücreleri tüpün altındaki pelette, tek hücreler ise bulutlu süpernatanttadır. Pipet supernatant daha sonra için bir santrifüj tüpü içine planktonik hücreleri içeren. ChIP-seq deneyleri için 25 mikrogram DNA girişi önerilir.

Bizim durumumuzda, 30 miligram biyofilm yaklaşık 25 mikrogram DNA verir. Biyofilm agregaları proteinayağ agregalarının bolmiktarda proteinasahip iler, çapraz bağlantı için rekabet eder ve immünopresidasyon için sunulan eşit olmayan çapraz bağlı ürünle sonuçlanabilir. Protein konsantrasyonu ile eşdeğer hücre materyalini belirlemek için bir protein teşp.

Bu durumda, altı OD 600 planktonik hücreler biyofilm 30 miligram için bir kontrol olarak hasat edilir. Biyofilm ıslak ağırlıkta hasat edilir ve koloni tarım üniteleri biyofilm gösterilen dönüşüm faktörü kullanılarak bulunabilir. Araştırmacılar homojenizasyon ve damla seyreltme ile birlikte çalıştıkları biyofilm oluşturan türlerin dönüşüm faktörünü bulmaya teşvik edilmektedir.

Biyofilm peletini bir mililitre lik koşullu triptona yeniden askıya alın ve önceden tartılmış iki mililitrelik bir kapak veya vidakapağı tüpüne geçin. 11,000 G.'de bir dakika santrifüj. Agregaların ağırlığını bulmak için tüp ağırlığını biyofilm ile tüpün ağırlığından çıkarın.

Hedef biyofilm ağırlığının %10'u içinde olmalıdır. Biyofilm agregalarını yeniden askıya almak için bir mililitre PBS ve girdap ekleyin. Süpernatant'ı yavaş hızlı santrifüjden santrifüj tüplerine dağıtın.

Bir spektrofotometre kullanarak planktonik hücrelerin optik yoğunluğunu 600 nanometre olarak ölçün ve altı od 600 son bir OD 600 için gerekli hacmi hesaplamak. Flora santrifüjünden 10 dereceye kadar serin ve Flora santrifüjünden oluşan planktonik hücreleri peletle. 10, 000 G'de 10 derecede 10 dakika santrifüj.

Supernatant çıkarın ve PBS pelet yeniden askıya. Bir spektrofotometre kullanarak planktonik hücrelerin OD 600'ünü yeniden ölçün ve altı OD 600 planktonik hücrenin hacmini iki mililitrelik bir kapak veya vida kapağı tüpüne dağıtın. Çapraz bağlantının hücrelere erişebilmesi için biyofilm agregaları birbirinden ayrılmalıdır.

Planktonik hücreler değişkenleri azaltmak için biyofilm hücreleri ile aynı şekilde tedavi edilir. Bir mikser fabrikasında metal boncuk ların kullanılması, biyofilmi ayırmak için cam doku homogenizers'den daha etkili olabilir. Aseptik, tüplerin her biri için bir sterilize metal boncuk ekleyin.

30 Hertz beş dakika için bir mikser değirmeni kullanarak homojenize. Biyofilmin homojenleşmiş hücreleri 1,5 mililitrelik yeni bir tüpe aktarmadan önce parçalandığını doğrulamak için toplu tüpleri gözlemleyin. PBS ile bir mililitre ye hacmi getirin.

Bu noktada, giriş hücrelerini saymak için damla seyreltme yapmak isteğe bağlıdır. Taze formaldehiti numune tüplerine yüzde bir nihai konsantrasyona dağıtın. Dönen bir tekerlek üzerinde oda sıcaklığında 30 dakika kuluçka.

Çapraz bağlamayı söndürmek için 125 milimolar son konsantrasyonuna glisin ekleyin ve dönen bir tekerlekte oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatın. Hücreleri yıkamak ve fazla crosslinker kaldırmak için, 8, 000 G üç dakika santrifüj ve supernatant çıkarın. Proteaz inhibitörleri ve filtre sterilize 500 mikrolitre pelet yeniden askıya.

600 mikrolitre likis tamponu içinde peleti yeniden askıya alın ve 10 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın. Kısmi lysate'yi 1,4 mililitre IP seyreltme tamponu içeren yeni bir tüpe taşıyın. Bir buçuk ila iki saat buzda tutun ve ara sıra girdap.

Bazı dirençli malzemeler tüplerde kalabilir. Ancak, uzun bir kuluçka dönemi ve ara sıra girdap lar toplu maddeyi parçalayacak ve geri kalanı sonication sırasında bozulacaktır. Sonicator'u ayarla.

15 mililitrelik tüpü buzkabına yerleştirin ve sondayı tüpün içine yerleştirin. Nabız 30 saniyelik beş sonication patlamaları için yüzde 20-40 ve sonication mermi arasında serin. Hücre lisate sonication önce bulutlu görünür ve sonication sonra net görünecektir.

Çökelmiş malzemeyi çıkarmak için, 8,000 G'de 4 derecede 10 dakika santrifüj ve süpernatantı siyah peletten kaçınarak yeni bir tüpe dağıtın. Sonicator enerji transferi ve hücre tipi direnci bir sonication tsay downstream kütüphane hazırlama ve sıralama için gerekli parça boyutu aralığı üretecek sonication mermi sayısını bulmak için tavsiye edilir bu yüzden farklı olabilir. İmmünenyağış için 1.35 mililitrelik aliquot ve giriş DNA'sı olarak bir 200 mikrolitre aliquot içine sonicated DNA dağıtın.

Giriş denetimini eksi 80 santigrat derecede, çapraz bağlama ve sindirme adımlarına kadar tutun. Hedef protein için özgüllüğünü sağlamak için antikorlar test ettikten sonra, immünopresidevar tüpleri antikor ekleyin ve dönen bir tekerlek üzerinde bir gecede dört derece santigrat de kuluçka. Protein G manyetik boncuk50 mikrolitre ekleyin ve üç saat boyunca dönen bir tekerlek üzerinde dört derece santigrat de kuluçka.

Boncukları manyetik bir stand kullanarak tüplerin kenarlarına bağlayın ve yıkıntılar yapın. 750 mikrolitre soğuk IP yıkama tamponu ile iki kez yıkayın. Bir tanesini 750 mikrolitre soğuk IP yıkama tamponu ile yıkayın.

PH 8'de 750 mikrolitre soğuk TE ile iki kez yıkayın. Yıyıkıyor sırasında tüpleri manyetik standda tutun. Her tüpe 450 mikrolitre IP elüsyon tamponu ekleyin ve her beş dakikada bir hafif girdapla 30 dakika boyunca 65 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.

Bir manyetik stand kullanarak tüplerin kenarlarına boncuk bağlayın. Çözelti temizlenene kadar en az iki dakika bekleyin ve temizlenmiş çözeltiyi 1,5 mililitrelik yeni bir tüpe dağıtın. Çapraz bağlantıları tersine çevirmek ve RNA'yı sindirmek için, iki mikrogram RNase sekiz ekleyin ve her tüpteki 0,3 molar'ın son konsantrasyonuna sodyum klorür ekleyin.

65 derecede altı saatten fazla veya bir gecede kuluçkaya yat. Proteini sindirmek için, her tüpe 180 mikrogram protein azk ekleyin ve 3-5 saat boyunca 45 derecede kuluçkaya yatırın. DNA'yı arındır.

ChIP sırasında elde edilen az miktardaDNA'nın bakteri hücreleri ile izole edilmesi için manyetik boncuklar tercih edilir. Ancak, kolon bazlı veya fenilkloroform ekstraksiyon yeterli ChIP DNA kurtarabilir. Arınma sonrası, kütüphaneler seçilen sıralama platformu ile uyumlu bir kit kullanılarak saflaştırılmış ChIP DNA'sından hazırlanır.

ChIP DNA kitaplıkları genellikle minimum sayıda bağdaştırıcı eklemeyi ve maksimum sayıda PCR amplifikasyon döngüsünü gerçekleştirmeyi gerektirir. Kitaplık boyutunu bir biyoanalizörle kontrol edin ve kitaplık konsantrasyonunu bir kübit veya QPCR kitaplık niceleme kitiyle kontrol edin. Kütüphaneleri birleştirin ve seçilen platformun belirtimine göre sıralamaya devam edin.

ChIP-seq verilerinin analizi, taban kalitesinin puanlanmasını, düşük kaliteli bazların kırpılmasını, bir montaj okumasını referans genoma hizalamayı, zirveleri çağırmayı, zirveleri genlerle ilişkilendirmeyi ve aşırı temsil edilen bağlayıcı motifleri analiz etmeyi gerektirir. ChIP-seq verileri genellikle düşük bir arka plan seviyesine sahiptir. İmmünyağış hedeflenen protein tarafından kontrol edilen DNA zenginleştirilmiş olacak ve arka plan üzerinde en az iki kat zirveleri olarak görünecektir.

Bu videoda salmonella biyofilm ve tek planktonik hücreler üzerinde ChIP-seq yapma yöntemlerini açıklamış ve bu da transkripsiyon faktörü tarafından kontrol edilen genlerde zenginleştirilmiş DNA'nın doruklarına ulaşmıştır. Doğadaki bakteri yaşamının büyük çoğunluğunun biyofilmlerde var olduğu düşünülmektedir ve insan hastalıklarının %40'A kadarının biyofilm ile ilişkili olduğu düşünülmektedir. Bu yüzden muazzam tıbbi ve ekonomik etkileri vardır.

Ancak, biyofilm dayanıklı dır ve sayısallaştırmak, açmak ve işlemek daha zordur. Araştırmacılar, uygun miktarda biyofilm hasat etmek, biyofilm, lizis hücreleri, sonicate homojenize etmek, immünopresipitasyon gerçekleştirmek, diğer biyofilm oluşturan bakteri türlerinin DNA'sını arındırmak ve sıralamak için tanımladığımız ChIP-seq tekniklerini kullanabilirler.