Tüm montaj immünohistokimya ve 3D Rekonstrüksiyon u kullanarak Faringeal Arch Arterlerin Görselleştirilmesi ve Analizi
31 Mart 2020
Burada, faringeal kemer arterlerin 3, 4 ve 6'sını tam montaj lı immünororesans, doku temizleme, konfokal mikroskopi ve 3Boyutlu rekonstrüksiyon kullanarak görselleştirmek ve analiz etmek için bir protokol uyguluyoruz.
Bu yöntem, her faringeal kemer bölümlere ayrılmasını sağlar. Endotel hücre numaraları daha sonra faringeal kemer arter gelişimi çalışma aracı olarak her kemer ölçülebilir. Bu yaklaşımın başlıca avantajları farklı vasküler yapılar arasındaki ilişkiyi görselleştirme yeteneği ve yapıların mutantları nasıl etkilediğini nicel olarak belirleyebilme yeteneğidir.
Aort kemer arterler genellikle konjenital kalp hastalığında mutasyona uğrar. Yöntemimiz mutasyonların damar oluşumu ve remodeling fizyolojik süreci nasıl değiştirdiğini çalışma sağlar. Konjenital kalp hastalığının mekanizmaları hakkında bilgi edinmek için bu yöntemi kullanmamıza rağmen, özellikle hafif sac mikroskobun ortaya çıkmasıyla diğer sistemlere uygulanabilir.
Her fare embriyonik gün 9.5 veya 10.5 embriyo bireysel iki mililitre tüpler pbs içeren aktarmak için bir cam pipet kullanarak başlayın. Fiksasyondan sonra, embriyoyu arka ekstremitenin hemen üzerinde dikkatlice çimdiklemek ve embriyonun arka yarısını çıkarmak için enine bir kesim yapmak için ince profalar kullanın. Embriyoları permeabilize etmek için, PBST ile PBS değiştirin ve bir gecede nazik ajitasyon ile dört derece santigrat embriyoyerleştirin.
Ertesi gün, pbst'yi embriyolara dokunmadan 600 mikrolitre bloke edici tampon ile değiştirin. Ertesi sabah, bloke tamponunu, dört santigrat derecede dört ila beş günlük bir kuluçka için tüp başına ilginin birincil antikorunun 600 mikrolitresi ile değiştirin. Kuluçka sonunda, oda sıcaklığında pbs her saat değişen nazik ajitasyon ile dört ila beş saat pBST bir mililitre için embriyoları yıkayın, dört derece santigrat taze PBST bir gecede kuluçka takip ve dört ila beş ek bir saat ertesi gün yıkar.
Son yıkamadan sonra, her tüpteki PBST'yi dört ila beş günlük bir kuluçka için uygun ikincil antikor çözeltisinin 600 mikrolitresi ile değiştirin. Kuluçka sonunda, sadece gösterildiği gibi yıkama başına taze PBST bir mililitre embriyoyıkamak ve yavaşça bireysel plastik parafin kalıpları içine her embriyo aktarmak için bir cam pipet kullanın. Dikkatle her embriyo etrafında herhangi bir PBST kaldırmak ve bir sagittal pozisyonda her embriyo yönlendirmek.
Sonra hızlı bir şekilde her embriyo sadece kaplı ve agarose katılaşmış kadar buz alüminyum folyo ile kaplı kalıpları yerleştirin kadar her kalıp sıcak agarose yaklaşık 500 mikrolitre ekleyin. Embriyonik örneklerin dehidratasyonu için, her embriyo etrafında agarose bir blok kesmek için temiz bir neşter kullanın ve% 25 metanol bir mililitre içeren etiketli iki mililitre tüp içine transferi için agarose kavramak için forseps kullanın. Karanlıkta nazik ajitasyon ile bir saatlik kuluçka sonra, karanlıkta ek bir saatlik kuluçka için tüp başına% 50 metanol bir mililitre ile% 25 metanol değiştirin.
Dehidratasyon sona erdikten sonra, karanlıkta nazik ajitasyon ile bir saatlik kuluçka için% 50 BABB bir mililitre ile% 100 metanol değiştirin. Kuluçka sonunda, karanlıkta nazik ajitasyon ile bir saatlik kuluçka için tüp başına% 100 BABB bir mililitre ile% 50 BABB değiştirin, sadece gösterildiği gibi% 100 BABB ile ikinci bir kuluçka izledi. Görüntüleme için embriyoları monte etmek için, hızlı bir kuyu tampon yapıştırıcı çıkarın ve bir 24 altı mililitre sayısı 1.5 cam coverslip üzerine tampon yerleştirin.
Kapak ve tampon arasındaki hava kabarcıklarını gidermek için yapıştırıcıya hafif basınç uygulayın ve her tüpten %100 BABB'yi dikkatlice atın. Daha sonra embriyoya dokunmadan embriyoyu hızlı kuyuya dikkatlice aktarmak için ince terlikler kullanın ve tampona ikinci bir kapak kaydırın. Tüm üçüncü faringeal kemer endotel yüzey için, yazılım ilgi görüntü açın ve yeni bir yüzey eklemek tıklayın.
Bir yüzeye çift tıklayın ve yeni yüzeyi üçüncü faringeal kemerle yeniden adlandırın. Otomatik oluşturmayı atla'yı seçin, el ile edin ve yüzey yönünü YZ düzlemine ayarlayın. Üçüncü faringeal kemer yüzey düzlemini üçüncü PAA ve dorsal aortun bağlandığı yere yerleştirmek için dilim konumunu kullanın.
Görüntüyü, üçüncü faringeal kemer yüzey düzleminin görünümünde olacak şekilde döndürün ve ortodilimleyiciyi kapatın. Çizim kontur modu altında, mesafe çizim modu işlevini seçin ve parametre ayarlarını gerektiği gibi ayarlayın. Tüm parametreler ayarlandığında, Kaçış tuşuna basın ve fare imleci ile üçüncü faringeal kemerin çevresini izlemek için çizime tıklayın.
Daha sonra 10 ila 25 dilim taşımak ve faringeal kemer çevre izlemek için dilim konumunu kullanın. Tüm kemer izlendiğinde, izlenen bölgenin yüzeyini oluşturmak için yüzey oluştur'u tıklatın. Yüzeyli yapıların maskelemesini yapmak için, edit menüsünde, üçüncü PAA ve DAPI için maske seçimini seçin ve Tamam'ı tıklatın. Ardından yeni kanalı PAA DAPI olarak yeniden adlandırın.
Kalan kanallar için bu adımı yineleyin. Endotel pleksusunun PAA'dan ayrı olarak görselleştirilmesi için üçüncü PAA için maske seçimini seçin ve DAPI'yi seçin. Seçil voxel'leri yüzeyin dışına doğru çekin ve yüzeyin içindeki voxel'leri kontrol edin.
Yüzeyin içindeki voxel'leri sıfıra ayarlayın ve Tamam'ı tıklatın. Yeni kanalı PAA DAPI olmayan olarak yeniden adlandırın. Kalan kanallar için bu adımı yineleyin. Üçüncü PA için maske seçimini seçin ve PAA OLMAYAN DAPI'yi seçin ve Tamam'ı tıklatın. Yeni kanalı pleksus DAPI olarak yeniden adlandırın.
Kalan kanallar için bu adımı yineleyin. İlgi çekici her yapıdaki tek tek endotel hücrelerini ölçmek için, ekran ayarlamaları panelinde, PAA ERG kanalı dışındaki tüm kanalları kapatın. Özellikler menüsünün altında, yeni noktalar ekleyin ve noktalar bir PAA toplam endotel hücre sayısını yeniden adlandırmak için tıklatın.
Mavi oku tıklatın ve kaynak kanal için PAA ERG kanalını seçin. Tahmini XY çapını dört mikrometreye ayarlayın ve bir sonraki panele geçmek için mavi oku tıklatın. Her ERG pozitif endotel hücre çekirdeğinin tek bir nokta yla temsil edilmesini sağlamak için nokta sayısını ayarlamak için kayan ölçeği kullanın.
Ardından, yeşil çift oku tıklatın ve ekran ayarlama panelindeki PAA ERG kanalını kapatın. PAA endotelgörselleştirmek için PAA VEGFR2 kanalını açın ve nesnenin yüzeyini seçmek için düzenle ve ekle/sil'i tıklatın. Daha sonra Kaçış tuşuna basın ve VEGFR2 pozitif olmayan noktaları silmek için Shift tuşuna basılı tutun ve endotel hücrelerinin toplam sayısını belirlemek için istatistik sekmesini tıklatın.
Tüm montaj immünofloresannet faringeal kemer endotel 3D rekonstrüksiyon sağlayan net ve temiz sonuçlar üretir. Bu resimde, büyük parlak nokta varlığı ya antikor veya engelleme tampon çözeltileri partikül sonucudur. Faringeal kemer ve PAA yüzey boyama sonra, maske fonksiyonunun kullanımı yüzey bölgeleri görsel olarak ayrılmış ve bağımsız olarak analiz sağlar.
Maskeleme aynı zamanda her yapı içinde endotel hücre sayılarının ayrı ayrı analiz ve niceliklendirilmesine olanak sağlar. Örneğin, burada nokta özelliği, ERG ifade eden her çekirdek için tek bir nokta atayarak hem PAA hem de pleksus endotel hücrelerinin toplam sayısını ölçmek için kullanılmıştır. Bu resimde spot fonksiyonu tarafından oluşturulan bir ERG pozitif VEGFR2 negatif nokta görülebilir.
Bu nedenle, yazılım tarafından tanınan her nokta aslında tek bir endotel hücresini temsil ettiğini doğrulamak esastır. Temiz ve net görüntüler elde etmek için, tüm çözümleri aşağı spin ve düzgün ve iyice antikor kuluçka sonra her embriyo yıkamak için unutmayın. BABB'nin aşındırıcı ve zehirli olduğunu unutmamak önemlidir.
Solventi düzgün bir şekilde talın ve atın ve BABB sızıntısını önlemek için erimiş embriyoları tamamen mühürlediğinden emin olun.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, fare embriyolarında 3, 4 ve 6 numaralı farinks yay arterlerini görselleştirmek ve analiz etmek için bir protokol açıklamaktadır. Yöntem, vasküler gelişimi incelemek için tüm-mont immünofloresan, doku şeffaf hale getirme, konfokal mikroskopi ve 3D rekonstrüksiyonu kullanır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Gelişimsel Biyoloji
- Vasküler Biyoloji
Arka Plan
- Farinks yay arterleri embriyonik gelişim için kritik öneme sahiptir.
- Konjenital kalp hastalığı genellikle aort yay arterlerindeki mutasyonları içerir.
- Vasküler yapı ilişkilerini anlamak, gelişimi incelemek için anahtardır.
- Işık tabakası mikroskobu, görselleştirme yeteneklerini artırır.
Çalışmanın Amacı
- Farinks yay arteri gelişimini görselleştirmek ve analiz etmek.
- Her yaındaki endotel hücresi sayılarını ölçmek.
- Mutasyonların damar oluşumu ve yeniden şekillenmesi üzerindeki etkilerini incelemek.
Kullanılan Yöntemler
- Tüm-mont immünofloresan
- Doku şeffaf hale getirme teknikleri
- Konfokal mikroskopi
- Vasküler yapıların 3D rekonstrüksiyonu
Ana Sonuçlar
- Farinks yalarında endotel hücresi sayımı.
- Vasküler yapı ilişkilerinin görselleştirilmesi.
- Konjenital kalp hastalığı mekanizmaları hakkında içgörüler.
- Diğer biyolojik sistemlerde potansiyel uygulamalar.
Sonuçlar
- Yöntem, vasküler gelişimi incelemek için kapsamlı bir yaklaşım sağlar.
- Mutasyonların fizyolojik süreçleri nasıl etkilediğini değerlendirmeye olanak tanır.
- Gelecekteki uygulamalar çeşitli biyolojik araştırma alanlarına yayılabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This method enables precise quantification of endothelial cell populations in developing vascular structures, supporting mechanistic de-risking in cardiovascular target validation. By providing 3D visualization and numerical readouts of arch artery formation, it enhances predictive confidence in early discovery pipelines focused on congenital heart disease pathways. The approach facilitates translational continuity from genetic perturbation to phenotypic vascular outcomes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying endothelial cell numbers in specific pharyngeal arches.
- Operational Value: Supports biological de-risking through compartmentalized analysis of vascular structures affected by genetic mutations.
- Predictive Value: Generates quantitative endothelial cell counts that inform target confidence and pathway validation in cardiovascular disease models.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized, reproducible vascular whole-mount preparations suitable for downstream immunohistochemical screening.
- Quantitative Output: Delivers endothelial cell number readouts in PAAs and surrounding plexuses, enabling comparative condition analysis.
- Platform Scalability: Compatible with light-sheet microscopy adaptation, supporting increased throughput and cross-project reuse.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly models congenital heart disease mechanisms by visualizing PAA 3, 4, and 6 formation and remodeling.
- Translational Continuity: Links genetic mutations to vascular phenotypes through endothelial cell quantification in defined arch territories.
- Risk-Adjusted Advancement: Provides phenotypic readouts that support go/no-go decisions in preclinical cardiovascular target validation.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing vascular phenotypic data between target engagement and lead optimization stages, particularly for cardiovascular pathways.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of vascular development genes through endothelial cell quantification in defined anatomical compartments.
- Screening: Enables assay-ready tissue preparation with preserved 3D vascular architecture for antibody or compound screening campaigns.
- Analytics: Generates spot-based endothelial cell counts and 3D vascular connectivity data that facilitate comparative statistical analysis across genotypes.
- Translational Research: Connects embryonic vascular phenotypes to congenital heart disease mechanisms via arch-specific endothelial cell analysis.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable vascular phenotyping platform applicable across multiple cardiovascular target validation projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in vascular development studies through direct endothelial cell quantification and 3D structural mapping.
- Operational Value: Standardizes vascular whole-mount processing and imaging, improving reproducibility across laboratories and timepoints.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision confidence by providing quantitative vascular phenotypic data early in target validation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of cardiovascular targets based on arch-specific endothelial cell phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in whole-mount immunofluorescence, tissue clearing, and confocal microscopy.
- Dependent on optical clearing (BABB) compatibility with antibody penetration and tissue integrity.
- Necessitates standardized washing and blocking protocols to minimize background from antibody particulates.
- Involves careful embryo orientation and agarose embedding to maintain sagittal positioning for consistent arch visualization.
- Relies on validated endothelial markers (ERG, VEGFR2) and spot-detection parameters for accurate cell quantification.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:55
Embryo Staining and Embedding
3:03
Methanol Dehydration and Tissue Clearing
4:04
Embryo Mounting
4:40
Third Pharyngeal Arch (PA) Surfacing
5:57
Surfaced Structure Masking
7:01
Endothelial Cell Quantification
8:19
Results: Representative PA and PAA Surfacing and EC Quantification
9:28
Conclusion
