LarvaSPA, Uzun Süreli Hızlandırılmış Görüntüleme için Drosophila Larva Montajı Için Bir Yöntem
27 Şubat 2020
Bu protokol, drosophila larvalarının sağlam canlı hayvanlarda 10 saatten daha uzun süre kesintisiz zaman atlamalı görüntüleme elde etmek için bir yöntem inşama yöntemini açıklamaktadır. Bu yöntem larva gövde duvarına yakın birçok biyolojik süreci görüntülemek için kullanılabilir.
LarvaSPA yüksek temporal ve mekansal çözünürlük ile 10 saatten fazla bozulmamış drosophila larvaların sürekli canlı görüntüleme sağlayan ilk yöntemdir. Bu yöntem larva periferik duyusal nöronların dinamik hücresel süreçlerini ortaya çıkarmak ve larva vücut duvarı yakınında meydana gelen diğer birçok hücresel süreçleri incelemek için kullanılır. Bu yöntemin kullanımı kolaydır ve larva boyutu üzerinde daha az sınırlama vardır.
Aynı anda görüntüleme odasına 6-9 larva monte edilebilir, bu da deneyi mümkün kılar. PDMS kübiklerinin görüntüleme odası en düşük maliyetle üretilebilir ve yeniden kullanılabilir. Bu yöntem özellikle drosophila larva dendritik yetkilendirme nöronlar kullanılarak dendrit gelişimi ve dendrit dejenerasyon mekanizmaları nın incelenmesinde yararlıdır.
Aynı nöronu saatlerce görüntüleyebilmek, dendritik desenlerdeki küresel değişikliklerin bireysel dal düzeyindeki kısa süreli davranışlardan ne kadar uzun süreli olarak ortaya çıkarıldığını ortaya çıkarabilir. Larva larınva boyutlarına uyan PDMS kübiklerinin kullanılması larvaları hareketsiz hale getirmenin başarı oranını artıracaktır. Lütfen sorun giderme bölümümüzde daha kullanışlı kasetler bulabilirsiniz.
Bir makine dükkanından alüminyum blok inşa ettikten sonra, UV tutkal ile uzun bir kapak kayma kullanarak metal çerçevenin alt mühür. 30 saniye boyunca bir el UV lambası kullanarak UV ipucu cure. Ambalaj bandı katmanlarını dikdörtgen petri kabının veya yuvarlak hücre kültür plakasının iç yüzeyine takın.
İkinci yıldız larvaları için bir katman, erken üçüncü yıldız larvaları için iki katman veya üçüncü yıldız larvaları için üç katman kullanın. Bir jilet ile belirli genişlikte gezileri içine bant, bir katman bant için 1,5 milimetre ve iki katman veya üç katmanlı bant için iki milimetre kesin. İki şerit arasında en az beş milimetrelik bir boşluk bırakın.
Alanı kaplayan bant katmanlarını çıkarın. Yapışkan bant kullanarak plakanın iç yüzeyindeki tozu çıkarın. Bundan sonra, kalıp kullanıma hazırdır.
PDMS karışımını hazırlamak için, yedi gram PDMS tabanını 0,7 gram kür maddesini küçük bir kapta iyice karıştırın. Karışımdan havayı çıkarmak için kabı en az 15 dakika vakumlu kurutucuya yerleştirin. Yavaş yavaş bir ila iki milimetre kalınlığı ulaşmak için kalıp üzerine yaklaşık 5,5 gram PDMS karışımı dökün.
PdMS karışımını, karışımdan kalan hava kabarcıklarını temizlemek için en az 15 dakika boyunca tekrar vakum kurutucuya yerleştirin. Bir pipet ucu ile son birkaç kabarcıklar break. PDMS'yi 65 santigrat derecede bir ısı kuvözde düz bir yüzeyde iki saat boyunca tedavi edin.
Daha sonra, küfün kenarı boyunca kürlenmiş PDMS gevşetmek ve kalıp tan ayırmak için bir jilet kullanın. PDMS'yi oda sıcaklığında iki parça büyük yapışkan bant arasında saklayın. Erken ve geç üçüncü yıldız larvaları için, küboidin uzun tarafının ortasında bant şeridi tarafından oluşturulan oluğu konumlandırarak PDMS'yi ikiye iki keserek bir milimetre küpü kesin.
İkinci yıldız larvaları için, kübik leri bir milimetreye kadar sekize indirin. Montaj için üst kapak fişini hazırlamak için, larvaların boyutlarına uyan oluklara sahip altı PDMS kübik seçin. PDMS'nin yüzeyindeki tozu yapışkan bantla çıkarın.
Daha sonra PDMS kübiklerini sabitlemek için 22'ye 50 milimetrelik uzun bir kapak fişine 12'ye beş milimetre boyutunda dört adet çift taraflı bant takın. İki çift taraflı bant parçası arasındaki boşlukları PDMS oluğunun genişliğiyle aynı şekilde ayarlayın. Her PDMS cuboid oluk içine UV tutkal küçük bir damla uygulayın ve kapak kayma çift taraflı bantlar arasındaki boşluğa UV tutkal altı küçük damla ekleyin.
Montaj için larva hazırlamak için, forseps bir çift kullanarak, vücut yüzeyinden gıda kaldırmak için su daki larvaları temizleyin. Temiz larvaları küçük bir kapaksız küçük bir Petri kabına nemlendirilmiş kağıt parçasına yerleştirin ve küçük Petri kabını kuru mendil kağıdı içeren büyük bir Petri kabına yerleştirin. Kimyasal bir başlık, kuru mendil kağıt üzerine izofluran 160 ila 240 mikrolitre uygulamak ve büyük Petri kabının kapağını kapatmak için plastik transfer pipet kullanın.
Larvaları izlerken 2-3 dakika bekleyin. Ağız kancaları hareket etmeyi bıraktıktan sonra, büyük Petri kabından larvaları çıkar. Immobilize larvaları, kapak fişine bakan dorsal miteile kapak kapağındaki çift taraflı bantlar arasında UV tutkalüzerine yerleştirin.
Her larvayı bir PDMS bloğuyla kapatın ve larvanın gövdesini PDMS'nin oluğuna sığdırın. Larvanın başını ve kuyruğunu PDMS oluğunun dışında bırakın. Larvanın spiracles'ini tutkalla engellemekten kaçının.
PDMS bloğunun uçlarına, oluk üzerinde kuvvet uygulamadan çift taraflı banda bastırın. PDMS altında miğde düzleştirmek için larva kuyruğunu yavaşça çekin. Güvenlik gözlüğü takın ve yüksek ayarda uv tutkalını dört dakika boyunca tedavi etmek için el yapımı UV lambası kullanın.
Kapağı ters çevirin ve UV tutkalını dört dakika daha tedavi etmek için UV lambasını kullanın. Görüntüleme odasının altına 15'e 30 milimetre boyutunda küçük bir mercek kağıdı yerleştirin. Kağıdı 20 ila 30 mikrolitre su ile nemlendirin.
Larvalar odanın içine bakacak şekilde kapak fişini odaya yerleştirin. Kapağın her iki ucunu metal yüzeye yapıştırmak için UV tutkalını kullanın. Larvaların dorsal tarafı konfokal mikroskop altında görüntülemeiçin hazırdır.
Görüntülemeden sonra, lens kağıdı kullanarak üst kapak taki yağı çıkarın. Üst kapağı metal çerçeveden ayırArak kapak fişi ile metal çerçeve arasındaki boşluğu bir jiletle ayırın. Görüntüleme odası yeniden kullanıma hazır.
PDMS kübiklerini üst kapaktan forceps ile ayırın. Tutkal kalıntısı ve toz kaldırmak için yapışkan bant üzerinde PDMS cuboids rulo. PDMS kübikleri yeniden kullanıma hazır.
Bu protokolde drosophila larvaları sürekli görüntüleme için 10 saatten uzun süre hareketsiz hale getirildi. Bu rakam, odaya monte edilmiş altı geç üçüncü yıldız larvasını göstermektedir. Larvaların gövdeleri sabitken başları ve kuyrukları hareket etmekte özgürdü.
Burada, larvaSPA'nın nöronal dendrite dinamiği ve dendrite dejenerasyonu çalışmalarında bir model olarak sınıf dört DA nöronlarını kullanarak uygulanmasını gösteriyoruz. Bu yöntemi kullanarak larvaları başarılı bir şekilde hareketsiz hale getirmek için, ağız kancaları hareket etmeyi bıraktıktan sonra larvaların isoflurana maruz bırakmayı bırakması ve larvalar tamamen uyanmadan önce UV tutkalını tedavi etmesi çok önemlidir. Dendrit dejenerasyonu ve rejenerasyonu incelemek için görüntüleme odasında larvalar hareketsiz kaldığında lazer hasarı yapılabilir.
LarvaSPA, dinamik büyüyen dendritlerin hepatik hücre proteoglikanlarında olduğu gibi epidermal hücreleri nasıl innerve edemediğini ve lazer yaralanması sonrası dejeneratif dendritlerde fosfatidilserinin nasıl maruz kaldığını anlamamıza yardımcı olmuştur. UV lambasını kullanırken gözleri güvenlik gözlükleri ile koruyun. Isofluran kullanarak larvaların nakavt edilmesi duman kaputunda yapılmalıdır.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, bütün haldeki Drosophila larvalarının 10 saatten fazla süreyle sürekli canlı görüntülemesi için geliştirilen yeni bir yöntem olan LarvaSPA'yı tanıtmaktadır. Bu teknik, özellikle periferik duyusal nöronlarda ve dendrit gelişimindeki dinamik biyolojik süreçlerin araştırılmasını kolaylaştırmak için tasarlanmıştır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Araştırma Alanı
- Hücre biyolojisi
- Gelişim biyolojisi
- Mikroskopi
Arka Plan
- Canlı larva sistemlerinde uzun süreli görüntülemeye olan ihtiyaç.
- Larva vücut duvarına yakın hücresel süreçlerin anlaşılması.
- Larvaların uzun süreler boyunca immobilize edilmesiyle ilgili zorluklar.
Kullanılan Yöntemler
- Özel PDMS küboidler kullanılarak sürekli canlı görüntüleme.
- Biyolojik model olarak Drosophila larvaları.
- Konfokal mikroskop altında yüksek çözünürlüklü görüntüleme teknikleri.
Temel Sonuçlar
- Uzun süreli görüntüleme oturumları için birden fazla larva başarıyla immobilize edildi.
- Dendrit gelişimini ve dejenerasyonunu görselleştirme yeteneği.
- Kısa süreli davranışlar nedeniyle dendritik modellerin zamanla nasıl değiştiği ortaya çıkarıldı.
Sonuçlar
- Bu yöntem, larval nöral gelişimi incelemek için görüntüleme tekniklerinde çığır açan bir gelişmeyi sergilemektedir.
- Model bir organizmadaki temel hücresel dinamiklerin anlaşılmasını geliştirir.
Sıkça Sorulan Sorular
Endüstriyel Uygulama Alanları
Bütün model organizmaların uzun süreli canlı görüntülemesi, hedef doğrulaması ve fenotipik tarama hakkında bilgi veren dinamik hücresel süreçleri ortaya çıkararak erken aşama keşiflerde mekanistik risk azaltma imkanı sağlar. LarvaSPA, uzun süreler boyunca dendritik dinamikler üzerine yüksek çözünürlüklü zamansal veriler sağlayarak nörogelişimsel ve nörodejenerasyon araştırmalarında öngörücü güveni destekler. Bu yetenek, sinir sistemi bozukluklarında preklinik model iyileştirme ve translasyonel biyobelirteç keşfi ile uyumludur.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Bozulmamış larval sinir sistemlerini kullanarak nöronal gelişim ve dejenerasyon yolaklarındaki terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Genetik veya farmakolojik perturbasyonlara karşı gerçek zamanlı dendritik yanıtları görselleştirerek fonksiyonel hedef doğrulamayı destekler.
- Öngörücü Değer: Duyusal nöronlardaki kısa vadeli dal değişimi davranışlarını uzun vadeli yapısal değişikliklerle ilişkilendirerek, öncü bileşiklerin belirlenmesindeki güvenilirliği artırır.
Tarama ve Deney Geliştirme
- Bilimsel Değer: Neurite büyümesini veya stabilitesini etkileyen bileşiklerin kantitatif taraması için standardize edilmiş, tekrarlanabilir larva preparasyonları hazırlar.
- Operasyonel Değer: Her bölme başına altı ila dokuz larvanın çoklu görüntülemesine olanak tanıyarak doz-yanıt veya genetik tarama için iş hacmini artırır.
- Deney Hazırlığı: Süreklilik arz eden fenotipik gözlemler için konfokal okumalarla uyumlu, stabil ve uzun süreli görüntüleme koşulları sağlar.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: Drosophila nöronlarındaki keşif gözlemlerini, nörogelişimsel ve nörodejeneratif hastalıkların memeli modelleriyle ilişkilendirir.
- Mekanistik Risk Azaltma: Kısa süreli dendritik dinamiklerin uzun süreli patolojilere nasıl katkıda bulunduğunu ortaya koyarak, erken evre hedef güvenlik değerlendirmelerini bilgilendirir.
- Biyobelirteç Uyumu: Fosfatidilserin ekspozisyonu ve epidermal innervasyon kaybının, nöronal stres veya hasarın potansiyel translasyonel biyobelirteçleri olarak incelenmesini kolaylaştırır.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, hedef hipotez testinden öncü bileşik optimizasyonuna kadar olan keşif sürecine, özellikle dinamik fenotipik okumalar gerektiren nörobilim odaklı süreçlere entegre edilmektedir.
- Keşif Biyolojisi: Dendritik arborizasyon ve dejenerasyonun kronik görüntülemesine olanak tanıyarak, somatosensoriyel nöron modellerinde yolak netleştirmeyi ve biyolojik risk azaltmayı destekler.
- Tarama: Farklı koşullar altında bileşiklerin nörit dinamikleri üzerindeki etkilerini karşılaştırmak için gerekli olan analiz standardizasyonunu ve kantitatif çıktıları sağlar.
- Analitikler: Ekiplerin sübaselüler davranışları zaman içinde fenotipik sonuçlarla ilişkilendirmesine olanak tanıyan yüksek çözünürlüklü temporal ve spatial veri setleri oluşturur.
- Translasyonel Araştırma: Dendrit korunum ve yaralanma yanıtının korunmuş mekanizmaları aracılığıyla, larval nöronal fenotipleri preklinik hastalık modelleriyle ilişkilendirir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Görüntüleme haznesini ve PDMS küboidlerini yeniden kullanılabilir platform bileşenleri olarak konumlandırarak, deney başına maliyeti düşürür ve boylamsal çalışma tasarımlarını destekler.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Dendritik büyüme ve dejenerasyon dinamiklerinin doğrudan gözlemlenmesi yoluyla hedef doğrulamasında öngörüsel güven.
- Operasyonel Değer: Yeniden kullanılabilir PDMS küboitler ve modüler görüntüleme odası tasarımı aracılığıyla standardizasyon, tekrarlanabilirlik ve ölçeklenebilirlik.
- Stratejik Değer: Nöronal yapısal plastisitedeki mekanik belirsizliği azaltarak nörodejenerasyon programlarındaki karar verme süreçlerinin iyileştirilmesi.
- Portföy Etkisi: Bozulmamış larva sistemlerinden elde edilen boylamsal fenotipik verilere dayalı olarak hedeflerin risk ayarlı önceliklendirmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- Drosophila bakımı, konfokal mikroskopi ve UV tabanlı mikrofabrikasyon tekniklerinde uzmanlık gerektirir.
- PDMS küboit üretimi için vakum desikatörlerine, ısı inkübatörlerine ve hassas kesim araçlarına erişime bağlıdır.
- Tekrarlanabilir sonuçlar için larval evreleme, immobilizasyon zamanlaması ve görüntüleme odası montajının ekipler arası standart hale getirilmesini gerektirir.
- Yöntemin, sınıf IV da nöronlarının dışındaki farklı larval evrelere veya nöronal alt tiplere uygulanması durumunda adaptasyon değerlendirmeleri içerir.
- Spirotların tıkanmasından kaçınma gerekliliği ve larvaların izoflorandan iyileşmesine göre UV kürleme zamanlamasının hassas ayarlanması gibi pratik sınırlamaları kapsar.
