Genom ÖlçeğiCRISPR/Cas9 Genetik Ekranlar Kullanılarak Hücre Yüzey Reseptör Tanımlama

Şu anda mevcut biyokimyasal yaklaşımlar kullanarak hücre yüzeyi etkileşimlerinin saptanması hala teknik zorluklar teşkil etmektedir. Bu protokol, hücre yüzeyindeki reseptör ligand etkileşimlerini belirlemek için genom ölçeği hücre tarama yaklaşımını kullanarak genetik bir alternatif sağlar. Diğer birçok mevcut yöntemin aksine, bu yöntem reseptörlerin biyolojisi ile ilgili hiçbir varsayımda bulunmaz.

Çok çeşitli hücre yüzey moleküllerinin aracılık ettiği etkileşimleri belirlemek için fırsatlar sağlar. Hücre yüzeyi molekülleri monoklonal antikorlar gibi ilaçlar için doğrudan erişilebilir. Bu nedenle, bu moleküller in aracılığı ile etkileşimlerin belirlenmesi önemli terapötik etkileri olabilir.

Bu yöntem genellikle hücresel sinyalizasyon ve tanıma süreçlerini keşfetmek isteyen araştırmacılar için geçerlidir, nöral ve immünolojik etkileşimlerin yanı sıra konak patojen etkileşimleri de dahil olmak üzere biyolojik bağlamlar geniş bir yelpazede. Protokol, yüksek iş üretim hücre ayırma makinesi ve yeni nesil sıralama makineleri gerektirir. Protokolü başlatmadan önce bu tesislerin kullanılabilir olduğundan emin olun.

Biyotinylated protein örneklerinin 96 kuyulu bir plaka içinde sekiz seri seyreltme yaparak her seyreltmenin son hacminin en az 200 mikrolitre olmasını ve yalnızca etiket kontrolü dahil edilmesini sağlayarak başlayın. Her kuyudan 100 mikrolitre çıkararak ve yeni bir 96-kuyu plakasına aktararak örneklerin bir kopyasını yapın. Tüm bağlayıcı denemelerde kontrol probolarak kullanılacak yalnızca etikete özel protein kontrolü ekleyin.

Plakalardan birinde bulunan kuyulara mililitre başına 0,1 mikrogram lık 100 mikrolitre ve diğer plakanın kuyularına 100 mikrolitre seyreltme tamponu ekleyin. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca plaka kuluçka. Bu arada, 15 dakika boyunca seyreltme tampon ile streptavidin kodlanmış plaka kuyuları kapatın.

Tabağı yıkadıktan sonra kuru olduğundan emin olun. Daha sonra her iki plakadan numunenin toplam hacmini streptavidin kodlu plakanın tek tek kuyularına aktarın ve oda sıcaklığında bir saat kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, 200 mikrolitre yıkama tamponu ile tabağı üç kez yıkayın.

Fare anti-rat Cd4d3+4 IgG 100 mikrolitre ekleyin ve bir saat daha plaka kuluçka. Yıkıntıları tekrarlayın. Bir anti-fare alkali fosfataz conjugate 100 mikrolitre ekleyin ve bir saat oda sıcaklığında plaka bırakın.

Daha sonra kuyuları üç kez yıkama tamponu ve bir kez de seyreltme tamponu ile yıkayın. P-nitrofenil fosfatı boya etanolin tamponunda mililitre başına bir miligramda hazırlayın ve her kuyuya 100 mikrolitre ekleyin. 15 dakikalık bir kuluçkadan sonra, emiciliğin her biri 405 nanometrede olduğunu ölçün.

Tetrameroluşturmak için uygun seyreltme faktörü olarak plaka üzerinde sinyal bulunmayan minimum seyreltme kullanın. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübate streptavidin-PE ve uygun biyotinylated protein seyreltme. Daha sonra konjuge proteinleri, daha fazla kullanıma kadar dört derece santigrat derecede ışık korumalı bir tüpte saklayın.

Konik tüpleri tedavi edilen ve kontrol numuneleri ile 200 kez G'de beş dakika döndürün. Supernatant çıkarın ve daha sonra kullanmak için eksi 20 santigrat derece tüplerden birini dondurun. 1% BSA ile PBS 10 mililitre diğer tüp pelet yeniden askıya ve 96-iyi plaka üzerinde negatif kontrol olarak hücrelerin 100 mikrolitre bir kenara koyun.

Daha sonra konik tüp ve 96-iyi plaka hücre süspansiyon için önceden konjuge rekombinant protein ekleyin. Hücre boyama yı en az bir saat boyunca dört santigrat derecede nazik bir rotasyonla tezgah üstü rotorüzerinde gerçekleştirin. Daha sonra hücreleri 200 kez G'de beş dakika boyunca peletleyin ve süpernatantı çıkarın.

Hücreleri iki kez yıkadıktan sonra, beş mililitre PBS ile tekrar askıya alın. Hücre kümelerini kaldırmak için hücreleri 30 mikrometrelik bir süzgeçten geçirin. O zaman onları bir akış Sodor ile analiz et.

BFP pozitif ve PE negatif hücreler için negatif kontrol örneğini kapıya kullanın. Daha sonra numuneyi sıralayın ve 1,5 mililitrelik bir santrifüj tüpüne 500,000 ila 1 milyon BFP pozitif ve PE negatif hücre toplayın. Boğaz kafesi hücrelerin proteine bağlanmasına bağlıdır, ancak normalde PE negatif örneklerin %1-5'i toplanır.

Şimdi beş dakika için 500 kez G santrifüj tarafından sıralanmış hücreleri izin, sonra dikkatle supernatant kaldırın. Pelet eksi 20 santigrat derecede altı aya kadar saklanabilir. Sıralanmamış ve sıralanmış popülasyondan ham sayım dosyası verecek olan başvuru kitaplığıiçin dizileri eşlemek için büyünün sayı işlevini kullanın.

Sıralanmamış kontrol örneğinden ham sayımları kontrol olarak ve sıralamalı örnekten alınan sayıları tedavi olarak kullanarak büyünün test işlevini çalıştırın. Oluşturulan gen özeti dosyasını açın ve duraklatma sırası sütununa artan sırada sıralayın. Ardından isabetleri 0,05 noktasından daha az bir yanlış bulma oranıyla tanımlayın.

Reseptör genellikle ilk pozisyonda yüksek sıklıkta sıralanır. Son olarak pozitif seçim için sağlam sıralama algoritması puanı çizmek için R veya eşdeğer bir yazılım kullanın. İnsan TNFSF9 ve P falciparum veya H5 insan TNFSF9 ve P falciparum Rh5'in bağlayıcı partnerinin tanımlanması için genom ölçeği nakavt ekranlar sırasıyla NCI-SNU-1 ve HEC-293 hücrelerinde yapıldı.

Rh5'in bağlanma davranışı hem heparan sülfattan etkilenmiş hem de bilinen reseptör BSG'dir, TN-FRSF-9 ise bilinen reseptörü TN-FSF-9'a bağlanmayı kaybetmemiş. Çözünür heparin ile kuluçka öncesi üzerine. Kontrol mutant kütüphanesindeki GNA dağılımı, kütüphane karmaşıklığının deney boyunca korundu.

Ekranların teknik kalitesi, g-rna'nın temel olmayan genlerin referans kümesini hedeflemesinde gözlenen kıvrım değişikliklerinin dağılımı incelenerek, temel genlerin bir referans kümesinin dağılımına göre değerlendirildi. Buna ek olarak, yol düzeyi zenginleştirme beklenen temel yollar tespit edildi ve önemli ölçüde açılan nüfus zenginleştirilmiş ortaya koymuştur. Kontrol örneğini orijinal plazmid kitaplığıyla karşılaştırırken.

Sağlam sıralama algoritması veya RRA-skoru, G-RNA'ların sürekli olarak beklenenden daha yüksek sıralandığı bir ölçü sağlar. TNFRSF9 için ekranda, üst hit Bilinen bir bağlama ortağı olan TNFSF9 oldu. Buna ek olarak, TP53 yolu ile ilgili genlerin bir dizi de tespit edilmiştir.

RH5 durumunda, bilinen reseptöre ek olarak, ve sülfatlı gags üretimi için gerekli gen, SLC16A1 geni de tespit edildi. Tarama yaklaşımı genellikle çok sağlamdır ve doğrudan etkileşen reseptör, bu popülasyon sırasına göre zenginleştirilmiş genler listesinde yüksek derecelerde yer almalıdır. Ekrandan elde edilen vuruşları doğrulamak çok önemlidir.

Etkileşim proteinler aracılığı ile, ikili Protein Protein etkileşimleri çalışmak için tasarlanmış biyokimyasal yaklaşımlar, örneğin, daha fazla doğrulama çalışmaları için kullanılabilir. Bu yaklaşımın tarafsız genom ölçeğidoğası nedeniyle, lipidler, multipass membran proteinleri ve glikanlar gibi hücre moleküllerinin incelenmesizor etkileşimleri keşfetmek yardımcı olacağını tahmin ediyoruz. Ayrıca reseptör ticareti ve biyoloji için gerekli yeni yollar ortaya çıkarabilir.