Floresan Mikroskopi ile Kesme Akışı Altında Tek Moleküllü Konformasyonel Değişikliklerin Karakterizasyonu

Kesme akışı altında tek biyo-moleküllerdeki konformasyonel değişikliklerin ölçülmesi, protein ve DNA gibi makromoleküllerin işlevini ve biyofiziğinin anlaşılmasında yararlıdır. Floresan mikroskopisi, yüksek zamansal ve uzamsal çözünürlüğe sahip fizyolojik akış ortamlarında tek moleküllerin gerçek zamanlı yerinde görüntülenmesine olanak sağlar. Bu AFM gibi diğer teknikler tarafından eşsizdir.

DNA'mızın küresel konformasyonel değişikliklere sahip olduğu kesme kuvvetini karakterize ederek, bu biyofiziksel özellikleri taklit eden ilaçlar daha iyi tasarlanabilir. Bu protokol, değişen akış koşullarında davranış veya diğer polimerleri, özellikle de biyo polimerleri incelemek ve karmaşık sıvıların reolojisini araştırmak için yaygın olarak uygulanabilir. Adımların zamanlaması başarı için çok önemlidir.

Mikroakışkan cihaz yüzey işleme ve floresan mikroskobu adımlarını verimli bir şekilde yürütmek için birçok kez uygulamanızı öneririz. Biyomoleküllerdeki konformasyonel değişiklikleri yakalamak, filmde en iyi izlenen görsel ve dinamik bir olgudur. Bilim adamları bu videoda sunulan gerçek zamanlı protein ve DNA mikroskobu gördükten sonra bu yöntemi daha iyi anlayacaktır.

Mikroakışkan cihazı hazırlamak için, bir parça tartı teknesinde bir parça kür ajan silikon elastomer baz beş parça ekleyin. ve önceden tedavi edilmiş bir PDMS çözümü oluşturmak için içeriği bir dakika boyunca iyice karıştırın. Plastik bir Petri kabına ana silikon gofret yerleştirin ve beş milimetrelik bir tabaka oluşturmak için gofret üzerine PDMS çözüm dökün.

Çanak kapağı ve hava kabarcıkları kaldırmak için bir saat vakum altında bir kurutucu bırakın. Daha sonra, PDMS'yi esnek bir katıhaline getirmek için bir gecede 60 santigrat derecede kapalı Petri kabını kuluçkaya yatırın, bu da pdms gofret arabiriminde mikroakışkan kanalların PDMS'ye şekillendirilmesine neden olur. Ertesi gün, PDMS her mikroakışkan kanal etrafında 20 tarafından 10 milimetre dikdörtgenler kesmek ve cımbız ile dikdörtgen blokları kaldırmak için bir jilet kullanın.

Kanalın bir ucundaki 0,5 milimetre çapındaki deliği delmek için keskinleştirilmiş kenarlı 25 kalibrelik künt uçlu iğne kullanın ve deliğin PDMS bloğundan tamamen geçtiğinden emin olun. PDMS'yi delikten çıkarmak için ince bir iğne kullanın ve kanalın diğer ucundaki işlemi tekrarlayın. PDMS bloğunu kanal tarafı yukarı ve kapak lı bir plazma yapıştırma makinesinin odasına yerleştirin ve tedaviye başlayın.

Tedavi tamamlandığında, PDMS bloğunu hızlı bir şekilde bir kapak kaymasına yerleştirin, böylece kanal kaymayla temas halindedir. Bloğun kenarlarına basınç uygulayın, ardından kalıcı bağı güçlendirmek için coverslip PDMS tertibatını 115 santigrat derecede 15 dakika sıcak bir tabağa yerleştirin. Son olarak, 10 santimetre uzunluğunda ekleyin.

0.25 milimetrelik iç çaplı tüp PDMS bloğunun üst kısmındaki çıkış deliğine sıvının kanaldan kolayca akmasını sağlar. Von Willebrand faktörü veya VWF deneyleri için, steril 1X PBS'de çözünmüş mililitre Başına 10 mikrolitreye kadar 10 mikrolitreye kadar mikrolitre lik mikroakışkan cihazın girişine enjekte edilir. Enjeksiyondan sonra pipet ucunda birkaç mikrolitre BSA-Biotin tutun ve ucun girişte gömülü kalmasını bekleyin.

BSA-Biotin'in cihazda iki saat kuluçkaya yatmasını bekleyin ve bu da BSA'nın kapak yüzeyine özel olarak bağlanmamasıyla sonuçlanır. Daha sonra pipet ucunu çıkarın ve kanala 10 mikrolitreye kadar kazein engelleme çözeltisi enjekte edin. Kazein çözeltisinin 30 dakika kuluçkaya yatmasını bekleyin, böylece serbest bölgeleri bloke edebilir ve biyomoleküllerin yüzeye olan spesifik olmayan bağlanmasını azaltabilir.

Ucu çıkarın ve steril PBS streptavidin 10 mikrolitre kadar enjekte kanala, Hangi BSA-Biotin biotin gruplarına bağlanacak. Daha sonra, fazla streptavidini temizlemek için 10 mikrolitreye kadar deterjan çözeltisi enjekte edin. Ucu çıkarın ve kazein çözeltisi veya lambda DNA ya VWF enjekte.

VWF'yi üç dakika veya lambda DNA'sını 45 dakika kuluçkaya yatırın. Sonra aşırı streptavidin bağlayıcı siteleri engellemek için beş milimolar ücretsiz biotin enjekte. Bir mililitre kazein engelleme çözeltisini şırıngaya yükleyin ve şırınga pompasına sabitlayın.

Sonra şırınga iğne ve hava kabarcıkları kaldırmak için çözelti akışı için boru bir ucunu takın. Serbest biotin enjeksiyonundan yaklaşık üç dakika sonra tüpün diğer ucunu mikroakışkan cihazın girişine takın. TIRF veya konfokal floresan mikroskobunun en yüksek büyütme hedefini seçin.

Gerekirse, hedefe daldırma yağı bir damla ekleyin. Mikroakışkan cihazı mikroskop aşamasına yerleştirin, böylece kapak kayması hedefe doğru sifonu çeksin. Parlak alan mikroskobu başlatın ve enkaz ve kabarcıklar gibi özellikleri görünür böylece odak ayarlayın.

Daha sonra mikroakışkan kanalın kenarı görünene ve çerçeveyi ikiye bölene kadar X ve Y yönünde sahneyi ayarlayın. FITC kanalına geçin ve bireysel yeşil küresel moleküller ayırt edilene kadar gerektiği gibi Z seviyesi ve TIRF açısını ayarlayın. Floresan molekülleri çok hızlı bir şekilde fotobeyazlama yapmadan görselleştirmek için lazer yoğunluğunu ve maruz kalma süresini ayarlayın.

Daha sonra molekülleri daha iyi görselleştirmek için kontrastı ayarlayın. Tam beş dakika ücretsiz biotin enjeksiyonu başlatmak ve saatte 5000 ve 30, 000 mikrolitre arasında akış oranları kullanarak moleküler konformasyon değişiklikleri gözlemlemek için şırınga pompası akışını durdurmak sonra. VWF ile, ücretsiz biotin enjeksiyonundan tam beş dakika sonra saatte 30 saniyelik 10, 000 mikrolitre lik akış gibi en az az bir akış uygulamak önemlidir.

Bunu mikroakışkan cihazın çeşitli alanlarında tekrarlayın ve akışı başlatma ve durdurma nın birden fazla döngüsü nde genişletip dinlendirebilecek molekülleri bulun. Moleküllerin maksimum uzantıya ulaşmasının ve tam gevşemeye ulaşması ve kesme akışı altındaki moleküllerin sürekli davranışlarının videolarını kaydetmelerinin ne kadar sürdüğünü unutmayın. Bir molekülün onayını değiştirme esnekliği, artan akış nedeniyle daha yüksek kesme hızları uygulandığı için uzabilme yeteneği yle sık lıkla ortaya konmuştur.

Von Willebrand faktör molekülünün uzatma ve kesme hızı eğrisi proteinin biyomekanik özelliklerini karakterize etmek için yararlıdır. Lambda DNA floresan mikroskopi görüntüleri benzer şekilde 30 saniye yüksek kesme hızları ve akış durdurulduktan sonra iki dakika içinde kademeli gevşeme üzerine artan uzantısı göstermektedir. VWF ile çalışırken, akış başlamadan önce sadece üç dakika ve ücretsiz biotin için beş dakika kuluçka unutmayın.

Bu, geri dönüşümlü çözülme için gerekli en uygun sayı veya biotin-streptavidin bağlantıları oluşturmak için önemlidir. Bu yöntem, birden fazla biyomolekül arasındaki gerçek zamanlı etkileşimleri görselleştirmek ve işlevlerini karakterize etmek için uyarlanabilir. Örneğin, vwf'nin yüksek makas altında çözünmesini ve trombosit yapışma molekülü GPIb-alfa ile bağlanmasını görselleştirerek trombosit fişi oluşumunu daha iyi anlamak daha iyi olabilir.