Name: Brightfield Mikroskobu Kullanan Larva Zebrabalığında Karaciğer Boyutunun Ölçülmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Öğrenin larva zebrabalığında karaciğer boyutunu aydınlık alan mikroskobu ile ölçme yöntemini. Bu teknik genetik ve farmakolojik müdahalelerin karaciğer gelişimi üzerindeki etkilerini değerlendirmeye olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz Maurine Hobbs ve Merkezi Zebrafish Hayvan Kaynağı (CZAR) Utah Üniversitesi'nde zebrabalığı yetiştiriciliği, laboratuvar alanı ve ekipman bu araştırmanın bölümlerini yürütmek için sağlamak için kabul etmek istiyorum. CZAR genişlemesi kısmen NIH hibe # 1G20OD018369-01 tarafından desteklenir. Biz de Rodney Stewart, Chloe Lim, Lance Graham, Cody James, Garrett Nickum ve Huntsman Kanser Enstitüsü (HCI) Zebrabalığı Tesisi zebra balığı bakımı için teşekkür etmek istiyorum. Biz R programlama ile ilgili yardım için Kenneth Kompass teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma kısmen Huntsman Kanser Vakfı'nın (P30 CA042014'ün Huntsman Kanser Enstitüsü'ne verilen hibe ile birlikte) ve NIH/NCI R01CA2222570 (KJE) hibeleri ile finanse edilmiştir.

Hayvan çalışmaları Utah Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanan prosedürler aşağıdaki yürütülmektedir.
1. Larvaların Sabitlenmesi
<ol><li>3-7 gün sonra döllenme (dpf), triain metansülfonat (%0.03) ile ötanazi larvaları ve cam pipet ve pipet pompası kullanarak 2 mL'lik bir tüpte 15 larva toplayın.</li>
	<li>Larvaları 1 mL soğuk (4 °C) 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile iki kez buz üzerinde yıkayın. Her yıkama için, cam pipet ve pipet pompası ile tüpten mümkün olduğunca çok sıvı çıkarın ve sonra tüpe 1 mL soğuk PBS ekleyin.</li>
	<li>Cam pipet ve pipet pompası kullanarak mümkün olduğunca fazla PBS çıkarın ve PBS'e 1 mL soğuk (4 °C) 4% paraformaldehit (PFA) ekleyin. DİkKAT: PFA tahriş edici ve şüpheli bir karsinojendir. PfA'yı kullanırken eldivengiyilmeli ve konsantre çözeltiler kimyasal bir duman kaputunda kullanılmalıdır.</li>
	<li>En az bir gecede (ama birkaç aya kadar) hafif sallanan 4 °C'de kuluçkaya yatırın.</li>
</ol>2. KaraciğerI Çevreleyen Dokuların Diseksiyonu
<ol><li>Larvaları PFA'dan 1 mL soğuk (4 °C) PBS ile 3x durulayarak ve durulamalar arasında 5 dakika sallayarak pfa'dan çıkarın. NOT: Durulanmış larvaları PBS'de 4 °C'de bir veya iki gün tutmakta bir sakınca yoktur.</li>
	<li>Pipet 9-iyi yuvarlak alt cam çanak bir kuyu içine PBS birkaç larva.</li>
	<li>Karaciğeri çevreleyen deriyi çıkarın.<ol>
<li>Larvayı sırtında tutmak için ince büşralar kullanın (göbek yukarı), başın her iki tarafını mümkün olduğunca hafifçe tutarak. Sonra sadece kalp örten deri kapmak için diğer elinde çok ince forseps kullanın.</li>
		<li>Balığın kuyruğuna ve balığın sol veya sağ tarafındaki yemeğin dibine doğru çapraz olarak deri çekin. Diğer taraf için tekrarlayın (sağ veya sol taraf).</li>
		<li>Tüm cilt ve melanoforlar üstte veya karaciğer yakın kaldırıldı kadar deri flepleri kapma ve aşağı / geri çekerek devam edin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Varsa sarısını çıkarın.<ol>
<li>5-6 dpf larvaları için, balığı sırtında ince forsepslerle tutarak ve sarısı hafifçe prod etmek için çok ince forsepskullanarak sarısını tek parça halinde kaldırın.</li>
		<li>3-4 dpf larvaları için, sarısını parçalar halinde kazıyın. Sırtında ince forceps ile balık tutun ve ventral taraftan başlayarak, sarısı inme için çok ince forceps kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bir cam pipet ve pipet pompası kullanarak taze soğuk PBS içine diseksiyon larvayerleştirin.</li>
</ol>3. Görüntüleme
<ol><li>Larvaları monte etmek için, temiz bir plastik Petri kabının kapağına %3'lük metil selüloz birkaç mL dökün.</li>
	<li>Metil selüloza larva eklemek için cam pipet ve pipet pompası kullanın ve larvalarla mümkün olduğunca az PBS ekleyin.</li>
	<li>Düşük büyütme de bir diseksiyon mikroskop altında, onlar sağ tarafında yatıyordu, sola bakacak şekilde balık yönlendirmek için ince çömeçler kullanın. NOT: Balığın yan larına mükemmel bir şekilde yönlendirildiğinden veya karaciğer ölçümlerinin doğru olmadığından emin olun.</li>
	<li>Her balığın fotoğrafını çek.<ol>
<li>Fotoğraflanacak balığın mükemmel bir şekilde hizalandığından, bir gözünün diğer gözün üzerinde olduğunu doğrulayın. Gerekirse, yönünü ayarlamak için balığın başına veya kuyruğuna hafifçe dokunmak için ince çerkesler kullanın. Balığın kuyruğu bükülürse, balığın düz yatabilmesi için forceps ile zorla çimdikleyerek kuyruğu çıkarın.</li>
		<li>Yüksek büyütme ve karaciğer odaklanmak yakınlaştırma, karaciğer anahat açıkça görünür olduğundan emin olun.</li>
		<li>Bir resim çekin ve dosyayı kaydedin.</li>
		<li>Büyütme her resim için aynı olduğundan emin olmak, tüm balıklar için tekrarlayın.</li>
		<li>Aynı büyütmeyi kullanarak bir mikrometrenin resmini çekin (Bkz. Şekil 2H).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Görüntü Analizi
<ol><li>Görüntü işleme yazılımı kullanarak her balığın karaciğer alanını ölçün.<ol>
<li>Potansiyel araştırmacı önyargı önlemek ve bilimsel titizlik teşvik etmek için tüm karaciğer resimleri Blind15. Bu adım başka bir laboratuvar üyesi tarafından el ile veya bir bilgisayar programı(Ek Malzeme)kullanılarak yapılabilir. Dosyaları rasgele yeniden adlandırın ve özgün dosya adlarının ve karşılık gelen kör dosya adlarının listesini içeren bir "rasgeleleştirme dosyası" oluşturun.</li>
		<li>Dosya 1'den başlayarak rasgele dosyaları sırayla açın.</li>
		<li>Freehand seçim aracını seçin ve her karaciğeri anahat.</li>
		<li>Her karaciğeralanını ölçmek için Ctrl-M tuşuna basın.</li>
		<li>Doğru ölçülemeyecek herhangi bir karaciğer için, bir yer tutucu ölçümü ekleyin (çok küçük veya çok büyük, böylece kolayca daha sonra hariç olabilir).</li>
		<li>Ölçümleri bir metin dosyasına kaydedin ("ölçümler dosyası").</li>
	</ol>
</li>
	<li>Görmeme ve verileri analiz<ol>
<li>Elektronik tablo programında "ölçümler dosyası" ve "randomizasyon dosyası"nı açın.</li>
		<li>"Ölçümler dosyası"na yeni bir sütun ekleyin ve "rasgeleleştirme dosyasını" kullanarak kör dosyaların özgün dosya adlarını ekleyin. Bu dosyayı "kör olmayan ölçümler dosyası" olarak kaydedin.</li>
		<li>Verileri özgün dosya adına göre sıralayın.</li>
		<li>Resimlerin yetersiz olduğu karaciğer ölçümlerini hariç tutabilmek için (Bkz. Şekil 2A-G).</li>
		<li>Gerekirse, ölçüm değerlerini istenilen ölçeğe dönüştürün (örneğin mm2).<ol>
<li>Görüntü işleme yazılımındaki ölçek çubuğunu açın.</li>
			<li>Ölçek çubuğunda 1 mm ölçmek için düz çizgi aracını kullanın. Görüntü işleme yazılımı karaciğerler (piksel) ile aynı birimlerde ölçülür ve bir dönüşüm faktörü verir.</li>
			<li>"Kör olmayan ölçümler dosyası"ndaki ölçümleri dönüştürmek için dönüştürme faktörlerini kullanın.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Elektronik tablo lama programını kullanmak veya verileri bilimsel bir grafik ve istatistik yazılımına yapıştırmak, ortalama ve standart sapmayı belirleyin ve p değerini(ler) hesaplayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Lin, D. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+and+Epigenomic+Heterogeneity+of+Hepatocellular+Carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Genomic and Epigenomic Heterogeneity of Hepatocellular Carcinoma.</a> Cancer Research. 77 (9), 2255-2265 (2017).</li>
<li>Ghouri, Y. A., Mian, I., Rowe, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+hepatocellular+carcinoma%3A+Epidemiology%2C+etiology%2C+and+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Review of hepatocellular carcinoma: Epidemiology, etiology, and carcinogenesis.</a> Journal of Carcinogenesis. 16, 1(2017).</li>
<li>Evason, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Chemical+Inhibitors+of+%CE%B2-Catenin-Driven+Liver+Tumorigenesis+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Identification of Chemical Inhibitors of β-Catenin-Driven Liver Tumorigenesis in Zebrafish.</a> PLoS Genetics. 11 (7), 1005305(2015).</li>
<li>Kalasekar, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneous+beta-catenin+activation+is+sufficient+to+cause+hepatocellular+carcinoma+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Heterogeneous beta-catenin activation is sufficient to cause hepatocellular carcinoma in zebrafish.</a> Biology Open. 8 (10), (2019).</li>
<li>Nguyen, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+level+of+liver-specific+expression+of+oncogenic+Kras%28V12%29+drives+robust+liver+tumorigenesis+in+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">A high level of liver-specific expression of oncogenic Kras(V12) drives robust liver tumorigenesis in transgenic zebrafish.</a> Disease Models & Mechanisms. 4 (6), 801-813 (2011).</li>
<li>Nguyen, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inducible+kras%28V12%29+transgenic+zebrafish+model+for+liver+tumorigenesis+and+chemical+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">An inducible kras(V12) transgenic zebrafish model for liver tumorigenesis and chemical drug screening.</a> Disease Models & Mechanisms. 5 (1), 63-72 (2012).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+zebrafish+liver+tumor+model+with+inducible+Myc+expression+reveals+conserved+Myc+signatures+with+mammalian+liver+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">A transgenic zebrafish liver tumor model with inducible Myc expression reveals conserved Myc signatures with mammalian liver tumors.</a> Disease Models & Mechanisms. 6 (2), 414-423 (2013).</li>
<li>Cox, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yap+reprograms+glutamine+metabolism+to+increase+nucleotide+biosynthesis+and+enable+liver+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Yap reprograms glutamine metabolism to increase nucleotide biosynthesis and enable liver growth.</a> Nature Cell Biology. 18 (8), 886-896 (2016).</li>
<li>Sadler, K. C., Amsterdam, A., Soroka, C., Boyer, J., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+screen+in+zebrafish+identifies+the+mutants+vps18%2C+nf2+and+foie+gras+as+models+of+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A genetic screen in zebrafish identifies the mutants vps18, nf2 and foie gras as models of liver disease.</a> Development. 132 (15), Cambridge, England. 3561-3572 (2005).</li>
<li>Huang, X., Zhou, L., Gong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+tumor+models+in+transgenic+zebrafish%3A+an+alternative+in+vivo+approach+to+study+hepatocarcinogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Oncology%22%5BJournal%5D)">Liver tumor models in transgenic zebrafish: an alternative in vivo approach to study hepatocarcinogenes.</a> Future Oncology. 8 (1), London, England. 21-28 (2012).</li>
<li>Yan, C., Yang, Q., Gong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-Associated+Neutrophils+and+Macrophages+Promote+Gender+Disparity+in+Hepatocellular+Carcinoma+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tumor-Associated Neutrophils and Macrophages Promote Gender Disparity in Hepatocellular Carcinoma in Zebrafish.</a> Cancer Research. 77 (6), 1395-1407 (2017).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ2%3A+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).</li>
<li>Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ImageJ+ecosystem%3A+An+open+platform+for+biomedical+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Reproduction+and+Development%22%5BJournal%5D)">The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis.</a> Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2012).</li>
<li>Landis, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+call+for+transparent+reporting+to+optimize+the+predictive+value+of+preclinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research.</a> Nature. 490 (7419), 187-191 (2012).</li>
<li>Dai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+fat+plus+high+cholesterol+diet+lead+to+hepatic+steatosis+in+zebrafish+larvae%3A+a+novel+model+for+screening+anti-hepatic+steatosis+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrition+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">High fat plus high cholesterol diet lead to hepatic steatosis in zebrafish larvae: a novel model for screening anti-hepatic steatosis drugs.</a> Nutrition & Metabolism. 12, 42(2015).</li>
<li>Kim, S. -H., Speirs, C. K., Solnica-Krezel, L., Ess, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+model+of+tuberous+sclerosis+complex+reveals+cell-autonomous+and+non-cell-autonomous+functions+of+mutant+tuberin%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Zebrafish model of tuberous sclerosis complex reveals cell-autonomous and non-cell-autonomous functions of mutant tuberin.</a> Disease Models & Mechanisms. 4 (2), 255-267 (2011).</li>
<li>Delous, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox9b+is+a+key+regulator+of+pancreaticobiliary+ductal+system+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Sox9b is a key regulator of pancreaticobiliary ductal system development.</a> PLoS Genetics. 8 (6), 1002754(2012).</li>
<li>Shin, D., Lee, Y., Poss, K. D., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restriction+of+hepatic+competence+by+Fgf+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Restriction of hepatic competence by Fgf signaling.</a> Development. 138 (7), Cambridge, England. 1339-1348 (2011).</li>
<li>Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basic+helix-loop-helix+transcription+factor%2C+heart+and+neural+crest+derivatives+expressed+transcript+2%2C+marks+hepatic+stellate+cells+in+zebrafish%3A+analysis+of+stellate+cell+entry+into+the+developing+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">The basic helix-loop-helix transcription factor, heart and neural crest derivatives expressed transcript 2, marks hepatic stellate cells in zebrafish: analysis of stellate cell entry into the developing liver.</a> Hepatology. 56 (5), Baltimore, Md. 1958-1970 (2012).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Karaciğer gelişimini, rejenerasyonu ve onkogenezini anlamaya yönelik çalışmalarda karaciğer büyüklüğünün sayısallaştırılması çok önemlidir. Burada açıklanan protokol larva zebra balığında karaciğer büyüklüğü niceliği için nispeten hızlı, kolay ve ucuz bir tekniktir. Protokolün belirli yönlerini uygularken uygun dikkatli olunması, sonuçların doğruluğunun artmasına ve hayal kırıklığının azalmasına yardımcı olabilir.
Larvaların doğru fiksasyonu iyi korunmuş biyolojik numunelerin elde edilmesi ve ...

Hepatosellüler karsinom (HCC) karaciğerin en sık görülen primer malignitesi1 ve kansere bağlı mortalitenin üçüncü önde gelennedenidir 2. Hepatokarsinogenezin mekanizmalarını daha iyi anlamak ve potansiyel HCC terapötiklerini belirlemek için, biz ve diğerleri β-catenin3,4,Kras(V12)5,6, Myc7, Yap18 gibi onkogenlerin hepatosite özgü ekspresyonu olan transgenik zebra balığı geliştirdik. Bu zebra balıklarında, karaciğer genişlemesi kadar erken olarak not edilir 6 gün sonrası döllenme (dpf), onkogen güdümlü karaciğer büyümesi üzerinde ilaçların ve genetik değişikliklerin etkilerini test etmek için kolay bir platform sağlayan. Larva karaciğer boyutunun doğru ve kesin ölçümü bu manipülasyonların etkilerini belirlemek için gereklidir.
Karaciğer büyüklüğü ve şekli, sabit zebrabalığı larvalarında 9 veya canlı zebrabalığı larvalarında hepatosite özgü floresan muhabirler ve floresan diseksiyon mikroskopisi kullanılarak yarı kantitatif olarak değerlendirilebilir5,6. İkinci yöntem nispeten hızlı, ve hassasiyet eksikliği fotoğraflama ve görüntü işlemeyazılımı7 kullanarak her karaciğer alanı ölçümü ile ele alınabilir 7,10. Ancak, teknik olarak iki boyutlu karaciğer alanı karaciğer boyutunun doğru bir temsili olduğunu bir deney de tüm canlı larvaları eşit konumlandırmak zor olabilir. Karaciğer boyutunu ölçmek için benzer bir teknik larva karaciğer hacmi ölçmek için hafif levha floresan mikroskopi kullanarak içerir8, karaciğer farklı boyutlarda düzgün olmayan genişletildiğinde boyut farklılıkları tespit etmek için daha doğru olabilir. Floresan aktive hücre sıralama (FACS) larva karaciğerlerinde floresan hepatosit ler ve diğer karaciğer hücre tipleri8,11etiketli sayısını saymak için kullanılabilir . Bu yöntemde, larva karaciğerleri havuza alınır ve ayrıştırılır, böylece bireysel karaciğer büyüklüğü ve şekli hakkında bilgi kaybolur. Başka bir karaciğer boyutu belirleme yöntemi ile birlikte, FACS artan hücre numarası (hiperplazi) ve artan hücre büyüklüğü (hipertrofi) arasında ayrım sağlar. Tüm bu yöntemler pahalı floresan teknolojisi (mikroskop veya hücre ayırıcı) kullanır ve CY3-SA etiketleme dışında, bir floresan muhabiri ile hepatosit etiketleme gerektirir.
Burada ayrıntılı olarak parlak alan mikroskobu ve görüntü işleme yazılımı3,12,13,14kullanarak zebra balığı larva karaciğer alanı ölçmek için bir yöntem açıklar. Bu protokol floresan mikroskopisi kullanılmadan bireysel karaciğerlerin yerinde tam olarak sayısallaştırılmasını sağlar. Karaciğer boyutunu analiz ederken, biz araştırmacı önyargı azaltmak ve bilimsel titizlik geliştirmek için görüntü kimliğini kör15.

<table><tbody><tr><td>Diseksiyon mikroskobu Leica için kamera</td><td>, örneğin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon mikroskobu</td><td>Leica, örneğin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fine (Dumont #5) forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Cam pipetler</td><td>VWR</td><td>14672-608</td><td></td></tr><tr><td>Görüntü analiz yazılımı</td><td>Image J/FIJI</td><td></td><td>ImageJ/FIJI ücretsiz olarak indirilebilir: <a href="https://imagej.net/Welcome" target="_blank">https://imagej.net/Welcome</a></td></tr><tr><td>Metil selüloz</td><td>Sigma</td><td>M0387</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu tuzlu su Çeşitli</td><td>tedarikçiler</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipet pompası</td><td>VWR</td><td>53502-233</td><td></td></tr><tr><td>Plastik Petri kapları</td><td>USA Scientific Inc</td><td>2906</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex 9 kuyulu yuvarlak tabanlı cam tabak</td><td>VWR</td><td>89090-482</td><td></td></tr><tr><td>Dosyaları körlemek için yazılım</td><td>R projesi</td><td></td><td>R ücretsiz olarak indirilebilir: <a href="https://www.r-project.org/" target="_blank">https://www.r-project.org/</a></td></tr><tr><td>Bilimsel grafik ve istatistik yazılımı</td><td>GraphPad Prizma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektronik Tablo programı</td><td>Microsoft Excel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trikain metansülfonat (Trikain-S)</td><td>Western Chemical</td><td>200-226</td><td></td></tr><tr><td>Çok ince (Dumont # 55) forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11255-20</td><td></td></tr></tbody></table>

brightfield mikroskobu kullanan larva zebrabalığında karaciğer boyutunun Ölçülmesi

Quantifying Liver Size in Larval Zebrafish Using Brightfield Microscopy

Hepatosellüler karsinom (HCC) çeşitli transgenik zebra balığı modellerinde erken larva evrelerinde hepatomegali görülebilir. Zebrabalığı HCC modellerinde larva karaciğer boyutunun ölçülmesi, ilaçların ve diğer manipülasyonların onkogene bağlı fenotip üzerindeki etkilerini hızla değerlendirmek için bir araç sağlar. Burada zebra balığı larvalarının nasıl düzeltilebildiğini, karaciğeri çevreleyen dokuları nasıl inceleyeceğimi, parlak alan mikroskobu kullanarak karaciğerleri nasıl fotoğraflayabildiğimizi, karaciğer bölgesini nasıl ölçtüğünü ve sonuçları analiz edebileceğimizi gösteriyoruz. Bu protokol karaciğer boyutunun hızlı ve hassas bir şekilde ölçülmesini sağlar. Bu yöntem karaciğer alanının ölçülmesini içerdiğinden, karaciğer hacmindeki farklılıkları hafife alabilir ve hücre büyüklüğündeki değişimler ile hücre sayısındaki değişimleri ayırt etmek için tamamlayıcı metodolojiler gereklidir. Burada açıklanan diseksiyon tekniği, immünoresans boyama ve yerinde hibridizasyon dahil olmak üzere sayısız downstream uygulamaları için doğal konumlarında karaciğer, bağırsak ve pankreas görselleştirmek için mükemmel bir araçtır. Larva karaciğer boyutunu ölçmek için açıklanan strateji karaciğer gelişimi ve rejenerasyon birçok yönü için geçerlidir.

Hepatosite özgü aktif β-catenin(Tg(fabp10a:pt-β-cat) zebrabalığı)3 ve transgenik olmayan kontrol kardeşleri 6 dpf'de ötenazi yemi olan transgenik zebrabalıkları brightfield mikroskopi ve görüntü işleme yazılımı kullanılarak ölçüldü. Transgenik zebra balıkları karaciğer boyutunu (0.0006 cm2)transgenik olmayan kardeşlere göre önemli ölçüde artırmıştır (0.0004 cm2, p &lt; 0.0001; Şekil 1).
<p class="jove_content" fo:ke...

Burada larva zebra balığında karaciğer boyutunu ölçmek için bir yöntem göstermek, karaciğer büyümesi ve gelişimi üzerinde genetik ve farmakolojik manipülasyonetkilerini değerlendirmek için bir yol sağlar.

Brightfield Mikroskobu Kullanan Larva Zebrabalığında Karaciğer Boyutunun Ölçülmesi

In several transgenic zebrafish models of hepatocellular carcinoma (HCC), hepatomegaly can be observed during early larval stages. Quantifying larval ...

Bu yöntem larva zebra balığında karaciğer boyutunu ölçmek için bir yol sağlar. Ayrıca karaciğer büyümesi ve gelişimi üzerinde genetik ve farmakolojik manipülasyon etkilerinin değerlendirilmesi için izin verir. Bu teknik, karaciğeri, bağırsak ve pankreası görselleştirmek ve ölçmek için hızlı ve hassas bir yol sağlar.Karaciğer boyutunu niteleme ek olarak, Bu diseksiyon yöntemi in situ hibridizasyon veya konfokal görüntüleme için karaciğer, bağırsak ve pankreas hazırlanması için yararlı olabilir. Deneysel larvalar üzerinde deskinning denemeden önce, deneysel olmayan numuneler üzerinde pratik bol zaman geçirdim ve önemli bir başarı oranına sahip emin olun. Zebrabalığı larvalarının ve çerperlerinin uygun yönünü ve hareketini görselleştirmek ve çevreyi rahatsız etmeden cildi çıkarmak için çok önemlidir.Gübreleme den sonra 3-7 gün, ötanazi larvaları sonra, iki mililitrelik bir tüp içinde 15 larva toplamak için bir cam pipet ve pipet pompası kullanın. Larvaları bir mililitre soğuk 1X PBS ile iki kez buz üzerinde yıkayın. Cam pipet ve pipet pompası kullanarak mümkün olduğunca fazla PBS çıkarın ve PBS'de bir mililitre soğuk yüzde dört PFA ekleyin.En azından bir gecede hafif sallanan dört santigrat derecede kuluçkaya yat. Cam pipet ve pipet pompası kullanarak, PFA'yı tüpten çıkarın ve bir mililitre soğuk PBS ile üç kez durulayın. Durulamaların arasında beş dakika kaya.Pipet pbs birkaç larva dokuz iyi yuvarlak alt cam çanak bir kuyuiçine. Bir mikroskop altında, sırtında bir larva tutmak için ince forceps kullanarak karaciğer çevreleyen deri kaldırmak, mümkün olduğunca hafifçe başın her iki tarafında tutarak. Sonra sadece kalp örten deri kapmak için diğer taraftan çok ince forseps kullanın.Balığın sol veya sağ tarafındaki yemeğin altındaki balığın kuyruğuna doğru çapraz olarak deri çekin. Diğer taraf için tekrarlayın. Deri flepleri kapma ve tüm cilt ve melanoforlar üstveya karaciğer yakın kaldırılana kadar aşağı çekerek devam edin.Eğer gübreleme dangazi sonrası beş ila altı gün boyunca sarısı varsa, balığı sırtında ince forsepslerle tutarak ve sarısı nazikçe dürtmek için çok ince forsepsleri kullanarak sarısını tek parça halinde kaldırın. Üç ila dört DPF larvaları için, sırtında ince forseps ile balık tutun ve ventral taraftan başlayarak sarısı inme için çok ince forseps kullanın. Sarısını parçalara ayırın.Bir cam pipet ve pipet pompası kullanarak iki mililitrelik bir tüp içinde taze, soğuk PBS içine diseksiyon larvayerleştirin. Larvaları monte etmek için, temiz, plastik Petri kabının kapağına yüzde üç metilselüloz birkaç mililitre dökün. Methylcellulose larva eklemek için bir cam pipet ve pipet pompası kullanın, mümkün olduğunca larva ile küçük PBS olarak ekleyerek.Düşük büyütme de bir diseksiyon mikroskop altında, onlar sola bakan sağ tarafında yatıyorböylece balık yönlendirmek için ince çömeçler kullanın. Fotoğraflanacak balığın bir gözüyle diğer gözün tam üzerinde mükemmel bir şekilde hizalandığından onaylayın. Balığın kuyruğu bükülürse, balığın düz yatabilmesi için forceps ile zorla çimdikleyerek kuyruğu çıkarın.Yüksek büyütme ve karaciğer odaklanmak yakınlaştırma, karaciğer anahat açıkça görünür olduğundan emin olun. Resmi tutturmak ve dosyayı kaydetmek için Görüntü Kaydet düğmesine basın. Büyütme her resim için aynı olduğundan emin olmak, tüm balıklar için tekrarlayın.Aynı büyütmeyi kullanarak bir mikrometrenin resmini çek. Potansiyel araştırmacı önyargı önlemek ve bilimsel titizlik teşvik etmek için tüm karaciğer resimleri kör programı R kullanmak için, dosyaları rasgele yeniden adlandırmak ve orijinal dosya adları ve karşılık gelen kör dosya adlarının listesini içeren bir randomizasyon dosyası oluşturmak. Birinci dosyadan başlayarak rasgele dosyaları sırayla açın.Freehand Seçimleri aracını seçin ve her karaciğeri anahat. Her karaciğer alanını ölçmek için Control-M tuşuna basın. Onlar artık deri, sarısı, odak dışında, çünkü doğru ölçülemez herhangi bir karaciğer için, ya da bozulmamış, bir yer tutucu ölçümü ekleyin.Ölçümleri bir metin dosyasına kaydedin. Verileri kör süzmek ve çözümlemek için, bir elektronik tablo programında ölçümler dosyasını ve randomizasyon dosyasını açın. Ölçümler dosyasına yeni bir sütun ekleyin ve Randomization dosyasını kullanarak kör dosyaların özgün dosya adlarını ekleyin.Bu dosyayı Körlenmemiş Ölçümler dosyası olarak kaydedin. Verileri özgün dosya adına göre sıralayın. Resimlerin yeterli olmadığı karaciğer ölçümleri hariç.Gerekirse, ölçüm değerlerini milimetre kare cinsinden istenilen ölçeğe dönüştürün. Görüntü işleme yazılımındaki Ölçek çubuğunu açın. Ölçek çubuğunda bir milimetreyi ölçmek için Düz Çizgi aracını kullanın.Görüntü işleme yazılımı daha sonra karaciğerlerle aynı ünitelerde ölçüler ve bir dönüşüm faktörü verir. Kör olmayan ölçümler dosyasındaki ölçümleri dönüştürmek için dönüşüm faktörlerini kullanın. Ortalama ve standart sapmayı belirleyin ve P değerlerini hesaplayın.Altı gün sonra döllenme, non-transgenik zebra balığı larvaları doğal pozisyon ve karaciğer bağırsak örten şekli gösterdi. Transgenik zebra balıkları, transgenik olmayan kardeşlerine göre karaciğer boyutunu önemli ölçüde artırmıştır. Yetersiz görüntü ve mikrometre bazı örnekler burada gösterilmiştir.Karaciğeri kaplayan deri ile larva, karaciğeri gizleyen larva, karaciğerparçaları koparılmış larva, karaciğer yerinden çıkmış ve düşen larva, karaciğeri eksik olan larva, tespit edilmesi zor karaciğer anahatlı larva ve yanlış konumlandırma ile larva. Bu işlemi denerken, karaciğer hasarı önlemek için küçük ve kontrollü hareketleri kullanmak önemlidir. Parlak alan mikroskobuna ek olarak, bu şekilde incelenmiş larvaları da kullanabiliriz, konfokal mikroskopi için, floresan muhabir proteinleri veya immün-floresan boyamayı görselleştirmek için, ve in situ hibridizasyon için.Formaldehit veya PFA tahriş edici ve şüpheli bir karsinojendir. PfA kullanılırken eldiven giyilmeli ve konsantre çözeltiler kimyasal bir duman kaputunda kullanılmalıdır.

quantifying-liver-size-larval-zebrafish-using-brightfield

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Zebra balığı embriyolarının dokuya özel floresans yarı otomatik görüntüleme için bir protokol aşağıda tarif edilmiştir.

Zebra balığı Embriyolar Doku spesifik Floresans yarı otomatik Görüntüleme

Zebra balığı larva kuyruk yüzgeci rejenerasyonunun dinamiklerini parlak alan tabanlı stereomikroskopi kullanarak tüm doku ölçeğinde yakalamak için bir protokol sunuyoruz. Bu teknik, tek hücre çözünürlüğü ile rejenerasyon dinamiklerinin yakalanmasını sağlar. Bu metodoloji, bir CCD kamera ve hızlandırılmış yazılım ile donatılmış herhangi bir stereomikroskoba uyarlanabilir.

Time-lapse aydınlık stereomikroskobi ile Zebra balığı Larva Doku Onarım yakalama

Işık tabakası floresan mikroskobu, embriyonik gelişimi görüntülemek için mükemmel bir araçtır. Yakın fizyolojik koşullarda canlı embriyoların uzun hızlandırılmış filmlerinin kaydedilmesine izin verir. Geniş uzaysal-zamansal ölçeklerde zebra balığı gözü gelişimini görüntüleme uygulamasını gösteriyoruz ve çok görüntülü veri kümelerinin füzyonu ve evrişiminin çözülmesi için bir boru hattı sunuyoruz.

Görüntü Zebra balığı Göz Geliştirme Işık Sac floresan mikroskobu kullanarak

Zebra balığı, diyetle alınan lipid işleme ve metabolik hastalıkların değerli bir modeli olarak ortaya çıkmaktadır. Lipid açısından zengin larva yemlerinin protokolleri, diyet floresan lipid analoglarının canlı görüntülenmesi ve gıda alımının miktarının belirlenmesi açıklanmıştır. Bu teknikler çeşitli tarama, görüntüleme ve hipoteze dayalı sorgulama tekniklerine uygulanabilir.

Larva Zebra balığı için Paradigma Besleme Yüksek yağlı: Besleme, Canlı Görüntüleme ve Gıda Alımı miktarının belirlenmesi

Burada, biz normal gelişimsel süreçleri bozmadan zebra balığı embriyo boyutunu azaltmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu teknik, boyut değişikliklere karşı desen ölçekleme ve gelişimsel sağlamlık etüdünü sağlar.

Embriyonik desen ölçekleme çalışma için zebrafish cerrahi boyutu azaltma

Bu protokol, karaciğer yenilenmesinin incelenmesini sağlamak için yetişkin zebra balıklarında karaciğerin ventral lobunun çıkarılması prosedürünü açıklar.

Yetişkin Zebra Balıklarında Kısmi Hepatektomi

Burada, ksnograftlar ve tümör davranış analizi, tam montajlı immünofluoresans ve konfokal görüntüleme nicelemesi için yönergeler oluşturmak için ipuçları içeren adım adım bir protokol sunuyoruz.

Zebra Balığı Larva Xenografts ve Tümör Davranış AnaliziNin Üretimi

Burada, kolesterol fazlasının karaciğer mikroçevresi ve bağışıklık hücresi manzarası üzerindeki etkisini incelemek için alkolsüz yağlı karaciğer hastalığı (NAFLD) ile ilişkili Hepatosellüler Karsinom (HCC) zebra balığı modelinin nasıl üretileceğini sunuyoruz.

Zebra Balığında Alkolsüz Yağlı Karaciğer Hastalığına Bağlı Hepatosellüler Karsinomun Erken İlerlemesi Sırasında Karaciğer Mikroçevresinin Analizi

Optik berraklık, zebra balıklarında hücre biyolojik ve fizyolojik çalışmaları için önemli bir avantajdır. Bireysel hayvanlarda hücre büyümesinin ölçülmesi için sağlam yöntemler, iskelet kasının ve komşu dokuların büyümesinin tüm vücut büyümesiyle nasıl bütünleştiğine dair yeni bilgiler sağlayan tanımlanmıştır.

Değiştirilmiş elektriksel aktiviteye maruz kalan bireysel canlı zebra balıklarında iskelet kası büyümesinin gerçek zamanlı ve tekrarlanan ölçümü

Burada, larva zebra balıklarının üç boyutlu floresan mikroskobu kullanılarak in vivo tüm beyin görüntülemesi için bir protokol sunulmaktadır. Deneysel prosedür numune hazırlama, görüntü toplama ve görselleştirmeyi içerir.

İn Vivo Üç Boyutlu Floresan Mikroskobu Kullanılarak Zebra Balığı Larvalarının Tüm Beyin Görüntülemesi

Bu protokol, zebra balığı larvalarında kardiyak kasılma fonksiyonunu araştırmak ve hücre izleme ve etkileşimli analiz yoluyla kalp mekaniği hakkında bilgi edinmek için ışık tabakası görüntülemeyi kullanır.

Zebra Balığı Kardiyak Kasılmasının 4D Işık Sayfası Görüntüleme

Öğrenin larva zebrabalığında karaciğer boyutunu aydınlık alan mikroskobu ile ölçme yöntemini. Bu teknik genetik ve farmakolojik müdahalelerin karaciğer gelişimi üzerindeki etkilerini değerlendirmeye olanak tanır.

Brightfield Mikroskobu Kullanan Larva Zebrabalığında Karaciğer Boyutunun Ölçülmesi

Daha fazla video keşfet