Name: Genom ÖlçeğiCRISPR/Cas9 Genetik Ekranlar Kullanılarak Hücre Yüzey Reseptör Tanımlama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-06T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Öğrenin, CRISPR/Cas9 genetik tarama ile hücre yüzeyi reseptör-ligand etkileşimlerini belirleme yöntemini. Bu yüksek verimli protokol, önyargısız tanımlama sağlar ve terapötik geliştirme için önemli uygulamalar sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, GJW'a verilen 206194 wellcome trust hibe numarası ile desteklenmiştir. Biz Cytometry Core tesisi teşekkür ederiz: Bee Ling Ng, Jennifer Graham, Sam Thompson, ve Christopher Hall FACS ile yardım için.

<ol><li>Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+initiation+in+biological+systems%3A+the+properties+and+detection+of+transient+extracellular+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+bioSystems%22%5BJournal%5D)">Signal initiation in biological systems: the properties and detection of transient extracellular protein interactions.</a> Molecular bioSystems. 5 (12), 1405-1412 (2009).</li>
<li>van der Merwe, P. A., Barclay, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+intercellular+adhesion%3A+the+importance+of+weak+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Transient intercellular adhesion: the importance of weak protein-protein interactions.</a> Trends in Biochemical Sciences. 19 (9), 354-358 (1994).</li>
<li>Wood, L., Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+to+identify+extracellular+receptor-ligand+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Approaches to identify extracellular receptor-ligand interactions.</a> Current Opinion in Structural Biology. 56, 28-36 (2019).</li>
<li>Bushell, K. M., Söllner, C., Schuster-Boeckler, B., Bateman, A., Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+screening+for+novel+low-affinity+extracellular+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Large-scale screening for novel low-affinity extracellular protein interactions.</a> Genome Research. 18 (4), 622-630 (2008).</li>
<li>Visser, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+extracellular+biochemical+screen+reveals+that+FLRTs+and+Unc5s+mediate+neuronal+subtype+recognition+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">An extracellular biochemical screen reveals that FLRTs and Unc5s mediate neuronal subtype recognition in the retina.</a> eLife. 4, e08149(2015).</li>
<li>Özkan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+extracellular+interactome+of+immunoglobulin+and+LRR+proteins+reveals+receptor-ligand+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An extracellular interactome of immunoglobulin and LRR proteins reveals receptor-ligand networks.</a> Cell. 154 (1), 228-239 (2013).</li>
<li>Martinez-Martin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Unbiased+Screen+for+Human+Cytomegalovirus+Identifies+Neuropilin-2+as+a+Central+Viral+Receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An Unbiased Screen for Human Cytomegalovirus Identifies Neuropilin-2 as a Central Viral Receptor.</a> Cell. 174 (5), 1158-1171 (2018).</li>
<li>Bianchi, E., Doe, B., Goulding, D., Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Juno+is+the+egg+Izumo+receptor+and+is+essential+for+mammalian+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Juno is the egg Izumo receptor and is essential for mammalian fertilization.</a> Nature. 508 (7497), 483-487 (2014).</li>
<li>Mullican, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFRAL+is+the+receptor+for+GDF15+and+the+ligand+promotes+weight+loss+in+mice+and+nonhuman+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">GFRAL is the receptor for GDF15 and the ligand promotes weight loss in mice and nonhuman primates.</a> Nature Medicine. 23 (10), 1150-1157 (2017).</li>
<li>Turner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+malaria+is+associated+with+parasite+binding+to+endothelial+protein+C+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Severe malaria is associated with parasite binding to endothelial protein C receptor.</a> Nature. 498 (7455), 502-505 (2013).</li>
<li>Frei, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+identification+of+ligand-receptor+interactions+on+living+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Direct identification of ligand-receptor interactions on living cells and tissues.</a> Nature Biotechnology. 30 (10), 997-1001 (2012).</li>
<li>Sobotzki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HATRIC-based+identification+of+receptors+for+orphan+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">HATRIC-based identification of receptors for orphan ligands.</a> Nature Communications. 9 (1), 1519(2018).</li>
<li>Sharma, S., Petsalaki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+CRISPR-Cas9+Based+Genome-Wide+Screening+Approaches+to+Study+Cellular+Signalling+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Application of CRISPR-Cas9 Based Genome-Wide Screening Approaches to Study Cellular Signalling Mechanisms.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).</li>
<li>Gebre, M., Nomburg, J. L., Gewurz, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+Genetic+Analysis+of+Virus-Host+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 Genetic Analysis of Virus-Host Interactions.</a> Viruses. 10 (2), (2018).</li>
<li>Zotova, A., Zotov, I., Filatov, A., Mazurov, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+antigen+specificity+of+a+monoclonal+antibody+using+genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+library%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Determining antigen specificity of a monoclonal antibody using genome-scale CRISPR-Cas9 knockout library.</a> Journal of Immunological Methods. 439, 8-14 (2016).</li>
<li>Puschnik, A. S., Majzoub, K., Ooi, Y. S., Carette, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRISPR+toolbox+to+study+virus-host+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A CRISPR toolbox to study virus-host interactions.</a> Nature Reviews. Microbiology. 15 (6), 351-364 (2017).</li>
<li>Kerr, J. S., Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avidity-based+extracellular+interaction+screening+%28AVEXIS%29+for+the+scalable+detection+of+low-affinity+extracellular+receptor-ligand+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Avidity-based extracellular interaction screening (AVEXIS) for the scalable detection of low-affinity extracellular receptor-ligand interactions.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), e3881(2012).</li>
<li>Tzelepis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRISPR+Dropout+Screen+Identifies+Genetic+Vulnerabilities+and+Therapeutic+Targets+in+Acute+Myeloid+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A CRISPR Dropout Screen Identifies Genetic Vulnerabilities and Therapeutic Targets in Acute Myeloid Leukemia.</a> Cell Reports. 17 (4), 1193-1205 (2016).</li>
<li>Sharma, S., Bartholdson, S. J., Couch, A. C. M., Yusa, K., Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+identification+of+cellular+pathways+required+for+cell+surface+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Genome-scale identification of cellular pathways required for cell surface recognition.</a> Genome Research. 28 (9), 1372-1382 (2018).</li>
<li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+analysis+of+pooled+CRISPR+genetic+screens+using+MAGeCKFlute%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Integrative analysis of pooled CRISPR genetic screens using MAGeCKFlute.</a> Nature Protocols. 14 (3), 756-780 (2019).</li>
<li>R Core team. A language and environment for statistical computing. , http://www.R-project.org (2013).</li>
<li>Hart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+Design+of+Genome-Wide+CRISPR%2FSpCas9+Knockout+Screens%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Evaluation and Design of Genome-Wide CRISPR/SpCas9 Knockout Screens.</a> G3. 7 (8), 2719-2727 (2017).</li>
<li>Kuleshov, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichr%3A+a+comprehensive+gene+set+enrichment+analysis+web+server+2016+update%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Enrichr: a comprehensive gene set enrichment analysis web server 2016 update.</a> Nucleic Acids Research. 44 (W1), W90-W97 (2016).</li>
<li>Crosnier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basigin+is+a+receptor+essential+for+erythrocyte+invasion+by+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Basigin is a receptor essential for erythrocyte invasion by Plasmodium falciparum.</a> Nature. 480 (7378), 534-537 (2011).</li>
<li>Kirk, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD147+is+tightly+associated+with+lactate+transporters+MCT1+and+MCT4+and+facilitates+their+cell+surface+expression%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">CD147 is tightly associated with lactate transporters MCT1 and MCT4 and facilitates their cell surface expression.</a> The EMBO Journal. 19 (15), 3896-3904 (2000).</li>
<li>Chong, Z. S., Ohnishi, S., Yusa, K., Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pooled+extracellular+receptor-ligand+interaction+screening+using+CRISPR+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Pooled extracellular receptor-ligand interaction screening using CRISPR activation.</a> Genome Biology. 19 (1), 205(2018).</li>
<li>van der Meer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Model+Passports-a+hub+for+clinical%2C+genetic+and+functional+datasets+of+preclinical+cancer+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Cell Model Passports-a hub for clinical, genetic and functional datasets of preclinical cancer models.</a> Nucleic Acids Research. 47 (D1), D923-D929 (2019).</li>
<li>Bausch-Fluck, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mass+spectrometric-derived+cell+surface+protein+atlas%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A mass spectrometric-derived cell surface protein atlas.</a> PloS One. 10 (3), e0121314(2015).</li>
<li>Behan, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prioritization+of+cancer+therapeutic+targets+using+CRISPR-Cas9+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Prioritization of cancer therapeutic targets using CRISPR-Cas9 screens.</a> Nature. 568 (7753), 511-516 (2019).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Hücresel tanıma ile ilgili hücresel bileşenleri kodlayan genleri tanımlamak için CRISPR tabanlı bir tarama stratejisi tanımlanmıştır. CRISPR aktivasyonu kullanarak benzer bir yaklaşım da büyük protein kütüphaneleri oluşturmak için gerek kalmadan rekombinant proteinlerin doğrudan etkileşim reseptörlerini belirlemek için genetik bir alternatif sağlar26. Ancak, bu yaklaşımın en önemli bir avantajı, hücre üzerinde doğal olarak görüntülenen yüzey molekülleri tarafından aracılık etkileşimleri için geçerli olmasıdır ve reseptörün bağlayıcı avidite etkileyebilir reseptörlerin aşırı ekspresyonu bağlı değildir. Diğer yöntemlerin aksine, bu nedenle, bu teknik reseptörlerin biyokimyasal doğası veya hücre biyolojisi ile ilgili hiçbir varsayımda bulunmaz ve normalde çok büyük proteinler gibi biyokimyasal yaklaşımlar kullanılarak incelenmesi zor olan proteinlerin aracılık ettiği etkileşimleri veya membranı birden fazla kez geçen veya diğer proteinlerle kompleksler oluşturan ve glikan, glikolipid ve fosfolipid gibi proteinler dışındaki molekülleri inceleme fırsatı sağlar. Yöntemin genom ölçekli doğası göz önüne alındığında, bu yaklaşım aynı zamanda reseptör ütülünün tanımlanması değil, aynı zamanda bağlayıcı olay için gerekli olan ek hücresel bileşenlerin de avantajına sahiptir, böylece reseptörün hücre biyolojisi hakkında bilgi sağlar.
Bir yetim proteinin reseptörü tanımlamak için kullanırken bu yöntemin önemli sınırlamalarından biri ilk proteine bağlanan bir hücre hattı tanımlamak için ilk gereksinimdir. Bu her zaman kolay değildir ve genetik ekranlara da izin veren bağlayıcı bir fenotip gösteren bir hücre hattını tanımlamak bu taslağı dağıtmak için zaman sınırlayıcı bir adım olabilir. Bazı hücre hatları diğerlerinden daha fazla proteine bağlanma eğilimindedir. Bu özellikle HS'yi bağlayan proteinler için önemlidir, çünkü bu proteinler yerel bağlama bağlamına bakılmaksızın HS yan zincirlerini gösteren herhangi bir hücre hattına bağlanma eğilimindedirler. Ayrıca hücre hatlarında sindekanların (yani HS içeren proteoglikanlar) yükseltisinin HS bağlayıcı proteinlerin daha fazla bağlanmasına yol açtığını gözlemledik26. Bu tarama için hücre hattı seçerken dikkate alınması gereken bir faktör olabilir. Ancak, dikkat edilmesi gereken önemli olan HS'nin katkı maddesinin belirli bir reseptöre bağlanmasını engellememesidir. Bu, bağlama gözlenirse, bu teşbikte HS'nin aracılık ettiği bağlayıcının19'abağımlı değil katkı maddesi olması nedeniyle yalnızca HS tarafından aracılık edilmesinin mümkün olduğu anlamına gelir. Böyle bir senaryoda, açıklanan heparin engelleme yaklaşımı tam bir genetik tarama yapmaya gerek kalmadan bu tür davranışları belirleyebilir.
Hücre hatları seçmek için yararlı bir kaynak Hücre Modeli Pasaport, genomik içeren, transkripsiyon, ve kültür durum bilgileri ~ 1,000 kanser hücre hatları27. Biyolojik içeriğe bağlı olarak, hücreler ifade profillerine göre seçilebilir. Hücre hatlarının seçimine yardımcı olmak için, ~1.500 premaye edilmiş insan hücresi yüzey glikoproteinleri28 ifadesine göre Hücre Modeli Pasaport ~1.000 hücre hatları kümelenmiş 28 (Ek Şekil 2; büyüme koşulları ile birlikte her hücre hattı için küme bilgileri Ek Tablo 2'deverilmiştir ). Bilinmeyen fonksiyonu ile bir proteinin bağlanması test ederken, reseptörlerin geniş bir yelpazede kapsayan şansını artırmak için her kümeden temsili hücre hatları bir panel seçmek yararlıdır. Bir seçim göz önüne alındığında, kültür ve transduce kolay hücre hatları seçmek için tavsiye edilir. Bu hücre hatları genom ölçekli taramada kullanılacağı için, daha sonraki adımlarda CRISPR tabanlı genetik tarama için sgRNA'nın teslimi için en yaygın yöntem olduğu için, büyük miktarlarda kolayca yetiştirilebilen ve lentiviral transdüksiyona izin verilmesi tercih edilir.
Genellikle, fenotip seçimleri tek bir sıralamada gerçekleştirilir. Ancak, bu kontrol ile karşılaştırıldığında lekeli hücre popülasyonunun parlaklığı ile belirlenir. İstenilen fenotipin sinyal-gürültü oranının düşük olduğu veya ekranın amacının güçlü fenotiplere sahip mutantları belirlemek olduğu senaryolar için yinelemeli seçim turları benimsenebilir. FACS tabanlı ekranlar için yinelemeli bir seçim yaklaşımı kullanırken, sıralama işleminin esas olarak ayıklayıcının katıksız gücü nedeniyle hücre ölümüne neden olabileceğini göz önünde bulundurmak önemlidir. Böylece, toplanan tüm hücreler sıralama sonraki turda temsil edilecektir.
Kütüphane karmaşıklığı başarılı genetik ekranlar, özellikle negatif seçim ekranları için performans çok önemli bir faktördür, çünkü bu tükenme ölçüde sadece başlangıç kitaplığı mevcut ne sonuçları karşılaştırArak belirlenebilir. Negatif seçim ekranları için, 500-1.000 x karmaşıklıkta kitaplıklar korumak için yaygındır. Pozitif seçim ekranları, ancak, kütüphane boyutları için daha sağlam, bu tür ekranlarda mutantların sadece az sayıda belirli bir fenotip için seçilmesi bekleniyor çünkü. Bu nedenle, burada açıklanan olumlu seçim ekranında, kitaplık boyutu ekranın kalitesinden ödün vermeden 50-100x karmaşıklığa düşürülebilir. Buna ek olarak, bu ekranlarda belirli bir günde belirli bir hücre hattı için bir denetim kitaplığı kullanmak da mümkündür verilen hücre hattı için gün sıralanmış tüm örnekler için bir "genel kontrol" olarak. Bu, üretilmesi ve sıralanmış olması gereken denetim kitaplıklarının sayısını azaltır.
Bu yaklaşımın kullanımı için bir diğer önemli husus in vitro hücre büyümesi için gerekli olan genlerin belirlenmesinde fonksiyon kaybı ekranlarının sınırlamalarıdır. Bu bağlamda ekranların zamanlaması çok önemlidir, çünkü mutant hücreler kültürde ne kadar uzun süre tutulursa, temel genlerdeki mutasyona sahip hücrelerin canlı olma olasılığı da o kadar yüksektir ve artık mutant kütüphanesinde temsil edilmiyor. 300'den fazla hücre hattında Proje Puanı girişiminin bir parçası olarak gerçekleştirilen son genetik ekranlar, KEGG-açıklamalı protein salgılaması ve N-glikozilasyon yolundaki birden fazla genin genellikle bir dizi hücre hattı için gerekli olarak tanımlandığını göstermektedir (Ek Şekil 3)29. Bu durum, hücresel tanıma süreci bağlamında çoğalma ve canlılık için gerekli genlerin etkisinin araştırılamaması durumunda ekran tasarımında göz önünde bulundurulabilir. Bu durumda, ekranların erken bir zaman noktasında (örn. 9. gün posttransdüksiyon) yapılması genel olarak uygun olacaktır. Ancak, yaklaşım genel hücresel yollar yerine güçlü boyut etkileri olan birkaç hedefi tanımlamak için kullanılırsa, daha sonraki bir zaman noktasında (örneğin, gün 15-16 posttransdüksiyon) ekranlar gerçekleştirmek için uygun olabilir.
Tarama sonuçları çok sağlam; geçmişte yapılan sekiz rekombinant protein bağlama ekranlarında, hücre yüzey reseptörü her durumda en çok etkilenen19. Etkileşim ortağını tanımlamak için bu yaklaşımı kullanırken, bu nedenle reseptörün ve yüzeydeki sunumuna katkıda bulunan faktörlerin yüksek istatistiksel güvenle tanımlanması beklenmelidir. Ekran yapıldıktan ve tek bir gRNA nakavt kullanılarak bir vuruş doğrulandıktan sonra, AVEXIS4 gibi mevcut biyokimyasal yöntemler ve yüzey plazmon rezonansı kullanılarak saflaştırılmış proteinlerin doğrudan doygun bağlanması kullanılarak daha fazla takip yapılabilir. Burada açıklanan yaklaşım, çözünür rekombinant bağlayıcı probu oluşturmak mümkün olan tüm proteinler için geçerlidir.
Özetle, bu hücre yüzeyproteinleri tarafından aracılık etkileşimleri belirlemek için bir genom ölçekli CRISPR nakavt yaklaşımdır. Bu yöntem genellikle hücre yüzeyinin tanınması için gerekli hücresel yolları belirlemek için bir organizmanın kendi hücreleri (örneğin, nöral ve immünolojik tanıma) ve konak hücreleri ve patojen proteinler arasında da dahil olmak üzere çok çeşitli biyolojik bağlamlarda uygulanabilir. Bu yöntem, reseptör tanımlaması için tasarlanmış biyokimyasal yaklaşımlara genetik bir alternatif sağlar ve reseptörlerin biyokimyasal doğası veya hücre biyolojisi ile ilgili önceden varsayımlar gerektirmediği için tamamen beklenmedik keşifler yapma potansiyeline sahiptir.

Hücre yüzeyreseptör proteinleri tarafından ekstrasellüler etkileşimleri doku organizasyonu, konak-patojen tanıma ve bağışıklık regülasyonu gibi önemli biyolojik süreçleri yönlendirir. Membran reseptörleri monoklonal antikorlar gibi sistematik olarak teslim terapötik eyleme hedefleri olduğundan, bu etkileşimleri soruşturma, daha geniş biyomedikal topluluk için ilgi çekicidir. Önemine rağmen, bu etkileşimleri incelemek teknik olarak zor olmaya devam etmektedir. Bunun başlıca nedeni membrana gömülü reseptörlerin amphipatik olması, biyokimyasal manipülasyon için biyolojik membranlardan izole etmelerini zorlaştırması ve etkileşimlerinin zayıf etkileşim yakınlıkları (μM-mMaralığındaki KDs)1. Sonuç olarak, birçok yaygın olarak kullanılan yöntemler protein etkileşimleri bu sınıf tespit etmek için uygun değildir1,2.
Benzersiz biyokimyasal özelliklerini dikkate alan ekstrasellüler reseptör-ligand etkileşimlerini özellikle araştırmak için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir3. Bu yaklaşımların bir kısmı, bu proteinlerin glikanlar ve disülfür bağları gibi yapısal olarak önemli olan çeviri sonrası modifikasyonlar içermesini sağlamak için memeli veya böcek hücre tabanlı sistemlerde çözünür rekombinant protein olarak reseptörün tüm ektoetki alanını ifade etmeyi içerir. Düşük yakınlık bağlama üstesinden gelmek için, ektodomains genellikle bağlayıcı avidite artırmak için oliomerize edilir. Hırslı protein ektodomains başarıyla doğrudan rekombinant protein-protein etkileşim ekranlarında etkileşim ortakları belirlemek için bağlayıcı problar olarak kullanılmıştır4,5,6,7. Geniş başarılı olsa da, rekombinant protein bazlı yöntemler bir membran reseptörünün ektoetkialanı çözünür bir protein olarak üretilmesi gerekir. Bu nedenle, genellikle bitişik bir hücre dışı bölge içeren proteinler için geçerlidir (örneğin, tek geçişli tip I, tip II veya GPI-anchored) ve genellikle membrana birden fazla kez yayılan reseptör kompleksleri ve membran proteinleri için uygun değildir.
Tamamlayıcı DNA'lardan oluşan bir kütüphanenin hücrelere aktarıldığı ve bağlayıcı bir fenotip artışı için test edildiği ekspresyon klonlama teknikleri de hücre dışı protein-protein etkileşimlerini tanımlamak için kullanılmıştır8. Son yıllarda klonlanmış ve sıralı cDNA ekspresyonu plazmidlerinin büyük koleksiyonlarınınkullanılabilirliği,cDNA'ları kodlayan hücre yüzey reseptörlerini aşırı ifade eden hücre hatlarının etkileşimleri tanımlamak için rekombinant proteinlerin bağlanması için tarandığı yöntemleri kolaylaştırmıştır9,10. CDNA aşırı ekspresyon temelli yaklaşımlar, rekombinant protein bazlı yöntemlerin aksine, plazma membranı bağlamında etkileşimleri belirleme olanağı nı karşılar. Ancak, cDNA ekspresyonu yapılışındaki başarı, hücrelerin proteini doğru katlanmış formda aşırı ifade etme yeteneğine bağlıdır, ancak bu genellikle taşıyıcılar, şaperonlar ve doğru oligomerik montaj gibi hücresel aksesuar faktörleri gerektirir. Bu nedenle tek bir cDNA'nın aktarılması hücre yüzeyi ekspresyonunu elde etmek için yeterli olmayabilir.
CDNA yapıları veya rekombinant protein probları kullanarak tarama teknikleri kaynak yoğun dur ve cDNA veya rekombinant protein kütüphanelerinin büyük koleksiyonlarını gerektirir. Özellikle tasarlanmış kütle spektrometresi tabanlı yöntemler büyük kütüphanelerin montaj gerektirmeyen hücre dışı etkileşimleri belirlemek için son zamanlarda kullanılmıştır. Ancak, bu teknikler hücre yüzeyinde mevcut moleküllerin biyokimyasal doğasını değiştirebilir ve şu anda sadece glikozile proteinler11,12aracılık etkileşimleri için geçerli olan hücre yüzeyinin kimyasal manipülasyon gerektirir. Şu anda mevcut yöntemlerin çoğunluğu da büyük ölçüde glikan, lipidler ve kolesterol gibi moleküller de dahil olmak üzere membran mikroortamdan katkısı göz ardı ederken proteinler arasındaki etkileşimleri üzerinde yoğun olarak odaklanır.
CRISPR tabanlı yaklaşımlar kullanılarak son derece verimli biallelik hedeflemenin son zamanlarda gelişmesi, farklı bağlamlarda yer alan hücresel bileşenleri tanımlamak için sistematik ve tarafsız bir şekilde taranabilen tek bir havuzda tanımlanmış genlerden yoksun hücrelerin genom ölçeğinde kütüphanelerini sağlamıştır, hücresel sinyal süreçlerinin incelenmesi, ilaçlara, toksinlere ve patojenlere karşı direnç sağlayan tedirginliklerin belirlenmesi ve antikorların özgüllüğünün belirlenmesidahil 13,14,15,16. Burada, hücre dışı reseptör-ligand etkileşimlerini tanımlamak için mevcut biyokimyasal yaklaşımlara alternatif sağlayan genom ölçekli CRISPR tabanlı nakavt hücre tarama testini tanımlıyoruz. Membran reseptörlerinin genetik ekranlar aracılığı ile oluşturduğu etkileşimleri tanımlama yaklaşımı, özellikle cd'lerin veya rekombinant proteinlerin büyük kütüphanelerinin derlenmesine gerek duymadığı için bireysel ligandlara odaklanmış bir ilgi duyan araştırmacılar için uygundur.
Bu tahlil üç ana adımdan oluşur: 1) İlgi reseptörünün hücre dışı bölgelerinden oluşan son derece hırslı rekombinant protein bağlama probları floresan esaslı akış sitometrisi-bağlama tahlillerinde üretilir ve kullanılır; 2) Bağlayıcı tahliller rekombinant protein probu etkileşim ortağı ifade eden bir hücre hattı tanımlamak için kullanılır; 3) Etki proteini ile etkileşime girilen hücre hattının Cas9-ekspres versiyonu üretilir ve genom ölçekli CRISPR/Cas9 tabanlı nakavt ekranı yapılır (Şekil 1). Bu genetik ekranda, bir rekombinant proteinin hücre hatlarına bağlanması, sondayı bağlama yeteneğini yitirmiş nakavt kitaplığı içindeki hücrelerin floresan bazlı aktif hücre sıralama (FACS) ve sıralama ile tanımlanan bağlayıcı fenotip kaybına neden olan genler kullanılarak sıralandığı ölçülebilir bir fenotip olarak kullanılır. Prensip olarak, avid probu bağlamaktan sorumlu reseptörü kodlayan genler ve hücre yüzeyi görüntüsü için gerekli olanlar tanımlanır.
Bu protokolün ilk adımı membrana bağlı reseptörlerin ektoetkialanını temsil eden hırslı rekombinant protein problarının üretimini içerir. Bu reseptörlerin ektodomains bir rekombinant çözünür protein1olarak ifade edildiğinde sık sık ekstrasellüler bağlayıcı işlevlerikorumak bilinmektedir. İlgi çekici bir protein için, çözünür rekombinant proteinler, daha fazla bağlayıcı avidite için oliomerize edilebilen herhangi bir formatta uygun ökaryotik protein ekspresyon sisteminde üretilebilir ve floresan bazlı akış sitometrisi bazlı bağlayıcı tahlillerde (örn. HEK293 protein ekspresyonu sistemi kullanılarak membran reseptörlerinin çözünür ektodomains üretimi için ayrıntılı protokoller, hem pentamerik proteinlerin ve monomerik proteinlerin üretimi için farklı multimerizasyon teknikleri ve protein ekspresyonu yapıları daha önce tarif edilmiştir1,17. Buradaki protokol, monomerik biyotinylated proteinlerden floresan avid probları üreterek, doğrudan hücre bazlı bağlayıcı tahlillerde kullanılabilen ve algılama için ikincil bir antikor gerektirmeyen bir avantaja sahip olan bir florokroma (örneğin, phycoerythrin veya PE) konjuge streptavidin'e konjuge ederek floresan avid probları üretme adımlarını açıklayacaktır. Genom ölçekli ekranlar gerçekleştirmek için genel protokoller zaten tarif edilmiştir20,21, bu nedenle protokol esas olarak Insan V1 kullanarak CRISPR / Cas9 nakavt tarama sistemi kullanarak akış sitometri tabanlı rekombinant protein bağlama ekranları performans özellikleri odaklanmak ("Yusa") kütüphane18.

<table><tbody><tr><td>Anti-fare alkalin fosfataz</td><td>Sigma</td><td>A4656</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>Chem-Cruz</td><td>SC-204655</td><td></td></tr><tr><td>Kan ve Hücre Kültürü DNA Maxi Kiti</td><td>Qiagen</td><td>13362</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A9647-100G</td><td></td></tr><tr><td>Dietanolamin</td><td>Sigma</td><td>398179</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>Dneasy Kan ve Doku kiti</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-96 Yan Mıknatıs</td><td>Invitrogen</td><td>12331D</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T paketleme hücreler</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma</td><td>H4784-1G</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix</td><td>Kapa</td><td>KK2602</td><td></td></tr><tr><td>PLUS reaktifli Lipofiktamin LTX</td><td>Invitrogen</td><td>15338100</td><td></td></tr><tr><td>MoFlo XDP hücre sıralayıcı</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ni2 + -NTA agaroz boncukları</td><td>Jena Bioscience</td><td>AC-501-25</td><td></td></tr><tr><td>OPTI-MEM</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>OX-68 antikoru</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA1022R</td><td></td></tr><tr><td>p-nitrofenil fosfat</td><td>Sigma</td><td>1040-506</td><td></td></tr><tr><td>PD-10 tuz giderme kolonları</td><td>GE sağlık</td><td>17085101</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>5 mL yatak hacmine sahip polipropilen tüpler</td><td>Qiagen</td><td>34964</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaz K, rekombinant, PCR Sınıfı</td><td>Roche</td><td>3115879001</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Gibco</td><td>A11138-03</td><td></td></tr><tr><td>Q5 Sıcak Başlangıç Yüksek Sadakat 2 kez; Master Mix</td><td>NEB</td><td>M0494L</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR saflaştırma kiti</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>SCFA filtresi</td><td>Nalgene</td><td>190-2545</td><td></td></tr><tr><td>Sony Hücre sıralayıcı</td><td>Sony</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SPRI boncukları (Agencourt AMPure XP boncukları)</td><td>Beckman</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin kaplı mikrotitre plakaları</td><td>Nalgene</td><td>734-1284</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-PE</td><td>Biolegend</td><td>405204</td><td></td></tr></tbody></table>

genom Ölçeğicrispr/cas9 genetik ekranlar kullanılarak hücre yüzey reseptör tanımlama

Cell Surface Receptor Identification Using Genome-Scale CRISPR/Cas9 Genetic Screens

Membrana gömülü hücre yüzey reseptörleri arasındaki doğrudan etkileşimler aracılığı ile aracılık edilen hücreler arası iletişim, çok hücreli organizmaların normal gelişimi ve işleyişi için çok önemlidir. Ancak, bu etkileşimleri algılamak teknik olarak zor olmaya devam etmektedir. Bu makale, belirli hücre yüzey tanıma olayları için gerekli hücresel yolları ortaya koyan sistematik genom ölçekli CRISPR/Cas9 nakavt genetik tarama yaklaşımını açıklamaktadır. Bu test, bir memeli protein ekspresyon sisteminde üretilen rekombinant proteinleri hücre tabanlı genetik bir ekranda etkileşim ortaklarını belirlemek için hevesli bağlayıcı problar olarak kullanır. Bu yöntem, membrana gömülü reseptörlerin ektodomains karşılık rekombinant bağlayıcı problar tarafından tespit hücre yüzeyi etkileşimleri için gerekli genleri tanımlamak için kullanılabilir. Daha da önemlisi, bu yaklaşımın genom ölçekli doğası göz önüne alındığında, aynı zamanda sadece doğrudan reseptör tespit değil, aynı zamanda hücre yüzeyinde reseptör sunumu için gerekli olan hücresel bileşenleri tespit avantajı vardır, böylece reseptörbiyolojisi içine değerli anlayışlar sağlayan.

Bu el yazması, hücre dışı reseptör-ligand etkileşimlerini tanımlamak için genom ölçeğinde hücre tabanlı tarama yaklaşımını açıklamaktadır.

Genom ÖlçeğiCRISPR/Cas9 Genetik Ekranlar Kullanılarak Hücre Yüzey Reseptör Tanımlama

Intercellular communication mediated by direct interactions between membrane-embedded cell surface receptors is crucial for the normal development and ...

Şu anda mevcut biyokimyasal yaklaşımlar kullanarak hücre yüzeyi etkileşimlerinin saptanması hala teknik zorluklar teşkil etmektedir. Bu protokol, hücre yüzeyindeki reseptör ligand etkileşimlerini belirlemek için genom ölçeği hücre tarama yaklaşımını kullanarak genetik bir alternatif sağlar. Diğer birçok mevcut yöntemin aksine, bu yöntem reseptörlerin biyolojisi ile ilgili hiçbir varsayımda bulunmaz.Çok çeşitli hücre yüzey moleküllerinin aracılık ettiği etkileşimleri belirlemek için fırsatlar sağlar. Hücre yüzeyi molekülleri monoklonal antikorlar gibi ilaçlar için doğrudan erişilebilir. Bu nedenle, bu moleküller in aracılığı ile etkileşimlerin belirlenmesi önemli terapötik etkileri olabilir.Bu yöntem genellikle hücresel sinyalizasyon ve tanıma süreçlerini keşfetmek isteyen araştırmacılar için geçerlidir, nöral ve immünolojik etkileşimlerin yanı sıra konak patojen etkileşimleri de dahil olmak üzere biyolojik bağlamlar geniş bir yelpazede. Protokol, yüksek iş üretim hücre ayırma makinesi ve yeni nesil sıralama makineleri gerektirir. Protokolü başlatmadan önce bu tesislerin kullanılabilir olduğundan emin olun.Biyotinylated protein örneklerinin 96 kuyulu bir plaka içinde sekiz seri seyreltme yaparak her seyreltmenin son hacminin en az 200 mikrolitre olmasını ve yalnızca etiket kontrolü dahil edilmesini sağlayarak başlayın. Her kuyudan 100 mikrolitre çıkararak ve yeni bir 96-kuyu plakasına aktararak örneklerin bir kopyasını yapın. Tüm bağlayıcı denemelerde kontrol probolarak kullanılacak yalnızca etikete özel protein kontrolü ekleyin.Plakalardan birinde bulunan kuyulara mililitre başına 0,1 mikrogram lık 100 mikrolitre ve diğer plakanın kuyularına 100 mikrolitre seyreltme tamponu ekleyin. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca plaka kuluçka. Bu arada, 15 dakika boyunca seyreltme tampon ile streptavidin kodlanmış plaka kuyuları kapatın.Tabağı yıkadıktan sonra kuru olduğundan emin olun. Daha sonra her iki plakadan numunenin toplam hacmini streptavidin kodlu plakanın tek tek kuyularına aktarın ve oda sıcaklığında bir saat kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, 200 mikrolitre yıkama tamponu ile tabağı üç kez yıkayın.Fare anti-rat Cd4d3+4 IgG 100 mikrolitre ekleyin ve bir saat daha plaka kuluçka. Yıkıntıları tekrarlayın. Bir anti-fare alkali fosfataz conjugate 100 mikrolitre ekleyin ve bir saat oda sıcaklığında plaka bırakın.Daha sonra kuyuları üç kez yıkama tamponu ve bir kez de seyreltme tamponu ile yıkayın. P-nitrofenil fosfatı boya etanolin tamponunda mililitre başına bir miligramda hazırlayın ve her kuyuya 100 mikrolitre ekleyin. 15 dakikalık bir kuluçkadan sonra, emiciliğin her biri 405 nanometrede olduğunu ölçün.Tetrameroluşturmak için uygun seyreltme faktörü olarak plaka üzerinde sinyal bulunmayan minimum seyreltme kullanın. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübate streptavidin-PE ve uygun biyotinylated protein seyreltme. Daha sonra konjuge proteinleri, daha fazla kullanıma kadar dört derece santigrat derecede ışık korumalı bir tüpte saklayın.Konik tüpleri tedavi edilen ve kontrol numuneleri ile 200 kez G'de beş dakika döndürün. Supernatant çıkarın ve daha sonra kullanmak için eksi 20 santigrat derece tüplerden birini dondurun. 1% BSA ile PBS 10 mililitre diğer tüp pelet yeniden askıya ve 96-iyi plaka üzerinde negatif kontrol olarak hücrelerin 100 mikrolitre bir kenara koyun.Daha sonra konik tüp ve 96-iyi plaka hücre süspansiyon için önceden konjuge rekombinant protein ekleyin. Hücre boyama yı en az bir saat boyunca dört santigrat derecede nazik bir rotasyonla tezgah üstü rotorüzerinde gerçekleştirin. Daha sonra hücreleri 200 kez G'de beş dakika boyunca peletleyin ve süpernatantı çıkarın.Hücreleri iki kez yıkadıktan sonra, beş mililitre PBS ile tekrar askıya alın. Hücre kümelerini kaldırmak için hücreleri 30 mikrometrelik bir süzgeçten geçirin. O zaman onları bir akış Sodor ile analiz et.BFP pozitif ve PE negatif hücreler için negatif kontrol örneğini kapıya kullanın. Daha sonra numuneyi sıralayın ve 1,5 mililitrelik bir santrifüj tüpüne 500,000 ila 1 milyon BFP pozitif ve PE negatif hücre toplayın. Boğaz kafesi hücrelerin proteine bağlanmasına bağlıdır, ancak normalde PE negatif örneklerin %1-5'i toplanır.Şimdi beş dakika için 500 kez G santrifüj tarafından sıralanmış hücreleri izin, sonra dikkatle supernatant kaldırın. Pelet eksi 20 santigrat derecede altı aya kadar saklanabilir. Sıralanmamış ve sıralanmış popülasyondan ham sayım dosyası verecek olan başvuru kitaplığıiçin dizileri eşlemek için büyünün sayı işlevini kullanın.Sıralanmamış kontrol örneğinden ham sayımları kontrol olarak ve sıralamalı örnekten alınan sayıları tedavi olarak kullanarak büyünün test işlevini çalıştırın. Oluşturulan gen özeti dosyasını açın ve duraklatma sırası sütununa artan sırada sıralayın. Ardından isabetleri 0,05 noktasından daha az bir yanlış bulma oranıyla tanımlayın.Reseptör genellikle ilk pozisyonda yüksek sıklıkta sıralanır. Son olarak pozitif seçim için sağlam sıralama algoritması puanı çizmek için R veya eşdeğer bir yazılım kullanın. İnsan TNFSF9 ve P falciparum veya H5 insan TNFSF9 ve P falciparum Rh5'in bağlayıcı partnerinin tanımlanması için genom ölçeği nakavt ekranlar sırasıyla NCI-SNU-1 ve HEC-293 hücrelerinde yapıldı.Rh5'in bağlanma davranışı hem heparan sülfattan etkilenmiş hem de bilinen reseptör BSG'dir, TN-FRSF-9 ise bilinen reseptörü TN-FSF-9'a bağlanmayı kaybetmemiş. Çözünür heparin ile kuluçka öncesi üzerine. Kontrol mutant kütüphanesindeki GNA dağılımı, kütüphane karmaşıklığının deney boyunca korundu.Ekranların teknik kalitesi, g-rna'nın temel olmayan genlerin referans kümesini hedeflemesinde gözlenen kıvrım değişikliklerinin dağılımı incelenerek, temel genlerin bir referans kümesinin dağılımına göre değerlendirildi. Buna ek olarak, yol düzeyi zenginleştirme beklenen temel yollar tespit edildi ve önemli ölçüde açılan nüfus zenginleştirilmiş ortaya koymuştur. Kontrol örneğini orijinal plazmid kitaplığıyla karşılaştırırken.Sağlam sıralama algoritması veya RRA-skoru, G-RNA'ların sürekli olarak beklenenden daha yüksek sıralandığı bir ölçü sağlar. TNFRSF9 için ekranda, üst hit Bilinen bir bağlama ortağı olan TNFSF9 oldu. Buna ek olarak, TP53 yolu ile ilgili genlerin bir dizi de tespit edilmiştir.RH5 durumunda, bilinen reseptöre ek olarak, ve sülfatlı gags üretimi için gerekli gen, SLC16A1 geni de tespit edildi. Tarama yaklaşımı genellikle çok sağlamdır ve doğrudan etkileşen reseptör, bu popülasyon sırasına göre zenginleştirilmiş genler listesinde yüksek derecelerde yer almalıdır. Ekrandan elde edilen vuruşları doğrulamak çok önemlidir.Etkileşim proteinler aracılığı ile, ikili Protein Protein etkileşimleri çalışmak için tasarlanmış biyokimyasal yaklaşımlar, örneğin, daha fazla doğrulama çalışmaları için kullanılabilir. Bu yaklaşımın tarafsız genom ölçeğidoğası nedeniyle, lipidler, multipass membran proteinleri ve glikanlar gibi hücre moleküllerinin incelenmesizor etkileşimleri keşfetmek yardımcı olacağını tahmin ediyoruz. Ayrıca reseptör ticareti ve biyoloji için gerekli yeni yollar ortaya çıkarabilir.

cell-surface-receptor-identification-using-genome-scale-crisprcas9

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Floresan polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) jel elektroforezi kılcal çiftler burada tarif edilen genotipleme tekniği, nükleaz aracılı nakavt klonları yüksek verimli genotipleme için izin verir. Diğer Genotipleme teknikleri karşılaştığı sınırlamaları ortadan ve dizileme yöntemleri maliyet açısından daha etkilidir.

CRISPR genotipine bir Floresan PCR kılcal jel elektroforezi Tekniği / yüksek verimli bir Format Nakavt Mutants Cas9 aracılı

Bu iletişim kuralını tasarlayın ve çoğaltılmış arttırıcılar deactivating füzyon protein SID4X-dCas9-KRAB, olarak da bilinen artırıcı girişim (Enhancer-i) ile hedefleme gerçekleştirmek için gereken adımları açıklar. Bu iletişim kuralı gen ekspresyonu düzenleyen arttırıcılar tanımlaması sağlar ve ortak bir hedef geni düzenleyen arttırıcılar arasındaki ilişkileri diseksiyon kolaylaştırır.

Diseksiyon artırıcı işlevi hücre hatlarında Multiplex artırıcı CRISPR tabanlı girişim kullanma

Burada, CRISPR-Cas9-hedefi faaliyeti kaybı olmadan daha yüksek bir özgüllüğü elde etmek için en iyi duruma getirmek için bir protokol mevcut. Keskin nişancı-ekran denilen bir yönlendirilmiş evrim yaklaşım istenen özelliklere sahip bir mutant Cas9 bulmak için kullanın. Keskin nişancı-Cas9 kesilmiş tek-Kılavuzu RNA'lar ve teslimat Ribonükleoprotein biçiminde, daha yüksek özelliklerine ulaşmak için iyi bilinen stratejileri ile uyumludur.

Keskin nişancı-Cas9 CRISPR-Cas9 hedef olarak faaliyet yönlendirilmiş evrim yoluyla kaybı olmadan hedef kapalı etkilerini en aza indirmek için kullanma

CRISPR/sgRNA Kütüphane protein kodlayıcı genlerin sorguya için uygulanmıştır. Ancak, işlev bir CTCF sınır gen düzenlemesi içinde ortaya çıkarmak için bir sgRNA kitaplığı fizibilite keşfedilmemiş kalır. Burada, CTCF sınırları içinde HOX loci fonksiyon aydınlatmak için HOX loci belirli sgRNA Kütüphane açıklayın.

HOX Loci odaklı CRISPR/sgRNA Kütüphane eleme tanımlayan kritik CTCF sınırları

CRISPR-Cas9 teknolojisi, memeli lerin genomunu herhangi bir hücre tipinde tam olarak dizmek için etkili bir yöntem sağlar ve genom çapında genetik ekranlar gerçekleştirmek için yeni bir araç tır. Havuzlu genom genişliğindeCRISPR-Cas9 ekranlarının başarılı bir şekilde performans alabildikleri adımları tartışan ayrıntılı bir protokol burada verilmiştir.

Memeli Hücrelerinde Havuzlu CRISPR Tabanlı Genetik Ekranlar

AviTag-spesifik Konum Kısıtlı Aydınlatma Takviyeli Biyotinilasyon (ALIBi), ribozom popülasyonlarının etiketlenmesi ve afinite-affinite-arındırıcı olarak arındırılması amacıyla geliştirilen, sonraki dizileme ve proteomik analiz için geliştirilen yeni bir optogenetik olarak aktive edilmiş yöntemdir.

Rekombinant Peptit Etiketine Özgü Konum Kısıtlı Aydınlatma Güçlendirilmiş Biyotinilasyona Dayalı Subhücresel Ribozom Alt Popülasyonlarının İzolasyonu

CRISPR gibi teknolojilerin önündeki önemli bir engel, hayati genleri bozabilecek hedef dışı olaylardır. 'Dizileme ile Bölünme Etkilerinin İn Vitro Raporlaması için Döngüselleştirme' (CIRCLE-seq), istenmeyen bölünme bölgelerini belirlemek için tasarlanmış bir tekniktir. Bu yöntem, CRISPR-Cas9'un genom çapındaki aktivitesini yüksek hassasiyetle ve önyargısız olarak haritalandırır.

Hedef Dışı Gen Düzenlemenin Sorgulanması için CIRCLE-Seq

Makale, sağlıklı donör kimerik antijen reseptörü T hücrelerinde genom çapında bir CRISPR nakavt ekranını tamamlamak için tükenme için bir in vitro modelin uygulanması için bir protokolü açıklamaktadır.

Kimerik Antijen Reseptörü T Hücrelerinde İn Vitro Genom Çapında CRISPR Nakavt Taraması Gerçekleştirme

Burada, hematopoietik kök ve progenitör hücrelerin anormal proliferatif kapasitesi için çok önemli olan aday genleri tanımlamak için CRISPR / Cas9 teknolojisini Hücre Sayma Kiti-8 (CCK-8) testi ile entegre eden bir protokol sunuyoruz.

Hematopoetik Kök ve Progenitör Hücrelerin Anormal Büyüme ile İlgili Genlerinin CRISPR/Cas9 Teknolojisi ile Hücre Sayımı ile Birleştirilerek Değerlendirilmesi

Genom çapında bir CRISPR / Cas9 tarama yönteminin uygulanması yoluyla dirençli ve hassas radyasyon genlerini seçmek için titiz ve yapılandırılmış bir yaklaşım verilmiştir. Bu protokol aynı zamanda klinik olarak uygulanan kimyasal ilaçlara direnç mekanizmalarını araştıran diğer araştırma çabaları için çok yönlü bir çerçeve olarak hizmet etme potansiyeline sahiptir.

Radyosensitif ve radyodirençli genleri ortaya çıkarmak için genom çapında CRISPR ekranı

Birincil CAR T hücreleri için optimize edilmiş bir CRISPR-Cas9 knockout tarama protokolü geliştirdik. Enzimatik sindirim ve sgRNA kaseti çekilmesiyle gDNA taşınmasını azaltarak, bu yaklaşım PCR artefaktlarını en aza indirerek doğru sgRNA tespitini ve fonksiyonel gen hedeflerinin sağlam tanımlanmasını sağlar.

CAR T Hücrelerinde CRISPR-Cas9 Ekranlarının İyileştirmesi: Kütüphane Hazırlığı için Geliştirilmiş Bir Yöntem

Öğrenin, CRISPR/Cas9 genetik tarama ile hücre yüzeyi reseptör-ligand etkileşimlerini belirleme yöntemini. Bu yüksek verimli protokol, önyargısız tanımlama sağlar ve terapötik geliştirme için önemli uygulamalar sunar.

Genom ÖlçeğiCRISPR/Cas9 Genetik Ekranlar Kullanılarak Hücre Yüzey Reseptör Tanımlama

Daha fazla video keşfet