Name: Canlı ve Fonksiyonel Murine Koklear Saç Hücrelerinde Dekstran Etiketleme ve Alımı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 55 s
Description: Öğrenin, canlı murine koklear saç hücrelerinde Texas Red-etiketli dextran alımını görselleştirme yöntemini. Bu teknik, mekanotransdüksiyon kanallarının işlevini değerlendirmek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz confocal görüntü edinimi yardımcı olmak için NICHD mikroskobu ve görüntüleme çekirdek Vincent Schram teşekkür, ve Tsg-Hui Chang koloni yönetimi ve fare bakımı ile paha biçilmez yardım için. Bu araştırma NINDS, NIH, Bethesda, MD Intramural Araştırma Programı tarafından K.J.S. A.B. tarafından NINDS, NIH Intramural Araştırma Programı ve intramural araştırma programından Robert Wenthold Doktora Sonrası Bursu tarafından desteklenmiştir. NIDCD'nin.

Hayvan bakımı ve deneysel prosedürler, Ulusal Nörolojik Bozukluklar ve İnme Enstitüsü Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (KJS'ye #1336 Hayvan protokolü) tarafından onaylanan Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı ile ilgili yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Fareler
<ol><li>Yavruların doğum tarihini kontrol etmek ve yavruların yaşını takip etmek için hayvan tesisinde üremek için C57BL/6J yabani tip üreme çiftleri bir çift ayarlayın.</li>
</ol>2. Kokleae Diseksiyonu
<ol><li>Diseksiyonları gerçekleştirmek için stereomikroskoba yakın temiz bir alan ayarlayın(Şekil 1A). Alanı ve çevreyi temizlemek ve temiz bir tezgah pedi yerleştirmek için %70 etanol kullanın. Bir Tıbbi Patolojik Atık (MPW) plastik torba hayvan leşleri atmak için gerekli olacaktır.</li>
	<li>Bazı Leibovitz's L15 medya ile birkaç 35 mm yemekler hazırlayın. NOT: Leibovitz's L-15 hücreli medya içerir 1-2 mM Ca2 +, uç bağlantılarının bütünlüğünü korumak için gerekli olan, ve esansiyel amino asitler içerir, vitaminler, ve hücre sağlığını ve sağkalımını artırmak için sodyum pirüuvat. Serum, düşük tanımlı bileşimi ve dekstran ile potansiyel girişim nedeniyle deneysel değişkenlik önlemek için dışlandı.</li>
	<li>Doğum sonrası-gün-6 (P6) farelerin kafasını nisbeten ötenazi. NOT: 6 günlük fareler inhalant anestezilere karşı biraz dirençlidir. Ötenazi için izofluran veya uzun süreli CO2 pozlama (50 dakikaya kadar) kullanılsa da, ölümü sağlamak için ikincil bir fiziksel yöntem önerilir.</li>
	<li>Arka uç ve dış işitsel kanallar arasında ön yüzeysel bir kesim yaparak kafatası deri kaldırmak için cerrahi makas kullanın.</li>
	<li>Kafatasını ortaya çıkarmak için deriyi buruna doğru katlayın (Şekil 2B).</li>
	<li>Arkadan kafatasının önüne ve göz çizgisinden(Şekil 2B-C)bir kesi yapın.</li>
	<li>Kafatasını iki ye ayırın ve temporal kemikleri ortaya çıkarmak için küçük bir spatula kullanarak beyni çıkarın (Şekil 2C-D).</li>
	<li>Küçük makas ile, temporal kemiklerin etrafında kesilmiş ve doku çıkarmak.</li>
	<li>Her iki temporal kemiği de 35 mm'lik bir tabağa yerleştirin ve L15 media(Şekil 2E)ile kaplanmış olduğundan emin olun. NOT: Aşağıdaki adımlar stereomikroskop altında gerçekleştirilir. Siyah bir arka plan genellikle ince diseksiyon adımları sırasında doku görselleştirmek için yardımcı olur.</li>
	<li>Geniş alan lı bir mercek (10X büyütme gücü (WF10X) ve harici alternatif akım (AC) halojen ışık kaynağı ile donatılmış stereomikroskop altında, çevredeki koklea dokularını, yarım daire kanalları ve cerrahi çalgılarile vestibüler organları çıkarın(Şekil 2F).</li>
	<li>Dextran ve L15 medyasının koklear kanala girmesine izin vermek için, biri yuvarlak pencerede diğeri apikal koklear bölgede olmak üzere, parçalanmış kokleae üzerinde iki delik sınırı gerçekleştirin.</li>
	<li>9 kuyulu cam depresyon plakasından her kuyuya 300 mL Leibovitz'in L15 ortamı ekleyin.</li>
	<li>Her kuyuya en az üç tane parçalanmış kokleae yerleştirin.</li>
</ol>3. Dextran Etiketleme
<ol><li>Hanks'in dengeli tuz çözeltisindeki dekstranı Ca2+ ve Mg2+ (HBSS-CFM) olmadan 10 mg/mL'lik son konsantrasyonda yeniden oluşturun. Bu stok çözeltisi opak siyah tüplerde (ışıktan korunmuş) ve kullanıma kadar -30 °C'de saklanmalıdır. NOT: Lizin düzeltilebilir dextran kullanımı bu protokolün başarılı bir sonucu için çok önemlidir.</li>
	<li>Leibovitz'in L15 media'sının 500 mL'sinde her dekstran 2 mg/mL'lik son konsantrasyonda hazırlayın.</li>
	<li>Kokleadan ortamı çıkarın ve Leibovitz'in 2 mg/mL'lik son konsantrasyonda ilgi dekstraniçeren L15 ortamını ekleyin. NOT: MET kanallarının bir kısmı41,42'deaçık olmasına rağmen, MET kanalının açık olasılığını artırmak için ekskütiflerin hafifçe sallanması ile dextran kuluçka işlemi gerçekleştirilmiştir.</li>
	<li>25° eğimli açıya sahip 3 boyutlu bir çalkalayıcı kullanarak hafif sallayarak 2 saat oda sıcaklığında kuluçkaya yatın .. NOT: Floresan etiketli dextran mümkünolduğunda ışıktan korunmalıdır. 2 saat kuluçka sırasında dextran korumak için, alüminyum folyo sarılmış bir hücre kültürü P150 çanak içine 9 iyi cam plaka yerleştirin.</li>
</ol>4. Görüntüleme için Örnek Hazırlama
<ol><li>Dekstran ile kuluçkadan sonra, 2 dk boyunca iki kez media ve bir kez HBSS ile doku yıkayın.</li>
	<li>Hanks'in dengeli tuz çözeltisinde (HBSS) %4 paraformaldehit ile 30 dk oda sıcaklığında doku kuluçka. DİkKAT: Formaldehite maruz kalmak gözlerde, burunda ve üst solunum yollarında tahriş edici olabilir. Bazı kişilerde, formaldehit tekrarlanan cilt maruziyeti alerjik dermatit neden olabilir duyarlılık neden olabilir. Formaldehit bilinen bir insan karsinojenve şüpheli bir üreme tehlikesidir.</li>
	<li>Paraformaldehiti çıkarmak için sabit dokuyu HBSS ile iki kez hızlı ve hafifçe yıkayın. NOT: Kokleanın bu gelişim evresinde temporal kemiklerin kireçlenmesine gerek yoktur.</li>
	<li>Corti organını incelemek için spiral ligamenti ve tektorial membranı ince uçlu terpler ile çıkarın (Şekil 2G).</li>
	<li>Doku tüm küçük parçaları çıkarın ve HBSS ile doku yıkayın.</li>
	<li>F-aktin etiketlemek ve görselleştirmek için 30 dakika boyunca 1:200 seyreltme de floresan etiketli phalloidin içeren PBS%0.5 Triton X-100 dokuyu permeabilize (TR veya FITC etiketli dextran alımını test ederken yeşil veya kırmızı konjuge) aktin bazlı stereocilia.</li>
	<li>Triton ve phalloidin fazlalığı kaldırmak için HBSS tampon ile 2-3 dakika her zaman doku yıkayın ve bir kez PBS ile tuzları kaldırmak için.</li>
	<li>Corti dokularının organını mikroskop slaytına monte edin ve üzerini montaj lı ortamla kapatın. NOT: Doku monte ederken, saç hücresi stereocilia içeren doku tarafında coverslip karşı karşıya olduğundan emin olun.</li>
	<li>Montaj ortamının eklenmesi sırasında oluşan olası kabarcıkları çıkarın ve kapak kaymasının yerleştirilmesi sırasında yeni kabarcıkların oluşmasını önleyin. NOT: Bir pipet ile aspire herhangi bir kabarcık montaj ortamının eklenmesi sırasında oluşturulan. Hava kabarcıklarının örtü altında sıkışıp kalmamasını önlemek için, coverslip'in kenarını numunenin yakınına yerleştirin ve coverslip'i forceps veya pipet ucu kullanarak dikkatlice ve yavaşça doku üzerinde indirin.</li>
	<li>Montaj ortamlarında dokuyu cam bir kapak fişi ile kapatın (Şekil 2H). NOT: 0,4'ün üzerinde sayısal diyafram açıklığına sahip hedefler, #1,5 kapaklı (0,17 mm kalınlık) kullanacak şekilde tasarlanmıştır. Yanlış kapak kaymasını kullanmak, görüntülerin yoğunluğu ve kalitesi açısından ciddi sonuçlar doğurabilir.</li>
	<li>Monte edilen dokuyu oda sıcaklığında bir gece boyunca kuluçkaya yatırın ve montaj ortamının kurumasını bekleyin ve slaytları görüntülemeye kadar 4 °C'de saklayın.</li>
</ol>5. Görüntü Edinme ve Görüntü İşleme
NOT: Konfokal görüntüler, süper çözünürlüklü (SR) mod 43 ve63x objektifte 32 kanallı Airyscan dedektörü ile donatılmış lsm 880 konfokal mikroskop ile çekildi.
<ol><li>Amaç daldırma yağı küçük bir damla ekleyin.</li>
	<li>Monte edilmiş doku örneğini içeren mikroskop slaytını, daldırma yağına bakan cam kapak lı mikroskop aşamasına yerleştirin.</li>
	<li>Örneğe odaklanın ve görüntü edinme yazılımını kullanarak görüntüleme parametrelerini ayarlayın.</li>
	<li>Her bağımsız deneme için x, y ve z çözünürlüğü için aynı görüntü alma ayarlarını ve en uygun parametreleri kullanın. Bir piezo odaklı odak sistemi hızlı ve hassas görüntü z-yığın elde ederken hedefi taşımak için gereklidir. NOT: Saç hücrelerinin tüm apikal bölgesini görüntülemek için, en uygun ayarları kullanarak stereocilia'dan saç hücresi vücudunun apikal yarısına kadar bir z-görüntü yığını toplayın. Vezikül benzeri parçacıkların görüntülenmesi için saç hücresi boyunca büyük bir z-yığını toplamak çok önemlidir.</li>
	<li>Airyscan 3D yeniden yapılandırma algoritmasını kullanarak ham confocal görüntüleri otomatik varsayılan dekonvolution filtresi ayarlarıyla işlemek için görüntü edinme yazılımını kullanın.</li>
	<li>Parlaklığı ve kontrastı ayarlamak, ölçek çubuğunu eklemek ve son rakamlar için görüntüleri dışa aktarmak için görüntü işleme yazılımındaki konfokal görüntüleri açın.</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu protokol, 3 kDa dextran Texas Red ile Corti ekstremitelerinin murine organında alım deneylerinin nasıl yapılacağını açıklar. Bu yöntemin amacı, daha önce test edilmiş diğerlerinden daha büyük moleküllerin aynı zamanda işitsel saç hücrelerini özel olarak etiketleyip MET kanalına nüfuz edip edemediğini test etmektir. Benzer deneysel protokoller daha önce FM1-43 (0,56 kDa)12,19,20 ve Texas Kırmızı etiketli aminoglikozitler (1.29...

İç kulağın saç hücreleri, sesi algılayan ve elektrik sinyallerindeki mekanik uyaranları getkileyen duyu hücreleridir ve bu hücreler sonuçta beynimiz tarafından yorumlanır. Bu hücreler, stereosilya olarak bilinen ve apikal bölge1,2'dençıkıntı yapan üç sıra aktin bazlı filamentten oluşan merdiven şeklinde bir demet vardır. Mekanik uyaranlar stereositif filamentleri en uzun sıraya doğru saptırır ve meçakontransdüksiyon (MET) kanallarının açılmasını tetikler3. MET kanallarının açılması hücrede polarize ve dolayısıyla saç hücresibazal bölgede sinaps veziküllerin serbest sinyalleri katyon akını yol açar.
MET kanalının işitme için gerekli olan biyofiziksel özellikleri kapsamlı bir şekilde karakterize edilmiştir. Diğer özellikleri arasında, bu kanallar katyonik seçici ve nispeten büyük iletkenlik var (150-300 düşük Ca2 +pS )4,5,6,7,8,9,10. Dikkat çekici, FM1-43 ve Texas Kırmızı etiketli aminoglikozitler gibi büyük floresan moleküller MET kanalının perkast blokerler, floresan mikroskopi11,12,13,14kullanılarak görselleştirilebilir saç hücre gövdesinde bunların birikimi ile sonuçlanan . Tam tersine, MET kanalının moleküler kimliği ve yapısı ve geçirim yolu zor kalmıştır. Deneysel kanıt artan transmembran benzeri kanal protein 1 (TMC1) olgun saç hücrelerinde MET kanalının bir bileşeni olduğunu gösterir15,16,17,18,19. Transmembran benzeri kanal 1 'deki (TMC1) mutasyonlar MET kanal özelliklerini19,20,21,22 olarak değiştirir ve sağırlık lara neden olur. Buna ek olarak, TMC1 MET kanal18,23 sitesine lokalize ve MET kanal24,25mekanik kuvvet iletimi sorumlu ucu bağlantı ile etkileşime . Ayrıca, son biyoinformatik analizi mechanosensitive kanalları TMEM63/OSCA proteinleri ve TMEM16 proteinleri, kalsiyum aktive klorür kanalları ve lipid scramblases bir aile ile ilgili evrimsel olarak TMC proteinleri tespit etmiştir26,27,28. Bu proteinler arasındaki ilişkiye dayanan TMC1 yapısal bir model protein-lipid arayüzü nde büyük bir kavite varlığını ortaya27. Bu kavite otozomal dominant işitme kaybına neden iki TMC1 mutasyonu barındıran (DFNA36)27,29,30,31,32, ve kavite kalıntıları için sistein mutantların seçici modifikasyonMET kanal özellikleri değiştirmek28, MET kanalının permeasyon yolu olarak işlev olabileceğini belirten. TMC proteinlerinde öngörülen bu kavitenin büyük boyutu, büyük moleküllerin MET kanalına nüfuz etme yeteneğini açıklayabilir. MET kanalının alışılmadık derecede büyük bir permeasyon yolu içerdiği öngörüsünü test etmek ve TMC1'de gözlenen boşluğun büyüklüğünün sınırlarını zorlamak için Corti ekspertizlerinin organında daha büyük bir moleküle sahip 3 kDa dextran floresan ile alım deneyleri yapmak için bir protokol geliştirdik.
Dextran alfa-1,6 glikozidik bağlantılarla bağlanmış birçok D-glukoz molekülünden oluşan karmaşık dallı bir polisakkarittir. Su, düşük hücre toksisitesi ve biyoinertite yüksek çözünürlük çeşitli hücresel süreçleri incelemek için çok yönlü bir araç yapmak. Buna ek olarak, dextran boyutları geniş bir yelpazede mevcuttur ve floresan çeşitli renk floroforlar ile etiketlenmiş. Floresan etiketli dekstrans yaygın hücre ve doku geçirgenlik araştırma33,34, birden fazla hücresel sistemlerde endositon çalışması için kullanılır35,36, ve nöral izleme için37,38. İşitsel alanda, dextran molekülleri de hücre-hücre kavşak bozulması ve Corti chinchilla organında yoğun gürültüye maruz kaldıktan sonra işitsel duyusal epitel bütünlüğünün kaybı nı değerlendirmek için kullanılmıştır39,40.
Bu çalışmada, bazı küçük özellikleri istismar (3 ve 10 kDa) floresan deksan dextrans minten iç kulak saç hücrelerinde alım deneyleri gerçekleştirmek ve iç kulak saç hücresi MET kanalının permeasyon yolunun boyutunu keşfetmek için. Buna ek olarak, stereositya ve işitsel saç hücrelerinin hücre gövdesinde floresan dekstran görselleştirmek ve lokalize etmek için airyscan dedektörü ile donatılmış bir lazer tarama konfokal mikroskop (LSM) 880 kullandık.

<table><tbody><tr><td># 1.5 cam lameller 18mm</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0714</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>ThermoFisher</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Phalloidin</td><td>ThermoFisher</td><td>A12381</td><td></td></tr><tr><td>alfa Plan-Apochromat 63X / 1.4 Yağ Corr M27 objektif</td><td>Carl Zeiss</td><td>420780-9970-000</td><td></td></tr><tr><td>Amilorid hidroklorür</td><td>EMD MILLIPORE</td><td></td><td></td>129876</tr><tr><td>Benchwaver 3 boyutlu Rocker</td><td>Karşılaştırmaları bilimsel</td><td>B3D5000</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J vahşi tip fare</td><td>türü 000664</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td></td></tr><tr><td>Hücre impermean BAPTA tetrapotasyum tuzu</td><td>ThermoFisher</td><td>B1204</td><td></td></tr><tr><td>Dekstran, Floresein, 10.000 MW, Anyonik, Lizin Sabitlenebilir</td><td>ThermoFisher</td><td>D1820</td><td></td></tr><tr><td>Dekstran, Teksas Kırmızısı, 10.000 MW, Lizin Sabitlenebilir</td><td>ThermoFisher</td><td>D1863</td><td></td></tr><tr><td>Dekstran, Teksas Kırmızısı, 3000 MW, Lizin Sabitlenebilir</td><td>ThermoFisher</td><td>D3328</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehit Sulu Çözelti EM Sınıfı Elektron</td><td>mikroskobu bilimi</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, kalsiyum, magnezyum, fenol kırmızısı yok</td><td>ThermoFisher</td><td>14025</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, kalsiyum yok, magnezyum yok, fenol kırmızısı yok</td><td>ThermoFisher</td><td>14170</td><td></td></tr><tr><td>Görüntü J veya FIJI</td><td>NIH</td><td><a href="http://fiji.sc/" target="_blank">http://fiji.sc/</a></td><td></td></tr><tr><td>Immersol 518F yağa daldırma ortamı</td><td>Carl Zeiss</td><td>444970-9000-000</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz'in L-15 Medium, GlutaMAX Takviyesi</td><td>ThermoFisher</td><td>31415029</td><td></td></tr><tr><td>neomisin trisülfat tuzu hidrat</td><td>Sigma</td><td>N6386</td><td></td></tr><tr><td>PBS (10X), pH 7.4</td><td>ThermoFisher</td><td>70011069</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin-CF405M</td><td>Biotium</td><td>00034</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Elmas antifade montaj ortamı</td><td>ThermoFisher</td><td>P36970</td><td></td></tr><tr><td>superfrost plus mikroskop slaytı</td><td>Fisherbrand</td><td>22-037-246</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Zen Black 2.3 SP1 yazılımı</td><td>Carl Zeiss</td><td><a href="https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html" target="_blank">https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html</a></td><td></td></tr></tbody></table>

canlı ve fonksiyonel murine koklear saç hücrelerinde dekstran etiketleme ve alımı

Dextran Labeling and Uptake in Live and Functional Murine Cochlear Hair Cells

Saç hücreli meçakondüksiyon (MET) kanalı işitmede önemli bir rol oynar. Ancak MET'nin moleküler kimliği ve yapısal bilgileri bilinmemektedir. Saç hücrelerinin elektrofizyolojik çalışmalar MET kanalı büyük bir iletkenlik olduğunu ve nispeten büyük floresan katyonik moleküllere geçirilebilir olduğunu ortaya koymuştur, bazı stratil boyalar ve Texas Kırmızı etiketli aminoglikozit antibiyotikler de dahil olmak üzere. Bu protokolde, fonksiyonel MET kanalları için analiz etmek için kullanılabilecek Corti eksbitkilerinin organının saç hücrelerindeki floresan dekstrans alımını görselleştirmek ve değerlendirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Biz bulduk 3 kDa Texas Kırmızı etiketli dextran özellikle etiketler fonksiyonel işitsel saç hücreleri 1-2 h kuluçka sonra. Özellikle, 3 kDa dextran etiketler iki kısa stereocilia satır ve fonksiyonel MET kanalları mevcut olduğunda bir diffüz desen hücre gövdesinde birikir. Saç hücrelerinin hücre vücudunda ve destekleyici hücrelerde vezür benzeri bir etiketleme deseni gözlendi. Verilerimiz, hücresel boya alımı için iki yolu görselleştirmek ve incelemek için 3 kDa Texas-Red dextran'ın kullanılabileceğini göstermektedir; fonksiyonel MET kanalları ve endositoz yoluyla bir saç hücresi özgü giriş yolu, bir desen de büyük dextran için kullanılabilir.

Biz 3 kDa dextran floresan Texas Red (dextran-TR)(Şekil 2A-B)ile etiketli yabani tip postnatal-day-6 (P6) farelerden Corti ekstrenlerin organ 2h kuluçka sonra saç hücrelerinin sağlam ve spesifik etiketleme gözlendi. Dekstran etiketleme, Corti organının bazal, orta ve apikal bölgelerinde hem iç hem de dış saç hücrelerinde (IHC ve OHC) gözlendi(Şekil 2B).
Floresan etiketli phalloidin filamentöz aktin (F...

Burada, fonksiyonel mekanotransdüksiyon kanalları ile işitsel saç hücrelerinde 3 kDa Texas Kırmızı etiketli dextran alımını görselleştirmek için bir yöntem salıyoruz. Buna ek olarak, 3-10 kDa dekstrans saç endositoz ve Corti organının destekleyici hücreleri çalışmak için kullanılabilir.

Canlı ve Fonksiyonel Murine Koklear Saç Hücrelerinde Dekstran Etiketleme ve Alımı

The hair cell mechanotransduction (MET) channel plays an important role in hearing. However, the molecular identity and structural information of MET ...

Bu protokolün genel amacı fonksiyonel mekanotransdüksiyon kanalları ile canlı saç hücrelerinde Texas Red ile etiketlenmiş düzenli dekstran floresan alımı incelemektir. Bu tekniğin en büyük avantajı üç kilodalton Texas Red dextran canlı saç hücrelerinde mechanotransdüksiyon kanal fonksiyonu değerlendirmek için kullanılabilir olmasıdır. Kokleayı hasat etmek için, doğum sonrası altı farenin kafatasını Leibovitz'in L-15 ortamını içeren 60 milimetrelik bir kültür yemeğine yerleştirin ve kafatasının arka ucuna ve dış işitsel kanallarboyunca ön uçtan yüzeysel bir kesim yapmak için cerrahi makas kullanın.Kafatası ortaya çıkarmak için burun doğru deri katlayın ve kafatasının ön ve göz hattı boyunca arka dan bir kesi yapmak. Kafatasını iki yarıya ayırın ve beyni çıkarmak için küçük bir spatula kullanın. Zamansal kemikler gözlemlenebilir zaman, doku çıkarmak için bu kemiklerin etrafında kesmek için küçük makas kullanın.Taze L-15 orta içeren 35 milimetrelik çanak temporal kemikleri batırın ve geniş bir alan gözlük ve harici alternatif akım halojen ışık kaynağı ile donatılmış bir stereo mikroskop altında çanak yerleştirin. Çevredeki koklear doku, yarım dairesel kanallar ve vestibüler organları

dextran-labeling-uptake-live-functional-murine-cochlear-hair

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu prosedür ya da spiral limbus ve spiral ganglion nöronlar Corti fare organ izolasyonu ve kültürü için bir yöntem açıklanır. Ayrıca elektroporasyon Corti eksplant organ dışsal bir muhabir gen ifadesi için bir yöntem göstermektedir.

İlköğretim Kültür ve Corti murin Organ Plazmid Elektroporasyon.

Bu video, bir fare kulak kepçesinin kıl foliküllerinde mekanik olarak uyarılmış afferent çıktı ve sinir terminali etiketlemesinin birleşik kaydını göstermektedir. Bir floresan membran boyasına maruz kalmadan önce ve sonra saç folikülü sinir terminallerinin mekanik stimülasyonu, üretilen aksiyon potansiyellerinin elektrofizyoloji kaydı ve saç foliküllerindeki sinir terminali etiketlemesinin görselleştirilmesi ile ilgili adımları ana hatlarıyla belirtir.

Fare kılı foliküllerinde mekanik olarak uyarılmış afferent çıktının ve sinir terminali etiketlemesinin birleşik kaydı

Embriyonik fare iç kulağından koklear eksplantların izolasyonunu ve kültürünü tanımlayan bir yöntem sunuyoruz.  Ayrıca, kare dalga elektroporasyon yoluyla koklear eksplantlara gen transferi için bir yöntem gösteriyoruz. Gen transfer tekniği ile birleştirilmiş in vitro eksplant kültürü, araştırmacıların gelişim sırasında gen ekspresyonunu değiştirmenin etkilerini incelemelerini sağlar.

Elektroporasyon tarafından Embriyonik Fare Koklear Eksplantlarından Kültür ve Gen Transferi

Hayvan modellerinin koklealarına ototoksik ajanlar eklemek için çeşitli yöntemler mevcuttur. Sunulan, ototoksik ajanların yuvarlak pencere nişine verilmesi için cerrahi bir protokoldür. Prosedür güvenilirdir, hedefe yönelik intra-koklear lezyonlar oluşturur ve mikromimaride mekanik hasarı önler. Koklear kendi kendine onarım/rejenerasyon muayenesi mümkündür.

Koklear Hücre Dejenerasyonu Inducing için hızlı ve Güvenilir Teknik: Ototoksik Ajan Teslimat için Fare Yuvarlak pencere Yaklaşımı

Biz üç bozulmamış koklear döner (apeks, orta ve üs) olarak Corti yetişkin organı izole etmek için bir yöntem mevcut. Biz de floresan levhası 'antikorlar ile immün için bir prosedür ortaya koymaktadır. Birlikte bu teknikler kokleadaki bulunan saç hücreleri, destek hücreler ve diğer hücre türleri çalışma sağlar.

Tüm Dağı Diseksiyon ve Yetişkin Fare Kohlea immünofloresan

Fare kulağı derisi kıl foliküllerini innerve eden palisade uçlarının mızrak şeklinde terminallerinin mekanik stimülasyonuna bağlı afferent deşarjı kaydetmek için basit ve yeni bir teknik sunulmuştur.

Fare Saç Folikül hançer Endings de Mekanik Uyarılmış Afferent Çıkışı ve Sinir Terminali Etiketleme Kombine Kaydı

Burada, stiril piridinyum boyalarla boyama ve lekelenme sırasında fare kulağı derisi kıl foliküllerini innerve eden palisade uçlarının canlı mızrak şeklinde duyusal terminallerini görüntülemek için yeni bir hazırlığı açıklıyoruz.

Saç Folikül hançer Endings Yaşam Sinir Terminal Etiketleme Optik İzleme<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Fare Kulak Cilt

Bu protokolün amacı, yenidoğan murin koklear eksplantlarının hazırlanması, kültürü, tedavisi ve immün boyanmasını göstermektir. Bu teknik, işitme araştırmalarında in vitro bir tarama aracı olarak kullanılabilir.

Yenidoğan Murin Koklear Explant Tekniği<em&gt; In vitro</em&gt; İşitme Araştırmalarında Tarama Aracı

Bu makalede, yetişkin fare kokleae immünohistokimya için 10 mm yuvarlak kapak fişleri koklear epitel parçaları yapıştırmak için bir hücre ve doku yapıştırıcı kullanımı ve kireçlenme gerektiren değiştirilmiş bir koklear yüzey hazırlama yöntemi sunar.

Yetişkin Farede Koklear Yüzey Hazırlama

Mevcut protokol, önceki protokolleri güncellemekte ve yüksek kaliteli koklear eksplantların kültürlenmesi için nispeten basit yaklaşımlar içermektedir. Bu, canlı ve sabit hücrelerde güvenilir veri toplama ve yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlar. Bu protokol, iç kulak hücrelerini incelemeye yönelik devam eden eğilimi desteklemektedir.

İn vitro Model Olarak Tüm Yenidoğan Koklear Eksplantları

Burada, farelerden birincil koklear saç hücrelerinin izole edilmesi ve kültürlenmesi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Başlangıçta, Corti'nin organı yenidoğan (3-5 günlük) murin koklealarından mikroskop altında diseke edildi. Daha sonra, hücreler enzimatik olarak tek hücreli bir süspansiyona sindirildi ve kültürde birkaç gün sonra immünofloresan kullanılarak tanımlandı.

Yenidoğan Farelerden Primer Koklear Saç Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü

Öğrenin, canlı murine koklear saç hücrelerinde Texas Red-etiketli dextran alımını görselleştirme yöntemini. Bu teknik, mekanotransdüksiyon kanallarının işlevini değerlendirmek için kullanılır.

Canlı ve Fonksiyonel Murine Koklear Saç Hücrelerinde Dekstran Etiketleme ve Alımı

Daha fazla video keşfet