Brightfield Mikroskobu Kullanan Larva Zebrabalığında Karaciğer Boyutunun Ölçülmesi

Bu yöntem larva zebra balığında karaciğer boyutunu ölçmek için bir yol sağlar. Ayrıca karaciğer büyümesi ve gelişimi üzerinde genetik ve farmakolojik manipülasyon etkilerinin değerlendirilmesi için izin verir. Bu teknik, karaciğeri, bağırsak ve pankreası görselleştirmek ve ölçmek için hızlı ve hassas bir yol sağlar.

Karaciğer boyutunu niteleme ek olarak, Bu diseksiyon yöntemi in situ hibridizasyon veya konfokal görüntüleme için karaciğer, bağırsak ve pankreas hazırlanması için yararlı olabilir. Deneysel larvalar üzerinde deskinning denemeden önce, deneysel olmayan numuneler üzerinde pratik bol zaman geçirdim ve önemli bir başarı oranına sahip emin olun. Zebrabalığı larvalarının ve çerperlerinin uygun yönünü ve hareketini görselleştirmek ve çevreyi rahatsız etmeden cildi çıkarmak için çok önemlidir.

Gübreleme den sonra 3-7 gün, ötanazi larvaları sonra, iki mililitrelik bir tüp içinde 15 larva toplamak için bir cam pipet ve pipet pompası kullanın. Larvaları bir mililitre soğuk 1X PBS ile iki kez buz üzerinde yıkayın. Cam pipet ve pipet pompası kullanarak mümkün olduğunca fazla PBS çıkarın ve PBS'de bir mililitre soğuk yüzde dört PFA ekleyin.

En azından bir gecede hafif sallanan dört santigrat derecede kuluçkaya yat. Cam pipet ve pipet pompası kullanarak, PFA'yı tüpten çıkarın ve bir mililitre soğuk PBS ile üç kez durulayın. Durulamaların arasında beş dakika kaya.

Pipet pbs birkaç larva dokuz iyi yuvarlak alt cam çanak bir kuyuiçine. Bir mikroskop altında, sırtında bir larva tutmak için ince forceps kullanarak karaciğer çevreleyen deri kaldırmak, mümkün olduğunca hafifçe başın her iki tarafında tutarak. Sonra sadece kalp örten deri kapmak için diğer taraftan çok ince forseps kullanın.

Balığın sol veya sağ tarafındaki yemeğin altındaki balığın kuyruğuna doğru çapraz olarak deri çekin. Diğer taraf için tekrarlayın. Deri flepleri kapma ve tüm cilt ve melanoforlar üstveya karaciğer yakın kaldırılana kadar aşağı çekerek devam edin.

Eğer gübreleme dangazi sonrası beş ila altı gün boyunca sarısı varsa, balığı sırtında ince forsepslerle tutarak ve sarısı nazikçe dürtmek için çok ince forsepsleri kullanarak sarısını tek parça halinde kaldırın. Üç ila dört DPF larvaları için, sırtında ince forseps ile balık tutun ve ventral taraftan başlayarak sarısı inme için çok ince forseps kullanın. Sarısını parçalara ayırın.

Bir cam pipet ve pipet pompası kullanarak iki mililitrelik bir tüp içinde taze, soğuk PBS içine diseksiyon larvayerleştirin. Larvaları monte etmek için, temiz, plastik Petri kabının kapağına yüzde üç metilselüloz birkaç mililitre dökün. Methylcellulose larva eklemek için bir cam pipet ve pipet pompası kullanın, mümkün olduğunca larva ile küçük PBS olarak ekleyerek.

Düşük büyütme de bir diseksiyon mikroskop altında, onlar sola bakan sağ tarafında yatıyorböylece balık yönlendirmek için ince çömeçler kullanın. Fotoğraflanacak balığın bir gözüyle diğer gözün tam üzerinde mükemmel bir şekilde hizalandığından onaylayın. Balığın kuyruğu bükülürse, balığın düz yatabilmesi için forceps ile zorla çimdikleyerek kuyruğu çıkarın.

Yüksek büyütme ve karaciğer odaklanmak yakınlaştırma, karaciğer anahat açıkça görünür olduğundan emin olun. Resmi tutturmak ve dosyayı kaydetmek için Görüntü Kaydet düğmesine basın. Büyütme her resim için aynı olduğundan emin olmak, tüm balıklar için tekrarlayın.

Aynı büyütmeyi kullanarak bir mikrometrenin resmini çek. Potansiyel araştırmacı önyargı önlemek ve bilimsel titizlik teşvik etmek için tüm karaciğer resimleri kör programı R kullanmak için, dosyaları rasgele yeniden adlandırmak ve orijinal dosya adları ve karşılık gelen kör dosya adlarının listesini içeren bir randomizasyon dosyası oluşturmak. Birinci dosyadan başlayarak rasgele dosyaları sırayla açın.

Freehand Seçimleri aracını seçin ve her karaciğeri anahat. Her karaciğer alanını ölçmek için Control-M tuşuna basın. Onlar artık deri, sarısı, odak dışında, çünkü doğru ölçülemez herhangi bir karaciğer için, ya da bozulmamış, bir yer tutucu ölçümü ekleyin.

Ölçümleri bir metin dosyasına kaydedin. Verileri kör süzmek ve çözümlemek için, bir elektronik tablo programında ölçümler dosyasını ve randomizasyon dosyasını açın. Ölçümler dosyasına yeni bir sütun ekleyin ve Randomization dosyasını kullanarak kör dosyaların özgün dosya adlarını ekleyin.

Bu dosyayı Körlenmemiş Ölçümler dosyası olarak kaydedin. Verileri özgün dosya adına göre sıralayın. Resimlerin yeterli olmadığı karaciğer ölçümleri hariç.

Gerekirse, ölçüm değerlerini milimetre kare cinsinden istenilen ölçeğe dönüştürün. Görüntü işleme yazılımındaki Ölçek çubuğunu açın. Ölçek çubuğunda bir milimetreyi ölçmek için Düz Çizgi aracını kullanın.

Görüntü işleme yazılımı daha sonra karaciğerlerle aynı ünitelerde ölçüler ve bir dönüşüm faktörü verir. Kör olmayan ölçümler dosyasındaki ölçümleri dönüştürmek için dönüşüm faktörlerini kullanın. Ortalama ve standart sapmayı belirleyin ve P değerlerini hesaplayın.

Altı gün sonra döllenme, non-transgenik zebra balığı larvaları doğal pozisyon ve karaciğer bağırsak örten şekli gösterdi. Transgenik zebra balıkları, transgenik olmayan kardeşlerine göre karaciğer boyutunu önemli ölçüde artırmıştır. Yetersiz görüntü ve mikrometre bazı örnekler burada gösterilmiştir.

Karaciğeri kaplayan deri ile larva, karaciğeri gizleyen larva, karaciğerparçaları koparılmış larva, karaciğer yerinden çıkmış ve düşen larva, karaciğeri eksik olan larva, tespit edilmesi zor karaciğer anahatlı larva ve yanlış konumlandırma ile larva. Bu işlemi denerken, karaciğer hasarı önlemek için küçük ve kontrollü hareketleri kullanmak önemlidir. Parlak alan mikroskobuna ek olarak, bu şekilde incelenmiş larvaları da kullanabiliriz, konfokal mikroskopi için, floresan muhabir proteinleri veya immün-floresan boyamayı görselleştirmek için, ve in situ hibridizasyon için.

Formaldehit veya PFA tahriş edici ve şüpheli bir karsinojendir. PfA kullanılırken eldiven giyilmeli ve konsantre çözeltiler kimyasal bir duman kaputunda kullanılmalıdır.