Canlı ve Fonksiyonel Murine Koklear Saç Hücrelerinde Dekstran Etiketleme ve Alımı
8 Şubat 2020
Burada, fonksiyonel mekanotransdüksiyon kanalları ile işitsel saç hücrelerinde 3 kDa Texas Kırmızı etiketli dextran alımını görselleştirmek için bir yöntem salıyoruz. Buna ek olarak, 3-10 kDa dekstrans saç endositoz ve Corti organının destekleyici hücreleri çalışmak için kullanılabilir.
Bu protokolün genel amacı fonksiyonel mekanotransdüksiyon kanalları ile canlı saç hücrelerinde Texas Red ile etiketlenmiş düzenli dekstran floresan alımı incelemektir. Bu tekniğin en büyük avantajı üç kilodalton Texas Red dextran canlı saç hücrelerinde mechanotransdüksiyon kanal fonksiyonu değerlendirmek için kullanılabilir olmasıdır. Kokleayı hasat etmek için, doğum sonrası altı farenin kafatasını Leibovitz'in L-15 ortamını içeren 60 milimetrelik bir kültür yemeğine yerleştirin ve kafatasının arka ucuna ve dış işitsel kanallarboyunca ön uçtan yüzeysel bir kesim yapmak için cerrahi makas kullanın.
Kafatası ortaya çıkarmak için burun doğru deri katlayın ve kafatasının ön ve göz hattı boyunca arka dan bir kesi yapmak. Kafatasını iki yarıya ayırın ve beyni çıkarmak için küçük bir spatula kullanın. Zamansal kemikler gözlemlenebilir zaman, doku çıkarmak için bu kemiklerin etrafında kesmek için küçük makas kullanın.
Taze L-15 orta içeren 35 milimetrelik çanak temporal kemikleri batırın ve geniş bir alan gözlük ve harici alternatif akım halojen ışık kaynağı ile donatılmış bir stereo mikroskop altında çanak yerleştirin. Çevredeki koklear doku, yarım dairesel kanallar ve vestibüler organları kaldırmak için forceps kullanın. Koklea kesildikten ve taze L-15 media ile yeni bir tabağa yerleştirildikten sonra, yuvarlak pencerede bir delik yara ve apikal koklear bölgede bir delik yapmak için cerrahi forseps kullanın.
Tüm kokleae hasat edildiğinde, taze L-15 orta 200 mikrolitre içeren dokuz kuyulu cam depresyon plaka bir kuyu içine doku yerleştirin. İzole dokuların dekstran etiketleme için, floresan konjuge dextran mililitre başına iki miligram ile takviye taze L-15 orta 200 mikrolitre ile iyi her örnekten orta değiştirin. Numuneleri oda sıcaklığında iki saat ve ışıktan korunan 25 derecelik eğimli bir açıyla üç boyutlu bir çalkalayıcıda dakikada 25 dönüş için kuluçkaya yatırın.
Kuluçka sonunda, dokuları orta ve bir kez hbss ile yıkama başına iki dakika yıkayın. İkinci yıkamadan sonra numuneleri oda sıcaklığında 30 dakika boyunca %4 paraformaldehit ve ardından HBSS'de iki hızlı ve nazik yıkama ile düzeltin. İkinci yıkamadan sonra koklear kemiği, spiral ligamenti ve tektorial membranı çıkarmak ve HBSS'de Corti'nin izole organını yıkamak için ince uçlu çertikler kullanın.
Saç hücrelerindeki doku bu adımda kolayca zarar görebildiği için şeffaf tektorial membranı çıkarırken ekstra özen. F-aktin etiketlemek için, pbs içinde 0.5% Triton X-100 içinde floresan phalloidin 100 ila 200 seyreltme ile desteklenen örnekleri permeabilize oda sıcaklığında 30 dakika boyunca ışıktan korunan. Kuluçka sonunda, pbs tek bir yıkama ardından gösterildiği gibi yıkama başına taze HBSS dokuları 2-3 kez yıkayın.
Corti dokularının organını cam mikroskop üzerine monte etmek için uygun bir montaj ortamı kullanın saç stereocilia yanları yukarı yaslanır ve 63X yağ daldırma hedefini kullanarak örnekleri floresan konfokal mikroskobun üzerinde görüntüleyin. Texas Red ile konjuge üç kilodalton dekstran floresan ile iki saatlik bir kuluçka sonra, yabani tip postnatal gün altı fareler Corti explant organı hem iç hem de dış saç hücrelerinin sağlam ve özel etiketleme göstermektedir. Saç hücresi stereocilia ve hücre organlarının görüntüleme sadece kendi hücre vücudunda üç kilodalton dextran Texas Red dahil olan bu hücrelerin de stereocilia floresan etiketleme gösterdi ortaya koymaktadır.
Daha da önemlisi, mechanotransdüksiyon kanalının bulunduğu kısa stereositif sıraların uçlarında zenginleştirme ile stereosita boyunca tek tip floresan sinyal gözlenir. Saç hücrelerinin hücre vücudunda vezikül benzeri yapılar ve komşu destek hücreleri de dextran Texas Red de endositon tarafından alınabilir düşündüren gözlenmiştir. Daha büyük 10 kilodalton dekstrans da saç hücreleri ve destekleyen hücrelerin hücre vücudunda vezikül benzeri bir desen üretti.
Özellikle, bir kalsiyum şelatör veya mekotransdüksiyon kanal blokerleri varlığı stereocilia etiketleme ve saç hücrelerinde üç kilodalton dextran Texas Red alımını önler. Vezikül benzeri desen hala mechanotransdüksiyon kanalı abluka varlığında gözlenen, ancak, alım bu desen fonksiyonel MET kanalları bağımsız olduğunu gösteren. Corti dokusunun organını dikkatle incelemek ve görüntüleme için doku monte etmeden önce saç hücrelerinin doğru yönünü doğrulamak çok önemlidir.
Canlı ve fonksiyonel saç hücrelerinin dekstran etiketleme sonra, sabit doku immünboyama ilgi proteinlerin belirli hücre türlerini belirlemek için yapılabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, fonksiyonel mekanotransdüksiyon kanallarına sahip işitsel tüy hücrelerinde 3 kDa Texas Red işaretli dekstranın alımının görselleştirilmesi için bir yöntem sunmaktadır. Bu teknik, canlı tüy hücrelerinde mekanotransdüksiyon kanalı fonksiyonunun değerlendirilmesine olanak tanır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Hücre Biyolojisi
- İşitsel Araştırmalar
Arka Plan
- İşitsel tüy hücrelerinde mekanotransdüksiyonun anlaşılması, işitsel fonksiyon için kritik öneme sahiptir.
- Endositoz gibi hücresel süreçleri incelemek için farklı boyutlardaki dekstranlar kullanılabilir.
- Corti organı, kokleada işitmeye yardımcı olan temel bir yapıdır.
- Florasan etiketleme, hücresel alım süreçlerinin görselleştirilmesine yardımcı olur.
Çalışmanın Amacı
- Canlı işitme tüy hücrelerinde Texas Red ile işaretlenmiş dekstran alımını görselleştirmek.
- Bu hücrelerdeki mekanotransdüksiyon kanallarının işlevselliğini değerlendirmek.
- Tüy ve destek hücrelerinde endositozu incelemek için dekstran kullanımını araştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Postnatal altıncı gün farelerinden kohleanın hasat edilmesi.
- Kohlear yapıları açığa çıkarmak için cerrahi tekniklerin kullanılması.
- İşitme tüy hücrelerine Texas Red işaretli dekstranın uygulanması.
- Alımın floresan mikroskobu kullanılarak görüntülenmesi.
Ana Sonuçlar
- Canlı tüy hücrelerinde dekstran alımının başarılı şekilde görselleştirilmesi.
- Mekanotransdüksiyon kanallarının işlevselliğinin kanıtlanması.
- Corti organındaki endositoz mekanizmalarına dair yeni bilgiler sağlanması.
- İşitsel hücre biyolojisini incelemek için güvenilir bir yöntemin oluşturulması.
Sonuçlar
- Yöntem, işitme tüy hücrelerindeki dekstran alımını etkili bir şekilde görselleştirir.
- Bu yaklaşım, işitmedeki mekanotransdüksiyonun anlaşılmasını geliştirebilir.
- Gelecekteki çalışmalar, ilgili hücresel süreçleri araştırmak için bu tekniğin üzerine inşa edilebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel Uygunluk
Canlı işitme tüy hücrelerinde mekanotransdüksiyon kanalı fonksiyonunun değerlendirilmesi, işitme kaybı terapilerinde hedef doğrulaması için kritik öneme sahiptir. Bu yöntem, floresan dekstran alımı aracılığıyla kanal aktivitesinin doğrudan ve kantitatif bir okumasını sağlayarak, duyusal transdüksiyonda yer alan hedeflerin mekanistik olarak riskten arındırılmasına imkan tanır. Bu yaklaşım, moleküler fonksiyonu hastalıkla ilgili bir sistemdeki hücresel fenotip ile ilişkilendirerek erken keşif aşamasında öngörücü güveni destekler.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Canlı tüy hücrelerindeki fonksiyonel mekanotransdüksiyon kanal aktivitesini doğrudan ölçerek terapötik hipotezleri sorgular.
- Operasyonel Değer: Kanal fonksiyonuna yönelik sağlam, görüntüleme tabanlı bir analiz yoluyla hedeflerin biyolojik risklerinin azaltılmasını sağlar.
- Öngörücü Değer: MET kanal fonksiyonunu koruyan veya modüle eden bileşikleri, bunları yapmayanlardan ayırarak portföy önceliklendirmesini destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Analiz Hazırlığı: MET-bağımlı dekstran alımını fonksiyonel bir biyobelirteç olarak doğrulayarak, aşağı akışlı bileşik taramaları için valide edilmiş biyolojik sistemleri hazırlar.
- Kantitatif Çıktı: Stereosilyalarda ve hücre gövdesinde, kanal aktivitesi ile ilişkili olan ve örnekler arasında normalize edilebilen ölçülebilir floresans sinyalleri üretir.
- Ölçeklenebilirlik ve Yeniden Kullanım: Corti organı eksplantlarında boya alım kinetiğinin yüksek içerikli analizi için platform adaptasyonunu destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Hastalıkla İlgili Önem: İşitme tüy hücresi fonksiyonlarını incelemek için hastalıkla ilgili bir sistem olarak postnatal murin organ of Corti eksplantlarını kullanır.
- Translasyonel Süreklilik: Deneysel aşamalar boyunca tutarlı bir MET aktivitesi okuması sağlayarak keşif bulgularını preklinik doğrulamaya bağlar.
- Riske Göre Ayarlanmış İlerleme: MET kanal blokajı yoluyla dekstran alımını bozan bileşikleri tanımlayarak go/no-go (devam/durdur) kararlarına temel oluşturur.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, hedef hipotez testinden öncü bileşik belirlemeye kadar uzanan keşif sürekliliğine uygundur; burada mekanotransdüksiyon kanallarının fonksiyonel doğrulaması, bileşik taraması ve optimizasyonundan önce gelir.
- Keşif Biyolojisi: Kıl hücrelerinde MET kanalı bağımlı hücresel alımın doğrudan bir çıktısını sağlayarak hipotez testlerini ve yolakların açıklığa kavuşturulmasını destekler.
- Tarama: Stereosiliyalarda ve hücre gövdesinde tekrarlanabilir, kantitatif floresan çıktıları veren standartlaştırılmış dekstran işaretleme protokolleri aracılığıyla analiz hazırlığı sağlar.
- Analitik: Deneysel koşulların ve bileşik etkilerinin karşılaştırılmasına olanak tanıyan ölçülebilir bağımlı değişkenler (stereosiliya sıralarındaki floresan yoğunluğu ve vezikül benzeri paternler) sunar.
- Translasyonel Araştırma: Hastalık modellerinde hedef etkileşimini değerlendirmek için aynı MET aktivite çıktısını kullanarak preklinik süreklilikle bağlantı kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: İşitsel araştırma programları genelinde duyusal transdüksiyon fonksiyonunu değerlendirmek için yeniden kullanılabilir bir yetkinlik oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Mekanotransdüksiyon yolak analizindeki mekanistik belirsizliği azaltarak, hedef doğrulamada öngörücü güven sağlar.
- Operasyonel Değer: Dekstran alımına yönelik tanımlanmış inkübasyon, yıkama ve görüntüleme parametreleri aracılığıyla standardizasyon ve tekrarlanabilirlik sağlar.
- Stratejik Değer: Hedef modülasyonunu fonksiyonel tüy hücresi okumalarıyla ilişkilendirerek, geç aşamadaki biyolojik riski azaltır ve go/no-go karar verme sürecini iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Hastalıkla ilgili bir sistemde MET-bağımlı dekstran alımı üzerindeki etkilerine dayanarak, bileşiklerin riske göre ayarlanmış önceliklendirmesine olanak tanır.
Uygulama Hususları
- Fare koklea diseksiyonu, Corti organı izolasyonu ve floresan mikroskopi konularında uzmanlık gerektirir.
- Texas Red floresansı için uygun lazer ve deteksiyon ayarlarına sahip konfokal görüntüleme altyapısına bağlıdır.
- Dekstran konsantrasyonunun, inkübasyon süresinin ve shaker koşullarının laboratuvarlar arasında standartlaştırılmasını gerektirir.
- Yöntemin farklı memeli modellerine veya gelişimsel evrelere uygulanmasında adaptasyon değerlendirmelerini içerir.
- Canlı doku hazırlama gerekliliği ve tüy hücrelerinin diseksiyon sırasındaki mekanik ve çevresel strese karşı hassasiyeti ile sınırlıdır.
