Name: Clostridioides difficile için Larva Zebrabalığı Enfeksiyon Modeli nin Geliştirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-14T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Keşfedin Clostridioides difficile enfeksiyon modelini zebrabalığı larvalarında mikroenjeksiyon ve mikrogavaj teknikleriyle. Bu yöntem anaerob bakteriler ve doğuşan bağışıklık yanıtı çalışmaları için uygundur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz mükemmel hayvan bakımı için Timo Fritsch için müteşekkiriz. Köster ve Steinert laboratuvarları üyelerine destek ve yararlı tartışmalar için teşekkür ederiz. Dr. Dandan Han'a el yazını eleştirel okuduğu için teşekkür ederiz. Biz minnetle Aşağı Saksonya Federal Devlet, Niedersächsisches Vorab (VWZN2889) tarafından fon kabul ediyoruz.

Burada açıklanan tüm hayvan işleri yasal düzenlemelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir (AB Direktifi 2010/63, lisans AZ 325.1.53/56.1-TUBS ve lisans AZ 33.9-42502-04-14/1418).
1. Düşük Eritme Agarose, Jel Levha ve Mikroenjeksiyon/Mikrogavaj İğnelerinin Hazırlanması
<ol><li>0.08 g düşük eriyen agarose(Malzeme Tablosu, agarose A2576) 10 mL danieau'nun orta (0.12 mM MgSO4, 0.18 mM Ca [NO3]2), 0.21 mM KCl, 1,5 mM HEPES (pH = 7,2) ve 17,4 mM NaCl, oda sıcaklığında (RT) %0,8 çözelti elde etmek için depolanır. NOT: Agarose'un daha yüksek veya daha düşük konsantrasyonları kullanılabilir. Ancak, katılaşmak için gerekli zaman agarose farklı markalar için değişir, aynı konsantrasyonda bile.</li>
	<li>Cam kılcal damarlardan mikroenjeksiyon ve mikrogavaj iğneleri hazırlayın(Malzeme Tablosu).<ol>
<li>Aşağıdaki ayarlara sahip bir mikropipet çekmecesi kullanın (birimlerin burada kullanılan çekmeceye özel olduğunu unutmayın; bkz. Malzeme Tablosu):mikroenjeksiyon iğneleri (hava basıncı = 500; ısı = 400; pull = 125; hız = 75; zaman = 150); ve mikrogavaj iğneleri (hava basıncı = 500; ısı = 400; çekme = 100; hız = 75; zaman = 150). Çekilen iğneye 3 μL nükleaz içermeyen H2O yüklemek için mikroyükleyici ucu kullanın.</li>
		<li>İğneyi enjektöre tanıtın ve düzgün bir şekilde bağlayın. İğneyi enjeksiyon için uygun bir açıya ayarlayın. Mikroenjeksiyon iğnesi için 600-900 hPa, gavaj iğnesi için 200-300 hPa arasında enjeksiyon basıncını ayarlayın.</li>
		<li>Kalibrasyon kaydırağının siyah halkasının üzerine bir damla mineral yağ yerleştirin. İğnenin ucunu kesmek için ince terpler kullanın. Damlacık boyutunu ölçmek için mineral yağ içine bir damla enjekte.</li>
		<li>Mikroenjeksiyon için enjeksiyon süresini 0,10-0,12 mm çapında, 0,5-1,0 nL hacmine eşit olan bir damlacık elde etmek için ayarlayın. Mikrogavaj için, çapı 0,18-0,20 mm olan ve 3-5 nL hacmine eşit olan bir damlacık elde edin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mikrogavaj kalıp olarak plastik bir kalıp kullanarak% 30 Danieau's orta 10 cm Petri çanak agarose(Malzeme Tablosu, 8050) ile% 1.5 agarose plaka hazırlayın. İhtiyaç duyulana kadar kurumasını önlemek için 4 °C'de saklayın. Deneyden önce RT veya 28 °C'ye sıcak.</li>
</ol>2. Floresan Boya ile C. difficile ve Sporların Hazırlanması ve Etiketlemesi
<ol><li>Floresan boyanın 1 mM stok çözeltisi(Malzeme Tablosu)hazırlayın. Boya 50 μg toz halinde satıldığı için, 1 mM stok konsantrasyonu elde etmek için şişeye 69 μL DMSO ekleyin.</li>
	<li>Floresan boyanın 100 μM çalışma çözeltisini, 18 μL DMSO'ya santrifüj tüpüne 2 μL'lik 1 mM stok çözeltisi ekleyerek hazırlayın ve iyice karıştırın.</li>
	<li>Kültür C. difficile (R20291, bir riboztip 027 zorlanma) bir gecede sallayarak olmadan bir anaerobik başlık bir plaka iki ila üç kolonileri ile BHIS sıvı orta 10 mL aşılayarak. BHIS BHI ile desteklenmektedir 0.5% (w / v) maya ekstresi ve 0.1% (w / v) L-sistein. 1 g L-sistein 10 mL ddH2O ve filtrasyon ile sterilize 1 g çözün, sonra otoklavlama önce orta 15 g / L agar-agar ekleyerek hazırlanan 1 g / L. Plakalar son konsantrasyon elde etmek için otoklavlı ortama ekleyin. C. difficile seçici culturing kromID C. difficile plakaları kullanılarak yapılır (Malzeme Tablosu).</li>
	<li>Floresan boya ile Boyama C. difficile<ol>
<li>Hasat C. difficile 1.0-1.2 bir OD600 ve 1 x 1x 1x PBS (5.000 x g RT 3 dakika için) ile yıkayın. 1 x PBS 1 mL resuspend.</li>
		<li>Floresan boyanın 3 μL'lik çalışma solüsyonu1 mL bakteri süspansiyonuna ekleyin. Karanlıkta RT'de 15 dakika boyunca numuneyi kuluçkaya yatırın. Lekeli C. difficile'ı 1 mL PBS ile yıkayın ve 1x PBS'de 1.0'ın OD600'üne geri alın (1.0 OD600 yaklaşık 108 cfu/mL'ye eşdeğerdir).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Boyalı C. Enjeksiyon zebrabalığı Larvaları içine difficile
<ol><li>Döllenme sonrası 5 gün 20-30 zebra balığı larvasını (burada 5 dpf olarak anılacaktır) %0,02-0,04 triain (trikotin tozu çift distile suda çözülür ve pH = 7'ye 1 M Tris-HCL çözeltisi ile ayarlanır) %30 Danieau'nun orta ~10 dk önce Enjeksiyon. Anestezili larvaları taze 10 cm Petri kabına aktarın ve danieau'nun orta sını %30'dan çıkarın.</li>
	<li>Kapsayacak şekilde zebrabalığı larvaları üzerine% 0.8 düşük erime agarose bir damla yerleştirin. Larvaları yanal konuma hafifçe ayarlayın. Petri kabını 30-60 s'lik buz üzerine yerleştirin ve düşük eriyen agarose'un katılaşmasını bekleyin. Agarose kapsayacak şekilde% 0.02-0.04% tricaine içeren% 30 Danieau's orta ekleyin.</li>
	<li>Enjeksiyon çözeltisini hazırlayın. Enjeksiyon işlemini görselleştirmek için PBS çözeltisine %0,5 fenol kırmızısı ilave edin.</li>
	<li>Bir microloader kullanarak enjeksiyon çözeltisi ile kalibre edilmiş bir mikroenjeksiyon iğnesi yükleyin. Yüklü iğneyi bir mikromanipülatöre monte edin ve stereomikroskop altında yerleştirin.</li>
	<li>Enjeksiyon basıncını 600-900 hPa arasında ayarlayın. 0.5-1.0 nL elde etmek için enjeksiyon süresini 0.1-0.3'e ayarlayın. İğneyi mikromanipülatöre gömülü larvaları gösteren ~45° açıyla ayarlayın.</li>
	<li>İğne ucunu ürogenital gözeneğe yakın gastrointestinal sistem üzerine yerleştirin. Pierce agarose ile sonra iğne ucu ile kas, sonra bağırsak lümen içine takın ve C. difficile0.5-1.0 nL enjekte . Enjekte edilen larvaları izlemek ve konfokal görüntüleme için düzgün enjekte edilen larvaları almak için floresan mikroskobu kullanın.</li>
</ol>4. Gnotobiyotik Zebrabalığı Larvalarının Üretimi
<ol><li>Gnotobiyotik zebra balığı embriyoları oluşturmak için köklü doğal üreme yöntemini kullanın, dahil: in vitro fertilizasyon, antibiyotik içeren orta ile yıkama (1 μg/mL amphotericin B, 10 μg/mL kanamisin, ve 20 μg/mL ampisilin), %0.1 wt/vol polivinil piroliyodone-iyot (PVP-I) çözeltisi ile yıkama ve hücre kaputkültüründe embriyoların kuluçka12.</li>
	<li>5 dpf kadar veya gavaj hemen öncesine kadar gnotobiyotik koşullar altında tüm gnotobiyotik zebra balığı larvaları koruyun. Gavajdan sonra, zebra balığı larvaları standart bir kuluçka makinesine aktarılacak ama steril %30 Danieau'nun orta sı.</li>
</ol>5. Zebrabalığı Larvalarının Gavajı
<ol><li>Adım 1.2'de açıklandığı gibi mikrogavaj iğnesini kalibre edin.</li>
	<li>İğneyi bir damla mineral yağla kalibrasyon kaydırağının üzerine yerleştirerek iğnenin ucunun çapını ölçün. Ucun 30-40 μm çapında, künt ve pürüzsüz olduğundan emin olun. Keskin veya pürüzlü iğneleri atın. NOT: İğnelerin keskin kenarları hızlı alev alınarak köreltilebilir.</li>
	<li>3.3. adımda açıklandığı gibi gavaj çözeltisini hazırlayın.</li>
	<li>3.4 adımda açıklandığı gibi iğneyi bir mikromanipülatöre yükleyin ve monte edin. İğneyi 45° açıyla konumlandıracak şekilde mikromanipülörü ayarlayın.</li>
	<li>Adım 3.1'de bahsedilen zebra balığı larvalarını anestezi edin. Larvalar hareket etmeyi bıraktığında, pasteur pipeti kullanarak onları bir mikrogavaj kalıbının oluğuna aktarın.</li>
	<li>Kapsayacak şekilde zebrabalığı larvaları üzerine% 0.8 düşük erime agarose bir damla yerleştirin. Larvaları, olukta 45° açılarda dik bakacak şekilde larvaları ve kuyrukları oluğun duvarına doğru yavaşça ayarlayın. Kafaların açılarının yaklaşık olarak aynı olduğundan emin olun, böylece gavaj iğnelerinin açısıyla hizalanırlar. Mikrogavaj kalıbını 30-60 s'lik buzüzerine yerleştirin ve larvaların pozisyonlarını dengelemek için düşük eriyen agarose'un katılamasını bekleyin.</li>
	<li>Enjeksiyon basıncını 200-300 hPa arasında ayarlayın. Enjeksiyon süresini 0.1-0.3 s olarak ayarlın ve 3-5 nL C. difficile enjeksiyon hacmi elde edin.
</li>
	<li>İğneyi agarose'dan sonra da yemek borusundan zebra balığı larvalarının ağzına doğru yavaşça çalıştırın. İğneucu ön bağırsak ampul içinde bir kez, bakteri serbest bırakmak için enjeksiyon pedalına basın. Verilen hacim ile bağırsak lümendoldurun. Yemek borusundan veya cloaca'dan taşmasına izin vermeyin. İğneyi zebra balığının ağzından yavaşça çekin.</li>
	<li>Gavaj'ı takiben, enfekte zebra balığı larvalarını önce agarose'u keserek sonra larvaları kaldırarak esnek bir mikroloader ucu yla agarose'dan kurtarın. Bu larvaları steril %30 Danieau'nun orta sına aktarın. Larvaları steril ortamda iki kez durula. Larvaları 10 cm'lik taze petri kabına aktarın. Larvalar 11 dpf'ye kadar muhafaza edilecektir.</li>
</ol>6. Enjekte Edilen Zebrabalığı Larvalarının Konfokal Mikroskopi Analizi
<ol><li>Anestezi zebra balığı larvaları adım 3.1'e atıfta bulundu. Görüntüleme odası olarak adlandırılan deliğe bağlı bir cam slayt ile 35 mm Petri kabının altında bir delik yapın. Embriyoları görüntüleme odasının altına %30 Danieau'nun orta aracı ile aktarın.</li>
	<li>Anestezili larvaları kapsayacak şekilde %1 düşük erime agarose'un 200-300 μL'sini ekleyin. Ters konfokal mikroskop kullanıldığından, larvaların enfekte bölgesini mümkün olduğunca yakından cam kaydırağından yakınlaştırın.</li>
	<li>Agarose 30-60 s.% 30 Danieau's içeren% 0.02-0.04% tricaine ile agarose batırmak için buz üzerinde katılaşmak sağlar.</li>
	<li>Bir konfokal lazer tarama mikroskobu ile larvagörüntü (Malzeme Tablosu).</li>
</ol>7. Canlı C. difficile kurtarmak için Larva Zebrabalığı Bağırsak Diseksiyon
<ol><li>Bakteriyel yükü analiz etmek için larvalardan gastrointestinal yolları izole edin. Zebra balığı larvalarını %0,4 tricaine ile ötenazi yaparak başlayın.</li>
	<li>Zebra balığını steril 1x PBS ile kısa bir süre durulayın ve taze bir agarose plakaya aktarın.</li>
	<li>Zebra balığının diseksiyonu<ol>
<li>Zebra balığı hareketsizleştirmek için kafaya yakın zebrabalık larvalarının sırt gövdesine bir iğne yerleştirin. Bir mızrak ile solungaçları arkasındaki baş çıkarın.</li>
		<li>İkinci iğneyi sırt gövdesinin ortasına takın. Zebra balığının karnına üçüncü iğneyi yerleştirin ve bağırsakları vücut boşluğundan çekin. NOT: Bozulmamış bağırsağın izole edilmesi için aşırı özen gerekir. Bunu yapmak zor ise, kalan iç organlardan bağırsak geri kalanı ayırmak için ek çeker gerçekleştirin.</li>
		<li>10-15 bağırsağı 1x PBS'nin 200 μL steril içeren 1,5 mL'lik tüpüne aktarmak için mikroenjeksiyon iğnesi kullanın.</li>
		<li>Dokuyu bozmak ve homojenleri hazırlamak için bağırsakları bir zararlı ile homojenize edin. Tüm bağırsakları tamamen bozmak için haşere tüp altına ulaştığından emin olun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Anaerobik odada taurokolat (TCA, C. difficile sporların bir germinant) ile veya olmadan, D-sikloserin ve sefüsitin içeren C. difficile yetiştirme orta sındaki homojenatları kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Plakayı 37 °C'de 48 saat boyunca anaerobik olarak kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>16S rRNA-PCR için bakteri kültürünü kullanın.<ol>
<li>Bir koloniyi 50 μL H2O'da yeniden askıya alın ve 95 °C'de 15 dakika kaynatın. Pelet santrifüj tarafından lysed enkaz (14.000 rt RT için 2 dakika için) ve C. difficileözgü primerler kullanarak PCR-reaksiyon 25 l şablon olarak supernatant 2 μL kullanın (Cdiff16Sfw: 5'GTG AGG CAG TAC AGG 3'; Cdiff16Srev: 5' TTA AGG AGA TGT CAT TGG 3').</li>
		<li>Sıvı kültürden bakteriler kullanıldığında, 1 mL kültür hasat ve 1 mL PBS (RT 2 dakika için 14.000 rpm) ile bir kez yıkayın. Peleti 100 μL H2Odd'de yeniden askıya alın ve yukarıda olduğu gibi tedavi edin. Daha fazla bakteri kolonileri karakterize etmek için, bir BHIS üzerinde çizgi- veya kromid plakası(Malzeme Tablosu).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Rupnik, M., Wilcox, M. H., Gerding, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+difficile+infection%3A+new+developments+in+epidemiology+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Clostridium difficile infection: new developments in epidemiology and pathogenesis.</a> Nature Reviews Microbiology. 7, 526-536 (2009).</li>
<li>Yang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+protection+against+Clostridium+difficile+infection+by+the+monoclonal+antitoxin+antibodies+actoxumab+and+bezlotoxumab%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of protection against Clostridium difficile infection by the monoclonal antitoxin antibodies actoxumab and bezlotoxumab.</a> Infection and Immunity. 83, 822-831 (2015).</li>
<li>Kelly, C. P., Kyne, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+host+immune+response+to+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The host immune response to Clostridium difficile.</a> Journal of Medical Microbiology. 60, 1070-1079 (2011).</li>
<li>Britton, R. A., Young, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+the+intestinal+microbiota+and+host+in+Clostridium+difficile+colonization+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Interaction between the intestinal microbiota and host in Clostridium difficile colonization resistance.</a> Trends in Microbiology. 20, 313-319 (2012).</li>
<li>Goorhuis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+Clostridium+difficile+Infection+Due+to+a+New+Hypervirulent+Strain%2C+Polymerase+Chain+Reaction+Ribotype+078%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Emergence of Clostridium difficile Infection Due to a New Hypervirulent Strain, Polymerase Chain Reaction Ribotype 078.</a> Clinical Infectious Diseases. 47, 1162-1170 (2008).</li>
<li>Pépin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+fluoroquinolones+as+the+predominant+risk+factor+for+Clostridium+difficile-associated+diarrhea%3A+a+cohort+study+during+an+epidemic+in+Quebec%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Emergence of fluoroquinolones as the predominant risk factor for Clostridium difficile-associated diarrhea: a cohort study during an epidemic in Quebec.</a> Clinical Infectious Diseases. 41, 1254-1260 (2005).</li>
<li>Merrigan, M. M., Sambol, S. P., Johnson, S., Gerding, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+Fatal+Clostridium+difficile+-Associated+Disease+during+Continuous+Administration+of+Clindamycin+in+Hamsters%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Prevention of Fatal Clostridium difficile -Associated Disease during Continuous Administration of Clindamycin in Hamsters.</a> The Journal of Infectious Diseases. 188, 1922-1927 (2003).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mouse+Model+of+Clostridium+difficile-Associated+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">A Mouse Model of Clostridium difficile-Associated Disease.</a> Gastroenterology. 135, 1984-1992 (2008).</li>
<li>Page, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evolutionarily+conserved+program+of+B-cell+development+and+activation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish.</a> Blood. 122, 1-12 (2014).</li>
<li>Benard, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+Zebrafish+Embryos+with+Intracellular+Bacterial+Pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), e3781(2012).</li>
<li>Theriot, C. M., Young, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+Between+the+Gastrointestinal+Microbiome+and+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Interactions Between the Gastrointestinal Microbiome and Clostridium difficile.</a> Annual Review of Microbiology. 69, 445-461 (2015).</li>
<li>Pham, L. N., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+generating+and+colonizing+gnotobiotic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Methods for generating and colonizing gnotobiotic zebrafish.</a> Nature Protocols. 3, 1862-1875 (2008).</li>
<li>Ransom, E. M., Ellermeier, C. D., Weiss, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+mCherry+red+fluorescent+protein+for+studies+of+protein+localization+and+gene+expression+in+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Use of mCherry red fluorescent protein for studies of protein localization and gene expression in Clostridium difficile.</a> Applied and Environmental Microbiology. 81 (5), 1652-1660 (2015).</li>
<li>Cocchiaro, J. L., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microgavage+of+Zebrafish+Larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microgavage of Zebrafish Larvae.</a> Journal of Visualized Experiments. (72), e4434(2013).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mouse+Model+of+Clostridium+difficile-Associated+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">A Mouse Model of Clostridium difficile-Associated Disease.</a> Gastroenterology. 135 (6), 1984-1992 (2008).</li>
<li>Hutton, M. L., Mackin, K. E., Chakravorty, A., Lyras, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+animal+models+for+the+study+of+Clostridium+difficile+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">Small animal models for the study of Clostridium difficile disease pathogenesis.</a> FEMS Microbiology Letters. 352, 140-149 (2014).</li>
<li>Brugman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+model+to+study+intestinal+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+%26+Comparative+Immunology%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a model to study intestinal inflammation.</a> Developmental & Comparative Immunology. 64, 82-92 (2016).</li>
<li>Goulding, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinctive+profiles+of+infection+and+pathology+in+hamsters+infected+with+Clostridium+difficile+strains+630+and+B1%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Distinctive profiles of infection and pathology in hamsters infected with Clostridium difficile strains 630 and B1.</a> Infection and Immunity. 77, 5478-5485 (2009).</li>
<li>Toh, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonizing+the+Embryonic+Zebrafish+Gut+with+Anaerobic+Bacteria+Derived+from+the+Human+Gastrointestinal+Tract%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Colonizing the Embryonic Zebrafish Gut with Anaerobic Bacteria Derived from the Human Gastrointestinal Tract.</a> Zebrafish. 10, 194-198 (2013).</li>
<li>Bloemberg, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+static+immersion+and+intravenous+injection+systems+for+exposure+of+zebrafish+embryos+to+the+natural+pathogen+Edwardsiella+tarda%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunology%22%5BJournal%5D)">Comparison of static immersion and intravenous injection systems for exposure of zebrafish embryos to the natural pathogen Edwardsiella tarda.</a> BMC Immunology. 12, 58(2011).</li>
<li>Díaz-Pascual, F., Ortíz-Severín, J., Varas, M. A., Allende, M. L., Chávez, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+host-pathogen+interaction+as+revealed+by+global+proteomic+profiling+of+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">In vivo host-pathogen interaction as revealed by global proteomic profiling of zebrafish larvae.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 1-11 (2017).</li>
<li>Valenzuela, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+capacity+of+human+gut+microorganisms+to+colonize+the+zebrafish+larvae+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Evaluating the capacity of human gut microorganisms to colonize the zebrafish larvae (Danio rerio).</a> Frontiers in Microbiology. 9, (2018).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Sunulan yöntemler değiştirmek ve hem enjeksiyon ve mikrogavage 10 ,14gerçekleştirerek zebra balığı larvaları enfekte mevcut bir yaklaşım genişletmek. Ayrıca zebrabalığı larvaları22ile anaerobik patojenleri incelemek için bir yaklaşım göstermektedir. Buna ek olarak, protokol CDI üzerine in vivo doğuştan gelen bağışıklık hücresi yanıtlarının analizini kolaylaştırır ve zebra balıklarında C. difficile kolonizasyonu üzerine. Yöntem tek...

C. difficile bir gram-pozitif, spor oluşturan, anaerobik, ve gastrointestinal sistemde ciddi enfeksiyonların önde gelen nedeni dir toksin üreten bacillus1. CDI tipik belirtileri ishal dahil, karın ağrısı, ve ölümcül psödomembranöz kolit, ve bazen ölüme yol açabilir1,2. Kanıtlar, konak immün yanıtların bu hastalığın hem ilerlemesinde hem de sonuçlarında kritik bir rol oynadığını göstermiştir3. Bağışıklık yanıtına ek olarak, yerli bağırsak mikrobiyota başlangıcı ve CDI patogenezi için çok önemlidir4. Son on yılda, c. difficile (BI/NAP1/027)5,6hipervirulent suşu ortaya çıkması nedeniyle olgu ların sayısı ve CDI mortalite oranı önemli ölçüde artmıştır. Altta yatan bağışıklık mekanizmaları ve CDI sırasında mikrobiyota rolünün daha iyi anlaşılması yeni terapötik gelişmelere ve gelişmelere yol açacaktır, Bu salgının daha iyi kontrol sağlayan.
Hamster ve fare gibi çeşitli hayvan modelleri, C. difficilekarşıbağışıklık savunma içine fikir sağlamak için geliştirilmiştir7 ,8. Ancak, doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin rolü hala kötü anlaşılmaktadır, özellikle doğuştan gelen bağışıklık hücresi davranışı ağırlıklı olarak histolojik analiz veya in vitro kültürlü hücrelerden türetilmiştir beri. Bu nedenle, canlı bir omurgalı organizmanın içinde C. difficile doğuştan gelen bağışıklık yanıtı ortaya çıkarmak için şeffaf bir zebrabalığı modeli kurulması bu tür çalışmaları kolaylaştıracaktır. Zebra balığı larvaları fonksiyonel doğuştan gelen bağışıklık sistemine sahiptir, ancak döllenmeden 4-6 hafta sonraya kadar adaptif bağışıklık sistemiyoktur. Bu benzersiz özellik zebra balığı larvaları CDI izole yanıt ve doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin fonksiyonu çalışma için mükemmel bir model yapar.
Bu rapor, makrofajlar ve nötrofiller gibi C. difficile ve doğuştan gelen bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşimleri incelemek için zebra balığı larvaları kullanarak yeni yöntemler açıklamaktadır. İlk olarak, C. difficile inokül ve boyama içeren lokalize bir mikroenjeksiyon protokolü sunulmuştur. İn vivo konfokal zaman atlamalı görüntüleme kullanılarak nötrofillerin ve makrofajların enfeksiyon bölgesine tepkisi kaydedilir ve nötrofiller ve makrofajlar tarafından bakterilerin fagositozisi gözlenir. Ancak, enjeksiyon kendisi doku hasarına neden olduğu bildirilmiştir ve bakteri bağımsız lökosit işe yol açar10. Bu nedenle, zebrabalığı larvalarının bağırsağı içine C. difficile teslim etmek için noninvaziv bir mikrogavaj protokolü daha sonra açıklanmıştır. Önceki çalışmalar yerli gastrointestinal mikrobiyota C. difficile11kolonizasyonuna karşı bir konak korumak göstermiştir. Bu nedenle, gnotobiyotik zebra balığı larvaları da enfekte zebra balığı yatkınlık için kullanılır 12. Daha sonra, bağırsak diseksiyonu uygun C. difficile kurtarmak ve zebrabalığı bağırsak larında varlığının süresini doğrulamak için yapılır.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2576</td><td>Ultra düşük jelleşmeli agaroz</td></tr><tr><td>Agaroz düşük erime noktalı (LM)</td><td>Pronadisa</td><td>8050</td><td>Agaroz plakalarında kullanılır</td></tr><tr><td>BacLight Kırmızı Bakteri Lekesi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B35001</td><td>Floresan boya</td></tr><tr><td>Beyin-Kalp İnfüzyon Suyu</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>X916.1</td><td></td></tr><tr><td>Pirinç (vahşi tip)</td><td></td><td></td><td>melanin sentezinde eksik, kararlı transgenik hatlar oluşturmak için kullanılır</td></tr><tr><td>Kalsiyum nitrat (Ca(NO3)2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1396</td><td></td></tr><tr><td>Kılcal Cam</td><td>Harvard Aparatı</td><td>30-0019</td><td>Enjeksiyon iğneleri</td></tr><tr><td>Clostridioides difficile</td><td></td><td></td><td>R20291,, bir ribotip 027 suşu, TcdA+/TcdB+/CDT+ üretimi</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>A994</td><td></td></tr><tr><td>FIJI</td><td>açık kaynak platformu</td><td></td><td>Görüntü işleme</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>6763</td><td></td></tr><tr><td>Yatay iğne çektirme</td><td>Sutter enstrümanı Inc</td><td>P-87</td><td></td></tr><tr><td>L-sistein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>168149</td><td></td></tr><tr><td>Leica Application Suite X (LAS X)</td><td>Leica</td><td></td><td>Görüntü işleme</td></tr><tr><td>Magnezyum sülfat (MgSO4)</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>P026</td><td></td></tr><tr><td>Mikro enjektör</td><td>eppendorf</td><td>5253000017</td><td></td></tr><tr><td>Mikroenjeksiyon kalıpları</td><td>Uyarlanabilir Bilim Araçları</td><td>TU1</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP8 konfokal mikroskop</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phenol Red</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum klorür (KCl)</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>5346</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür (NaCl)</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>9265</td><td></td></tr><tr><td>Taurocholate</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>8149</td><td></td></tr><tr><td>Tg(lyZ: KalTA4)bz17/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3</td><td></td><td></td><td>lyZ promotörlerinin nötrofillerde EGFP floresan proteininin ekspresyonunu yönlendirdiği kararlı transgenik hat</td></tr><tr><td>Tg(mpeg1.1: KalTA4)bz16/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3</td><td></td><td></td><td>mpeg1.1'in makrofajlarda EGFP floresan proteininin ekspresyonunu yönlendirdiği kararlı transgenik hat</td></tr><tr><td>Trikain</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>Maya özü</td><td>BD Bacto</td><td>212750</td><td></td></tr></tbody></table>

clostridioides difficile için larva zebrabalığı enfeksiyon modeli nin geliştirilmesi

Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile

Clostridioides difficile enfeksiyonu (CDI) Amerika Birleşik Devletleri'nde en yaygın sağlık ilişkili gastrointestinal enfeksiyonlardan biri olarak kabul edilir. C. difficile karşı doğuştan gelen bağışıklık yanıtı tanımlanmıştır, ancak CDI nötrofiller ve makrofajlar tam rolleri daha az anlaşılmaktadır. Mevcut çalışmada, Danio rerio (zebrabalığı) larvaları in vivo bu doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin davranış ve işbirliği görüntüleme için bir C. difficile enfeksiyon modeli oluşturmak için kullanılır. C. difficileizlemek için, floresan boya kullanılarak bir etiketleme protokolü kurulmuştur. Lokalize enfeksiyon, zebra balığı nın bağırsak sisteminde aktif olarak yetişen ve CDI'deki intestinal epitel hasarı taklit eden C. difficile etiketli mikroenjeksiyon ile elde edilir. Ancak, bu doğrudan enfeksiyon protokolü invaziv ve deneysel sonuçları etkileyebilir mikroskobik yaralar, neden olur. Bu nedenle, daha noninvaziv bir mikrogavage protokolü burada açıklanmıştır. Yöntem açık ağız yoluyla entübasyon yoluyla doğrudan zebrabalığı larvaları bağırsak içine C. difficile hücrelerinin teslim içerir. Bu enfeksiyon yöntemi yakından C. difficiledoğal enfeksiyon rotasını taklit eder.

C. difficile kesinlikle anaerobik, ancak floresan proteinlerin kromofor genellikle olgun oksijen gerektirir. Bu sorunu aşmak için, bir floresan boya aktif olarak büyüyen canlı C. difficile hücreleri leke kullanılmıştır (R20291, bir ribotype 027 suş; Şekil 1A). Gal4/UAS sistemi kullanılarak, canlı görüntüleme için kararlı transgenik zebra balığı hatları oluşturuldu ve mpeg1.1 veya lyZ organizatörleri EGFP floresan proteininin makrofajlarda ...

Burada mikroenjeksiyon ve noninvaziv mikrogavaj ile floresan olarak etiketlenmiş anaerobik C. difficile ile zebra balığı larvaları enfekte etmek için güvenli ve etkili bir yöntemdir.

Clostridioides difficile için Larva Zebrabalığı Enfeksiyon Modeli nin Geliştirilmesi

Clostridioides difficile infection (CDI) is considered to be one of the most common healthcare-associated gastrointestinal infections in the United ...

Bu yöntem, makrofajların bu patojeni tanıyıp tanıyabileceği veya fagositoze neden olduğu gibi Clostridium enfeksiyonunda doğuştan gelen bağışıklık sisteminin rolü hakkındaki temel soruyu yanıtlayabilir. Bu yöntemin ana avantajı birçok farklı anaerobik bakterilere uygulanabilir olmasıdır, enfeksiyon süresi manipüle edilebilir, ve oral uygulama çok daha yakın normal insan enfeksiyonu temsil eder. Kültürden sonra, kültürün bir mililitresini spektrofotometre cuvette'ine aktarın ve OD600'ü ölçün.Son hacmin bir mililitresinde 1 ila 1,2'lik son bir OD'ye ulaşmak için gerekli miktarı 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Bir mililitre 1X PBS ile bir kez yıkayın ve oda sıcaklığında üç dakika boyunca 5,000 kez g santrifüj. 1X PBS bir mililitre resuspend.Bir mililitrelik bakteriyel süspansiyon içine hazırlanan floresan boya çalışma çözeltisi üç mikrolitre ekleyin. Karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika boyunca numune kuluçkaya yatırın. Bundan sonra, lekeli Clostridioides difficile bir kez 1X PBS artık boya kaldırmak için yıkama ve 1X PBS bir mililitre resuspend bir OD600 elde etmek için 1.0.İlk olarak, kapsayacak bir Petri kabında zebrabalığı larvaları üzerine% 0.8 düşük erime agarose bir damla yerleştirin. Larvaları yanal konuma hafifçe ayarlayın. Petri kabını 30-60 saniye boyunca buzun üzerine yerleştirin ve düşük eriyen agarose'un katılamasını bekleyin.Agarose kapsayacak şekilde% 0.02 ila 0.04% tricaine içeren% 30 Danieau's orta ekleyin. Enjeksiyon çözeltisi hazırlamak için, boya lekeli Clostridioides difficile inoculum dokuz mikrolitre içine PBS çözeltisi% 0.5 fenol kırmızı bir mikrolitre ekleyin. Microloader kullanarak enjeksiyon çözeltisi ile kalibre edilmiş bir mikroenjeksiyon iğnesi yükleyin.Yüklü iğneyi bir mikromanipülatöre yerleştirin ve stereo mikroskop altında yerleştirin. Enjeksiyon basıncını 600 ile 900 hektopascal arasında ayarlayın. 0,5 ila 1,0 nanolitre elde etmek için enjeksiyon süresini 0,1 ila 0,3 saniye olarak ayarlayın.İğneyi mikromanipülatöre yaklaşık 45 derecelik bir açıyla yerleştirin ve gömülü larvaları işaret edin. İğne ucunu gastrointestinal sistem üzerine, ürogenital gözeneğe yakın bir yere yerleştirin. Agarose'u del, sonra iğne ucuolan kasları.Sonra bağırsak lümen içine yerleştirin ve Clostridioides difficile 0.5 ila 1.0 nanolitre enjekte. Enjekte edilen larvaları izlemek için floresan mikroskobu kullanın ve konfokal görüntüleme için düzgün enjekte edilen larvaları almak için esnek bir Microloader ucu kullanın. Olukları ile% 1.5 agarose plaka, kapsayacak şekilde zebrabalığı larvaları üzerine% 0.8 düşük eriyen agarose bir damla yerleştirin.Larvaları, olukta 45 derecelik açılarda dik bakacak şekilde larvaları ve kuyrukları oluğun duvarına doğru yavaşça ayarlayın. İğneyi agarose'dan, sonra da yemek borusundan zebra balığı larvalarının ağzına doğru yavaşça çalıştırın. İğneucu ön bağırsak ampul içinde bir kez, bakteri kültürünün 0,5 bir nanolitre serbest bırakmak için enjeksiyon pedalına basın.Bağırsağın lümenini doldurun. Yemek borusundan veya cloaca'dan taşmasına izin vermeyin. İğneyi zebra balığının ağzından yavaşça çekin.Gavaj'ı takiben, enfekte zebra balığı larvalarını önce agarose'u keserek, sonra larvaları kaldırarak esnek bir Microloader ucuyla agarose'dan kurtarın. Bu larvaları steril %30 Danieau'nun orta makinesine aktarın ve iki kez durula. Zebra balığı larvalarını anestezi ettikten sonra, anestezili larvaları kapsayacak şekilde %1'lik düşük eriyen agarose'un 200 ila 300 mikrolitresini ekleyin.Larvaların enfekte bölgesini mümkün olduğunca yakından cam bir kaydırağa karşı yerleştirin. Agarose 30-60 saniye buz üzerinde katılaşmak sağlar. Agarose%30 Danieau'nun %0,02 ila %0,04 trikotin içeren ortamına batırın.Larvaları bir konfokal lazer tarama mikroskobu ile görüntüye devam edin. Enfekte zebra balığı larvaları ötenazi sonra, zebrabalığı larvaları baş yakın dorsal gövde içine bir iğne yerleştirin zebrabalığı hareketsiz hale getirmek için. Bir mızrak ile solungaçları arkasındaki baş çıkarın.Sırt gövdesinin ortasına ikinci bir iğne yerleştirin. Zebra balığının karnına üçüncü bir iğne yerleştirin ve bağırsakları vücut boşluğundan çekin. 10 ila 15 bağırsakları 200 mikrolitre steril 1X PBS içeren 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarmak için mikroenjeksiyon iğnesi kullanın.Dokuyu bozmak ve homojenleri hazırlamak için bağırsakları bir zararlı ile homojenize edin. Tüm bağırsakları tamamen bozmak için haşere tüp altına ulaştığından emin olun. Homojenatlar içine, Clostridioides difficile yetiştirme orta D-sikloserin ve sefüsitin içeren ekleyin, veya taurokolate olmadan, ve bir anaerobik odada kuluçka.Bu çalışmada hem nötrofiller hem de makrofajlar enfeksiyon bölgelerine ulaşabilmektedir. İki bakteriyi aktive eden makrofaj fagositizasyonu örneği, fagositoz ile temizlenmesini ve etiketli Clostridioides difficile'nin sindirimini göstermektedir. Flüoresans etiketli Clostridioides'in makrofaj ve nötrofil muhabir hatlarının bağırsak lümenine beş gün sonra döllenme sonrası yaygınlaşması, Clostridioids difficile enfeksiyonunun doğal yolunu taklit etmesi dir.Ancak nötrofiller ve makrofajlar mikrogavajdan sonra 12 saate kadar gastrointestinal sistemde belirgin bir göç göstermediler. Bu arada, etiketli Clostridioides difficile floresan yaklaşık beş saat sonra mikrogavage sonra kayboldu. İnfeksiyon sonrası 24 saat bağırsak örnekleri incelenmiş ve bakteriyel büyüme göstermiştir.Kontrol grubunda bakteri büyümedi. Daha sonraki zaman noktalarında, kuluçkaya yatan örnekler sadece TCA içeren ortamda büyüdü, bu da bağırsaktaki total Clostridioides difficile'nin sporlar oluşturduğunu düşündürdü. 16S rDNA PCR clostridioides difficile olarak yetiştirilen bakteri tespit, hangi öngörülebilir boyutta özel PCR amplicons üretmek etrafında 800 baz çiftleri.CHROMID plakası üzerine yetiştirilen bakteri kültürleri tipik siyah koloniler olarak ortaya çıktı, bu da zebra balığı bağırsaklarından gelen bakterilerin Clostridioides difficile olduğunu gösterdi. Anaerobik bakterilerle çalışmak aerobik adımların kısa tutulmasını gerektirir çünkü bu bakterilerin biyolojisini etkiler. Zebra balığıdoğuştan bağışıklık hücresi manipüle edilebilir.Örneğin, enfeksiyona doğuştan gelen bağışıklık hücresi yanıtlarının mekanizmasını deşifre edebilirler. Yöntemimiz, zebra balığının insan bağırsanın anaerobik patojenini incelemek için bir araç olabileceğini gösterdi. Çok dirençli patojenlerle çalışmak için uygun güvenlik önlemlerinin alınması gerekmektedir.

development-larval-zebrafish-infection-model-for-clostridioides

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Şeffaf zebrabalıkları embriyolar gibi görselleştirmek için faydalı model bilgisayarlar ve doğuştan gelen bağışıklık hücreleri ve hücre içi bakteriyel patojenler arasında işlevsel çalışma etkileşimleri,...

Hücre içi bakteriyel patojenler ile Zebra balığı Embryolarının Enfeksiyon

Zebra balığı hızla gelişmesi, küçük boyutu ve şeffaflık enfeksiyon doğal immün kontrolü çalışması için çok büyük avantajları...

Zebra balığı Larva yılında Dissemine Kandidiyazis non-invaziv Görüntüleme

Kaynak: Li, J. ve diğerleri. Clostridioides difficile için Larva Zebra Balığı Enfeksiyon Modelinin Geliştirilmesi. J. Vis. Uzm. (2020)Bu video, floresan etiketli Clostridioides difficile'nin anestezi uygulanmış bir zebra balığı larvasının bağırsak lümenine mikroenjeksiyon bazlı dağıtımını göstermektedir. Larva hazırlama, bakteri enjeksiyonu ve bağırsaktaki bakteri lokalizasyonunun floresan mikroskobu tabanlı doğrulanması ile ilgili adımları özetlemektedir.

Mikroenjeksiyon Kullanılarak Zebra Balığı Larvasının Bağırsak Lümenine Bakterilerin Lokalize Verilmesi

Kaynak: Li, J., vd. al., Clostridioides difficile için Larva Zebra Balığı Enfeksiyon Modelinin Geliştirilmesi. J. Vis. Uzm. (2020)Bu video, Clostridioides difficile bakterilerinin larva zebra balığının bağırsağından izolasyonunu ve kültürlenmesini göstermektedir. Enfekte bağırsak diseke edilir, homojenize edilir ve antibiyotik içeren seçici anaerobik ortamda inkübe edilir. Bu koşullar rakip mikropları baskılar ve canlı hücrelerin büyümesini destekler.

Larva Zebra Balığı Bağırsağından Clostridioides difficile Bakterilerinin İzolasyonu ve Kültürü

Kaynak: Flores, E. ve diğerleri. Zebrafish larvalarında gıda kaynaklı enfeksiyonlar için protozoan paramecium caudatum aracı olarak kullanılması. J. Vis. Exp. (2019).Bu video, zebrafish larvalarında floresan E. coli enfekte paramecia ile beslenerek gıda kaynaklı bakteriyel bağırsak enfeksiyonu modeli oluşturma yöntemini göstermektedir.

Zebrafish larvalarında Bağırsak Enfeksiyonunun Gıda Kaynaklı Bakterilerle Modellenmesi

Kaynak: Winston, J. A. ve diğerleri. Klâlis olarak Önemli Clostridium difficile Strain R20291 için sefoperazonla tedavi edilmiş fare modeli.  J. Vis. Exp. (2016)Bu video, antibiyotikle önceden tedavi edilmiş farelerin Clostridium difficile sporlarıyla aşılanması prosedürünü göstererek patogenezi ve konak yanıtlarını incelemek için enfeksiyon modeli oluşturulmuştur.

Clostridium difficile enfeksiyonunun fare modeli oluşturulması

Kaynak: Li, J. ve diğerleri.  Clostridioides difficile için larva zebrafish enfeksiyonu modelinin geliştirilmesi. J. Vis. Exp. (2020).Bu video, anestezi edilmiş zebrafish larvasının agarozda immobilize edilip izleyici yönlendirmeli iğne kullanılarak patojenik bir bakteriyle oral enjekte edildiği mikrogavaj prosedürünü gösteriyor. İnvaziv olmayan teslimat, doğal enfeksiyonu taklit eder ve bakteriyel çoğalması, toksin salınımı ve bağırsak epitel hasarının analizini mümkün kılar.

Mikrogavaj kullanarak Zebrafish larva enfeksiyonu modelinin geliştirilmesi

İn vivo patojen ve immün savunmanın mukozal düzeydeki uzaysal-zamansal etkileşimleri, mevcut omurgalı konakçılarında kolayca görüntülenemez. Burada sunulan yöntem, genç zebra balığının yüzme kesesini bir enfeksiyon bölgesi olarak kullanarak canlı omurgalılarda mukozal kandidiyazisi incelemek için çok yönlü bir platformu tanımlamaktadır.

Swimbladder Enjeksiyon ile Larva Zebra balığı Mukozal Candidiazis Modelleme

Optik olarak şeffaf zebra balığı embriyoları, patojenik mikroorganizmalar ve doğuştan gelen bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşimleri gerçek zamanlı olarak incelemek ve görselleştirmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Mycobacterium abscessus'un mikro enjeksiyonu, floresan görüntüleme ile birlikte, zebra balığı embriyolarında kordon oluşumu gibi temel patojenik özellikleri incelemek için kullanılır.

Görüntüleme Patogenez ve Cording Deşifre ve<em&gt; Mycobacterium abscessus</em&gt; Zebra balığı Embriyolar

Bu protokol klinik olarak ilgili ve genetik uysal gerginlik, R20291 kullanarak Clostridium difficile enfeksiyonu (CDI) sefoperazon fare modeli özetliyor. Klinik hastalık izleme, C. difficile bakteriyel numaralandırma, toksin sitotoksisite ve bir fare modelinde CDI genelinde histopatolojik değişikliklere vurgu protokolde ayrıntılı olarak verilmiştir.

ve Cefoperazone-tedavi edilmiş fare modeli klinik olarak ilgili<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; Gerilme R20291

Bu da çalışmanın bir zebra balığı embriyo modeli içinde vivo görselleştirme ve enfeksiyonu floresans mikroskobu göre zaman içinde biomaterial ilgili intravital analizi için açıklar. Bu model içinde vivo biomaterial ilişkili enfeksiyonların çalışmak için fare modelleri gibi memeli hayvan modelleri tamamlayan gelecek vaat eden bir sistemdir.

Bir zebra balığı embriyo Model In Vivo görselleştirme ve Staphylococcus aureus Intravital analiz Biomaterial ilişkili enfeksiyon

Keşfedin Clostridioides difficile enfeksiyon modelini zebrabalığı larvalarında mikroenjeksiyon ve mikrogavaj teknikleriyle. Bu yöntem anaerob bakteriler ve doğuşan bağışıklık yanıtı çalışmaları için uygundur.

Clostridioides difficile için Larva Zebrabalığı Enfeksiyon Modeli nin Geliştirilmesi

Daha fazla video keşfet