Name: Diş Hamuru Parakrin Sinyalleri yanıt olarak Neurite Outgrowth Çalışma Co-Kültür Yöntemi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Öğrenin diş hamuru hücreleri ile trigeminal ganglion nöronlarının ko-kültür yöntemini. Bu teknik, diş inervasyonu ve nöral onarım mekanizmalarını incelemek için sağlam bir platform sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma a) Ulusal Sağlık Enstitüleri/NIAMS (rs'ye R01 AR062507 ve R01 AR053860, b) Alabama Üniversitesi Birmingham Diş Akademik Araştırma Eğitimi (DART) hibe (sayı T90DE022736 (PI MacDougall)) tarafından Desteklenmiştir. c) Bir UAB Küresel Merkezi Kraniyofasiyal, Ağız ve Diş Bozuklukları (GC-KODLU) Pilot ve Fizibilite hibe SBP ve d) Ulusal Diş ve Kraniyofasiyal Enstitüsü Araştırma / Ulusal Sağlık Enstitüleri K99 DE024406 SBP hibe.

Farelerle yapılan tüm deneyler UAB Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
1. Plaka Hazırlama
NOT: Coverslips, tayın sonundaDP hücrelerini görüntülemek için kullanılabilir. Numune işleme sırasında kontaminasyonu önlemek için steril doku kültürü başlığının dışındaki tüm kuluçka ve durulama basamaklarında plaka kapağının açık olduğundan emin olun.
<ol><li>
Coverslip hazırlama
	<ol>
<li>Otoklav dairesel kapakları.</li>
		<li>Ultra saf suyu kaputun altına süzün.</li>
		<li>Kapakları 24 kuyulu bir tabağa aktarın ve her birini 0,1 mg/mL poli-D-lizin 400 μL ile kaplayın.</li>
		<li>Coverlips emmek için izin verin, 5 dakika batırılmış, bir rocker üzerinde 12 rpm veya orbital shaker 40-50 rpm. Kontaminasyonu önlemek için kapağın üzerinde olduğundan emin olun.</li>
		<li>12 rpm veya shaker bir rocker üzerinde yaklaşık 5 dakika boyunca filtre ultrasaf su ile kapakları durulayın 50 rpm. Tekrar.</li>
		<li>Kapak kapaklarının kaputun altında en az 2 saat kurumasını bekleyin ve plaka kapağı kapalı buharlaşmayı kolaylaştırın. Bu kapaklar 48 saat içinde kullanılmalıdır.</li>
		<li>İmmünofloresans için yapılan tayın sonunda coverslips ve proses üzerine tohum DP hücreleri (bölüm 3.3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kaplama filtreleri
	<ol>
<li>Laminanın 10 μg/mL'ye seyreltilmesi. Seyreltilmiş laminin kaputun altına süzün.</li>
		<li>Pipet 450-500 μL 10 μg/mL laminin 24 kuyunun her kuyuiçine.</li>
		<li>Transwell filtresini, 3 μm gözenekliliği, laminin çözeltisi ile temas etmesi için bir kuyuya yerleştirin ve 2 saat veya gece boyunca 37 °C'lik bir kuluçka makinesinde bırakın. Filtre gözenekleri, çözeltinin bir kısmının filtrenin hem üst hem de alt kısmını dağıtmasına ve kaplamasına izin vermelidir. Bu filtreler 48 saat içinde kullanılmalı veya 4 °C'de 1 haftaya kadar buzdolabında bekletilmelidir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. İsteğe Bağlı Genetik Manipülasyon ile Hücre Kaplaması
<ol><li>Fareler: Mezenkimal-nöronal etkileşimleri incelemek için DP hücrelerinin genetik değişimi yapılabilir (ancak gerekli değildir). Önerilen genetik varyasyonlar için bölüm 2.3 ve 2.4'e bakın.</li>
	<li>DP diseksiyonu, dağılım ve kaplama (Şekil 1) NOT: DP diseksiyonu için ultra ince, düz kenarlı forseps kullanın. Ultra ince kenarlar, kullanıcının mineralize yapı ile DP dokusu arasındaki forcep kenarını sıkıştırmasını sağlar.<ol><li>Hasat P5-P8 fareler. Bu aşamada dişler mineralleşmeli ve kök açık olmalıdır.</li>
		<li>Neonatları hipotermi yoluyla, 4 °C'lik buzdolabında ki bir tabağa yerleştirerek, dokunmaya devam edene kadar anestezi edin. Belirlenen tesiste ki Yoğun Bakım Ünitesi prosedürlerine uygun olarak ve kafa kesme ile nötralar.</li>
		<li>Her fareden DP toplamak için 50 mL konik tüpte %0,25 tripsin-EDTA'dan oluşan 3-5 mL aliquot hazırlayın. Bu doğum sonrası farelerdiş hamuru sindirimini kolaylaştıracaktır. 10'dan fazla doğum sonrası fareden doku sindiriyorsanız 3 mL'den fazla kullanın.</li>
		<li>Ağzı tavana doğru ve boyun tabanı çalışma yüzeyinde düz olacak şekilde tek kullanımlık bir alt lık üzerine baş yerleştirin. Mandibulayı maksilladan ayırmak için testere hareketiyle jilet kullanın.</li>
		<li>İsteğe bağlı olarak azı azı nalerine daha kolay erişim sağlamak için dili makasla veya çömleçlerle çıkarın.</li>
		<li>Açılan başı steril bir gazlı bez yastığının üzerine bir tabağa yerleştirin ve numuneyi bir kesme mikroskobunun altına yerleştirin(Şekil 1D).</li>
		<li>İlk azı döşeylerini çevreleyen alveoler kemik dokusunu çıkarın. Submandibular dişler bu noktada tam olarak patlak vermez. Alveolar açılım içine forceps yerleştirin ve ağız bukcal (yanak) veya lingual (dil) tarafına doğru diş uzak doku kızdırmak. Maksiller dişler pozlama ve çıkarılması için diş etrafında yarık tam kaldırılmasını gerektirir.</li>
		<li>Submandibular ve maksiller ilk azı döşeylerini (M1s) 1x fosfat tamponlu salin (PBS) içeren ayrı bir hücre kültür yemeğine yavaşça aktarın.</li>
		<li>Tüm M1'ler toplanana kadar 2.2.4-2.2.8'i tekrarlayın. Hasat sırasında buz üzerinde M1s içeren çanak tutun.</li>
		<li>Her M1'in dışını çevreleyen Emaye Dış Organını (EOE) çıkarın. Bu alternatif olarak adım 2.2.11 sonra yapılabilir.</li>
		<li>Bir set ile M1'i döndürün, böylece tepeler inin ve açık kök açıkta kalır. Dişin alt kısmında oval bir açıklık ve ince bir dentin ve mine tabakası ile kapsüllenmiş opak DP dokusu olacaktır.</li>
		<li>Forceps ucu nu kullanarak, mineralize dokunun iç çevresi etrafında forceps bir kol çalıştırarak DP yavaşça gevşetin. DP dokusunu mineralize yapıdan çıkarın ve 1x PBS içeren üçüncü bir tabağa aktarın. EOE'yi zaten ayrılmamışsa çıkarın(Şekil 1E).</li>
		<li>50 mL konik tüpte tüm DP dokusunu %0.25 tripsin-EDTA'ya aktarın. Girdap karışımı ve 10 dakika boyunca 37 ° C ılık su banyosu yer. Bu aynı forceps veya uzun, şişe forceps ile yapılabilir. Doku dağıtmak zor olacak ve her 3-4 dakika girdap gerektirecektir. Tripsin hücre zarlarına zarar verebileceğinden 10 dk trypsinizasyonu geçmeyin.</li>
		<li>Steril bir başlık altında, enzimin inaktive etmek için en az 1:1 medya son oranına ısınmış co-kültür medya(Tablo 1)ekleyin. Daha fazla doku dağılımı isteniyorsa daha büyük oranlar kabul edilebilir.</li>
		<li>Pipet, DP'yi medyada daha fazla dağıtmak için 10 mL'lik pipetle medyayı birden çok kez yukarı ve aşağı doğru çevirin. Büyük kabarcıklar önlemek için dikkatli olun. Tam dağılım neredeyse doku yapışkan doğası nedeniyle mümkün değildir. Ancak, hücreler bir kez kaplanmış doku dan dışa doğru göç edecek çünkü de gerekli değildir.</li>
		<li>Dağılmış DP'nin 1 mL'sini 24 kuyulu doku kültür plakasının her kuyuya aktarımı(Şekil 1F).</li>
		<li></ol></li><li><ol><li> </li><li> <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60809/60809equ01.jpg"></li><li><li></li><li></ol></li><li> <ol><li><li><li></li><li><li><li><li></li><li><li><li><li></li><li><li><li></li><li><li><li><li></li><li><li></ol></li></ol><ol><li><ol><li><li></li><li><li><li><li><li><li> </li><li><li><li> </li><li><li> </li></ol></li><li><ol><li><li><li></ol></li><li><ol><li><li></ol></li></ol>

<ol><li>Moe, K., Sijaona, A., Shrestha, A., Kettunen, P., Taniguchi, M., Luukko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semaphorin+3A+controls+timing+and+patterning+of+the+dental+pulp+innervation%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Semaphorin 3A controls timing and patterning of the dental pulp innervation.</a> Differentiation. 84 (5), 371-379 (2012).</li>
<li>Kollar, E. J., Lumsden, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tooth+morphogenesis%3A+the+role+of+the+innervation+during+induction+and+pattern+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+de+biologie+buccale%22%5BJournal%5D)">Tooth morphogenesis: the role of the innervation during induction and pattern formation.</a> Journal de biologie buccale. 7 (1), 49-60 (1979).</li>
<li>Lillesaar, C., Fried, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurites+from+trigeminal+ganglion+explants+grown+in+vitro+are+repelled+or+attracted+by+tooth-related+tissues+depending+on+developmental+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurites from trigeminal ganglion explants grown in vitro are repelled or attracted by tooth-related tissues depending on developmental stage.</a> Neuroscience. 125 (1), 149-161 (2004).</li>
<li>Fried, K., Lillesaar, C., Sime, W., Kaukua, N., Patarroyo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+finding+of+pain+nerve+fibers%3A+Neural+growth+mechanisms+in+the+tooth+pulp%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%26+Behavior%22%5BJournal%5D)">Target finding of pain nerve fibers: Neural growth mechanisms in the tooth pulp.</a> Physiology & Behavior. 92 (1-2), 40-45 (2007).</li>
<li>Pagella, P., Jiménez-Rojo, L., Mitsiadis, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+innervation+in+developing+and+regenerating+orofacial+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Roles of innervation in developing and regenerating orofacial tissues.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (12), 2241-2251 (2014).</li>
<li>Luukko, K., Kettunen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+tooth+morphogenesis+and+innervation+by+local+tissue+interactions%2C+signaling+networks%2C+and+semaphorin+3A%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adhesion+%26+Migration%22%5BJournal%5D)">Integration of tooth morphogenesis and innervation by local tissue interactions, signaling networks, and semaphorin 3A.</a> Cell Adhesion & Migration. , 1-9 (2016).</li>
<li>Smit, M., Leng, J., Klemke, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+for+neurite+outgrowth+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Assay for neurite outgrowth quantification.</a> BioTechniques. 35 (2), 254-256 (2003).</li>
<li>de Almeida, J. F. A., Chen, P., Henry, M. A., Diogenes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+of+the+apical+papilla+regulate+trigeminal+neurite+outgrowth+and+targeting+through+a+BDNF-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Stem cells of the apical papilla regulate trigeminal neurite outgrowth and targeting through a BDNF-dependent mechanism.</a> Tissue engineering. Part A. 20 (23-24), 3089-3100 (2014).</li>
<li>Pagella, P., Miran, S., Mitsiadis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Developing+Tooth+Germ+Innervation+Using+Microfluidic+Co-culture+Devices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices.</a> Journal of Visualized Experiments. (102), e53114(2015).</li>
<li>Coelen, R. J., Jose, D. G., May, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+hexadimethrine+bromide+%28polybrene%29+on+the+infection+of+the+primate+retroviruses+SSV+1%2FSSAV+1+and+BaEV%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Virology%22%5BJournal%5D)">The effect of hexadimethrine bromide (polybrene) on the infection of the primate retroviruses SSV 1/SSAV 1 and BaEV.</a> Archives of Virology. 75 (4), 307-311 (1983).</li>
<li>Caroni, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+growth-associated+proteins+in+the+neurons+of+adult+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience+methods%22%5BJournal%5D)">Overexpression of growth-associated proteins in the neurons of adult transgenic mice.</a> Journal of neuroscience methods. 71 (1), 3-9 (1997).</li>
<li>Alić, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+from+mouse+strain+Thy1+YFP-16+are+a+valuable+tool+to+monitor+and+evaluate+neuronal+differentiation+and+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells from mouse strain Thy1 YFP-16 are a valuable tool to monitor and evaluate neuronal differentiation and morphology.</a> Neuroscience Letters. 634, 32-41 (2016).</li>
<li>Howroyd, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+the+Trigeminal+Ganglion+of+Nonrodent+Species+Used+in+Toxicology+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Dissection of the Trigeminal Ganglion of Nonrodent Species Used in Toxicology Studies.</a> Toxicologic Pathology. , (2019).</li>
<li>Schwieger, J., Esser, K. H., Lenarz, T., Scheper, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+long-term+spiral+ganglion+neuron+culture+with+reduced+glial+cell+number%3A+Effects+of+AraC+on+cell+composition+and+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Establishment of a long-term spiral ganglion neuron culture with reduced glial cell number: Effects of AraC on cell composition and neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 268, 106-116 (2016).</li>
<li>Liu, R., Lin, G., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Efficient+Method+for+Dorsal+Root+Ganglia+Neurons+Purification+with+a+One-Time+Anti-Mitotic+Reagent+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">An Efficient Method for Dorsal Root Ganglia Neurons Purification with a One-Time Anti-Mitotic Reagent Treatment.</a> PLoS ONE. 8 (4), 60558(2013).</li>
<li>Burry, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimitotic+drugs+that+enhance+neuronal+survival+in+olfactory+bulb+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Antimitotic drugs that enhance neuronal survival in olfactory bulb cell cultures.</a> Brain Research. 261 (2), 261-275 (1983).</li>
<li>Katzenell, S., Cabrera, J. R., North, B. J., Leib, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+Purification%2C+and+Culture+of+Primary+Murine+Sensory+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Isolation, Purification, and Culture of Primary Murine Sensory Neurons.</a> Methods in molecular biology. 1656, Clifton, N.J. 229-251 (2017).</li>
<li>Dussor, G. O., Price, T. J., Flores, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activating+transcription+factor+3+mRNA+is+upregulated+in+primary+cultures+of+trigeminal+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Activating transcription factor 3 mRNA is upregulated in primary cultures of trigeminal ganglion neurons.</a> Molecular Brain Research. 118 (1-2), 156-159 (2003).</li>
<li>Lillesaar, C., Arenas, E., Hildebrand, C., Fried, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+of+rat+trigeminal+neurones+to+dental+pulp+cells+or+fibroblasts+overexpressing+neurotrophic+factors+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Responses of rat trigeminal neurones to dental pulp cells or fibroblasts overexpressing neurotrophic factors in vitro.</a> Neuroscience. 119 (2), 443-451 (2003).</li>
<li>Lillesaar, C., Eriksson, C., Fried, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+tooth+pulp+cells+elicit+neurite+growth+from+trigeminal+neurones+and+express+mRNAs+for+neurotrophic+factors+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Rat tooth pulp cells elicit neurite growth from trigeminal neurones and express mRNAs for neurotrophic factors in vitro.</a> Neuroscience Letters. 308 (3), (2001).</li>
<li>Lillesaar, C., Eriksson, C., Johansson, C. S., Fried, K., Hildebrand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tooth+pulp+tissue+promotes+neurite+outgrowth+from+rat+trigeminal+ganglia+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurocytology%22%5BJournal%5D)">Tooth pulp tissue promotes neurite outgrowth from rat trigeminal ganglia in vitro.</a> Journal of neurocytology. 28 (8), 663-670 (1999).</li>
<li>Chmilewsky, F., Ayaz, W., Appiah, J., About, I., Chung, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+Growth+Factor+Secretion+From+Pulp+Fibroblasts+is+Modulated+by+Complement+C5a+Receptor+and+Implied+in+Neurite+Outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Nerve Growth Factor Secretion From Pulp Fibroblasts is Modulated by Complement C5a Receptor and Implied in Neurite Outgrowth.</a> Scientific reports. 6, 31799(2016).</li>
<li>Pagella, P., Neto, E., JimÃ©nez-Rojo, L., Lamghari, M., Mitsiadis, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+co-culture+systems+for+studying+tooth+innervation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Microfluidics co-culture systems for studying tooth innervation.</a> Frontiers in Physiology. 5, 326(2014).</li>
<li>Miura, T., Yokokawa, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+culture+on+a+chip%3A+Developmental+biology+applications+of+self-organized+capillary+networks+in+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Development%2C+Growth+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Tissue culture on a chip: Developmental biology applications of self-organized capillary networks in microfluidic devices.</a> Development, Growth & Differentiation. 58 (6), 505-515 (2016).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Ağız boşluğugünlük faaliyetleri dişlerin uygun kullanım ve bakım izin vermek için dış uyaranları ve iç iltihabı algılamak gerektirir. Ancak, diş innervasyonunun gelişim süreçlerini yönlendiren sinyallerle ilgili sadece sınırlı bilgi mevcuttur. Bu protokol, iki popülasyon arasındaki çapraz iletişimi incelemek için birincil DP hücrelerini ve TG nöronlarını izole etmek ve birlikte kültüre getirmek için bir yöntem sağlar. Çeşitli değişkenler optimize edildi ve aşağıda açıklandığı gibi, araştırma nın diğer yollarını açık bıra...

Diş innervasyonu dişlerin basınç, sıcaklık ve iltihabı algılamasını sağlar, bunların hepsi diş organının kullanımı ve bakımı için çok önemlidir. Diş çürükleri ve travma ile ilişkili diş ağrısı hissedilmemesi hastalığın ilerlemesine yol açar. Böylece, uygun innervasyon normal diş büyümesi, fonksiyon ve bakım için bir gerekliliktir.
Çoğu organ tamamen işlevsel ve doğum zamanı ile innerve iken, diş gelişimi yetişkin yaşam içine uzanır, diş innervasyonu ve mineralizasyon sonrası aşamalarında meydana gelen ile1,2. İlginçtir, diş hamuru (DP) mezenchyme başlangıçta gelişmekte olan diş organıiçine akson girişini önlemek için embriyogenez sırasında itici sinyalleri salgılar, hangi daha sonra diş patlaması yakın olarak çekici faktörlerin salgısına geçer3,4. Doğum sonrası evrelerde, trigeminal (TG) sinirinden gelen afferent aksonlar, dentin birikiminin başladığı zaman dişin içine ve her zamanına nüfuz eder (Pagella, P. ve ark.5'tegözden geçirilir). Vivo çalışmalarda çeşitli nöronal-mezenkimal etkileşimler farelerde diş innervasyonu kılavuzu göstermiştir (Luukko gözden, K. veark. 6),ama moleküler mekanizmaların birkaç ayrıntı mevcuttur.
Hücre ortak kültürleri, araştırmacıların nöronal ve mezenkimal popülasyonlar arasındaki etkileşimleri manipüle edebildiği kontrollü ortamlar sağlar. Ortak kültür deneyleri, diş innervasyonu ve gelişimine rehberlik eden sinyal yollarının daha derinlerine dalmamayı mümkün kılar. Ancak, ortak kültürdeki hücreleri incelemek için kullanılan geleneksel yöntemlerin bir çoğu teknik zorluklar sunmaktadır. Örneğin, neurite büyüme kristal mor boyama non-özel TG demet dağılımları dahil Schwann hücreleri leke olabilir, ve nispeten küçük tepkiler ile renk yoğunluğu zirveleri olabilir7. Mikroakışkan odaları cazip bir seçenek sunuyoruz, ancak transwellfiltreler 8,9 ve sadece DP salgıları nöronal tepkilerin araştırılmasına izin çok daha pahalıdır. Bu sorunları ele almak için, bir protokol geliştirdik: a) DP salgılarına yanıt olarak TG neurite outgrowth kesin boyama ve görüntüleme, b) DP hücreleri ve / veya TG nöronlar genetik modifikasyonbelirli sinyal yollarını araştırmak için, ve c) TG nöronlar tarafından salgılanan faktörlere DP hücre yanıtlarının araştırılması. Bu protokol, bir in vitro co-kültür testin kontrollü ortamında diş innervasyonunun çeşitli özelliklerini tam olarak araştırma olanağı sağlar.

<table><tbody><tr><td>5-Floro-2'-deoksiüridin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503</td><td>15 & mu'da mitotik İnhibitör olarak kullanılır; Ko-kültür ortamında M konsantrasyonu, Gün 2</td></tr><tr><td>24 Kuyu Hücre Kültürü Plakası</td><td>Corning</td><td>3524</td><td>Ko-kültür plakası</td></tr><tr><td>Alexa-546 anti-tavuk</td><td>Invitrogen</td><td>A-11040</td><td>Anti-GFP antikoru ile etiketlenmiş leke nörit büyümesine ikincil, 1:500 seyreltme</td></tr><tr><td>Anti-GFP Antikoru</td><td>Aves Lab, Inc</td><td>GFP-1010</td><td>Thy1-YFP nöronlarını etiketlemek için birincil antikor, 1:200 seyreltme</td></tr><tr><td>Anti-Nörofilament 200 antikor</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NO142</td><td>Nöronları etiketlemek için monoklonal birincil antikor, 1:1000 seyreltme, YFP fareleri mevcut değilse alternatif</td></tr><tr><td>B6; 129- Tgfbr2tm1Karl/J</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td>12603</td><td>Tgfbr2f/f optimize edilmiş protokol B6'da diş pulpası hücreleri için kullanılan fare modeli</td></tr><tr><td>. Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/J</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td>3709</td><td>Trigeminal nöronlar için kullanılan Thy1-YFP fare modeli genotipi</td></tr><tr><td>Kollajenaz Tip II</td><td>Millipore</td><td>234155-100MG</td><td>Trigeminal nöronları dağıtmak için kullanılır</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Gibco</td><td>10437</td><td>Ko-kültür ortamına katkı</td></tr> maddesi <tr><td>İnce forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11413-11</td><td>TG diseksiyonu için ince forseps</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td>, transwell eklerini 10 & mu'luk nihai konsantrasyonda kaplar; g / ml, stok çözeltisi 1.5 mg / ml'de varsayılır</td></tr><tr><td>Lizis Tamponu (Tampon RLT)</td> <td>Qiagen</td><td>79216</td><td>Ko-kültür sonrası diş pulpası hücrelerinden RNA'yı çıkarır</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td>Ko-kültür ortamına katkı maddesi</td></tr><tr><td>Mikro diseksiyon makası</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3146-1EA</td><td>Kafatasını açmak için diseksiyon makası</td></tr><tr><td>Mikroskop Kapağı Cam</td><td>Fisherbrand</td><td>12-545-81</td><td>İsteğe bağlı hücre kültürü ve immünofloresan işleme için dairesel lamel</td></tr><tr><td>Minimal Esansiyel Ortam bir</td><td>Gibco</td><td>12571063</td><td>Ko-kültür ortamı tabanı</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td>Ko-kültür ortamına antibiyotik katkı maddesi</td></tr><tr><td>Fosfataz İnhibitörü</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>04 906 837 001</td><td>RIPA Tamponuna Katkı Maddesi Diş pulpası hücrelerinden protein ekstrakte etmek için ko-kültür</td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td>Diş pulpası hücre transfeksiyonuna yardımcı olmak için kullanılır</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280</td><td>Diş pulpasının hücresel yapışmasına yardımcı olmak için lamel kaplama</td></tr><tr><td>Proteaz İnhibitörleri</td><td>Millipore</td><td>05 892 791 001</td><td>KO-kültür sonrası diş pulpası hücrelerinden protein ekstrakte etmek için RIPA Tamponuna katkı</td></tr> maddesi <tr><td>RNAse/DNAse içermeyen eppendorf tüpleri</td><td>Denville</td><td>C-2172</td> Test <td>sonunda RNA, DNA veya protein toplanması için önceden sterilize edilmiş 1.7 ml tüpler</td></tr><tr><td>ThinCert Hücre Kültürü Eki</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662631</td><td>Ko-kültür deneylerinde trigeminal nöronlar için transwell ekleri</td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA (%0.25)</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td>Diş pulpası hücrelerini dağıtmak için kullanılır</td></tr><tr><td>Tripsin Tip II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-7409</td><td>Dağıtmak için kullanılır trigeminal nöronlar</td></tr><tr><td>Ultra İnce Forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11370-40</td><td>Diseksiyon için ultra ince forseps</td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3750</td><td>1 & mu'da mitotik İnhibitör olarak kullanılır; Ko-kültür ortamında M konsantrasyonu, 2</td></tr>. <tr><td>Gün Vakum Filtrasyon Sistemi</td><td>Millipore</td><td>SCNY00060</td><td>Steriflip tek kullanımlık filtre, 50 & mu; m naylon net filtre</td></tr><tr><td>Flakon forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>110006-15</td><td>Koniklere doku transferi için uzun forseps</td></tr></tbody></table>

diş hamuru parakrin sinyalleri yanıt olarak neurite outgrowth Çalışma co-kültür yöntemi

A Co-Culture Method to Study Neurite Outgrowth in Response to Dental Pulp Paracrine Signals

Diş innervasyonu dişlerin basınç, sıcaklık ve iltihabı algılamasını sağlar, bunların hepsi diş organının kullanımı ve bakımı için çok önemlidir. Duyusal innervasyon olmadan, günlük oral aktiviteler onarılamaz hasara neden olur. Önemine rağmen, diş geliştirme ve bakım innervasyon rolleri büyük ölçüde göz ardı edilmiştir. Çeşitli çalışmalar DP hücrelerinin dişe ve diş boyunca TG aksonları çekmek ve yönlendirmek için hücre dışı matriks proteinleri ve parakrin sinyalleri salgıladığını göstermiştir. Ancak, birkaç çalışma DP mezenchyme ve nöronal afferents arasındaki çapraz konuşma içine ayrıntılı bir fikir sağlamıştır. Bilgideki bu boşluğu gidermek için araştırmacılar bu etkileşimleri araştırmak için ortak kültürleri ve çeşitli tekniklerden yararlanmaya başladılar. Burada, gözenekleri aracılığıyla aksonal büyüme sağlamak için büyük çaplı gözenekleri ile bir üstteki transwell filtre üzerinde dağınık TG nöronlar ile co-culturing birincil DP hücreleri dahil birden fazla adım göstermektedir. Adenovirüs-Cre-GFP rekombinaz sistemi kullanılarak gen delesini kolaylaştırmak için loxP bölgelerinin oluşturduğu ilgi genine sahip primer DP hücreleri kullanılmıştır. Thy1-YFP fareden TG nöronlar kullanarak hassas afferent görüntüleme için izin, konfokal mikroskopi ile arka plan seviyelerinin çok üzerinde ifade ile. DP yanıtları protein veya RNA toplama ve analizi yoluyla veya alternatif olarak çıkarılabilir cam kapaklar üzerine kaplanmış DP hücrelerinin immünofloresan boyama yoluyla araştırılabilir. Medya proteomik analizler gibi teknikler kullanılarak analiz edilebilir, ancak bu medyada fetal sığır serumunun varlığından dolayı albümin tükenmesini gerektirir. Bu protokol, tg nöronlarının ve DP hücrelerinin morfolojik, genetik ve sitosiskeleter yanıtlarını incelemek için manipüle edilebilen basit bir yöntem sağlar.

Bu sonuçlar, TG neurite monokültür kontrolüne göre altta yatan primer DP hücrelerinin varlığında TG neurite outgrowth'un arttığını göstermektedir(Şekil 2A,C). Neurite büyüme bazı tas-to-asa değişkenliği vardır. Böylece, bir TG nöron monokültür nörat büyüme bazal düzeylerini tespit etmek için bir kontrol olarak tüm tahliller dahil edilmelidir. Ad-Cre-GFP enfeksiyonu ve Ad-eGFP enfeksiyonu eşdeğer sayıda hücre olarak doğrulandıktan sonra bu protokolde Tgfbr2f/f fare...

Biz izolasyon, dağılım ve diş hamuru kaplama (DP) trigeminal ile birincil hücrelerin kaplama (TG) nöronlar üstteki transwell filtreleri üzerinde kültürlü. DP hücrelerinin hücresel yanıtları immünofloresan veya RNA/protein analizi ile analiz edilebilir. Konfokal mikroskopi ile nöronal belirteçlerin immünfloresansi neurite outgrowth yanıtlarının analizine izin verir.

Diş Hamuru Parakrin Sinyalleri yanıt olarak Neurite Outgrowth Çalışma Co-Kültür Yöntemi

Tooth innervation allows teeth to sense pressure, temperature and inflammation, all of which are crucial to the use and maintenance of the tooth organ. ...

Bu protokol trigeminal nöronlar ile birlikte diş hamuru kök hücreleri nasıl co-kültür ayrıntılı anahat sağlar. Bununla, onların çapraz konuşmaları tarafından yönlendirilen birden fazla yanıtı araştırabiliriz. Bu tekniğin en büyük avantajı, hücre popülasyonlarını veya her ikisini de inceleyip manipüle edebilme ve sonuçları tam olarak ölçebilme yeteneğidir.Bu yöntem nöral araştırmalara doğrudan ilgi vardır ve diş posası kök hücrelerinin travmatik olaylar veya nörodejeneratif hastalıklardan zarar gören nöral dokuları nasıl onardığı üzerine araştırmalara ışık verebilir. Bu tekniğin öğrenmesi gereken birkaç aşama vardır ve hepsini uzak tutmak zor olabilir. Bu protokol bu işe yardımcı olmak için her aşamayı ayrıntılarıyla anlatır.Diş hamuru ve ganglia dağıtmak zordur ve çeşitli girdap ve pipetleme gerektirir. O zaman bile optimizasyon ve çoğaltma gerekli olacak bu yüzden tam dağılım almasanız. Farenin ötenazisinden sonra, ağzı tavana doğru ve boyun tabanı çalışma yüzeyinde düz olacak şekilde tek kullanımlık alt lık üzerine baş yerleştirin.Mandibulayı maksilladan ayırmak için jilet ve testere hareketi kullanın. Azı dlarına daha kolay erişim sağlamak için dili makasla veya çömleğiyle çıkar

a-co-culture-method-to-study-neurite-outgrowth-response-to-dental

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Biz civciv E4 statoacoustic ganglion ve E6 omurilik eksplantlar incelemek ve kültürüne nasıl gösterilmektedir. Eksplantlarındaki 24 saat için 3D kollajen jel serum serbest koşullar altında kültüre. Neurite yanıt büyüme faktörü desteği orta ve protein kaplı boncuklar ile test edilir.

Diseksiyon ve Chick Statoacoustic Ganglion ve Kollajen Jeller Omurilik eksplantlar Kültür Neurite akıbet Tahliller

Yöntemi kullanarak insan dental pulpa kök hücrelerinin (hDPSCs) izolasyonu ve karakterizasyonu...

İnsan Diş Pulp Kök Hücre İzolasyonu, Karakterizasyonu ve Karşılaştırmalı Farklılaşma İki Farklı Yöntemler Kullanılarak Daimi Dişler türetilen

Bu videoda, bir transwell filtresi kullanarak trigeminal nöronların ve birincil diş pulpası hücrelerinin ko-kültürünü oluşturmak için bir teknik gösterilmektedir. Fiziksel olarak ayrılmış bu durumda, diş pulpası dokusundan elde edilen mezenkimal hücreler, gözeneklerden geçen parakrin sinyal molekülleri salgılar ve nöronların mezenkimal hücrelere doğru farklılaşmasını ve göçünü teşvik ederek bir ko-kültür sistemi oluşturur.

Çapraz iletişim için dental pulpa hücreleri ve trigeminal nöronların ortak kültürünün oluşturulması

Bu video, diş germ pulpası ve trigeminal gangliyonlar arasındaki etkileşimleri incelemek için mikroakışkan bir cihazın kullanımını göstermektedir. Dokuların mikroakışkan cihazın içine yerleştirilmesini gösterir ve cihazın mikro olukları aracılığıyla diş germine doğru trigeminal nörit büyümesinin ayrıntılı bir görselleştirmesini sağlar. Ek olarak, dişten türetilen moleküler faktörlerin, doğum sonrası diş innervasyonunu verimli bir şekilde sağlamak için çok önemli olan diş germ pulpasına nörit...

Diş Germi ve Trigeminal Gangliyon Etkileşimlerinin Mikroakışkan Ko-Kültür Sistemi Kullanılarak Analiz Edilmesi

Dorsal kök gangliyon (DRG), periferal sinir sisteminin duyusal nöronlar ihtiva eden yapılardır. Ayrışmış zaman, yaralanma yerinde in vivo ortamda taklit in vitro sinir rejenerasyonu ve miyelin incelemek için değerli bir model sağlayan, Güney Carolina gibi yağ elde edilen kök hücreleri (ASC) ile birlikte kültürlenebilir.

Kök Ganglia Nöronlar ve Farklılaştırılmış Yağ-türetilmiş Kök Hücreler Dorsal: bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; Co-kültür Modeli Periferik Sinir Rejenerasyon Eğitim

Ko-kültürler, sinirler ile hedef doku ve organlar arasındaki etkileşimleri incelemek için değerli bir yöntemi temsil eder. Mikroakışkan sistemler, gangliyonların ve tüm gelişmekte olan organların veya dokuların farklı kültür ortamlarında birlikte kültürlenmesine izin verir, böylece nöronlar ve hedefleri arasındaki karışmanın in vitro çalışması için değerli bir araçtır.

Mikroakışkan Co-kültür Aygıtları Kullanma Diş Germ innervasyon Geliştirme Analizi

Mezenkimal kök hücre diş hamurundan izole ve prostat kanseri hücre etkileşimi doğrudan ve dolaylı ortak kültür yöntemleri üzerinde temel değerlendirilmesi için iletişim kuralları sağlar. Koşul orta ve trans-şey membranlar dolaylı parakrin etkinliğini çözümlemeye uygundur. Differentially Tohum hücreleri birlikte lekeli doğrudan hücre-hücre etkileşim için uygun bir model olduğunu.

Mezenkimal kök hücre izolasyon hamuru doku ve kanser hücreleri ile ortak kültür ilişkileri incelemek için

Burada insan diş Pulp kök hücre izolasyon ve yayılması için bir protokol Nöronal Farklılaşma süreci sırasında prion protein ifade değerlendirmek için mevcut.

Yalıtım, yayma ve insan diş Pulp kök hücrelerin Nöronal Farklılaşma sırasında Prion Protein ifade

Burada, 3D matrislerde büyüyen akons davranışlarını analiz etmek, doğal gelişimini taklit etmek için bir yöntem sağlıyoruz.

Sinir sistemi gelişimi sırasında axonal büyüme ve davranışı analiz etmek için 3-b kollajen bazlı hydrogels üretimi

Bu makale, eksplant kültür yöntemini kullanarak dental pulpa kök hücrelerinin birincil kültürünü oluşturmak ve bu hücrelerin ICSCRT yönergelerine dayalı olarak karakterizasyonunu yapmak için adım adım bir kılavuz sağlar. Bu protokol ile izole edilen hücreler, daha sonraki uygulamalar için mezenkimal kök hücreler olarak kabul edilebilir.

Dental pulpa kök hücrelerinin birincil kültürü

Bu protokol, fare Dorsal Kök Gangliyonlarının (DRG) tüm mount ve ayrışmış kültürlerinin oluşturulması için yöntemleri ve bunların tümör-sinir etkileşimlerini değerlendirmek için kullanımlarını açıklar.

Dorsal Kök Gangliyon Kültürünün İn Vitro Modellerinin Oluşturulması: Kanser-Sinir Karışmasının Araştırılmasında Tamamlayıcı Yaklaşımlar

Öğrenin diş hamuru hücreleri ile trigeminal ganglion nöronlarının ko-kültür yöntemini. Bu teknik, diş inervasyonu ve nöral onarım mekanizmalarını incelemek için sağlam bir platform sunar.

Diş Hamuru Parakrin Sinyalleri yanıt olarak Neurite Outgrowth Çalışma Co-Kültür Yöntemi

Daha fazla video keşfet