Name: Akış Sitometrisinin Kullanılmasında Eritrosit Kompleman Reseptörü 1 Ölçümü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Öğrenin, akış sitometrisi ve immün boyama kullanarak eritrositlerde CR1 reseptörü yoğunluğunu ölçme yöntemini. Alzheimer ve sistemik lupus eritematozus gibi hastalıklarda reseptör ifadesini değerlendirmek için etkilidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

PROTOKOLÜn optimizasyonuna ve doğrulanmasına katkıda bulunan TÜM URCACyt üyelerine, akış sitometri teknik platformuna, İmmünoloji Anabilim Dalı personeline ve İç Hastalıkları ve Geriatri Anabilim Dalı personeline teşekkür ederiz. Bu çalışma Reims Üniversitesi Hastaneleri (hibe numarası AOL11UF9156) tarafından finanse edilmiştir.

İnsan kanı toplama ve işleme protokolü bölgesel etik komitesi (CPP Est II) tarafından gözden geçirildi ve onaylandı ve protokol numarası 2011-A00594-37'dir. Aşağıdaki protokolinsan kanının işlenmesini açıkladığı için, biyolojik tehlikeli maddelerin atılması na yönelik kurumsal kurallara uyulmalıdır. Laboratuvar önlükleri ve eldivenler gibi laboratuvar güvenlik ekipmanları giyilmelidir.
1. Eritrosit yıkama
NOT: İşlemden bir gün önce, büyükbaş hayvan serum albumininin (BSA) %0,15'ini içeren fosfat tamponlu salin (PBS) içeren bir PBS-BSA tamponu hazırlayın ve 4 °C'de buzdolabına koyun. Bu tampon bir yıkama tamponve seyreltme tampon olarak kullanılacaktır.
<ol><li>50 mL'lik bir tüpiçine 20 mL PBS-BSA pipet.</li>
	<li>Aspire 250 μL sodyum etilendirmin tetraasetik asit (EDTA) kan depolama tüplerinden tam kan antikoagüle ve PBS-BSA 20 mL içeren tüp ekleyin. Kapağı vidalayarak tüpü kapatın. Tüpü 2x ters çevirerek hafifçe karıştırın.</li>
	<li>4 °C'de 10 dk 430 x g'datüpü santrifüj edin. 10 mL'lik pipet kullanarak supernatant'ı çıkarın ve atın. Nazik ve dikkatli pipetleme ile supernatant artık hacminde pelet resuspend.</li>
	<li>Pelet içeren tüpiçine 20 mL soğuk PBS-BSA (4 °C) ekleyin. 4 °C'de 10 dk 430 x g'datüpü santrifüj edin. 10 mL'lik pipet kullanarak supernatant'ı çıkarın ve atın.</li>
	<li>Pelet içeren tüpiçine 20 mL soğuk PBS-BSA (4 °C) ekleyin. 4 °C'de 10 dk 430 x g'datüpü santrifüj edin. Tüpü 4 °C'de santrifüjde bırakın ve bölüm 2'ye gidin.</li>
</ol>2. Eritrosit seyreltme
<ol><li>Pipet 3 mL soğuk PBS-BSA 50 mL'lik bir tüpe yerleştirin ve 4 °C'de buz içinde bir rafta saklayın.</li>
	<li>Eritrositleri içeren santrifüjlü tüpü (adım 1.4) buza yerleştirilen bir rafa koyun.</li>
	<li>Pipet 8 μL peletli eritrositler pipet kullanarak ve eritrosit seyreltme elde etmek için PBS-BSA 3 mL içeren 50 mL tüp ekleyin. Eritrositlerin homojen hücre süspansiyonu elde etmek için tüpü elle hafifçe karıştırın.</li>
</ol>3. Eritrosit immünostaining
<ol><li>Pipet 100 μL eritrosit seyreltme (bölüm 4 elde) ve 1.4 mL tüpler ekleyin.</li>
	<li>4 °C'de 4 30 x g'da5 dk tüpleri santrifüj edin. Santrifüj sırasında, PBS-BSA tamponunda 0,05 g/μL konsantrasyonda biyotinylated anti-CR1 J3D3 antikor seyreltme hazırlayın.</li>
	<li>Santrifüj yapıldıktan sonra supernatant'ı çıkarın ve atın.</li>
	<li>Doğrudan pelete 20 μL biyotinylated anti-CR1 J3D3 ekleyin. Negatif denetimi hazırlamak için, bunun yerine 20 μL PBS-BSA arabelleği ekleyin. Tüpleri hafifçe karıştırın ve 4 °C'de 45 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Kuluçka 45 dk sonra tüplere 750 μL PBS-BSA ekleyin. 4 °C'de 4 30 x g'da5 dk tüpleri santrifüj edin. Supernatant'ı çıkarın ve atın. Tekrar.</li>
	<li>Bu arada, PBS-BSA tampon seyreltilmiş streptavidin-phycoerythrin bir 1:10 seyreltme hazırlayın. Pipet 20 μL streptavidin-phycoerythrin 1:10 seyreltme ve tüpler eklemek. Tüpleri hafifçe karıştırın ve 4 °C'de 45 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Tüplere 750 μL PBS-BSA tamponu ekleyin. 4 °C'de 4 30 x g'de5 dk boyunca iyice karıştırın ve santrifüj edin. Supernatant'ı çıkarın ve atın. Tekrar.</li>
	<li>Santrifüj sırasında, PBS-BSA tampon seyreltilmiş biyotinylated anti-streptavidin antikor 1:100 seyreltme hazırlayın.</li>
	<li>Santrifüj yapıldıktan sonra supernatant'ı çıkarın ve atın.</li>
	<li>Pipet 20 μL 1:100 biyotinylated anti-streptavidin tüpler içine seyreltilmesi. Tüpleri hafifçe karıştırın. Tüpleri 4 °C'de 45 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>45 dk inkübasyondan sonra, pipet 750 μL PBS-BSA tamponu ve tüplere ekleyin. 4 °C'de 4 30 x g'da5 dk tüpleri santrifüj edin. Supernatant'ı çıkarın ve atın. Tekrar.</li>
	<li>Pipet 20 μL streptavidin-phycoerythrin 1:10 seyreltme ve tüpler içine ekleyin. Tüpleri hafifçe karıştırın. Tüpleri 4 °C'de 45 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Pipet 750 μL PBS-BSA tampon ve tüpler içine ekleyin. İyice karıştırın ve 430 x g4 °C'de 5 dk tüpleri santrifüj. Supernatant'ı çıkarın ve atın. Bu adımı 2x tekrarlayın.</li>
</ol>4. İmmünosli eritrosit fiksasyonu
<ol><li>Son santrifüj sırasında, yıkama tamponu PBS-BSA kullanarak% 37 formaldehit 1:100 seyreltme fiksasyon tampon uy.</li>
	<li>Pipet 450 μL fiksasyon tamponve 5 s için girdap ise immünosülereriterit tüpleri (adım 3.13) ekleyin.</li>
	<li>Pipet 5 mL yuvarlak alt tüpler içine tüm sabit hücreleri ve buzdolabında saklayın. NOT: Protokol burada 48 saate kadar duraklatılabilir.</li>
</ol>5. Lekeli eritrositlerin akış sitometri analizi
NOT: Sitometrik okumaların nasıl yapılacağını bilmek için sitometre (Bkz. Malzemeler Tablosu)için operatör kılavuzuna başvurmanız tavsiye edilir. Aşağıdaki önerilen parametreler kullanılan alete uygulanır ve her sitometre için optimize edilmelidir.
<ol><li>Akış sitometresini açın, sonra bilgisayarı açın. Optik sistem sıcaklığını 30 dakika açık bırakarak sabitlesin. Sitometrenin iş istasyonuna bağlı olduğundan emin olmak için yazılımdaki sitometre penceresini kontrol edin (Sitometre Bağlı İleti görüntülenir).</li>
	<li>Arabellek kabının dolu olup olmadığını ve atık kabın boş olduğundan kontrol edin. Temizleme sistemini kullanarak arabellek filtresindeki ve tampon hattındaki hava kabarcıklarını çıkarın. Sitometrenin konsolundaki Prime düğmesine basarak akışkan sistemi prime. Gösterge ışığı kırmızıdan yeşile değişene kadar bekleyin.</li>
	<li>Akışkanları temizlemek için, numune enjeksiyon portuna 3 mL'lik bir temizleme çözeltisi içeren bir tüp yerleştirin ve temizleme solüsyonunun yüksek numune akış hızıyla 5 dk boyunca çalışmasını bekleyin. Distile su ile durulama çözeltisi ile tekrarlayın. Numune enjeksiyon portuna su içeren tüpü bırakın.</li>
	<li>Kalibrasyon boncukları hazırlamak için, pipet 400 μL PBS yuvarlak bir alt tüpün altına. 30 s. PBS içeren yuvarlak alt tüp bir damla ekleyin girdap tarafından güçlü boncuk stokları karıştırın. 30 s için girdap tarafından dikkatle karıştırın.</li>
	<li>Performans denetimini çalıştırın. Yazılımdaki sitometre Kurulum ve İzleme modülünü açın ( Şekil1A). PE immünoleme kullanarak deney için sitometre yapılandırmasının doğru olduğunu doğrulayın. Kalibrasyon boncuk toplu yapılandırma ile doğru olduğunu doğrulayın.</li>
	<li>Boncuk tüpünü numune enjeksiyon portuna takın ve düşük numune akış hızıyla çalıştırın. Tamamlanması yaklaşık 5 dakika süren performans denetimini çalıştırın). Performans denetimi tamamlandıktan sonra, sitometre performansının tatmin edici olduğunu doğrulayın(Şekil 1B). Yazılımdaki sitometre Kurulum ve İzleme modüllerini kapatın.</li>
	<li>Deneme ayarlamak ve uygulama ayarları oluşturmak için tarayıcı araç çubuğundaki Yeni Deneme düğmesini tıklatın ve yeni denemeyi açın. Uygun sitometre ayarlarını seçerek parametreleri belirtin: İleri Dağılım (FSC), Yan Dağılım (SSC) ve PE denemenin açılır menüsünden(Şekil 1C). FSC parametresi için Doğrusal Mod'u ve SSC ve PE parametreleri için Logaritma Modu'nu seçin.</li>
	<li>Açık denemede, Sitometre Ayarları 'nı(Şekil 1D)seçin, ardından Uygulama Ayarları'nıseçin ve genel bir çalışma sayfası oluşturun (Şekil 1E). Optimizasyona rehberlik etmek için gri kutuları ve artı işaretini kullanın.</li>
	<li>Lekesiz kontrol tüpünü sitometreye yükleyin ve Edinme'yiçalıştırın. FSC ve SSC gerilimlerini optimize ederek ilgi alanının (örn. RBC) ölçekte olduğundan emin olun. İlgi alanıyla karışmadan enkazı ortadan kaldırmak için FSC eşik değerini optimize edin.</li>
	<li>FSC vs SSC arsa Üzerinde RBC'lerin etrafına bir kapı çizin. RBC popülasyonunu PE floresan'ın nokta çiziminde görüntüleyin. Gerekirse, negatif popülasyonu gri kutulara yerleştirmek için fotoçarpan tüpünün (PMT) gerilimlerinin floresanını artırın. Lekelenmemiş kontrol tüpünü sitometreden boşaltın.</li>
	<li>Pozitif popülasyonların ölçekte olduğunu doğrulayın. Lekeli kontrol tüpünü sitometreye yükleyin ve Edinme'yi çalıştırın. Pozitif popülasyon tamamen ölçekte görülene kadar pozitif popülasyon için PMT gerilimini küçültün. Sonra lekeli örnek boşaltın.</li>
	<li>Örnekleri kaydetmek ve analiz etmek için, yeni bir küresel çalışma sayfasında, verileri önizlemek için aşağıdaki çizimleri oluşturun: 1) FSC vs SSC ve 2) PE floresan histogram. İlk örneği sitometreye yükleyin ve Edinme'yiçalıştırın.</li>
	<li>FSC vs SSC arsa eritrositler etrafında bir RBC kapısı çizin. Pe floresan histogramında RBC popülasyonunu görüntüleyin. İstatistik görünümünde, GR popülasyonlarında PE floresan parametrelerinin ortalamasını seçin (Şekil 1F).</li>
	<li>Edinme panosunda, durdurma kapısındaki tüm olayları ve kaydedilecek 10.000 olayı seçin (Şekil 1G). Verileri Kaydet'itıklatın. Olay kaydı tamamlandığında, ilk tüpü sitometreden çıkarın. Genel çalışma sayfası çizimleri Şekil 2'dekigibi görünmelidir.</li>
	<li>Aşağıdaki örnekleri yükleyin ve kaydedin.</li>
</ol>6. Eritrosit CR1 yoğunluğunun belirlenmesi
<ol><li>"Düşük" öznesine karşılık gelen örneklerin ortalama floresan yoğunluklarının değerlerini alın(Şekil 3, Tablo I, RBC MFI), "orta" konu(Şekil 4, Tablo D, RBC MFI), "yüksek" özne(Şekil 4, Tablo I, RBC MFI) ve negatif kontrol örneğine(Şekil 3, Tablo I, RBC MFI).</li>
	<li>CR1 yoğunluğunun bir fonksiyonu olarak ortalama floresan yoğunluğunu temsil eden bir grafikte, negatif kontrole karşılık gelen dört noktayı, "düşük" özneyi, "orta" özneyi ve "yüksek" özneyi (mavi noktalar, Şekil 6)yerleştirin.</li>
	<li>Kalibrasyon çizgisini ve denklemini almak için regresyon çizgisini çizin.</li>
	<li>Yoğunluğu belirlenecek deneklere karşılık gelen numunelerin ortalama floresan yoğunluğudeğerlerini alın. (Şekil 5, Tablo D ve I, RBC MFI).</li>
	<li>Ortalama floresan yoğunluklarının değerlerini kullanarak "Y" yerine "Y" yerine denklemi edinin ve CR1/E'nin yoğunluğunu hesaplayın (Şekil 6).</li>
	<li>Ortalama floresan yoğunluk değerlerinin ve belirlenen CR1/E yoğunluğunun kalibrasyon hattındaki bir noktaya karşılık geldiğini grafikte kontrol edin(Şekil 6).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Eritrosit CR1 (CR1/E) yoğunluğunu belirlemek için çeşitli teknikler mevcuttur. Kullanılan ilk teknikler anti-CR1 antikorları31 ile kırmızı kan hücrelerinin agglutinasyonu ve C3b32ile kaplanmış eritrosit varlığında rozet oluşumudur. Bu temel teknikler hızla radiolabeled anti-CR1 antikorlar kullanılarak immünboyama yöntemleri ile değiştirildi1,33. Ayrıca enzime bağlı immünosorbent tsay (ELISA)34</sup...

CR1 (kompleman reseptör tip 1, CD35) eritrositler1,B lenfositler2, monosit hücreler, bazı T hücreleri, foliküler dendritik hücreler3, fetal astrositler4ve glomerüler podositler5gibi birçok hücre tipinin yüzeyinde bulunan 200 kDa transmembran glikoproteindir. CR1 onun ligands C3b müdahale, C4b, C3bi6,7,8,9, ilk kompleman bileşeni bir alt birim, C1q10 ve MBL (mannan bağlayıcı lektin)11 kompleman aktivasyonunu inhibe ve humoral ve hücresel immün yanıt katılır.
Primatlar, insanlar da dahil olmak üzere, eritrosit CR1 karaciğer ve dalak bağışıklık komplekslerinin taşınması nda yer almaktadır, kan arındırmak ve deri veya böbrekler gibi savunmasız dokularda birikimini önlemek için12,13,14. Bağışıklık kompleksleri ve eritrositler arasındaki immün yapışı olgusu CR1 moleküllerinin sayısına bağlıdır15. İnsanlarda CR1/E'nin ortalama yoğunluğu sadece 500'dür (yani eritrosit başına 500 CR1 molekülü). Bu yoğunluk bir bireyden diğerine (100-1.200 CR1/E) ve aynı bireyde bir eritrositten diğerine değişir. "Null" fenotip bazı bireyler az ifade 20 CR1/E16.
CR1/E'nin yoğunluğu, CR1*117,18için gen kodlamasının intron 27'sinde bir nokta mutasyonuna bağlı iki eş-dominant otozomal alel tarafından düzenlenir. Bu mutasyon HindIII enzimi için ek bir kısıtlama alanı üretir. Bu durumda HindIII ile sindirim sonrası elde edilen kısıtlama parçaları CR1 güçlü bir ifade bağlı alel için 7.4 kb (H: yüksek alel) ve alel düşük CR1 ekspresyonu (L: düşük alel) bağlı alel için 6.9 kb. Bu bağlantı Kafkaslar ve Asyalılar bulunur ama Afrika kökenliinsanlarda 19.
Eritrosit CR1'in ekspresyon düzeyi, ekson 13 kodlama SCR 10 (I643T) ve ekson 19 kodlama SCR16 (Q981H) ile nokta nükleotit mutasyonlarının varlığı ile de ilişkilidir. Homozigot 643I/981Q'da yüksek, homozigot 643T/981H bireylerde düşüktür20. Böylece, "düşük" bireyler 150 CR1/E, "orta" bireyler 500 CR1/E, "yüksek" bireyler ise 1.000 CR1/E civarında ifade eder.
Bu eritrosit yoğunluğu polimorfizmine ek olarak CR1, farklı boyutlardaki dört allotipe karşılık gelen bir uzunluk polimorfizmi ile karakterizedir: CR1*1 (190 kDa), CR1*2 (220 kDa), CR1*3 (160 kDa) ve CR1*4 (250 kDa)21 ve kan grubu KN22'yekarşılık gelen bir antijenik polimorfizm .
CR1/E yoğunluğu bilinen üç denek kullanarak CR1/E'nin yoğunluğunu belirlemek için akış sitometrisine dayalı yöntemimizi sintometriye dayanarak sintometrisi, düşük yoğunluklu bir seviye (180 CR1/E), orta yoğunlukseviyesi (646 CR1/E) ve yüksek yoğunluklu bir seviye (966 CR1/E) ifade ederek, akış sitometresi kullanarak anti-CR1 immünoboyalamadan sonra eritrositveya kırmızı kan hücrelerinin (RBC) ortalama floresan yoğunluğunu (MFI) ölçmek kolaydır. Daha sonra CR1/E yoğunluğunun bir fonksiyonu olarak MFI'yi temsil eden standart bir çizgi çizilebilir. CR1/E yoğunluğu bilinmemektedir deneklerin MFI ölçümü ve bu standart çizgi ile karşılaştırılması, bireylerin CR1/E yoğunluğunu belirlemek mümkündür. Bu teknik laboratuvarda uzun yıllardır kullanılmaktadır ve sistemik lupus eritematosus (SLE)23, Edinsel immün yetmezlik sendromu (AIDS)24, sıtma25, ve son zamanlarda Alzheimer hastalığı (AD)26,27 gibi birçok patolojide eritrosit CR1 ekspresyonunda bir azalma tespitetmemizisağlamıştır . Anti-trombotik ilaçlar28'de olduğu gibi CR1'i eritrositlerle çifte hedefleyen ilaçların geliştirilmesi, CR1/E yoğunluğunun değerlendirilmesi ve CR1'i ölçmek için sağlam bir tekniğin kullanılabilirliği gerektirmektedir.
Sunulan protokol tek tekçalışır. Belirli ticari olarak kullanılabilen 96 kuyu plakası kullanan birçok kişide CR1/E'nin yoğunluğunu belirlemek için uyarlanabilir (Bkz. Malzeme Tablosu). Bu amaçla, herhangi bir 96 iyi plaka bizim yöntem adapte etmek kolaydır. Her örnek için eritrositlerin hücre süspansiyonu (0.5 x 106–1 x 10 6 eritrosit) kuyu başına dağıtılır.6 Her kuyu için, ilk birincil anti-CR1 antikor eklenir, sonra streptavidin PE, ikincil anti-streptavidin antikor, ve yine streptavidin PE, bizim yöntem aynı seyreltme kullanarak, ancak hacimleri adapte ve orantılılık saygı.
Cr1 için ölçülecek deneklerin ve deneklerden alınan kan örnekleri aynı anda çekilmeli, buzdolabında 4 °C'de saklanmalı ve 4 °C'de (buz ve/veya buzdolabında) kullanılmalıdır.

<table><tbody><tr><td>1000E Bariyer Ucu</td><td>Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, Fransa</td><td>2079E</td><td>numune pipetleme</td></tr><tr><td>1-100 & mikro; L Eğimli, filtre ucu</td><td>Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Almanya</td><td>S1120-1840</td><td>numune pipetleme</td></tr><tr><td>Biyotinile anti-CR1 monoklonal antikor (J3D3)</td><td>Ticari olmayan monoklonal antikorun evde üretimi, Dr J. Cook'un</td><td></td> izniyle immün <td>boyama</td></tr><tr><td>Bluz</td><td></td><td></td><td>koruması</td></tr><tr><td>Bovin serum albümini (%7,5)</td><td>Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, Fransa</td><td>15260037</td><td>sitometri</td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Thermo Fischer Scientific, F-67403 Illkirch, Fransa</td><td>11176917</td><td>santrifüjleme</td></tr><tr><td>Temiz Çözelti</td><td>BD, F-38801 Le Pont de Claix, Fransa</td><td>340345</td><td>sitometrisi</td></tr><tr><td>Comorack-96</td><td>Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath</td><td>944060P</td><td>raf</td></tr><tr><td>Sitometresi Kurulumu ve İzleme Boncukları Kiti</td><td>BD, F-38801 Le Pont de Claix, Fransa</td><td>655051</td><td>sitometri</td></tr><tr><td>Formaldehit çözeltisi %36,5</td> <td>Sigma Aldrich, F-38070 Saint Quentin Fallavier, Fransa</td><td>F8775-25ML</td><td>Fiksasyon</td></tr><tr><td>10 & mikro; L Mezun, filtre ucu</td><td>Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Almanya</td><td>S1121-3810</td><td>numune pipetleme</td></tr><tr><td>LSRFORTESSA Akış Sitometresi</td><td>BD, F-38801 Le Pont de Claix, Fransa</td><td>647788</td><td>sitometrisi</td></tr><tr><td>Microman Kılcal Pistonlar</td><td>Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath</td><td>067494</td><td>numune pipetleme</td></tr><tr><td>Micronic 1.40 mL yuvarlak tabanlı tüpler</td><td>Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath</td><td>MP32051</td><td>karışımı</td></tr><tr><td>Mikropipet Microman - M25 tipi -</td><td>Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath</td><td>066379</td><td>numune pipetlemesi</td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu Salin (PBS)</td><td>Thermo Fischer Scientific, F-67403 Illkirch, Fransa</td><td>10010031</td><td>sitometrisi</td></tr><tr><td>Pipet PS 325 mm, 10 mL</td><td>Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath</td><td>391952</td><td>numune pipetleme</td></tr><tr><td>tozsuz Nitril Muayenesi eldivenler</td><td>Medline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, ABD</td><td>486802</td><td>numune koruması</td></tr><tr><td>Referans 2 pipet, 0,5-10 ve mikro; L</td><td>Eppendorf Fransa SAS, F-78360 Montesson, Fransa</td><td>4920000024</td><td>numune pipetleme</td></tr><tr><td>Referans 2 pipet, 20-100 ve mikro; L</td><td>Eppendorf Fransa SAS, F-78360 Montesson, Fransa</td><td>4920000059</td><td>numune pipetleme</td></tr><tr><td>Referans 2 pipet, 100-1000 ve mikro; L</td><td>Eppendorf Fransa SAS, F-78360 Montesson, Fransa</td><td>4920000083</td><td>numune pipetleme</td></tr><tr><td>Durulama Çözeltisi</td><td>BD, F-38801 Le Pont de Claix, Fransa</td><td>340346</td><td>sitometrisi</td></tr><tr><td>Yuvarlak tabanlı tüp</td><td>Sarstedt, F-70150 Marnay, Fransa</td><td>55.1579</td><td>sitometri</td></tr><tr><td>Güvenli Kilitli Tüpler, 1.5 mL</td><td>Eppendorf Fransa SAS, F-78360 Montesson, Fransa</td><td>0030120086</td><td>karışımı</td></tr><tr><td>streptavidin R-PE</td><td>Tebu Bio, F-78612 Le Perray-en-Yvelines, Fransa</td><td>AS-60669</td><td>immün boyama</td></tr><tr><td>Konik Santrifüj Tüpleri 50 mL</td><td>Thermo Fischer Scientific, F-67403 Illkirch, Fransa</td><td>10203001</td><td>karışımı</td></tr><tr><td>Vektör anti streptavidin biotin</td><td>Eurobio Ingen, F-91953 Les Ulis, Fransa</td><td>BA-0500</td><td>immün boyama</td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>Scientific Industries, Inc, Bohemya, NY 111716, ABD</td><td>SI-0236</td><td>karışımı</td></tr></tbody></table>

akış sitometrisinin kullanılmasında eritrosit kompleman reseptörü 1 Ölçümü

Measuring Erythrocyte Complement Receptor 1 Using Flow Cytometry

CR1 (CD35, C3b/C4b için Kompleman Reseptör tip 1) aktivasyonu tamamlayan, bağışıklık komplekslerini taşıyan ve humoral ve hücresel immün yanıtlara katılan yaklaşık 200 kDa'lık yüksek molekül ağırlıklı membran glikoproteindir. CR1 eritrositler de dahil olmak üzere birçok hücre tipinin yüzeyinde bulunur ve uzunluk, yapı (Knops veya KN, kan grubu) ve yoğunluk polimorfizmleri sergiler. Eritrosit başına CR1 (CR1/E) başına ortalama yoğunluk eritrosit başına 500 moleküldür. Bu yoğunluk bir bireyden diğerine (100-1.200 CR1/E) ve aynı bireyde bir eritrositten diğerine değişir. Burada cr1/E'nin yoğunluğunu ölçmek için sağlam bir akış sitometrisi yöntemi sitometri sitometri sitometri sitometri sitometri sitometrisi, düşük yoğunluklu olarak ifade eden denekler de dahil olmak üzere, güçlendirici bir immünboyama sistemi yardımıyla sitometri yöntemi ni sintometri sitometrisi sitometrisi sitometrisi sitometri sitometrisi sitometrisi sitometrisi sitometris Bu yöntem, Alzheimer hastalığı (AD), sistemik lupus eritematosus (SLE), AIDS veya sıtma gibi hastalıklarda CR1 eritrosit ekspresyonunun alçaltıcılığını göstermemizi sağlamıştır.

CR1 yoğunluğu bilinen üç deneğin eritrositleri ("düşük" özne [180 CR1/E], "orta" konu [646 CR1/E], ve "yüksek" konu [966 CR1/E]) ve CR1 yoğunluğu nun belirlenmesi gereken iki deneğin eritrositleri, fikotorin flukromoru kullanarak bir anti-CR1 antikor ile birleştirilmiş bir anti-CR1 antikor ile immünosiye edildi. Başlangıçta, düşük-yüksek aralıktaki deneklerin CR1 yoğunluğu radiolabeled antikorlar kullanılarak Scatchard yöntemi29 ile belirlendi. Belirlenen standartlar (düşük, orta ve yüksek) bir ka...

Bu yöntemin amacı, eritrosit CR1 yoğunluğu bilinen üç denek ile karşılaştırarak herhangi bir deneğin eritrositlerinde CR1 yoğunluğunu belirlemektir. Yöntem, deneklerin eritrositlerinin phycoerythrin (PE) kullanılarak güçlendirilmiş bir sisteme bağlı bir anti-CR1 monoklonal antikor ile immünoboya dan sonra akış sitometrisini kullanır.

Akış Sitometrisinin Kullanılmasında Eritrosit Kompleman Reseptörü 1 Ölçümü

CR1 (CD35, Complement Receptor type 1 for C3b/C4b) is a high molecular weight membrane glycoprotein of about 200 kDa that controls complement activation, ...

Bu protokol ilgi hücresel reseptör üzerinde antijenik sitelerin sayısını ölçmek için kullanılabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, düşük yoğunlukta ifade edilen reseptörler için bile sağlam sonuçlar üretmesidir. Bu yöntem CR1 eritrosit ekspresyonunun azaltılmasının değerlendirilmesini sağlar ve bu alzheimer, sistemik lupus eritematosus, AIDS ve sıtma gibi.Bu protokol hücre reseptör yoğunluğunun herhangi bir analizi için yararlıdır ve aynı zamanda floresan mikroskobu ile hücre reseptör ekspresyonu çalışmasına uygulanabilir. Hücre ve antikor dağılımı sırasında tüplerin aralıklarını ve mümkünse ilk analizsırasında bir sitometrik uzman eşliğinde olmamızı öneririz. Akış sitometrisi ile immünboyama ve yoğunluk niceliğinin görsel gösterimi, analiz parametrelerinin nasıl doğru ayarlanıncayakadar ının anlaşılması açısından önemlidir.Analize başlamadan önce, kan depolama tüplerinden 250 mikrolitre sodyum EDTA antikoagüle tam kan ekleyin ve 20 mililitrelik dört derece Santigrat PBS-BSA içeren 50 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin. Tüp içeriğini nazik bir şekilde ters çevirerek karıştırın ve hücreleri santrifüj le döndürün. Supernatant atmak ve dikkatle çözelti kalıntı hacminde pelet ask

measuring-erythrocyte-complement-receptor-1-using-flow-cytometry

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Doğrudan taze hasat fare kemik iliği, dalak veya fetal karaciğer farklılaşma aşamalı özel fare eritroid atalarıdır ve öncüleri, belirlenmesi ve moleküler analiz için bir akış sitometri yöntemi. Tahlil hücre yüzey belirteçleri CD71, Ter119 ve hücre boyutu dayanır.

CD71/TER119 Flow-sitometrik Testi kullanarak Fare eritro-id progenitörlerin Tanımlama ve Analiz

Bu video, bir fare gözünde intravitreal doğumdan sonra floresan biyopartiküllerin mikroglial alımını ölçmek için akış sitometrisini göstermektedir. Akış sitometrisi, CD11b'yi eksprese eden canlı hücreleri tespit eder ve yeşil floresan sergileyen fagositik mikroglia hücrelerini, Ly6C eksprese eden monositler ve Ly6G eksprese eden nötrofiller dahil olmak üzere diğer miyeloid hücrelerden ayırır.

Akış Sitometrisi Kullanılarak İntravitreal Olarak Verilen Floresan Partiküllerin Mikroglial Alımının Ölçülmesi

Bu videoda, insan periferik kan mononükleer hücrelerinde (PBMC'ler) CD4+ ve CD8+ T hücrelerini, γδ T hücrelerini, B hücrelerini, doğal öldürücü (NK) hücreleri ve monositleri tanımlamak için iki florokrom kullanan akış sitometrisi tabanlı bir teknik gösterilmektedir. Hücrelerin yüzey belirteçlerine karşı florokrom konjuge antikorlarla inkübe edilmesinin ardından, hücre alt kümeleri optimal bir akış sitometrik geçit stratejisi kullanılarak tanımlanır.

Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinde İmmün Hücre Alt Kümelerini Tanımlamak için Bir Akış Sitometrisi Testi

Burada, kırmızı kan hücrelerine karşı antikorlar tarafından neden olunan kompleman aktivasyon ölçmek için iki tahlil tarif eder. Mevcut deneylerde üzerinde en büyük avantajı, nicel ve kolay yorumlamak doğasıdır.

Kırmızı kan hücreleri üzerinde antikor kaynaklı kompleman aktivasyon sayısal tespiti için Yöntemler

Monositler, aktive edildiğinde glikolitik metabolizmaya dayanan insan doğuştan gelen bağışıklık sisteminin ayrılmaz bileşenleridir. Taze tam kandaki toplam monositler ve monosit alt popülasyonları tarafından glikoz taşıyıcı ekspresyonunu ve glikoz alımını ölçmek için bir akış sitometrisi protokolü tanımladık.

Basit Akım Sitometrisi Yöntemi Tüm Kan Monosit subpopulations için glikoz alımını ve Glikoz Transporter Anlatım Tedbir

doku homeostazında ve yetersiz fagositik fonksiyonunun korunması patolojisinde dahil olmuştur için mikrogliyal fagositoz kritiktir. Ancak, in vivo mikroglia fonksiyonunu değerlendirmede teknik olarak zordur. Biz tam izleme ve fizyolojik bir ortamda mikroglia fagositik potansiyelini ölçülmesi için basit ama güçlü bir teknik geliştirdiler.

Retina Mikroglial Fagositik Fonksiyonu değerlendirilmesi<em&gt; İn Vivo</em&gt; A Akış Sitometri bazlı analiz kullamlarak

Bu kağıt sitometrisi görüntüleme akışı kullanarak T hücrelerinin karışık bir popülasyonda alloreaktivitesini ölçülmesi için bir yöntemi tarif etmektedir.

Görüntüleme Akım Sitometri Kullanımı T Hücresi alloreaktivitesini Ölçümü

Sitometresi tabanlı hücresel bağlama tahlil anlatılan ve öncelikle bir tarama aracı olarak bir fluorescently etiketli CXC Kemokin ligand 12 (CXCL12) bağlama CXC Kemokin reseptör 4 (CXCR4) inhibe bileşikler tanımlamak için kullanılan bir akış.

Fluorescently etiketli CXC Kemokin Ligand 12 CXC Kemokin reseptör 4 için bağlama bozabilir bileşikler tanımlamak için Akış Sitometresi tabanlı tahlil

Bu çalışmada FcγR etkinleştirilmesinden kaynaklanan Reaktif oksijen türleri (ROS) üretim algılamak için Akış Sitometresi kullanımını gösterir. Bu yöntem değişiklikleri antimikrobiyal ve fagositler yanıt bağışıklık kompleksleri, opsonized mikroorganizmalar veya doğrudan FcγR cross-linking fonksiyonlu Redoks değerlendirmek için kullanılabilir.

Akış sitometrik ölçüm makrofajlar FcγR Cross-linking yanıt ROS üretim

Burada, erken patlama oluşturan birim eritroid (BFU-e) ve koloni oluşturan birim eritroid (CFU-e) progenitörlerinin doğrudan taze fare kemik iliği ve dalağından prospektif izolasyonu için yeni bir akış sitometrik yöntemi tanımladık. Tek hücreli transkriptomik verilere dayanarak geliştirilen bu protokol, dokunun tüm eritroid progenitörlerini yüksek saflıkta izole eden ilk protokoldür.

Patlama Oluşturan Birim ve Koloni Oluşturan Birim Eritroid Progenitörlerinin Fare Dokusundan Akım Sitometrisi ile Tanımlanması ve İzolasyonu

Öğrenin, akış sitometrisi ve immün boyama kullanarak eritrositlerde CR1 reseptörü yoğunluğunu ölçme yöntemini. Alzheimer ve sistemik lupus eritematozus gibi hastalıklarda reseptör ifadesini değerlendirmek için etkilidir.

Akış Sitometrisinin Kullanılmasında Eritrosit Kompleman Reseptörü 1 Ölçümü

Daha fazla video keşfet