Tümör Mikroortamında Bağışıklık Hücre Popülasyonlarının Görselleştirilmesi, Ölçülmesi ve Haritalanması

Tümör mikroortamında bağışıklık hücrelerinin mekansal organizasyonu klinik değeri vardır. Bu strateji kolayca tümör dokusu içinde bağışıklık hücrelerinin görselleştirilmesi, niceleme ve haritalama için kullanılabilir. İmmünoterapi kanser tedavisinde devrim yarattı.

Ancak, tüm hastalar iyi yanıt. Bu strateji iyi bir anti-tümör yanıtı tahmin edebilirsiniz doku-bağışıklık imzaları tanımlamak için hizmet edebilir. Bir deney yapmadan önce, kontrol dokularında antikor kombinasyonlarını ve sıyırma tekniklerini test edin ve AAP'lerin ilgi çekici işaretleri tespit etmede doğru olduğunu doğrulayın.

Görüntü analizi yöntemlerinin yazılı açıklamaları gelişmiş teknik dil kullandığından, metnin videoyla birleştirilmesi metodolojinin daha iyi anlaşılmasını ve çoğaltılmasını kolaylaştırır. Formalin-sabit antijen alımı için, parafin gömülü tümör doku bölümleri, antijen alma çözeltisi coplin kavanozuna dewaxed doku örneği batırın ve musluk suyu içeren bir elektrik düdüklü tencere içine kavanoz yerleştirin. Su, antijen alma çözeltisi ile karışmaması için kavanozun yüksekliğinin yarısını geçmemelidir.

Tencerenin kapağını ve basınç vanasını kapatın ve slaytları 10 dakika yüksek basınçla tedavi edin. Tedavinin sonunda, ocağın fişini çekin, basıncı bırakın ve kapağı açın. Slaytlar ocakta 30 dakika soğuduktan sonra, örnekleri yeni bir Coplin kavanozunda yıkama başına beş dakika boyunca iki kez yıkayın, ardından her doku bölümünün etrafına bir bariyer çizmek için hidrofobik bir kalem kullanın.

Daha sonra, slaytları PBS'de gösterildiği gibi iki kez durulamadan önce oda sıcaklığında 15 dakika PBS'de 0,1 molar glisin ebatırın. İkinci yıkamadan sonra, bir nem odasına slaytlar aktarın ve engelleme çözeltisi ile her doku bölümü kapağı. Oda sıcaklığında 30 dakika sonra, yıkama başına taze PBS-Tween beş dakika boyunca bölümleri iki kez durulayın sonra, her slayt, ışıktan korunan engelleme çözeltisi seyreltilmiş ilgi birincil antikorlar ekleyin.

Kuluçka sonunda, taze PBS-Tween'de slaytları yıkama başına beş dakika boyunca üç kez durulayın, ardından bölümleri oda sıcaklığında bir saat boyunca uygun ikincil antikorlarla etiketleyin. Kuluçka sonunda, taze PBS-Tween üç kez yıkama başına beş dakika slaytlar durulayın. Çift distile suda tek bir durulama ile izleyin.

Her slayttan fazla su çıkarın ve DAPI ve bir kapak slayt ile takviye orta montaj ile dokuları monte. Aşırı montaj ortamını sıktınktan sonra, slaytların tüm slayt tarayıcısı kullanarak tüm kanallar için görüntü elde etmeden önce ışıktan korunan oda sıcaklığında 20 dakika kurumasını bekleyin. Taramadan sonra, görüntü analizi yazılımındaki görüntüleri açın ve Tissuealign sekmesine tıklayın.

Slayt tepsisine hizalanacak görüntüleri almak için veritabanından hizalanacak ilk görüntüyü seçin. Tüm görüntüler yüklendiğinde, görüntüleri bağlamak için İş Akışı adımlarında İleri'yi tıklatın ve ilk görüntüye hizalanacak tüm görüntüleri sürükleyip bırakın. Tüm görüntüler uygun şekilde bağlandığında, bağlantılı görüntülerdeki homolog doku özelliklerini gösteren görüntü başına en az üç iğne kullanın.

Elde edilen hizalamanın kalitesini kontrol etmek için ilk görüntüyü izlemek için bir pin kullanın. Tatmin edici bir hizalama elde edildiyse, görüntü katmanlarını görüntülemek ve bileşik görüntüyü veritabanına kaydetmek için İleri'yi tıklatın. Kullanıcı tanımlı protokol APP 1'i kullanarak doku algılaması gerçekleştirmek için Görüntü Analizi sekmesini açın ve görüntü analizi modülündeki bileşik görüntüyü açın.

APP'i Aç simgesine tıklayın ve uygun UYGULAMAYı seçin. UYGULAMAnın çalıştığını doğrulamak için seçili bir doku konumuna gidin ve Önizleme'yi tıklatın. Sonuçlar tatmin ediciyse, seçili UYGULAMAYı kullanarak görüntüyü işlemek için tıklatın.

İşlem sırasında APP, pikselin dokuyla ilişkili olup olmadığını belirleyerek dokuyla ilişkili piksellerin tümünün ilgi çekici bir bölgeye dönüştürülmesine izin verir. Yeni oluşturulan ilgi alanı daha sonra hizalanmış görüntülerden herhangi biri aktarılabilir. Çözümlemenin sonunda, değiştirilmiş görüntüyü yeni oluşturulan ilgi alanıyla kaydetmek için Dosya ve Kaydet'i tıklatın.

Dokuların stroma ve parankim içine segmentasyonu için Görüntü Analizi sekmesini açın ve veritabanından ilgi çekici dosyaları seçin. AP 2'yi açın, APP 2 doku segmentasyonu için PSR lekeli görüntüyü kullanır. Görüntüyü seçili bir görüş alanında işleyerek APP 2'yi önizleyin.

Sonuçlar tatmin ediciyse, app 2'yi tam görüntü üzerinde işlemek için Çalıştır'ı tıklatın. Dokunun ilgi bölgesi stroma ve parankim olarak bölümlere ayrılır ve ilgili bölgeler belirlenir. Stroma ve parankim için yeni oluşturulan bölgeler hizalanmış görüntülere aktarılabilir, daha sonra değiştirilmiş görüntüyü gösterildiği gibi dışa aktarAbilir ve kaydedebilir.

İlgi alan hücre popülasyonlarını belirlemek ve ölçmek için, ilginin segmentli görüntüsünü görüntü çözümleme modülüne aktarın. Rengi ayarladıktan sonra APP 3'u açın. APP 3 ilgi hücre popülasyonları tespit edecek ve parankim ve stroma içinde bunları ölçmek.

Sonuçlar tatmin ediciyse, APP 3'ün tam görüntüüzerinde çalıştırın. Tüm ilgi hücreleri etiketlenecek, doku koordinatları depolanacak ve stroma ve parankimal bölgelerdeki ilgi hücrelerinin yoğunlukları belirlenecektir. Değiştirilen görüntü gösterildiği gibi kaydedilebilir.

İlgi alanı etiketli nesnelerin doku ısı eşlenemesini gerçekleştirmek için, APP seçim penceresinde uygun kullanıcı tanımlı protokolü açın ve ısı haritasıoluşturmak için antikor etiketli nesnelerin koordinatlarını kullanması için APP'i çalıştırmak'ı tıklatın. Kırmızı ile vurgulanan sıcak nokta alanları, en yüksek yoğunlukta hücre nüfusunun ilgi alanını içerirken, koyu mavi alanlar en düşük alana sahiptir. Belirli bir hücre popülasyonunun ısı haritası, bu hücrelerin tümör mikroortamında nasıl organize edildiği hakkında ek bilgi sağlamak için hizalanmış görüntülerin üzerine eklenebilir.

Sonra ihracat ve doku ısı haritası kaydedin. Etiketlemenin özgüllüğünü, tasarlanan APP'lerin doğruluğunu ve aynı bölümdeki farklı lekelerin sıyırma ve reprobing verimliliğini doğrulamak çok önemlidir. Seri görüntüleme, sıralı etiketleme ve doku hizalama entegre edilerek, aynı anda daha fazla belirteç görselleştirilebilir ve sınırlı klinik örneklerden daha fazla bilgi elde edilebilir.

Rezeke tümör doku kesitlerinin H&E boyanması doku mimarisinin, hücre morfolojisinin ve malignite nin tipi, tümör derecesi ve genel immün infiltrasyon gibi klinik olarak ilgili parametrelerin değerlendirilmesine olanak sağlar. CD34 boyama endotel hücrelerinin saptanmasına olanak sağlar. Sitokalatin 8/18 boyama epitel hücrelerinin varlığını ortaya çıkarır, ve anti-alfa düz kas aktin boyama fibrojenik belirlenmesini sağlar, aktive, hepatik stellat hücreleri.

CD68 ve Desmin'e karşı antikorlarla reprobing sırasıyla makrofajlar ve miyofibroblastların saptanması sağlar. Daha iyi tümör-immün infiltrasyon karakterize etmek için, T-hücre belirteçleri ve miyeloperoksidaz için boyama yapılabilir. Picro Sirius Kırmızı boyama da fibriller kollajen görselleştirmek ve stroma ve parankim segmentasyon kolaylaştırmak için yapılabilir.

Lekeli bölümler deki doku ilişkili pikseller, belirli bir ilgi alanı içindeki farklı bölmelerin segmentasyonuna izin verecek şekilde tanımlanabilir. Daha sonra her bölgede ilgi çeken hücre popülasyonları, belirli bir hücre popülasyonu için yüksek yoğunluklu bölgelerin sıcak noktalar olarak gösterildiği ve nispeten düşük yoğunluklu bölgelerin soğuk noktalar olarak göründüğü doku haritalarının üretilmesine olanak sağlar. Doku örneklerindeki bağışıklık hücrelerinin tanımlanması, ölçülmesi ve haritalanması için yapılan bu metodoloji, belirli bir araştırma sorusu ve ilgi çekici belirteç için uyarlanabilir ve doğrulanabilir.

Bu strateji, yüksek iş analizi için doku mikro dizilerine uygulanabilir. Aynı zamanda yerinde protein ve gen ekspresyonunu aynı anda incelemek için in situ hibridizasyon ile kombine edilebilir. Bu stratejiyi, il-17A üreten hücreleri hastaların fibrotik karaciğer dokusunda yerinde belirlemek ve haritalamak için kullandık.

Protokolde belirtildiği gibi, birkaç reaktif kimyasal olarak tehlikelidir ve ilgili prosedürler uygun kişisel koruyucu donanım ve önlemler kullanılarak kimyasal bir başlık içinde yapılmalıdır.