Name: Biyomalzeme Membranlar Üzerinde İnsan ve Koyun Korneal Endotel Hücre Tabakalarının Büyümesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 20 s
Description: Keşfedin, korneal endotel hücrelerini biyomalzeme membranlar üzerinde yetiştirme yöntemini. Epitelden mezenkimal geçişi önleyerek hücre fenotipini koruyun ve rejeneratif tıp için sürdürülebilir hücre kaynağı sağlayın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Şekil 7hazırlanması sırasında ona yardım için Noémie Gallorini sayesinde . Bu çalışma, Avustralya Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi (Project Grant 1099922) tarafından DH'ye verilen bir proje hibesi ve Queensland Göz Enstitüsü Vakfı'ndan alınan ek finansman la desteklenmiştir.

Araştırma için donör onayı ile insan korneaları Queensland Göz Bankası'ndan alındı ve Metro South Hastanesi ve Sağlık Servisi İnsan Araştırma Etik Komitesi (HREC/07/QPAH/048) etik onayı ile kullanıldı. Koyun korneaları queensland Üniversitesi Herston Tıbbi Araştırma Tesisi'nde bir doku paylaşımı anlaşması ile ötenazi hayvanlardan elde edildi.
1. Diseksiyon araçlarının hazırlanması
<ol><li>4 numaralı saat üreticisi iki çift forsepsi 5 dakika boyunca %70 etanol çözeltisinde ıslatarak veya otoklavlayarak sterilize edin.</li>
</ol>2. Kültür ortamı ve doku kültür plakalarının hazırlanması
<ol><li>Opti-MEM 1 (1x) + GlutaMAX-1, %5 fetal büyükbaş ve 100 U/mL Pen/Strep içeren 100 mL kültür ortamı hazırlayın. Bu kültür ortamı koyun korneal endotel hücre kültürleri için yeterlidir, ancak, insan kornea endotel hücre kültürleri için orta 50 μg / mL sığır hipofiz ekstresi, 0.08% kondroitin sülfat, 200 μg/mL kalsiyum klorür ve 0.3 mM L-askorbik asit 2-fosfat ile takviye edilmelidir. Kültür ortamı karanlıkta 4 °C'de iki hafta saklanabilir.</li>
	<li>Üreticinin talimatlarını kullanarak Ek Faktörü ile 6 kuyulu doku kültür plakasının kuyularını katlayın ve daha sonra kaplanmış her bir kuyuya 1 mL kültür ortamı ekleyin. Her kornea için bir iyi hazırlayın.</li>
</ol>3. Explant diseksiyonu ve hücre kültürü prosedürü
<ol><li>Kornea yerleştirin, endotel tarafı yukarı, bir diseksiyon mikroskop aşamasında steril bir Petri kabına. Endüste'yi kornea yüzeyinin endotel tabakasını vurgulamak için yeterli kontrastla iyi aydınlatılmış olması için ayarlayın. Zum, kenar Ve bazı merkezi kornea endotel görünümünde olacak şekilde ayarlayın.</li>
	<li>Descemet'in membranını altta yatan stromadan yavaşça kaldırmak ve yırtmak için sterilize edilmiş saat çicitlerini kullanın (Şekil 1). Membran hemen kıvrılır bir şerit olarak stroma ayıracak. Şerit, Ek Faktörü ile kaplanmış ve 1 mL kültür ortamı içeren 6 kuyulu doku kültürü plakasının bir kuyuya yerleştirin. Doku kültür plakasının kapağı kontaminasyon riskini azaltmak için eksektisek bitkilerin ekildiği durumlar dışında her zaman tutulmalıdır.</li>
	<li>Descemet'in membran şeritlerini önce endotel'in aşırı çevresinden sonra da merkezi bölgelerden çıkarın. 6-iyi plaka içinde tek bir kuyuiçine bir kornea tüm şeritler yerleştirin.</li>
	<li>%5 CO2 ve 37 °C olarak belirlenen nemli hücre kültürü kuluçka makinesinde ekskütörlerin kuluçkaya yatırın. Ekstesyon ve plaka yüzeyine bağlamak için eksbitki izin vermek için 2 gün boyunca kültür rahatsız edilmeden bırakın. Tipik olarak, eksebitkilerin üçte biri kadarı plakaya bağlanmayı başaramaz.</li>
	<li>4 gün sonra orta ve herhangi bir bekar eksbitkiyi kültürden çıkarın ve ekli eksplants rahatsız etmemeye özen alarak yavaşça taze kültür ortamı 2 mL ekleyin. Kültür ortamı haftada iki kez değiştirilmelidir.</li>
</ol>4. Seri eksplant kültürüne göre kornea endotel hücrelerinin sürekli üretimi
NOT: Ekstremiteler ek kornea endotel hücre kültürleri oluşturmak için 10 gün sonra taze doku kültür plakaları transfer edilebilir.
<ol><li>Eksplant kültürünü bir diseksiyon mikroskobunun aşamasına yerleştirin ve eksplantların görünür olması için aydınlatmayı ve yakınlaştırmayı ayarlayın.</li>
	<li>Sterilize saat çicitleri kullanarak, her explant'ı kültür plakasından yavaşça koparın ve Ek Faktörü ile kaplanmış ve 1 mL kültür ortamı içeren 6 kuyulu doku kültür plakasının taze kuyuya aktarın.</li>
	<li>Ekseforların kültür ortamını 2 mL taze kültür ortamıyla değiştirmeden önce 4 gün boyunca yeni plakalarının yüzeyine yerleşmelerine izin verin. Değişim kültür ortamı haftada iki kez değişti.</li>
</ol>5. İmmünfloresan analizleri için cam kapaklarda kornea endotel hücrelerinin büyümesi
NOT: İmmünfloresan kullanılarak analiz edilmesi gereken hücre kültürleri, boyama işleminden sonra cam mikroskop slaytlarına monte edilebilen cam kapaklar üzerine kurulmalıdır.
<ol><li>Bir otoklavda 13 mm çapındaki yuvarlak cam kapaklı bir paketi sterilize edin veya 15 dakika boyunca %70 etanol ve ardından fosfat tamponlu salin (PBS) üç durulama yıkıntArak.</li>
	<li>24 kuyulu doku kültürü plakasının kuyularına tek tek kapakları yerleştirin, Ek Faktörü ile kaplayın ve her kuyuya 0,5 mL kültür ortamı ekleyin.</li>
	<li>Sterilize saat çicitleri kullanarak doku kültür plakalarından eksplinleri çıkarır ve kapak içeren kuyulara aktarın. Explants orta değiştirmeden önce 4 gün boyunca kapakları üzerine yerleşmek için izin verin.</li>
	<li>Gerekli kuluçka döneminden sonra, kültür kuyuları içindeki örtüör kültürleri düzeltin ve lekelayın. Lekeli kapakları, floresan mikroskobu altında analiz için cam mikroskop slaytlarına monte edin.</li>
</ol>6. Dispase II kullanarak kornea endotel hücrelerinin alt kültürü
NOT: Büyük fibroblastik hücreler bu prosedürü kullanmadan önce 6 kuyulu plakalarda eksplant kültürlerinden seçici olarak çıkarılabilir. Tüm hücreler alt kültüre alınacaksa, 6.2 ile 6.4 adımlarını gerçekleştirmeyin. Bu işlemin amacı hücreleri mümkün olduğunca hücreden hücreye temaslarını sürdürürken yeni plakalara aktarmaktır. Hücreler nazikçe ele alınmalıdır. Tamamen confluent kuyular 1:2 oranında geçilmelidir, subconfluent kuyular ise 1:1 veya daha az bir oranda geçilmelidir.
<ol><li>Ortamı kültürden çıkarın ve DPBS ile kısa bir süre durulanın.</li>
	<li>Versene 1 mL ekleyin. 30 s için oda sıcaklığında kuluçka.</li>
	<li>Versene kaldırın ve TrypLE 1 mL ekleyin. 3 7 °C'de doku kültürü kuluçka makinesinde 3 dk kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Bir faz kontrast mikroskobu kullanarak kültürü gözlemleyin. Hücreleri plakadan çıkarmak için kültüre hafifçe dokunun. En kısa sürede büyük fibroblastik hücreler plaka dan ayrılmış onları ve TrypLE 1 mL pipet kullanarak kaldırın. Kalan hücrelerden kalan TrypLE'ı 2 mL DPBS ile iki kez durulayarak yıkayın.</li>
	<li>1 mg/mL Dispase II'nin kültüre 1 mL'sini ekleyin ve doku kültürü kuluçka makinesinde 1 ila 2 saat veya tüm hücreler plakadan ayrılana kadar kuluçkaya yatırın. Hücreler yavaş yavaş kümeler halinde plaka uzak yüzen gerekir.</li>
	<li>Hücreleri 1 mL pipet kullanarak toplayın ve 50 mL'lik bir santrifüj tüpte 20 mL DPBS'ye aktarın. Oda sıcaklığında 300 x g 5 dakika santrifüj.</li>
	<li>Supernatant çıkarın ve yavaşça kültür orta 1 mL pipet ile triturasyon ile hücre pelet yeniden askıya. Hücre süspansiyonuna 6 kuyuluk bir veya iki kuyuya, sırasıyla 1:1 veya 1:2 oranında geçiş eaktarın.</li>
	<li>2 mL yapmak ve doku kültürü kuluçka içine kültürleri yerleştirmek için her kuyuda orta kadar top. Orta yı haftada iki kez 2 mL taze orta ile değiştirin.</li>
</ol>7. Biyomalzeme zarlarında kornea endotel hücre tabakalarının büyümesi
NOT: Aşağıdaki yordam, hücre kültürü için mikro Boyden odası adı verilen özel yapım bir montaj cihazına membranöz biyomalzeme nin monte edilmesiyle ilgili adımları açıklar. Cihaz hakkında daha fazla bilgi ve satın alma ayrıntıları için lütfen son yayın6'ya bakın.
<ol><li>Mikro Boyden haznesinin üst odasını, ortasına kırmızı bir O-halkası yerleştirerek birleştirin.</li>
	<li>Bir politetrafloroetilen (PTFE) kesme tahtası üzerindeki biyomalzeme levhasından bir diski delmek için 18 mm çapında bir trephine kullanın. Bu diski mikro Boyden odasının üst odasına kırmızı o-halkasının üzerine yerleştirin.</li>
	<li>Alt hazneyi üst hazneye vidala, aradaki biyomalzeme diskini emniyete ala.</li>
	<li>Sterilize etmek için 1 saat boyunca % 70 etanol içinde monte mikro-Boyden odası ıslatın.</li>
	<li>Etanol çıkarmak için 10 dakika boyunca steril HBSS'de birleştirilmiş mikro Boyden haznesini tamamen batırın. Bu yıkama adımLarını iki kez tekrarlayın. Tamamlanmamış kültür ortamda 10 dakika için son bir yıkama adımı gerçekleştirin.</li>
	<li>Sterilize mikro-Boyden haznesini, üst haznenin en üstte olmasını sağlayan 6 kuyulu bir plakanın kuyusundaki kültür ortamına aktarın. Biyomalzeme zarının alt yüzeyine temas eder ancak üst hazneye akmayacak şekilde kültür ortamının seviyesini ayarlayın.</li>
	<li>Bölüm 6'da belirtilen prosedürü kullanarak kornea endotel hücrelerinin süspansiyon hazırlayın. Mikro-Boyden haznesinde membranda cm2 başına en az 100.000 hücrenin tohumlama yoğunluğuna izin vermek için süspansiyonda yeterli hücre yoğunluğu sağlanmalıdır. Mikro Boyden haznesindeki kültür yüzey alanı 0,5 cm2 olup 100 μL hacimde olabilir. Bu nedenle 500.000 hücre/mL içeren bir süspansiyon hazırlanmalıdır.</li>
	<li>Pipet 100 μL hücre süspansiyonu (50.000 hücre) mikro-Boyden odasındamembran üzerine. Doku kültürü kuluçka kuluçka 4 saat için tamamen oda batırmak için orta kadar tepesi önce. Haftada iki kez orta yerine, gerekli süre için kültür kuluçka. NOT: Kornea endotel hücreleri biyomateryal membranın üst yüzeyine bağlandıktan sonra mikro-Boyden haznesi kültür içinde ters çevrilebilir, böylece alt oda en üstte yer alabilir. Daha fazla hücre daha sonra membranın diğer yüzeyinde hücre kültürleri başlatmak için odasına eklenebilir. Örneğin, kornea stromal hücreleri kolayca alternatif yüzeye böylece arka kornea içinde görüldüğü gibi kornea hücre tiplerinin göreli konumunu taklit uygulanabilir.</li>
</ol>

<ol><li>Güell, J. L., El Husseiny, M. A., Manero, F., Gris, O., Elies, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Historical+Review+and+Update+of+Surgical+Treatment+for+Corneal+Endothelial+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Historical Review and Update of Surgical Treatment for Corneal Endothelial Diseases.</a> Ophthalmology and Therapy. 3, 1-15 (2014).</li>
<li>Tan, D. T. H., Dart, J. K. G., Holland, E. J., Kinoshita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Corneal transplantation.</a> The Lancet. 379 (9827), 1749-1761 (2012).</li>
<li>Soh, Y. Q., Peh, G. S. L., Mehta, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+issues+for+human+corneal+endothelial+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regnerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Translational issues for human corneal endothelial tissue engineering.</a> Journal of Tissue Engineering and Regnerative Medicine. 11 (9), 2425-2442 (2017).</li>
<li>Senoo, T., Joyce, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Cycle+Kinetics+in+Corneal+Endothelium+from+Old+and+Young+Donors%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology%2C+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Cell Cycle Kinetics in Corneal Endothelium from Old and Young Donors.</a> Investigative Ophthalmology, Visual Science. 41 (3), 660-667 (2000).</li>
<li>Roy, O., Leclerc, V. B., Bourget, J. M., Thériault, M., Proulx, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+process+of+corneal+endothelial+morphological+change+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology%2C+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Understanding the process of corneal endothelial morphological change in vitro.</a> Investigative Ophthalmology, Visual Science. 56, 1228-1237 (2015).</li>
<li>Harkin, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mounting+of+Biomaterials+for+Use+in+Ophthalmic+Cell+Therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Mounting of Biomaterials for Use in Ophthalmic Cell Therapies.</a> Cell Transplantation. 26 (11), 1717-1732 (2017).</li>
<li>Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Comprehensive+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cell migration.</a> Comprehensive Physiology. 2 (4), 2369-2392 (2012).</li>
<li>Walshe, J., Harkin, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+explant+culture+provides+novel+insights+into+the+potential+location+and+phenotype+of+corneal+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Serial explant culture provides novel insights into the potential location and phenotype of corneal endothelial progenitor cells.</a> Experimental Eye Research. 127, 9-13 (2014).</li>
<li>Al Abdulsalam, N. K., Barnett, N. L., Harkin, D. G., Walshe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+of+corneal+endothelial+cells+from+sheep%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Cultivation of corneal endothelial cells from sheep.</a> Experimental Eye Research. 173, 24-31 (2018).</li>
<li>Parekh, M., Ferrari, S., Sheridan, C., Kaye, S., Ahmad, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+Review%3A+An+Update+on+the+Culture+of+Human+Corneal+Endothelial+Cells+for+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Concise Review: An Update on the Culture of Human Corneal Endothelial Cells for Transplantation.</a> Stem Cells Translational Medicine. 5 (2), 258-264 (2016).</li>
<li>Peh, G. S., Toh, K. P., Wu, F. Y., Tan, D. T., Mehta, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+of+human+corneal+endothelial+cells+isolated+from+paired+donor+corneas%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cultivation of human corneal endothelial cells isolated from paired donor corneas.</a> PLoS One. 6 (12), 28310(2011).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan.

İnsan kornea endotel hücrelerinin kurulması ve genişletilmesi ile ilgili önemli bir teknik sorun emt kültürlerde meydana gelen engelliyor. EMT hücre-hücre teması kaybı ile kornea endotel hücrelerinde tetiklenebilir, ancak bu hücreler için çoğu hücre kültürü protokolleri izolasyon ve altkültür10sırasında tek hücrelere enzimatik dissositasyon içerir. Burada kornea endotel hücreleri için, izolasyon ve alt kültür aşamalarında hücrelerin birbirleriyle teması kaybetme riskini en aza indiren alternatif b...

Kornea gözün önünde bulunan şeffaf bir dokudur. Üç ana tabakadan oluşur: dış yüzeyde bir epitel tabakası, bir orta stroma tabakası, ve kornea endotel denilen bir iç tabaka. Kornea endotel Descemet membran denilen bir bodrum membran üzerinde oturur hücrelerin bir monolayer ve altta yatan sulu mizah stroma girer sıvı miktarını düzenleyerek kornea şeffaflığını korur. Stroma içinde çok fazla sıvı kornea şişmesine neden olur, opaklık ve görme kaybı. Endotel bu nedenle görme korumak için hayati önem taşımaktadır.
Kornea endotel yaşlanma, hastalık ve yaralanma gibi nedenlerle bir dizi için işlevsiz olabilir, ve tek mevcut tedavi nakli ameliyatı. Bu ameliyat sırasında endotel ve Descemet'in zarı hastanın korneasından çıkarılır ve donör korneadan elde edilen endotel ve Descemet membranı grefti ile değiştirilir. Birçok endotel greftleri de taşıma ve ev sahibi kornea1eki yardımcı olmak için stromal doku ince bir tabaka içerir.
Dünya çapında, organ nakli ameliyatları için kornea donör dokusu için talep göz bankaları tarafından temin edilebilir miktardan daha fazladır2. Bu nedenle bu açığı hafifletmek için kullanılabilecek doku mühendisliği kornea endotel nakli geliştirmek için bir sürücü olmuştur3. Bunun gerekçesi şu anda, tek bir korneadan endotel sadece tek bir hastaya transfer edilebilir gerçeğine dayanmaktadır, ancak, kornea endotel hücreleri ilk genişletilmiş ve doku kültüründe biyomalzeme iskeleler üzerinde yetiştirilen ise, birden fazla hasta tedavisinde kullanılabilir.
Doku mühendisliğikorneal endotel nakli cerrahlar için uygun bir seçenek haline gelmeden önce ele alınması gereken başlıca zorluklar şunlardır: (1) yüksek kaliteli kornea endotel hücrelerini genişletmek ve olgun ve üretmek için teknikler kurmak fonksiyonel kornea endotel hücre tabakaları in vitro, ve (2) biyomalzeme iskelelerinde hücreleri büyütmek için teknikler oluşturarak şu anda kullanılan donör kornea kaynaklı greftlere eşit veya daha iyi doku mühendisliği greftler üretmek için.
Korneal endotel hücreleri in vivo çok düşük proliferatif potansiyele sahip ama in vitro bölmek için uyarılabilir4. Yine de, onlar in vitro epitelyal-mezenkimal geçiş geçmesi için güçlü bir eğilim var (EMT), hangi olgun, fonksiyonel endotel tabakası oluşturmak için kapasitelerini azaltır. Kornea endotel hücrelerinde EMT için bilinen tetikleyiciler bazı büyüme faktörleri ve hücre-hücre teması kaybı maruz kalma içerir5. Bu nedenle alt kültür sırasında enzimatik olarak ayrıştırılan kornea endotel hücre kültürlerinin EMT ile ilişkili değişikliklere uğraması neredeyse kaçınılmazdır. Burada, izolasyon, genişleme ve alt kültür aşamalarında hücre-hücre temaslarının bozulmasını en aza indirmek ve EMT potansiyelini azaltmak için tasarlanmış insan veya koyun kornea endotel hücreleri için bir hücre kültürü yöntemi salıyoruz. Ayrıca, donör kornea kaynaklı endotel/Descemet membran/stromal doku greftlerine benzeyen doku yapımı greftlerin, biyomalzeme zarının her iki tarafında ki kültürlü hücre tabakalarının özel yapım bir montaj cihazında nasıl yetiştirilebildiğini gösteriyoruz.

<table><tbody><tr><td>Bağlantı faktörü</td><td>Gibco</td><td>S006100</td><td>Doku kültürü yüzeylerini kaplamak için kullanılan jelatin içeren 1X steril bir çözelti. 4 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>Sığır hipofiz özü</td><td>Gibco</td><td>13028014</td><td>Tek bir şişe 25 mg içerir. Alikotlarda dondurun.</td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür</td><td>Merck</td><td>C5670</td><td>1 mM'lik bir stok çözeltisi yapmak için HBSS'de çözün. Filtre sterilize.</td></tr><tr><td>Santrifüj tüpü, 50 ml</td><td>Labtek</td><td>650.550.050</td><td></td></tr><tr><td>Kondroitin sülfat</td><td>LKT Laboratuvarları</td><td>C2960</td><td>Bu sığır kondroitin sülfattır. 0.08 g / mL'lik bir stok çözeltisi yapmak için HBSS'de çözün. Süzün, sterilize edin ve alikotlarda dondurun.</td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Gibco</td><td>17105-041</td><td>2 mg / mL'lik bir stok çözeltisi yapmak için DPBS'de çözün. Süzün, sterilize edin ve alikotlarda dondurun.</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Labtek</td><td>EA043</td><td>%100 denatüre edilmemiş etanol, aletleri ve yüzeyleri sterilize etmek için deiyonize suda %70'e kadar seyreltilmelidir.</td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>GE Healthcare Australia Pty Ltd</td><td>SH30084.03</td><td>Bu, fetal sığır serumunun bir HyClone markasıdır.</td></tr><tr><td>Kapak camı No. 1, & Oslash; 13 mm</td><td>Proscitech</td><td>G401-13</td><td>Sterilize edilmiş kapak fişlerini doku kültürü için 24 oyuklu plakalara yerleştirin.</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td>Hank'in kalsiyum klorür ve magnezyum klorür içeren dengeli tuz çözeltisi, 1X.</td></tr><tr><td>L-askorbik asit 2-fosfat</td><td>Merck</td><td>A8960</td><td>150 mM'lik bir stok çözeltisi yapmak için HBSS'de çözün. Filtre sterilize.</td></tr><tr><td>Mikro-Boyden odası</td><td>CNC Bileşenleri Pty. Ltd.</td><td>Üst halka: QUT-0002-0006, Taban halkası: QUT-0002-0007</td><td>Her iki bileşen de politetrafloroeterinden (PTFE) yapılmıştır.</td></tr><tr><td>Mikro-Boyden odası için O-ring</td><td>Ludowici Sızdırmazlık Çözümleri</td><td>RSB012</td><td>Silikon kauçuktan oluşur.</td></tr><tr><td>Opti-MEM 1 (1X) + GlutaMAX-1</td><td>Gibco</td><td>51985-034</td><td>Glutamin içeren indirgenmiş bir serum ortamı.</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuzlu suyu, 1X, kalsiyum klorür ve magnezyum klorür içermez.</td></tr><tr><td>Pen</td><td>Strep Gibco</td><td>15140-122</td><td>10.000 Ünite / mL penisilin ve 10.000 & mikro içeren 100X antibiyotik solüsyonu; g/mL streptomisin.</td></tr><tr><td>Petri kabı</td><td>Sarstedt</td><td>82.14473.001</td><td>Steril Petri kabı, 92 X 16 mm, doku diseksiyonları için.</td></tr><tr><td>Doku kültürü plakası, 24 kuyulu</td><td>Corning Incorporated</td><td>Costar 3524</td><td>Her biri 2 cm2 yüzey alanına sahip 24 kuyucuk içeren bir plaka.</td></tr><tr><td>Doku kültürü plakası, 6 kuyulu</td><td>Corning Incorporated</td><td>Costar 3516</td><td>Her biri 9 cm2 yüzey alanına sahip 6 kuyucuk içeren bir plaka.</td></tr><tr><td>TrypLE Select</td><td>Gibco</td><td>12563-011</td><td>Hücreleri ayırmak için 1X enzim çözeltisi.</td></tr><tr><td>Versene</td><td>Gibco</td><td>15040-066</td><td>Hücreleri ayırmak için 1X EDTA çözeltisi.</td></tr><tr><td>Saatçi forseps</td><td>Labtek</td><td>BWMF4</td><td>Numara saatçi forsepsleri, endotel/Descemet zarının şeritlerini kornealardan çıkarmak için iyi çalışır.</td></tr></tbody></table>

biyomalzeme membranlar Üzerinde İnsan ve koyun korneal endotel hücre tabakalarının büyümesi

Growth of Human and Sheep Corneal Endothelial Cell Layers on Biomaterial Membranes

Korneal endotel hücre kültürleri hücre-hücre teması kaybından sonra epitelyal-mezenkimal geçiş (EMT) geçmesi eğilimi vardır. EMT, olgun ve işlevsel bir tabaka oluşturma yeteneklerini azalttığı için hücreler için zararlıdır. Burada, insan ve koyun kornea endotel hücre kültürleri kurmak ve subculturing için bir yöntem sunmak hücre-hücre teması kaybını en aza indirir. Kornea endotel/Descemet zarının eksektimi donör kornealardan alınarak hücrelerin kültür yüzeyine topluca göç etmesini sağlayan koşullar altında doku kültürüne yerleştirilir. Bir kültür kurulduktan sonra, eksebitkiler yeni kültürler ilerler. Dispase II hafifçe alt külleme için doku kültürü plakaları kapalı hücrelerin kümeleri kaldırmak için kullanılır. Bu protokol kullanılarak kurulan korneal endotel hücre kültürleri, hayvan deneylerinde transplantasyon için doku mühendisliği hücre tabakaları üretmek için biyomalzeme zarlarına aktarılması için uygundur. Doku kültürü sırasında biyomateryal membranları desteklemek için özel yapım bir cihaz tanımlanmış ve kornea endotel hücrelerinin bir tabaka ve kollajen tip I membran her iki tarafında kornea stromal hücrelerinin bir tabaka oluşan bir doku mühendislik greft bir örnek sunulmaktadır.

Kornea endotel hücrelerinin insan veya koyun kornealarından izole etme ve genişletme yöntemi Şekil 1 ve Şekil 2'deözetlenmiştir. 1 ila 2 yaşındaki koyunların kornealarından elde edilen ekbitkilerin çoğu veya 30 yaşından küçük insan donörler bir hafta içinde Ek Faktör kaplı doku kültür plakalarına eklenecektir, ancak eksebitkilerin üçte birinin bu süre içinde bağlanmadığını görmek olağandışı değildir. Bu 'yüzen' eksplants kültürlerden kaldırılabilir. 30 yaşından ...

Bu protokol, insan veya koyun dokusu eksbitkilerinden kornea endotel hücre kültürleri kurmak ve büyümek için gerekli kritik adımları açıklar. Membranöz biyomalzemeler üzerinde kornea endotel hücrelerinin subculturing için bir yöntem de sunulmaktadır.

Biyomalzeme Membranlar Üzerinde İnsan ve Koyun Korneal Endotel Hücre Tabakalarının Büyümesi

Corneal endothelial cell cultures have a tendency to undergo epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) after loss of cell-to-cell contact. EMT is ...

Bu hücre kültürü protokolü, kornea endotel hücrelerinin izolasyon, genişleme ve alt kültür sırasında epitelden mezenkimal geçişe girmesini önlemek için tasarlanmıştır. Hücre kültürleri kornea doku eksplants kurulur, hangi bir donör birincil hücrelerin sürekli kaynağı sağlamak için yeniden kullanılabilir. Üreticinin talimatları kullanarak ek faktörü ile altı kuyudoku kültür plakası kuyuları kaplama ile başlayın.Sonra her iyi kodlanmış kültür orta bir mililitre ekleyin. Kornea endotel tarafını, bir diseksiyon mikroskobu niçin steril bir Petri kabına yerleştirin. Endüste yüzeyinin endotel tabakasını vurgulamak için yeterli kontrastla iyi aydınlatılmış olması için aydınlatmayı ayarlayın ve kenar ın ve bazı merkezi kornea endotelgörünümünü sağlayacak şekilde yakınlaştırmayı ayarlayın.Descemet'in membranını altta yatan stromadan yavaşça kaldırmak ve yırtmak için sterilize edilmiş saat çicitlerini kullanın. Membran şeridini kültür plakasının hazırlanmış kuyularından birine yerleştirin ve kontaminasyon riskini azaltmak için plakanın kapağını hemen değiştirmeyi unutmayın. Descemet'in zarının şeritlerini önce endotel'in aşırı çevresinden ve daha sonra orta bölgelerden çıkararak bir korneadaki tüm şeritleri tek bir kuyuya yerleştirin.Bittiğinde, 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit ayarlanmış nemlendirilmiş hücre kültürü kuluçka ekskütif. Mikro Boyden odasının üst odasını, ortasına kırmızı bir O halkası yerleştirerek birleştirin. PTFE kesme tahtasındaki biyomalzeme levhasından bir diski çıkarmak için 18 milimetre çapında bir trephine kullanın.Daha sonra, mikro Boyden odasının üst odasında kırmızı O halkası üzerinde disk yerleştirin. Alt hazneyi üst hazneye vidala, biyo malzemenin diskini arada sabitle. Ve bir araya getirilen mikro Boyden haznesini sterilize etmek için bir saat boyunca %70 etanolle ıslatın.Bekletildikten sonra, etanol çıkarmak için 10 dakika boyunca steril HBSS'deki hazneyi tamamen batırın. Daha sonra 10 dakika kültür ortamı içinde oda yıkayın. Ve altı kuyuluk bir kuyunun içindeki kültür ortamına aktarArak üst haznenin yukarı doğru yöneldiğinden emin olun.Biyomalzeme membranının alt yüzeyine temas edin, ancak üst hazneye akmayacak şekilde ortamın seviyesini ayarlayın. Pipet 100 mikrolitre hücre süspansiyonu mikro Boyden odasına membran üzerine, ve doku kültürü kuluçka dört saat kuluçka, tamamen oda batırmak için orta eklemeden önce kuluçka. Bir ila iki yaşındaki koyunların kornealarından elde edilen ekbitkilerin çoğu veya 30 yaşından küçük insan donörler bir hafta içinde ek faktör kodlu doku kültür plakalarına iliştirilir.Altı hafta sonra, birçok küçük, sıkıca paketlenmiş hücreler ekstrplant yanında mevcuttu. Kornea endotel hücre kültürleri içinde küçük, sıkıca paketlenmiş hücreler üçlü ile sindirime dayanıklı, büyük fibroblastik hücreler ise daha duyarlıdır. Bu fark, küçük hücreleri yeni plakalara aktarmadan önce kültürlerden büyük hücreleri seçici olarak kaldırmak için yararlanıldı.Sıkı bir kavşak proteini olan ZO-1 ve bir bağlılık kesişme proteini olan N-kadherin'i bulmak için kornea endotel hücre kültürleri üzerinde immünal uneskence analizleri yapıldı. Aynı antikorlar hem koyun hem de insan hücreleri için kullanıldı ve her iki protein de her iki türün plazma zarlarında tespit edildi. Özel yapım mikro Boyden odası, bir zarın her iki tarafının aynı anda hücre kültürü yüzeyi olarak kullanılmasına olanak sağladı.Bir doku mühendislik hücre yapısının kesit görünümü bir yüzeyde kornea endotel hücrelerinin tek bir tabaka gösterir, ve diğer kornea stromal hücrelerinin çok katmanlı bir kültür. Bu protokolü denerken, Descemet'in zarını korneadan çıkarırken endotel'i ponplerinizle kazımaktan kaçınmanız önemlidir. Bu işlemden sonra, bir membran üzerindeki kornea endotel hücre tabakasının bütünlüğü elektrikdirenci ölçülerek kontrol edilebilir.

growth-human-sheep-corneal-endothelial-cell-layers-on-biomaterial

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Hücre Tek katmanlar mekanik uyarılması bağlı Kalsiyum Dalga Yayılım: Sığır Kornea Endotel Hücreleri Örneği

Biz hücre davranışlarını incelemek için hangi electrospun zarlar içinde mikrocepler imalatı için bir teknik rapor. Özellikle, PLGA (poli (laktid-ko-glikolid)) microfeatures ile donatılmış kornea biyomalzeme cihazların üretimi için microstereolithography ve üretebilmektedir bir kombinasyonunu tarif eder.

Microstereolithography ve ELEKTROÜRETİM kombinasyonu Kornea Yenilenme Nişli ile donatılmış Membranlarını Üretiliyor

İnsan diyabetik organ kültürü yapılmış kornealarda adenoviral gen tedavisinin bir örneği, bu kornealarda gecikmiş yara iyileşmesinin normalleşmesine ve belirgin şekilde azalmış epitelyal kök hücre belirteç ekspresyonuna yönelik olarak sunulmuştur. Ayrıca, kök hücre ile zenginleştirilmiş limbal epitel kültürlerinde bu sürecin optimizasyonunu da açıklar.

Diyabetik Keratopatide için adenoviral Gen Tedavisi: İnsan Organ-kültürlü kornealar ve Limbal Epitel Hücreleri Yara İyileşmesi Üzerine Etkileri ve Hücre Marker İfade Kök

sığır endotel hücrelerinin ana bir kültürü kornea endotelial-mezenkimal geçiş mekanizmasını araştırmak için kullanıldı. Ayrıca, bir fare endotel cryoinjury modeli in vivo olarak endotel-mezenkimal geçiş göstermek için kullanılmıştır.

Vitro ve in vivo Modelleri Kornea Endotel-mezenkimal Geçiş Çalışması için

Bu iletişim kuralı muayene ve etkileşimleri iki hücre tiplerinin anlayış yardımcı olmak için nerede kornea stromal hücreler ve farklılaştırılmış nöronal hücre birlikte kültürlü bir roman üç boyutlu vitro modeli, açıklar.

Kornea doku Mühendisliği: İnsan kornea sinir Stromal etkileşimlerin bir Vitro modeli

Retina pigment epitel hücrelerinin insan amniyotik membran ve hayvan modellerinde aşılama için hazırlık üstüne kültürlü insan pluripotent kök hücreler elde oluşan bir retina doku mühendisi bir yöntem açıklanmaktadır.

Transplantasyonu uygun Retina Pigment epitel doku mühendisliği insan embriyonik kök hücrelerden türetilmiş

Eski bir protokol vivo kornea organ kültür model çalışmaları şifa yara açıklanan için yararlı. Bu modeli sistem rejeneratif iyileşmesine katkıda bulunmak üzere ajanlar veya ilaç toksisitesi organize 3D çok hücreli ortamında etkilerini değerlendirmek için kullanılabilir.

Ex vivo kornea Organ kültür modeli için yaranın çalışmaları

Burada domuz eti bölünmüş kornea düğmelerinin hazırlanması ve yetiştirilmesi için adım adım bir protokol sunulmuştur. Bu organo-tipik ekili organ kültürü modeli 15 gün içinde hücre ölüm oranlarını gösterir gibi, insan donör kornea karşılaştırılabilir, toksik dekstran eklemeden insan dışı kornea uzun vadeli ekimi sağlayan ilk modeli temsil eder.

Split Korneal Düğmeleri Kullanarak Bir Domuz Korneal Endotel Organ Kültür Modeli

Burada kornea endotel hücrelerinin (MSK) neodimyum kullanarak Descemet zarından (DM) ayrılması için bir protokol sunuyoruz:YAG (Nd:YAG) lazer, büllöz keratopati (BK) için eksvivo hastalık modeli olarak.

Kornea Endotel Hücre Kaybının Noninvaziv, Lazer Destekli Deneysel Modelinin Geliştirilmesi

Descemet's Stripping Only, Fuchs Endotelyal Kornea Distrofisinden kaynaklanan merkezi kornea guttası olan hastalarda, periferik hücrelerin endotel tabakasını yenilemesi için Descemet'in zarının sıyrıldığı deneysel bir prosedürdür. Bu yazıda, eFGF1 (NM141) tarafından uyarılan hızlandırılmış iyileşme ile distrofik insan kornealarında ex vivo'da DSO'yu simüle eden yeni metodoloji sunulmaktadır.

Descemet'in Sadece Mühendislik Fibroblast Büyüme Faktörü 1 Tarafından Uyarılan Hızlandırılmış İyileşme ile Sıyırılmasının İnsan Kornea Organ Kültürü Modeli

Burada, kollajenaz A ve tripsin ile ardışık sindirim yoluyla tüm fare kornealarından yüksek kaliteli tek hücreli süspansiyonlar elde etmek için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, yüksek RNA bütünlüğüne sahip geçerli tek hücreler sağlar ve bu da onları tek hücreli RNA dizileme ve akış sitometriy gibi sonraki uygulamalarla uyumlu kılar.

Fare Kornealarından Tek Hücreli Süspansiyonun Hasat İçin Bir Protokol

Keşfedin, korneal endotel hücrelerini biyomalzeme membranlar üzerinde yetiştirme yöntemini. Epitelden mezenkimal geçişi önleyerek hücre fenotipini koruyun ve rejeneratif tıp için sürdürülebilir hücre kaynağı sağlayın.

Biyomalzeme Membranlar Üzerinde İnsan ve Koyun Korneal Endotel Hücre Tabakalarının Büyümesi

Daha fazla video keşfet