Name: Fare Sperm Kapasasyonu Sırasında Glikoliz ve Oksidatif Fosforilasyondaki Değişiklikleri Ölçmek için Hücre Dışı Akı Analizörü Kullanma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Öğrenin fare sperm kapasasyonu sırasında glikoliz ve oksidatif fosforilasyon değişikliklerini hücre dışı akı analizörü ile gerçek zamanlı izlemeyi. Bu yöntem üreme biyolojisi araştırmalarında metabolik profilleri karşılaştırmaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Rockefeller Yüksek Throughput ve Spektroskopi Kaynak Merkezi'nde Dr Lavoisier Ramos-Espiritu destek kabul etmek istiyorum.

Spermler 8-16 haftalık CD-1 erkek farelerden toplanır. Hayvan deneyleri Weill Cornell Medicine'in Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
1. Tsamadan önceki gün
<ol><li>
Sensör kartuşunun ve hücre dışı akı analizörü kallibrantının hazırlanması
	<ol>
<li>Sensör kartuşunu nemlendirmek için sensör kartuşunu XFe96 Hücre Dışı Akı Çıkış Kiti'nden çıkarın ve sensör kartuşunu servis plakasının yanına ters yerleştirin.</li>
		<li>Çok kanallı pipet kullanarak 25 mL çift distile H2O ile bir çözelti haznesini doldurun, yardımcı plakanın her kuyuya 200 μL H2O ekleyin. Sensör kartuşu tekrar yardımcı plakaya yerleştirin ve bir gecede 37 °C'likCO 2 kuluçka makinesine yerleştirin. NOT: Kartuşun en az 4 saat süreyle sulu olması gerekir.</li>
		<li>Aliquot 25 mL hücre dışı akı analizörü calibrant 50 mL konik tüp içine ve bir gecede 37 ° C non-CO2 kuluçka kuluçka.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ConA kaplamalı mikroplakaların hazırlanması
	<ol>
<li>0,5 mg/mL (w/v) stok hazırlamak için 5 mL'lik çift distile H2O'da 2,5 mg ConA'yı çözün.</li>
		<li>Çok kanallı bir pipet kullanarak, 0,5 mg/mL Con A çözeltisinin 50 μL'si ile hücre dışı akı analizörü 96 kuyulu bir plakanın her bir kuyuyu doldurun. Kapağı açık bırakın ve oda sıcaklığında bir gecede tabağı kurutun. NOT: Birden fazla plaka aynı anda kaplanabilir ve kullanıma hazır olana kadar dört hafta boyunca 4 °C'de saklanabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sperm tamponunun hazırlanması
	<ol>
<li>138 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1.7 mM CaCl2, 1.2 mM KH2PO4, 1.2 mM MgSO4, 5.6 mM glukoz ve 1 mM HEPES içeren düşük HEPES içeren 250 mL ekstrasellüler akı analizörü TYH tampon hazırlayın. Tamponu 37 °C'ye ısıtın ve pH'ı 7,4'e ayarlayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Teşekkün günü
<ol><li>Kartuş kalibrasyonu için hazırlık
	<ol>
<li>Yardımcı plakadaki H2O'yu kuyu başına 200°L XF kallibrant ile değiştirin ve CO2 37 °C'li olmayan bir kuluçka makinesinde en az 1 saat inkübatör. NOT: Kalibran yerine steril filtreli PBS, pH 7.4 kullanılabilir.</li>
		<li>37 °C'de 50 mL TYH tamponu ısıtın.</li>
	</ol></li>
	<li>Hücre dışı akı çözümleyicisi için dalga şablonu oluşturma
	<ol>
<li>Hücre dışı akı analizörü açın ve sıcaklığın 37 °C'ye sabitlemesine izin verin.</li>
		<li>Dalga yazılımını açın ve boş bir şablon açarak yeni bir şablon tasarlayın (Bkz. Ek Dosya 1, dalga şablonu).</li>
		<li>Grup tanımları sekmesini aç. Assay ortamını TYH olarak tanımlayın; pH 7.4 ve fare spermi olarak hücre tipi, enjeksiyon stratejileri ve ön tedaviler boş bırakın. Her bir atama koşulu için farklı gruplar oluşturun; Bu örnekte 6 farklı grup bulunmaktadır (TYH, TYH + db-cAMP/IBMX, 2-DG, 2-DG + db-cAMP/IBMX, Ant/Rot, Ant/Rot + db-cAMP/IBMX); dibutyryl cAMP (db-cAMP) ve 3-Izobutyl-1-metilxanthine (IBMX) kapacitation indüklemek için, 2-deoksiglukoz (2-DG) glikoliz inhibitörü olarak, antimisin A (antA) ve rotenon (rot) karmaşık III ve elektron taşıma zincirinin kompleks I inhibitörü olarak. NOT: Kuyular arasındaki değişkenliği hesaba katmak için, her koşul da en az 7-8 kuyu paralel olarak ölçülmelidir.</li>
		<li>Plaka haritası sekmesini açın ve belirli kuyulara gruplar atayarak plaka haritasını tanımlayın. NOT: Dört köşe kuyusu (A1, A12, H1, H12) TYH tamponu (sperm yok) ile doldurulacak ve daha sonra arka plan çıkarma için kullanılacaktır.</li>
		<li>Protokol sekmesini açın, 4 farklı ölçüm döngüsü ekleyin, ilgili bağlantı noktasını seçin ve ölçüm ayrıntılarını edin(Şekil 2, Tablo 1). Enjeksiyondan sonra ölçüvurgulayın ve dengeyi vurgulamayın. </li>
		<li>Tahsin şablonu kaydedin, proje özetini doldurun ve sonuç dosyası için kaydetme konumunu tanımlayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Sensör kartuşuna yüklemek için bileşiklerin hazırlanması
	<ol>
<li>TYH tamponunda 9,8 mg bileşiğin eritilmesi yle 50 mM db-cAMP'ın 2 mL'sini hazırlayın ve IBMX'i 5 mM'lik son konsantrasyona ekleyin. NOT: IBMX, TYH arabelleği nde seyreltildikten sonra çökelme eğilimine sahiptir. Çökeltiler, TYH/db-cAMP/IBMX çözeltisinin 5 dakika boyunca 37 °C'lik bir ısı bloğunda girdap ve kuluçkaya yatırılarak çözülebilir.</li>
		<li>TYH tamponundaki 82.1 mg bileşiği eriterek 500 mM 2-DG'nin 1 mL'sini hazırlayın.</li>
		<li>HER iki ilacı da TYH tamponunda seyrelterek 1 mL 5 M AntA/Rot hazırlayın. NOT: Bileşikler hücre dışı akı analizörü kartuşuna enjekte edilerek 10 kat seyreltilir; bu nedenle, enjeksiyon çözeltilerinin 10 kat daha konsantre olduğundan emin olun.</li>
	</ol></li>
	<li>Fare sperminin izolasyonu
	<ol>
<li>8 ile 16 hafta arasında 3 erkek fareyi izofluran e-posta ile anesteleştirin ve parmak sıkışmasına yanıt alınamadıktan sonra servikal çıkık ile fareleri kurban edin. Kauda epididamids ve vasa deferentia kaldırın.</li>
		<li>Her kauda'yı 24 kuyulu plakaya 500 μL önceden ısıtılmış TYH tamponuna yerleştirin, bir çift çalgılar kullanarak kauda'yı tabağın dibine yerleştirin ve tüy makası ile 5-7 küçük kesi yaparak dokuyu açın.</li>
		<li>Plakayı hemen CO2 37 °C'li olmayan bir kuluçka makinesine aktarın ve spermin 15 dakika boyunca dağılmasını sağlar.</li>
	</ol></li>
	<li>Sensör kartuşunun yüklenmesi
	<ol>
<li>Hücre dışı Akı kitinde A ve D portu ile B ve C bağlantı noktası için iki bağlantı noktası yükleme kılavuzu bulunur. Belirli bir bağlantı noktasını yüklemek için, sensörün kartuşundan kapağı çıkarın ve ilgili bağlantı noktası yükleme kılavuzunun harfini kartuşun sol üst köşesine hizalayın. Enjekte ederken, bağlantı noktası yükleme kılavuzunu yerinde tutmak için enjekte etmeyen elin parmak uçlarını kullanın ve pipet uçlarını bağlantı noktası yükleme kılavuzu deliklerine dikey olarak yerleştirin.</li>
		<li>Port A: Çok kanallı bir pipet kullanarak, her sütuna 20 μL TYH tampon enjekte edin.</li>
		<li>Port B: 22 μL TYH tamponu 1-4 sütununa enjekte edin, 22 μL 500 mM 2-DG'yi 5-8 sütununa ve 25 μL 5 μM AntA/Rot'u 9-12 no'lu kolona enjekte edin.</li>
		<li>Port C: Her sütuna tek sayılarla 25 μL TYH arabellek enjekte edin, 25 μL 10 mM db-cAMP/ 500 μM IBMX'i eşit sayılarla her sütuna enjekte edin.</li>
		<li>Sensör kartuşunu kalibrasyon plakalı hücre dışı akı analizörüne yerleştirin ve tayı başlatın. Kalibrasyon 10 - 15 dk sürer.</li>
	</ol></li>
	<li>Sperm plakalarının hazırlanması
	<ol>
<li>45 mg BSA'yı 15 mL TYH tamponunda (3 mg/mL w/v) çözün ve 5 mL santrifüj tüpte her biri 3 mL BSA/TYH çözeltisi üç ertaminek hazırlayın.</li>
		<li>Her biri 1,5 mL'lik santrifüj tüpünde iki sperm kuyusu birleştirin, hematositometre kullanarak spermi sayın ve spermi 2 x 107 sperm/mL konsantrasyonuna seyreltin. NOT: Hücrelere zarar vermemek için sperm borulamak için kesme pipet uçlarını kullanın.</li>
		<li>700 x g3 dakika sperm santrifüj, supernatant kaldırmak ve TYH tampon 1 mL ekleyin. Santrifüj adımını tekrarlayın, süpernatantı çıkarın ve her sperm süspansiyonu 3 mL BSA/TYH ile 5 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.</li>
		<li>180 μL TYH tamponu her köşeye cona kaplamalı bir plakanın (A1, A12, H1, H12) yerleştirin. ConA kaplı plakanın her boş kuyusunun içine 180 μL sperm süspansiyonu yerleştirin (1.2 x 106 sperm/kuyu).</li>
		<li>Sperm plakasını 1 dk için 250 x g'de santrifüj edin, plakayı 180°'ye döndürün ve 1 dk için 250 x g'de tekrar santrifüj edin (en düşük frenleme oranı 1).</li>
		<li>Ekstrasellüler akı analizöründen kalibrasyon plakasını çıkarın ve sperm plakasını ekleyin. Taramaya devam et.</li>
	</ol></li>
	<li>Veri ayıklama ve analiz
	<ol>
<li>Tahkikatı tamamladıktan sonra kartuşun kaldırılmasını, sonuç dosyasını açın, Dışa Aktar sekmesini tıklatın ve tamamlanan çalıştırmayı GraphPad Prizma dosyası olarak dışa aktarın (Ek Dosya 2: Şekil 3için kullanılan birincil örnek veriler).</li>
		<li>ECAR ve OCR dosyasını Yeni sekmesine ve ardından Yinelenen Aile sekmesine tıklayarak çoğaltma ... ( Şekil3A).</li>
		<li>İlk 7 veri satırını silin (Şekil 3B).</li>
		<li>CAMP/IBMX enjeksiyonundan önceki veri noktasına temel satır 1'i çıkararak normalleştirin. Analyze sekmesine tıklayın, ardından Taban Çizgisi ve Sütun Matematik sekmesini kaldır. İlk Satır, Hesaplama: Oran:Değer/Taban Çizgisive Alt Sütunlar: Alt Sütunu Yokla. Tamam 'ı tıklatın (Şekil 3C).</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+metabolic+analysis+reveals+a+close+link+between+attenuated+mitochondrial+bioenergetic+function+and+enhanced+glycolysis+dependency+in+human+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 292 (1), C125-C136 (2007).</li>
<li>Amo, T., Yadava, N., Oh, R., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+assessment+of+bioenergetic+differences+caused+by+the+common+European+mitochondrial+DNA+haplogroups+H+and+T%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Experimental assessment of bioenergetic differences caused by the common European mitochondrial DNA haplogroups H and T.</a> Gene. 411 (1-2), 69-76 (2008).</li>
<li>Choi, S. W., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+analysis+of+isolated+cerebrocortical+nerve+terminals+on+a+microgram+scale%3A+spare+respiratory+capacity+and+stochastic+mitochondrial+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic analysis of isolated cerebrocortical nerve terminals on a microgram scale: spare respiratory capacity and stochastic mitochondrial failure.</a> Journal of Neurochemistry. 109 (4), 1179-1191 (2009).</li>
<li>de Groof, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+OXPHOS+activity+precedes+rise+in+glycolytic+rate+in+H-RasV12%2FE1A+transformed+fibroblasts+that+develop+a+Warburg+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer%22%5BJournal%5D)">Increased OXPHOS activity precedes rise in glycolytic rate in H-RasV12/E1A transformed fibroblasts that develop a Warburg phenotype.</a> Molecular Cancer. 8, 54(2009).</li>
<li>Chao, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+resistance+and+altered+systemic+glucose+metabolism+in+mice+lacking+Nur77%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Insulin resistance and altered systemic glucose metabolism in mice lacking Nur77.</a> Diabetes. 58 (12), 2788-2796 (2009).</li>
<li>Chang, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilizing+capacity+of+spermatozoa+deposited+into+the+fallopian+tubes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fertilizing capacity of spermatozoa deposited into the fallopian tubes.</a> Nature. 168 (4277), 697-698 (1951).</li>
<li>Austin, C. R., Bishop, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+rodent+acrosome+and+perforatorium+in+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%2C+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Role of the rodent acrosome and perforatorium in fertilization.</a> Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 149 (935), 241-248 (1958).</li>
<li>Ishijima, S., Baba, S. A., Mohri, H., Suarez, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+flagellar+movement+in+hyperactivated+and+acrosome-reacted+golden+hamster+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Reproduction+and+Development%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of flagellar movement in hyperactivated and acrosome-reacted golden hamster spermatozoa.</a> Molecular Reproduction and Development. 61 (3), 376-384 (2002).</li>
<li>Suarez, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+hyperactivation+in+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction+Update%22%5BJournal%5D)">Control of hyperactivation in sperm.</a> Human Reproduction Update. 14 (6), 647-657 (2008).</li>
<li>Goodson, S. G., Qiu, Y., Sutton, K. A., Xie, G., Jia, W., O'Brien, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+substrates+exhibit+differential+effects+on+functional+parameters+of+mouse+sperm+capacitation%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Metabolic substrates exhibit differential effects on functional parameters of mouse sperm capacitation.</a> Biology of Reproduction. 87 (3), 75(2012).</li>
<li>Travis, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+relationships+between+capacitation-dependent+cell+signaling+and+compartmentalized+metabolic+pathways+in+murine+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Functional relationships between capacitation-dependent cell signaling and compartmentalized metabolic pathways in murine spermatozoa.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (10), 7630-7636 (2001).</li>
<li>Urner, F., Leppens-Luisier, G., Sakkas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+tyrosine+phosphorylation+in+sperm+during+gamete+interaction+in+the+mouse%3A+the+influence+of+glucose%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Protein tyrosine phosphorylation in sperm during gamete interaction in the mouse: the influence of glucose.</a> Biology of Reproduction. 64 (5), 1350-1357 (2001).</li>
<li>Danshina, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoglycerate+kinase+2+%28PGK2%29+is+essential+for+sperm+function+and+male+fertility+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Phosphoglycerate kinase 2 (PGK2) is essential for sperm function and male fertility in mice.</a> Biology of Reproduction. 82 (1), 136-145 (2010).</li>
<li>Miki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glyceraldehyde+3-phosphate+dehydrogenase-S%2C+a+sperm-specific+glycolytic+enzyme%2C+is+required+for+sperm+motility+and+male+fertility%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase-S, a sperm-specific glycolytic enzyme, is required for sperm motility and male fertility.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (47), 16501-16506 (2004).</li>
<li>Mori, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+spermatogenic+cell-specific+type+1+hexokinase+%28mHk1-s%29+transcripts+are+expressed+by+alternative+splicing+from+the+mHk1+gene+and+the+HK1-S+protein+is+localized+mainly+in+the+sperm+tail%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Reproduction+and+Development%22%5BJournal%5D)">Mouse spermatogenic cell-specific type 1 hexokinase (mHk1-s) transcripts are expressed by alternative splicing from the mHk1 gene and the HK1-S protein is localized mainly in the sperm tail.</a> Molecular Reproduction and Development. 49 (4), 374-385 (1998).</li>
<li>Westhoff, D., Kamp, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glyceraldehyde+3-phosphate+dehydrogenase+is+bound+to+the+fibrous+sheath+of+mammalian+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase is bound to the fibrous sheath of mammalian spermatozoa.</a> Journal of Cell Science. 110 (15), 1821-1829 (1997).</li>
<li>Nevo, A. C., Rikmenspoel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+of+ATP+in+sperm+flagella%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Theoretical+Biology%22%5BJournal%5D)">Diffusion of ATP in sperm flagella.</a> Journal of Theoretical Biology. 26 (1), 11-18 (1970).</li>
<li>Adam, D. E., Wei, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+transport+of+ATP+within+the+motile+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Theoretical+Biology%22%5BJournal%5D)">Mass transport of ATP within the motile sperm.</a> Journal of Theoretical Biology. 49 (1), 125-145 (1975).</li>
<li>Tombes, R. M., Shapiro, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+termini+of+a+phosphocreatine+shuttle.+Purification+and+characterization+of+two+creatine+kinase+isozymes+from+sea+urchin+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Enzyme termini of a phosphocreatine shuttle. Purification and characterization of two creatine kinase isozymes from sea urchin sperm.</a> Journal of Biological Chemistry. 262 (33), 16011-16019 (1987).</li>
<li>Gomendio, M., Tourmente, M., Roldan, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+mammalian+lineages+respond+differently+to+sexual+selection%3A+metabolic+rate+constrains+the+evolution+of+sperm+size%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+of+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Why mammalian lineages respond differently to sexual selection: metabolic rate constrains the evolution of sperm size.</a> Proceedings of the Royal Society of Biological Sciences. 278 (1721), 3135-3141 (2011).</li>
<li>Tourmente, M., Villar-Moya, P., Rial, E., Roldan, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+ATP+generation+via+glycolysis+and+oxidative+phosphorylation+and+relationships+with+sperm+motility+in+mouse+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Differences in ATP generation via glycolysis and oxidative phosphorylation and relationships with sperm motility in mouse species.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (33), 20613-20626 (2015).</li>
<li>Visconti, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capacitation+of+mouse+spermatozoa.+II.+Protein+tyrosine+phosphorylation+and+capacitation+are+regulated+by+a+cAMP-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Capacitation of mouse spermatozoa. II. Protein tyrosine phosphorylation and capacitation are regulated by a cAMP-dependent pathway.</a> Development. 121 (4), 1139-1150 (1995).</li>
<li>Buck, J., Sinclair, M. L., Schapal, L., Cann, M. J., Levin, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytosolic+adenylyl+cyclase+defines+a+unique+signaling+molecule+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Cytosolic adenylyl cyclase defines a unique signaling molecule in mammals.</a> PNAS. 96 (1), 79-84 (1999).</li>
<li>Visconti, P. E., Bailey, J. L., Moore, G. D., Pan, D., Olds-Clarke, P., Kopf, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capacitation+of+mouse+spermatozoa.+I.+Correlation+between+the+capacitation+state+and+protein+tyrosine+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Capacitation of mouse spermatozoa. I. Correlation between the capacitation state and protein tyrosine phosphorylation.</a> Development. 121 (4), 1129-1137 (1995).</li>
<li>Morgan, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+PKA+inhibition+using+a+chemical+genetic+approach+and+its+application+to+studies+on+sperm+capacitation%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific PKA inhibition using a chemical genetic approach and its application to studies on sperm capacitation.</a> PNAS. 105 (52), 20740-20745 (2008).</li>
<li>Lybaert, P., Danguy, A., Leleux, F., Meuris, S., Lebrun, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+methodology+for+the+detection+and+quantification+of+the+acrosome+reaction+in+mouse+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Histology+and+Histopathology%22%5BJournal%5D)">Improved methodology for the detection and quantification of the acrosome reaction in mouse spermatozoa.</a> Histology and Histopathology. 24 (8), 999-1007 (2009).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bazı metabolik substratların veya kritik metabolik enzimlerin yokluğunda sperm kapaizatif kaybı başarılı döllenmeyi destekleyen önemli bir faktör olarak enerji metabolizmasını ortaya koymuştur. Hücre aktivasyonu sırasında bir metabolik geçiş diğer hücre tiplerinde köklü bir kavramdır, ancak, biz sadece nasıl sperm kapasiasyon sırasında artan enerji talebine metabolizmaadapte anlamaya başlıyor. Hücre dışı akı analizörü kullanarak, sperm kapasitasyonu sırasında glikoliz ve oksidatif fosforilasyondaki değişiklikleri gerçek ...

Kütle spektrometresi uygulaması metabolizma çalışmalarında devrim yarattı. Hedeflenen metabolik profilleme ve metabolomik izleme, enerji metabolizmasındaki değişikliklerin hassas bir şekilde izlenmesine olanak sağlar. Ancak, metabolomik performans başarıyla kapsamlı eğitim gerektirir, deneyimli personel, ve pahalı, son derece hassas kütle spektrometreler her laboratuvar için hazır değil. Son yıllarda, bir hücre dışı akı analizörü kullanarak, Seahorse XFe96 gibi çeşitli hücre tiplerinde enerji metabolizmasında ki değişiklikleri ölçmek için bir vekil yöntemi olarak popüler büyüdü1,2,3,4,5.
Sperm son derece özel hareketli hücrelerdir; kimin görevi yumurta için baba genomu teslim etmektir. Boşaldıktan sonra erkek üreme sisteminden ayrılan spermler hala işlevsel olarak olgunlaşmamış durumdadır ve yumurtaların yeleklerine giremedikleri için yumurtayı dölleyemezler. Onlar kapacitation6,7olarak bilinen bir olgunlaşma sürecinde kadın üreme sistemi ile transit olarak Sperm döllenme yetkinliği elde . Cauda epididimisinden yeni boşalan sperm veya sperm, Ca2+içeren tanımlanmış kapasitasyon ortamlarında inkübasyon veya hücregeçirgen cAMP analogu (örn. dibutyryl-cAMP), kolesterol kabul verici (örneğin, sığır serum albumini, BSA) ve bir enerji kaynağı (örneğin, glikoz). Kapacitation sırasında, sperm asimetrik kamçı ritmi içine hareketlilik deseni değiştirmek, hiperaktivasyon denilen bir yüzme modu temsil 8,9, ve onlar akrozom reaksiyonu geçmesi için yetkili hale7, proteolitik enzimler yumurtaların vestments sindirmek serbest bırakılır. Bu süreçler enerji gerektirir ve somatik hücrelere benzer, sperm glikoliz yanı sıra mitokondriyal TCA döngüsü ve oksidatif fosfor (oksfos)10yoluyla ATP ve diğer yüksek enerjibileşikleri üretmek . Birden fazla çalışma glikoli gerekli ve sperm kapacitation desteklemek için yeterli olduğunu göstermek iken11,12,13,14, okfos katkısı daha az açıktır. Glikolisfiziksel TCA döngüsü ile birleştiğinde diğer hücre türlerinin aksine, sperm son derece bölümlere ayrılmıştır ve ayrı kamer bölmelerinde bu süreçleri korumak için düşünülmektedir: midpiece mitokondriyal makine konsantreleri, glikoli anahtar enzimleri ana parça 15 ile sınırlı gibi görünür ise16. Bu bölümleme, glikoliz tarafından ana parçada üretilen pirüvatın orta parçadaki mitokondriyal okfosu destekleyip desteklemeyeceği ve orta parçada oxphos tarafından üretilen ATP'nin anaparçanın 17,18,19'undistal kısımlarındaki enerji gereksinimlerini desteklemek için kamçının uzunluğu boyunca yeterince hızlı bir şekilde yayılıp dağıtılamayacağı konusunda devam eden bir tartışmayla sonuçlanır. Ayrıca sperm kapasitasyonunda oksfos rolü desteklenir. Sadece oxphos glikoliz daha enerjik olumlu, glikoliz daha 16 kat daha fazla ATP üreten, ancak orta hacim ve mitokondriyal içerik doğrudan eşleri için erkekler arasında rekabet daha büyük derece sergileyen memeli türlerinde üreme fitness ile ilişkilidir20. Bu soruların ele alınması, sperm kapanizasyonu sırasında glikoli ve okfosun göreceli katkılarını incelemek için yöntemler gerektirir.
Tourmente ve ark. 24-iyi ekstrasellüler akı analizörü uygulanan önemli ölçüde farklı sperm performans parametreleri ile yakından ilişkili fare türlerinin enerji metabolizmasını karşılaştırmak için21. Kapasitif olmayan spermin bazal ECAR ve OCR değerlerini raporlamak yerine, fare sperm kapaizasyonu sırasında ki enerji metabolizmasındaki değişiklikleri gerçek zamanlı olarak izlemek için 96 kuyulu hücre dışı akı analizörü kullanarak metodlarını uyarlıyoruz. Oksijen (O2) ve proton (H+)(Şekil 1A)akını ölçerek, spermde glikoliz ve okfosların on iki farklı deneysel koşullarda kamçıyı yenerek gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlayan bir yöntem geliştirdik. Glikoliz sırasında laktat için piruvat ın bozulması ve TCA-döngüsü ile CO2 üretimi nedeniyle, kapasite olmayan ve kapasitasyonlu sperm ekstrüzyonu H+ ispret media içine h+-hassas floropores ile algılanan bir sensör kartuşunun prob ucuna hareketsiz. Buna paralel olarak, oksidatif fosforilasyon ile O2 tüketimi aynı prob ucuna hareketsiz hale getirilen O2-duyarlı florofores ile tespit edilir(Şekil 1B). Serbest bırakılan H+ ve tüketilen O2 etkili tespiti bikarbonat veya fenol kırmızı olmadan düşük tamponlama kapasitesi ile değiştirilmiş bir sperm tampon gerektirir. Böylece, bikarbonat yokluğunda kapacitation indüklemek için, geniş menzilli PDE inhibitörü IBMX22ile birlikte enjekte bir hücre geçirgen cAMP analog kullanımını kabul etti. Üç ek bağımsız enjeksiyon portu farmakolojik aktivatörlerin ve/veya inhibitörlerin enjeksiyonuna izin verir, bu da deneysel manipülasyon nedeniyle hücresel solunum ve glikoliz hızındaki değişikliklerin gerçek zamanlı olarak algılanmasını kolaylaştırır.

<table><tbody><tr><td><güçlü > Reaktifler< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-Deoksi-D-glikoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8375</td><td>2-DG</td></tr><tr><td>3-İzobutil-1-metilksantin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7018</td><td>IBMX; DMSO'da (111.1 mg / ml) 500 mM'lik bir stok çözeltisi hazırlayın ve küçük alikotlarda saklayın</td></tr><tr><td>Antimisin A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td>AntA; DMSO'da (2.7 mg / ml) 5 mM'lik bir stok çözeltisi hazırlayın ve küçük alikotlarda saklayın</td></tr><tr><td>Sığır serum albümini</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1470</td><td>BSA</td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td>CaCl2</td></tr><tr><td>Concanacalin A, Arachis hypogaea'dan (yer fıstığı)</td> <td>Lektin Sigma-Aldrich</td><td>L7381</td><td>ConA</td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>Isothesia</td><td>Henry Schein Hayvan Sağlığı</td><td>1169567761</td><td>İzofluran</td></tr><tr><td>Magnezyum sülfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643</td><td>MgSO4</td></tr><tr><td>N6,2'-O-Dibutiriladenosin 3 ',5'-siklik monofosfat sodyum tuzu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0627</td><td>db-cAMP</td></tr><tr><td>Potasyum klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>KCl</td></tr><tr><td>Potasyum dihidrojen fosfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>KH2PO4</td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Cayman Kimya Şirketi</td><td>13995</td><td>Çürük; DMSO'da (2mg / ml) 5 mM'lik bir stok çözeltisi hazırlayın ve küçük alikotlarda saklayın</td></tr><tr><td>Sodyum bikarbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>NaHCO3-Sodyum</td></tr> <tr><td>klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>NaCl</td></tr><tr><td><güçlü>Ekipman ve malzemeler< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>12 kanallı pipet 10-100 & mu; L</td><td>eppendorf</td><td>ES-12-100</td><td></td></tr><tr><td>12 kanallı pipet 50-300 &mu; L</td><td>vwr</td><td>613-5257</td><td></td></tr><tr><td>37 & derece; C, CO2 inkübatör</td><td>vwr</td><td>1545</td><td></td></tr><tr><td>5 mL cetrifuge tüpleri</td><td>eppendorf</td><td>30119380</td><td></td></tr><tr><td>50 mL konik santrifüj tüpleri</td><td>vwr</td><td>76211-286</td><td></td></tr><tr><td>Plaka adaptörlü santrifüj</td><td>Thermo Scientific</td><td>IEC FL40R</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon kiti</td><td>Dünya Hassas Aletler</td><td>MOUSEKIT</td><td></td></tr><tr><td>40X objektifli ters faz kontrast mikroskobu</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OctaPool Çözelti Rezervuarları, 25 ml, bölünmüş</td><td>Thomas Scientific</td><td>1159X93</td><td></td></tr><tr><td>OctaPool Çözelti Rezervuarları, 25 mL, bölünmüş</td><td>Thomas Scientific</td><td>1159X95</td><td></td></tr><tr><td>Denizatı XFe96 Analizörü</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Denizatı XFe96 FluxPak</td><td>Agilent</td><td>102416-100</td><td>Ayrıca XFe96 FluxPak mini (102601-100) olarak 18 yerine 6 kartuşlu olarak satılmaktadır.</td></tr></tbody></table>

fare sperm kapasasyonu sırasında glikoliz ve oksidatif fosforilasyondaki değişiklikleri Ölçmek için hücre dışı akı analizörü kullanma

Using an Extracellular Flux Analyzer to Measure Changes in Glycolysis and Oxidative Phosphorylation during Mouse Sperm Capacitation

Memeli spermleri kapacitation olarak bilinen bir süreç içinde kadın üreme sisteminde döllenme kapasitesi elde. Kapacitation ile ilişkili süreçler enerji gerektirir. Sperm progresif hareketliliği, kapasitasyon, hiperaktivasyon ve akrozom reaksiyonunu besleyen ATP'yi üreten kaynaklar hakkında devam eden tartışmalar devam etmektedir. Burada, fare sperm kapamanı sırasında enerji metabolizmasındaki değişiklikleri analiz etmek için bir araç olarak hücre dışı akı analizörü uygulaması açıklar. H+ve O2- hassas floropores kullanarak, bu yöntem glikoliz ve oksidatif fosforilasyon un kapasitif olmayan ve kapasitif sperm gerçek zamanlı olarak izlenmesine olanak sağlar. Farklı enerji yüzeyleri ve/veya farmakolojik aktivatörler ve/veya inhibitörlerin varlığında bu titreşmenin kullanılması, farklı metabolik yolların katkısı ve sperm kapacitation sırasında sinyal basamakları ile metabolizma arasındaki kesişim hakkında önemli bilgiler sağlayabilir.

Bu yöntem, fare sperm kapamansırasında glikoliz ve oksfos oranındaki gerçek zamanlı değişiklikleri izlemek için hücre dışı akı analizörü kullanır. Şekil 4, farmakolojik modülatörler olarak tek enerji substratı ve 2-DG ve antimisin ve rotenon olarak glikoz varlığında spermin kapasitif olduğu örnek bir deney göstermektedir. Ekstrasellüler akı analizörü TYH tamponundaki enerji substratı ve farmakolojik modülatörler deneyin amacına bağlı olarak serbestçe seçilebi...

Fare sperm kapamanı sırasında glikoliz ve oksidatif fosforilasyondaki gerçek zamanlı değişiklikleri izlemek için hücre dışı akı analizörü uygulamasını tanımladık.

Fare Sperm Kapasasyonu Sırasında Glikoliz ve Oksidatif Fosforilasyondaki Değişiklikleri Ölçmek için Hücre Dışı Akı Analizörü Kullanma

Mammalian sperm acquire fertilization capacity in the female reproductive tract in a process known as capacitation. Capacitation-associated processes ...

Bu protokol sperm kapaizasyonu sırasında enerji metabolizmasındaki değişiklikleri izlemek için bir hücre dışı akı analizörü uygulamak için kullanılabilir. Bu protokolü, kondansatif olmayan ve kapasitif fare spermi arasındaki glikoliz ve oksidatif fosforilasyondaki değişiklikleri gerçek zamanlı olarak karşılaştırmak için geliştirdik. Tramadan bir gün önce, sensör kartuşunu hücre dışı akı temizleme kitinden çıkarın ve kartuşun ubeyv plakasının yanına ters yerleştirin.Bir çözelti haznesini 25 mililitre çift distile suyla doldurun ve kullanım plakasının her kuyuya 200 mikrolitre su ekleyin, ardından sensör kartuşunu tekrar servis plakasına yerleştirin. Plakayı 37 derece karbondioksit olmayan bir kuvöze yerleştirin. Sonra, 50 mililitrekonik tüp içine ekstrasellüler akı analizörü calibrant 25 mililitre aliquot ve 37 derece santigrat anti-karbondioksit kuluçka içine tüp yerleştirin.ConA kaplı mikro plakalar hazırlamak için, çift distile su beş mililitre ConA 2,5 miligram eritmek ve ConA çözeltisi 50 mikrolitre ile bir ekstrasellüler akı analizörü 96-iyi plaka her kuyu doldurmak için çok kanallı pipet kullanın, sonra plaka bir gecede kurumasını sağlamak için kapağı açık bırakın. Sperm tamp

using-an-extracellular-flux-analyzer-to-measure-changes-glycolysis

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu protokol, hücre dışı akı testi ile primer lösemik hücrelerin hücre dışı asitlenme oranını (ECAR) ve oksijen tüketim oranını (OCR) ölçmek için biyokimyasal bir yaklaşım sağlar. Bu hücrelerin metabolik profilinin değerlendirilmesi, taleplerinin karakterize edilmesine yardımcı olarak kişiselleştirilmiş tedaviye yol açar.

Hücre Dışı Akı Deneyi: Hücrelerin Metabolik Profilini Ölçmek İçin Bir Yöntem

Hücre içi Ca Ölçme<sup&gt; 2 +</supDört Teknikleri ile İnsan rm&gt; Değişiklikler: Konvansiyonel Florometre, Akış Florometre, Sitometrisi ve Tek Hücre Görüntüleme Durduruldu

Herhangi bir hücre tipinin proteomik analizi, sıvı kromatografi kütle spektrometresinden (MS) önce numuneyi dekompleksten arındırmak için başlangıç materyalinin hem saflığına hem de ön fraksiyonlanmasına büyük ölçüde bağlıdır. Ters yıkama teknikleri kullanılarak, kemirgenlerden saf spermatozoa elde edilebilir. Sindirimi takiben, fosfopeptitler TiO2 kullanılarak zenginleştirilebilir.

Kemirgen Epididimal Spermatozoa&#39;lar phosphopeptide Analizi

Glikoliz, çoklu biyolojik sistemlerde tanımlayıcı bir metabolik belirteçtir. H + hücre dışı akışını ölçerek glikolizin izlenmesi yaygındır, ancak kantitatif ve açık olması için düzeltme gerektirir. Burada, hücre dışı asitlenmenin solunum ve glikolitik kaynaklarını ayırt etmek için hücre dışı akı verilerinin nasıl toplanacağını ve düzeltileceğini gösteriyoruz.

Ekstraselüler Asit Üretim Ölçüm ve Analiz Glikolitik Hızı belirleme

Bu teknik oksijen tüketimi ve ekstraselüler asitleştirme oranları explanted fare Retina dokularında bir hücre dışı akı çözümleyicisini kullanarak gerçek zamanlı kayıt açıklar.

Explanted Retina doku hücre dışı akı analizi ile enerji metabolizmasında ölçümü

Burada, iki orta-den geçerek deneyleri Ca2 +etkileri değerlendirilmesi için-sinyalizasyon ve acrosome tepki insan sperm olarak açıklanmıştır. Bu deneyleri bileşikler üzerinde Ca2 +etkileri için büyük miktarda hızlı ve kolay bir ekran için kullanılabilir-insan sperm sinyal ve acrosome reaksiyon.

Orta-den geçerek deneyleri Ca2 +etkileri değerlendirilmesi için eleme-sinyal ve insan Sperm Acrosome reaksiyon

Hematopoetik kök ata hücreleri (HSPCs) kan oluşumu sırasında metabolik plastisite nedeniyle bir farklılaşma durumuna quiescent devlet geçiş. Burada, HSPC'lerin mitokondriyal solunumunu ve glikolizini ölçmek için optimize edilmiş bir yöntem salıyoruz.

Hematopoetik Kök Atasının Hücre Metabolizmasının Analizi

Burada sunulan yöntem, HSPC'lerin hücre dışı asitlenme hızını (ECAR) ve oksijen tüketim hızını (OCR) gerçek zamanlı olarak ölçmek için hücre dışı akı analizörünü kullanarak yapışkan olmayan fare hematopoetik kök ve ilkel progenitör hücrelerinde (HSPC'ler) hücresel biyoenerjetik değerlendirme için optimize edilmiş protokolleri özetlemektedir.

Hücre Dışı Akı Analizörü Kullanılarak Fare Hematopoetik Kök ve İlkel Progenitör Hücrelerinde Hücresel Biyoenerjetik Verilerin Değerlendirilmesi

Sperm mitokondriyal fonksiyonunun yüksek çözünürlüklü respirometri ile analizi, kapalı bir oda sisteminde serbestçe hareket eden spermatozoanın oksijen tüketiminin ölçülmesine izin verir. Teknik, sperm mitokondriyal özellikleri ve bütünlüğü hakkında bilgi sağlayan insan spermatozoasında solunumu ölçmek için uygulanabilir.

İnsan Spermatozoasında Mitokondriyal Fonksiyonu Değerlendirmek için Yüksek Çözünürlüklü Respirometri

Burada açıklanan AcroSensE fare modeli ve canlı hücre görüntüleme yöntemleri, sperm akrozomunun hücre altı bölmesindeki kalsiyum dinamiklerini ve bunların membran füzyonu ve akrozom ekzositozuna yol açan ara adımları nasıl düzenlediğini incelemek için yeni bir yaklaşım sağlar.

Canlı fare sperminde akrozomal kalsiyum dinamiği ve ekzositozun gerçek zamanlı görüntülenmesi

Bu protokol, birincil fare mikrogliasında metabolik yeniden programlamayı niceliklendirmek için glikoliz stres testi yapmanın maliyet etkin bir yolunu tanımlar. İzolasyon ve inflamatuar uyarımdan sonra, taze hazırlanmış, pH-ayarlanmış reaktiflerle hücre dışı asitleşme oranı (ECAR) ölçülür, ardından protein normalizasyonu uygulanarak glikolitik değişimlerin doğru ve tekrarlanabilir değerlendirilmesini sağlar.

Birincil mikrogliada glikolizin ekstraselüler akı testi kullanılarak araştırılması

Öğrenin fare sperm kapasasyonu sırasında glikoliz ve oksidatif fosforilasyon değişikliklerini hücre dışı akı analizörü ile gerçek zamanlı izlemeyi. Bu yöntem üreme biyolojisi araştırmalarında metabolik profilleri karşılaştırmaya yardımcı olur.

Fare Sperm Kapasasyonu Sırasında Glikoliz ve Oksidatif Fosforilasyondaki Değişiklikleri Ölçmek için Hücre Dışı Akı Analizörü Kullanma (Video) | JoVE Journal

Fare Sperm Kapasasyonu Sırasında Glikoliz ve Oksidatif Fosforilasyondaki Değişiklikleri Ölçmek için Hücre Dışı Akı Analizörü Kullanma

Daha fazla video keşfet