Name: In Vitro İnsan Fibroblast Genişlemesini Artırmak için Otolog Trombosit Bakımından Zengin Plazma Üretimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Öğrenin, trombosit bakımından zengin plazma kullanarak in vitro insan fibroblast genişlemesini nasıl artıracağınızı. Bu otolog yöntem, hücre tedavileri için güvenli ve etkili bir protokol sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Akış sitometrisi verileriyle ilgili teknik yardım için Sayın Grégory Schneiter'e teşekkür ederiz; Profesör Muriel Cuendet (Farmakognozi Laboratuvarı, Farmasötik Bilimler Fakültesi ve Cenevre Üniversitesi), Attune akış sitometresinin ve Cytation 3 yüksek verimli mikroskobun kullanımına izin verdiği için; Profesör Brigitte Pittet bilimsel tavsiyeler için.

Çalışma protokolü Helsinki Deklarasyonu'na uyuyordu ve tüm hastalar çalışmaya katılmadan önce yazılı bilgilendirilmiş onam verdiler. Cenevre Üniversitesi Hastaneleri (Cenevre, İsviçre) Plastik, Rekonstrüktif ve Estetik Cerrahi Bölümü'nde abdominoplasti uygulanan sağlıklı kadınlardan deri örnekleri alınmaktadır. Prosedür, Helsinki Deklarasyonu'nun ilkelerine uygundur ve yerel kurumsal etik komitesi tarafından onaylanmıştır (protokol #3126).
1. PRP hazırlanması
NOT: CuteCell-PRP tüpleri (Malzeme Tablosu), kapalı devre sistemde hastanın kanının küçük bir hacminden PRP'nin hızlı bir şekilde hazırlanması için tasarlanmıştır.
<ol><li>Tam kan toplanması NOT: Tıp enstitüsünün toplama protokolüne göre, PRP tüpüne doğrudan bağlı bir kelebek iğnesi kullanarak kolun periferik damarından otolog kan toplayın. Hasta anestezi altındaysa kan doğrudan venöz kanülden çekilebilir.<ol><li>Tüp blister paketini açın. Venöz ponksiyonu gerçekleştirin ve istediğiniz sayıda PRP tüpünü tam kanla doldurun. Tüplerin içindeki vakum, gerekli kan hacminin (~ 10 mL) otomatik olarak toplanmasını sağlayacaktır.</li>
		<li>Kanı antikoagülanla karıştırmak için tüpleri dikkatlice birkaç kez baş aşağı çevirin.</li>
		<li>Bir biyogüvenlik kabininin içinde (sınıf 2), daha fazla kan hücresi sayısı sayımı için 1 mL'lik bir şırınga kullanarak 100 μL toplam tam kanı çıkarın.</li>
	</ol></li>
	<li>Santrifüjleme NOT: Çalıştırmadan önce santrifüjün doğru şekilde dengelendiğinden emin olun.<ol><li>PRP tüplerinde kan toplandıktan sonra, gerekirse, PRP tüpündeki kanla aynı seviyeye kadar su ile bir karşı denge tüpü (ayrı olarak verilir) hazırlayın. Doldurulmuş tüpleri birbirinin karşısındaki santrifüje yerleştirin ve makinenin dengelendiğinden emin olun.</li>
		<li>Numuneleri 5 dakika boyunca 1.500 x g'de santrifüj edin. NOT: İlgili rpm hızını santrifüj üreticisinin talimatlarına göre ayarlayın. Santrifüjlemeden sonra, kan fraksiyone olur. Kırmızı ve beyaz kan hücreleri jelin altında sıkışır ve trombositler jelin yüzeyine yerleşir (Şekil 1).</li>
	</ol></li>
	<li>Plazma süpernatanındaki trombosit birikintisini yeniden askıya almak için PRP tüpünü 20 kat ters çevirin. NOT: Trombositlerin jelden tamamen ayrıldığından emin olun. Plazma berrak ve şeffaftan bulanıklığa değişmelidir. Trombosit agregaları varsa, plazma ile toplanmalıdır.</li>
	<li>PRP toplamak için, 10 mL'lik bir şırıngaya bağlı bir şırınga transfer cihazı kullanarak plazma çözeltisini tüpten alın. NOT: Her tüpten yaklaşık 5 mL PRP elde edilecektir. PRP çözeltisi artık son ortam hazırlığında karıştırılmaya hazırdır. Çözelti, hematoloji analizörü ve kullanımını içeren gelecekteki adımlara kadar güvenlik kabininin altında oda sıcaklığında (RT) tutulabilir.</li>
	<li>PRP'yi kullanmadan önce, otomatik bir hematoloji analizörü kullanarak trombosit konsantrasyonunu, ortalama trombosit hacmini ve kırmızı ve beyaz kan hücrelerinin sayısını belirleyin (Malzeme tablosu). Bunu yapmak için, çözeltinin 100 μL'sini dikkatlice geri çekin ve 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın. NOT: PRP,% 5-20 v / v arasındaki bir konsantrasyonda otolog bir kültür takviyesi olarak kullanılır. PRP'nin optimal konsantrasyonu her hücre hattı için belirlenmelidir. Fibrin pıhtı oluşumunu önlemek için, son kültür ortamına 2 U / mL heparin eklenmelidir.</li>
</ol>2. FBS veya PRP takviyeli ortamlarda otolog fibroblastların ve kültürün izolasyonu
<ol><li>Cilt numunelerini fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 50 mL'lik bir polipropilen tüpte hafifçe çalkalayarak yıkayın.</li>
	<li>Cilt örneği nispeten büyükse (>10 cm2), numuneyi 150cm2'lik bir doku kültürü kabının kapağına (epidermal yan aşağı) yerleştirin. Bir çift forseps ve makas kullanarak deri altı yağ dokusunu çıkarın. Dokunun kurumasını önlemek için, PBS'de birkaç dakikada bir dokuyu durulayın. NOT: Daha küçük numuneler için daha küçük doku kültürü kabı kullanın.</li>
	<li>Yağ kesme işlemi tamamlandığında, steril bir neşter kullanarak dokuyu yaklaşık 0,5 cm x 1,5 cm'lik şeritler halinde kesin.</li>
	<li>Steril 15 mL'lik bir tüpe 5 mL kollajenaz-dispaz karışımı (Malzeme Tablosu; 14 Wünsch ünitesi/mL) ekleyin.</li>
	<li>Kesilen dokuyu tüpe aktarın, doku parçalarının çözeltiye batırılmasını sağlayın. Tüpü güvenli bir şekilde kapatın.</li>
	<li>Tüpleri 37 ° C'de bir inkübatöre yerleştirin ve 150 dakika boyunca orbital sallantıya sahip olun. İnkübasyondan sonra, dokuyu içeren tüpü biyogüvenlik kabinine yerleştirin.</li>
	<li>Steril 100 mm'lik bir kültür kabının kapağını biyogüvenlik kabinine baş aşağı yerleştirin. Sindirilmiş doku çözeltisini sıçramadan 100 mm'lik kültür kabının dibine aktarın. Tüpte herhangi bir doku parçası kalırsa, doku parçalarını 100 mm'lik kültür kabının altına aktarmak için steril 1 mL'lik bir pipet veya steril forseps kullanın.</li>
	<li>Epidermis şeridi yukarı bakacak şekilde, sağlam epidermis tabakasını iki çift forseps kullanarak dermisten ayırın. Doku şeridinin dermisini bir çift forseps ile ve epidermisin kenarını başka bir çift forseps ile tutun. Dermis ve epidermisi iki parça halinde soyun, ayrılan parçaları aynı kapakta tutun. Bu adımı hızlı bir şekilde gerçekleştirmeye çalışın ve her doku parçası için manipülasyonu tekrarlayın.</li>
	<li>Dermal parçaları PBS içeren yeni bir 100 mm kültür kabına aktarın.</li>
	<li>Laboratuvar forsepslerini kullanarak, dermal parçaları 3 mL% 0.3 tripsin / PBS içeren 15 mL'lik bir polipropilen tüpe yerleştirin. 37 ° C'lik bir su banyosunda 10-20 dakika inkübe edin ve tüpü her 2-3 dakikada bir birkaç kez ters çevirin.</li>
	<li>Enzimatik reaksiyonu durdurmak için, 3-5 mL buz gibi soğuk tam büyüme ortamı (Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamı [DMEM] veya% 10 FBS içeren RPMI) ekleyin. Tüpü birkaç kez kuvvetlice vorteksleyin. Dermal kalıntıları gidermek için fibroblast süspansiyonunu 85 μm'lik bir naylon ağdan (50 mL'lik bir tüpün üstüne yerleştirilmiş) filtreleyin.</li>
	<li>150 x g'de, 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüj. Süpernatantı aspire edin ve peleti 100−1.000 μL tam büyüme ortamında yeniden askıya alın.</li>
	<li>Hücre süspansiyonu ile karıştırılmış tripan mavisi (x2 seyreltme faktörü) kullanarak, hemositometrenin odasını doldurarak toplam ve canlı hücrelerin sayısını sayın. NOT: Hücre canlılığı, enzimatik sindirim için kullanılan koşullara bağlıdır. Hücre iyileşmesini ve hücre canlılığını arttırmak için, cilt örneği daha küçük parçalara ayrılabilir.</li>
	<li>25cm2'lik bir doku kültürü şişesinde 5 mL tam FBS büyüme ortamında (DMEM, 56 ° C'de 60 dakika boyunca inaktive edilmiş% 10 FBS,% 1 1 M HEPES tampon çözeltisi,% 100x esansiyel olmayan amino asit karışımı,% 100x L-glutamin,% 100x penisilin / streptomisin,% 1 100x sodyum piruvat plakası 3−10 x 10 x4 hücre. 37 °C'de inkübe edin. NOT: Canlı fibroblastlar 24 saat içinde şişeye yapışacak ve 2-3 gün içinde iğ şeklini sergilemeye başlayacaktır.</li>
	<li>2. günde, yapışkan olmayan hücreler içeren ortamı aspire edin ve taze ortam ekleyin. NOT: Kültür ortamındaki ölü hücreler canlı fibroblastların büyümesini etkilediğinden, yapışkan olmayan, ölü hücreler kültürden uzaklaştırılmalıdır.</li>
	<li>Kültür% 70-80 akıcılığa ulaşana kadar ortamı her 3-4 günde bir değiştirin.</li>
	<li>Fibroblastları hasat etmek için, PBS ile yıkayın ve inkübatörde 37 ° C'de 3 dakika boyunca tripsin / EDTA çözeltisi ile inkübe edin.</li>
	<li>Reaksiyonu durdurmak için, 3-5 mL sıcak tam büyüme ortamı (% 10 FBS içeren DMEM veya RPMI) ekleyin. Hemositometre ile hücreleri saymak için hücre süspansiyonunun bir alikotunu alın. Süspansiyonu 200 x g'de 5 dakika santrifüj edin ve ortamı aspirasyonla çıkarın.</li>
	<li>PRP besiyerindeki fibroblastın (DMEM, %20 PRP, %1 1 M HEPES tampon çözeltisi, %1 100x esansiyel olmayan amino asit karışımı, %1 100x L-glutamin, %1 100x penisilin/streptomisin, %1 100x sodyum piruvat, 2 U/mL heparin) inkübatörde 37 °C'de kültürlenmesi. NOT: Önerilen minimum hücre yoğunluğu 4.000 canlı hücre/cm2'dir.</li>
	<li>PRP'nin fibroblast proliferasyonu üzerindeki etkilerini değerlendirmek için, farklı PRP konsantrasyonlarına (%1, %5, %10, %20, %30, %40 ve %50) ve 2 U/mL heparin veya klasik kültür ortamı koşullarında (%10 FBS) PRP besiyerinde kuyu başına 8 x 103 hücre yoğunluğunda 24 kuyucuk plakasında tohum fibroblastları (pasaj 2). 7 günlük kültürden sonra, hücrelere hayati bir boya (hücre proliferasyon menekşesi) ekleyin ve proliferasyonu akış sitometrisi ile değerlendirin.</li>
	<li>Sitoiskelet yeniden düzenlemelerini incelemek için, tam FBS büyüme DMEM'inde 1 x 10 5 hücre / mL konsantrasyonunda 96 kuyu siyah / berrak düz taban plakasındaki tohum hücreleri (bkz. adım 2.14) 24 saat boyunca%0.5 FBS ile desteklenmiştir. Hücreleri 7 gün boyunca% 10 FBS veya farklı PRP konsantrasyonları (% 1,% 5,% 10,% 20,% 30,% 40 ve% 50) ile tedavi edin.<ol><li>Fibroblastları 10 dakika boyunca% 4 paraformaldehit ile sabitleyin ve RT'de 5 dakika boyunca% 0.1 Triton X-100 ile geçirgenleştirin. fibroblastları 50 mL 5 U / mL faloidin ile lekeleyin, PBS ile 2 kez yıkayın ve 5 dakika boyunca 50 mL 1 mg / mL 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile işaretleyin. Sitasyon 3 hücreli görüntüleme multimod okuyucu (BioTek) kullanılarak faloidin boyanması görüntülendi.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Kumar, S., Mahajan, B. B., Kaur, S., Singh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+therapies+in+dermatology%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+and+Aesthetic+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Autologous therapies in dermatology.</a> The Journal of Clinical and Aesthetic Dermatology. 7 (12), 38-45 (2014).</li>
<li>Martin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+survey+on+cellular+and+engineered+tissue+therapies+in+Europe+in+2009%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+A%22%5BJournal%5D)">The survey on cellular and engineered tissue therapies in Europe in 2009.</a> Tissue Engineering. Part A. 17 (17-18), 2221-2230 (2011).</li>
<li>Stunova, A., Vistejnova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dermal+fibroblasts-A+heterogeneous+population+with+regulatory+function+in+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine+%26+Growth+Factor+Reviews%22%5BJournal%5D)">Dermal fibroblasts-A heterogeneous population with regulatory function in wound healing.</a> Cytokine & Growth Factor Reviews. 39, 137-150 (2018).</li>
<li>Thangapazham, R. L., Darling, T. N., Meyerle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+skin+properties+with+autologous+dermal+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Alteration of skin properties with autologous dermal fibroblasts.</a> International Journal of Biological Sciences. 15 (5), 8407-8427 (2014).</li>
<li>Costa-Almeida, R., Soares, R., Granja, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts+as+maestros+orchestrating+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts as maestros orchestrating tissue regeneration.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (1), 240-251 (2018).</li>
<li>Weiss, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+cell+therapy%3A+will+it+replace+dermal+fillers%5BTitle%5D)+AND+%22Facial+Plastic+Surgery+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Autologous cell therapy: will it replace dermal fillers.</a> Facial Plastic Surgery Clinics of North America. 21 (2), 299-304 (2013).</li>
<li>Ichim, T. E., O'Heeron, P., Kesari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts+as+a+practical+alternative+to+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts as a practical alternative to mesenchymal stem cells.</a> Journal of Translational Medicine. 16 (1), 212(2018).</li>
<li>Gstraunthaler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternatives+to+the+use+of+fetal+bovine+serum%3A+serum-free+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22ALTEX%22%5BJournal%5D)">Alternatives to the use of fetal bovine serum: serum-free cell culture.</a> ALTEX. 20 (4), 275-281 (2003).</li>
<li>Karnieli, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+consensus+introduction+to+serum+replacements+and+serum-free+media+for+cellular+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">A consensus introduction to serum replacements and serum-free media for cellular therapies.</a> Cytotherapy. 19 (2), 155-169 (2017).</li>
<li>van der Valk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+Bovine+Serum+%28FBS%29%3A+Past+-+Present+-+Future%5BTitle%5D)+AND+%22ALTEX%22%5BJournal%5D)">Fetal Bovine Serum (FBS): Past - Present - Future.</a> ALTEX. 35 (1), 99-118 (2018).</li>
<li>Cavallo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-Rich+Plasma%3A+The+Choice+of+Activation+Method+Affects+the+Release+of+Bioactive+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Platelet-Rich Plasma: The Choice of Activation Method Affects the Release of Bioactive Molecules.</a> BioMed Research International. 2016, 6591717(2016).</li>
<li>Peng, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-Rich+Plasma+for+Skin+Rejuvenation%3A+Facts%2C+Fiction%2C+and+Pearls+for+Practice%5BTitle%5D)+AND+%22Facial+Plastic+Surgery+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Platelet-Rich Plasma for Skin Rejuvenation: Facts, Fiction, and Pearls for Practice.</a> Facial Plastic Surgery Clinics of North America. 27 (3), 405-411 (2019).</li>
<li>Fadadu, P. P., Mazzola, A. J., Hunter, C. W., Davis, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+concentration+yields+in+commercially+available+platelet-rich+plasma+%28PRP%29+systems%3A+a+call+for+PRP+standardization%5BTitle%5D)+AND+%22Regional+Anesthesia+and+Pain+Medicine%22%5BJournal%5D)">Review of concentration yields in commercially available platelet-rich plasma (PRP) systems: a call for PRP standardization.</a> Regional Anesthesia and Pain Medicine. 44, 652-659 (2019).</li>
<li>Berndt, S., Turzi, A., Pittet-Cuenod, B., Modarressi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+Platelet-Rich+Plasma+%28CuteCell+PRP%29+Safely+Boosts+In+Vitro+Human+Fibroblast+Expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Autologous Platelet-Rich Plasma (CuteCell PRP) Safely Boosts In Vitro Human Fibroblast Expansion.</a> Tissue Engineering. Part A. 25 (21-22), 1550-1563 (2019).</li>
<li>Zeng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+safety+studies+on+autologous+cultured+human+skin+fibroblast+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Preclinical safety studies on autologous cultured human skin fibroblast transplantation.</a> Cell Transplantation. 23 (1), 39-49 (2014).</li>
<li>Lee, E. C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+Autologous+Cultured+Fibroblast+Cells+as+a+Treatment+for+Patients+with+Facial+Contour+Defects%3A+A+Clinical+Replication+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cosmetics%2C+Dermatological+Sciences+and+Applications%22%5BJournal%5D)">Efficacy of Autologous Cultured Fibroblast Cells as a Treatment for Patients with Facial Contour Defects: A Clinical Replication Study.</a> Journal of Cosmetics, Dermatological Sciences and Applications. 7, 306-317 (2017).</li>
<li>Eca, L. P., Pinto, D. G., de Pinho, A. M., Mazzetti, M. P., Odo, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+fibroblast+culture+in+the+repair+of+aging+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Dermatologic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Autologous fibroblast culture in the repair of aging skin.</a> Dermatologic Surgery. 38 (2), 180-184 (2012).</li>
<li>Nilforoushzadeh, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+fibroblast+suspension+for+the+treatment+of+refractory+diabetic+foot+ulcer%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Journal+of+Dermatology%2C+Venereology+and+Leprology%22%5BJournal%5D)">Autologous fibroblast suspension for the treatment of refractory diabetic foot ulcer.</a> Indian Journal of Dermatology, Venereology and Leprology. 82 (1), 105-106 (2016).</li>
<li>Cowper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Platelet+Lysate+as+a+Functional+Substitute+for+Fetal+Bovine+Serum+in+the+Culture+of+Human+Adipose+Derived+Stromal%2FStem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Human Platelet Lysate as a Functional Substitute for Fetal Bovine Serum in the Culture of Human Adipose Derived Stromal/Stem Cells.</a> Cells. 8 (7), 724(2019).</li>
<li>Atashi, F., Jaconi, M. E., Pittet-Cuenod, B., Modarressi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+platelet-rich+plasma%3A+a+biological+supplement+to+enhance+adipose-derived+mesenchymal+stem+cell+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">Autologous platelet-rich plasma: a biological supplement to enhance adipose-derived mesenchymal stem cell expansion.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 21 (3), 253-262 (2015).</li>
<li>Martinez-Zapata, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+platelet-rich+plasma+for+treating+chronic+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22The+Cochrane+Database+of+Systematic+Reviews%22%5BJournal%5D)">Autologous platelet-rich plasma for treating chronic wounds.</a> The Cochrane Database of Systematic Reviews. (5), (2016).</li>
<li>Cervelli, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+platelet-rich+plasma+and+hyaluronic+acid+in+the+loss+of+substance+with+bone+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Skin+%26+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">Use of platelet-rich plasma and hyaluronic acid in the loss of substance with bone exposure.</a> Advances in Skin & Wound Care. 24 (4), 176-181 (2011).</li>
<li>Nicoli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+hidradenitis+suppurativa+treatment+using+platelet-rich+plasma+gel+and+Hyalomatrix%5BTitle%5D)+AND+%22International+Wound+Journal%22%5BJournal%5D)">Severe hidradenitis suppurativa treatment using platelet-rich plasma gel and Hyalomatrix.</a> International Wound Journal. 12 (3), 338-343 (2015).</li>
<li>Gentile, P., Bottini, D. J., Spallone, D., Curcio, B. C., Cervelli, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+platelet-rich+plasma+in+maxillofacial+surgery%3A+clinical+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Craniofacial+Surgery%22%5BJournal%5D)">Application of platelet-rich plasma in maxillofacial surgery: clinical evaluation.</a> The Journal of Craniofacial Surgery. 21 (3), 900-904 (2010).</li>
<li>Saleem, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adjunctive+Platelet-Rich+Plasma+%28PRP%29+in+Infrabony+Regenerative+Treatment%3A+A+Systematic+Review+and+RCT%27s+Meta-Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Adjunctive Platelet-Rich Plasma (PRP) in Infrabony Regenerative Treatment: A Systematic Review and RCT's Meta-Analysis.</a> Stem Cells International. 2018, 9594235(2018).</li>
<li>Everts, P. A., Pinto, P. C., Girao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+pure+platelet-rich+plasma+injections+for+facial+skin+rejuvenation%3A+Biometric+instrumental+evaluations+and+patient-reported+outcomes+to+support+antiaging+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cosmetic+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Autologous pure platelet-rich plasma injections for facial skin rejuvenation: Biometric instrumental evaluations and patient-reported outcomes to support antiaging effects.</a> Journal of Cosmetic Dermatology. 18 (4), 985-995 (2019).</li>
<li>Fiaschetti, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+resonance+imaging+and+ultrasound+evaluation+after+breast+autologous+fat+grafting+combined+with+platelet-rich+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Magnetic resonance imaging and ultrasound evaluation after breast autologous fat grafting combined with platelet-rich plasma.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 132 (4), 498-509 (2013).</li>
<li>Gentile, P., Scioli, M. G., Orlandi, A., Cervelli, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+Reconstruction+with+Enhanced+Stromal+Vascular+Fraction+Fat+Grafting%3A+What+Is+the+Best+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Breast Reconstruction with Enhanced Stromal Vascular Fraction Fat Grafting: What Is the Best Method.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 3 (6), 406(2015).</li>
<li>Modarressi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platlet+Rich+Plasma+%28PRP%29+Improves+Fat+Grafting+Outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Plastic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Platlet Rich Plasma (PRP) Improves Fat Grafting Outcomes.</a> World Journal of Plastic Surgery. 2 (1), 6-13 (2013).</li>
<li>Muraglia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+Medium+Supplements+Derived+from+Human+Platelet+and+Plasma%3A+Cell+Commitment+and+Proliferation+Support%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Culture Medium Supplements Derived from Human Platelet and Plasma: Cell Commitment and Proliferation Support.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 5, 66(2017).</li>
<li>Ferrao, A. V., Mason, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+heparin+on+cell+proliferation+and+type-I+collagen+synthesis+by+adult+human+dermal+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">The effect of heparin on cell proliferation and type-I collagen synthesis by adult human dermal fibroblasts.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1180 (3), 225-230 (1993).</li>
<li>Gonzalez-Delgado, P., Fernandez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypersensitivity+reactions+to+heparins%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Hypersensitivity reactions to heparins.</a> Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 16 (4), 315-322 (2016).</li>
<li>Atashi, F. S. B., Nayernia, Z., Pittet-Cuénod, B., Modarressi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+Rich+Plasma+Promotes+Proliferation+of+Adipose+Derived+Mesenchymal+Stem+Cells+via+Activation+of+AKT+and+Smad2+Signaling+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Platelet Rich Plasma Promotes Proliferation of Adipose Derived Mesenchymal Stem Cells via Activation of AKT and Smad2 Signaling Pathways.</a> Stem Cell Research & Therapy. 5 (8), (2015).</li>
</ol>

Bu proje Regen Lab SA tarafından finanse edilmiştir. Sarah Berndt, Regen Lab'ın hücre terapisi baş proje yöneticisidir ve Regen Lab SA tarafından istihdam edilmektedir. Antoine Turzi, RegenLab'ın CEO'sudur.

Otolog fibroblastların yara hücresi tedavisinde diğer dolgu maddelerine kıyasla doğal bir alternatif olarak kullanılmasının avantajları arasında iyi biyouyumluluk, minimal yan etkiler ve hasat ve kullanım kolaylığı sayılabilir. Bununla birlikte, bu terapötikleri günlük klinik ortamda kullanmadan önce, büyüme özelliklerini tanımlamak ve transplantasyondan önce ve sonra izole fibroblastların biyolojik fonksiyonunu ve güvenliğini değerlendirmek için uygun klinik öncesi çalışmalar gereklidir. Bu nedenle, izolasyon işleminden...

Rejeneratif tıp, yaş, hastalık veya travma nedeniyle hasar gören doku ve organları iyileştirmeyi veya değiştirmeyi ve konjenital kusurları düzeltmeyi amaçlar. Otolog tedavide, hücreler veya dokular bir hastadan çekilir, genişletilir veya değiştirilir, daha sonra donöre yeniden verilir. Bu terapötik form, dermatoloji alanında geniş bir potansiyele sahiptir1. Otolog fibroblast tedavisinde, bir hastanın fibroblastları kırışıklıkları, ritidleri veya akne izlerini tedavi etmek için kültürlenir ve yeniden enjekte edilir. Fibroblastlar dermisteki ana fonksiyonel hücreler olduğundan, otolog fibroblastların enjeksiyonu yüz gençleştirmede diğer tedavilerden daha faydalı olabilir2.
Deride, fibroblastlar hücre dışı proteinlerin (yani kollajen, elastin, hyaluronik asit ve glikozaminoglikanlar) sentezinden ve salgılanmasından sorumludur. Ayrıca normal cilt homeostazında ve yara iyileşmesinde hücre fonksiyonunu, göçünü ve hücre-matriks/hücre-hücre etkileşimlerini düzenleyen büyüme faktörlerini serbest bırakırlar3. Dermal fibroblastlar, estetik ve plastik cerrahi prosedürlerinde cilt yara iyileşmesi4, doku rejenerasyonu5 veya dermal dolgu maddeleri için potansiyel bir klinik hücre tedavisi olarak tanıtılmıştır6. Bazı çalışmalar, rejeneratif tıp bağlamında, fibroblastların mezenkimal kök hücrelerden daha pratik ve etkili bir hücre tedavisi olabileceğini düşündürmektedir7.
Klinik uygulamalar için yeterli sayıda fibroblast elde etmek için, hücre genişlemesi genellikle zorunludur. Ex vivo / in vitro hücre kültürü, hücre yapışmasını ve çoğalmasını desteklemek için büyüme faktörleri, proteinler ve enzimlerle desteklenmiş bazal ortam gerektirir. Fetal sığır serumu (FBS), hücre kültürü ortamı için yaygın bir takviyedir, çünkü fetal kan 1) yetişkin kanına kıyasla büyüme faktörleri bakımından zengindir ve 2) düşük antikor içeriği sunar8. Hücre tedavisi ilerledikçe, FBS'nin kültür ortamına eklendiği klasik hücre kültürü koşullarının güvenliği konusunda endişeler vardır. Ayrıca, şimdi FBS'yi alternatif9 ile değiştirme eğilimi var. Birkaç FBS yedeği umut verici sonuçlar göstermiştir10.
Burada trombositten zengin plazma (PRP) alternatifi seçildi ve PRP'nin CuteCell-PRP adlı standart bir preparatını üretmek için tıbbi bir cihaz geliştirdik. Bu cihazın kullanım amacı, GMP koşulları altında otolog hücrelerin in vitro genişlemesi için bir kültür ortamı takviyesi olarak kullanılmak üzere otolog PRP'nin hazırlanmasıdır.
PRP, plazmada konsantre trombosit süspansiyonu olarak tanımlanır. 1) ihtiyaç duyulan kan miktarı, 2) kullanılan cihaz türleri ve 3) santrifüjleme protokolünde farklılık gösteren çok sayıda hazırlık protokolü olduğundan, ortaya çıkan trombosit konsantrasyonları kan bazal değerinin biraz üstünden 10 katından fazlasına kadar değişir. Ek olarak, PRP preparatları değişken seviyelerde kırmızı ve beyaz kan hücresi kontaminasyonu içerir. Bu nedenle "PRP" terminolojisi, biyolojik bileşimlerinde ve potansiyel terapötik etkilerinde büyük farklılıklar gösteren ürünleri tanımlamak için kullanılır.
Çoğu çalışmada, FBS ikamesi, aktive edilen farklı PRP konsantrasyonları kullanılarak (trombin veya kalsiyum ile) elde edilir. Bu yapay aktivasyon, trombosit büyüme faktörlerinin 15 dakikadan 24 saate kadar11 saate kadar derhal ve önemli bir şekilde salınmasına neden olur. Bu nedenle, trombosit aktivasyonunun, kademeli trombosit degranülasyonundan büyüme faktörlerinin yavaş salınımının gerekli olduğu hücre kültürlerindeki uygulamalar için istenmeyen bir durum olduğuna inanılmaktadır.
PRP tedavisi, konsantre plazma12'de otolog trombositlerin hazırlanmasını içerir. Optimal trombosit konsantrasyonu belirsizdir ve PRP13'ü hazırlamak için çok çeşitli ticari cihazlar mevcuttur. Bu standardizasyon eksikliği, çalışmalar arasındaki tutarsızlıktan kaynaklanmaktadır ve enjeksiyonun dozu ve zamanlaması ile ilgili bir kara kutuya yol açmıştır. Bu protokol, %100 otolog ex vivo kültür modelinde cilt fibroblastlarını genişletmek için bu özel PRP cihazını kullanarak otolog PRP elde etmek için bir prosedürü açıklamaktadır.

<table><tbody><tr><td>96 kuyulu siyah açık düz dipli</td><td>BD Falcon</td><td>353219</td><td>32/kutu</td></tr><tr><td>Hücre izi Menekşe Boya</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>C34557</td><td>180 tahlil</td></tr><tr><td>CuteCell PRP</td><td>Regen Lab SA</td><td>CC-PRP-3T</td><td>Paket başına 3 tüp</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>1 mg</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>52400-025</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270106</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Glutamin 200 mM</td><td>Gibco</td><td>25030024</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Hematoloji Sayacı</td><td>Sysmex</td><td>KK-21N</td><td></td></tr><tr><td>Heparin 5000E Likemin</td><td>Drossapharm AG</td><td></td><td>0,5 mL</td></tr><tr><td>HEPES Tampon Çözeltisi 1M</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Liberaz DH</td><td>Roche</td><td>5401054001</td><td>Paket başına 2x 5 mg</td></tr><tr><td>MEM NEAA 100x</td><td>Gibco</td><td>11140-035</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Na Piruvat 1mg/mL</td><td>Gibco</td><td>11360-039</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Penisilin streptomisin</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Phalloidin alexa Fluor 488</td><td>Moleküler Problar</td><td>A12379</td><td>300 birim</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Tripsin 1x %0.25</td> <td>Gibco</td><td>25050-014</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Tripsin EDTA %0.25</td> <td>Gibco</td><td>25200056</td><td>100 mL</td></tr></tbody></table>

in vitro İnsan fibroblast genişlemesini artırmak için otolog trombosit bakımından zengin plazma Üretimi

Production of Autologous Platelet-Rich Plasma for Boosting In Vitro Human Fibroblast Expansion

Günümüzde otolog fibroblastların cilt onarımı için kullanımına büyük klinik ilgi vardır. Çoğu durumda, in vitro cilt hücrelerinin kültürü gereklidir. Bununla birlikte, ksenojenik veya allojenik kültür ortamını kullanan hücre kültürünün bazı dezavantajları vardır (yani, enfeksiyöz ajan iletimi veya yavaş hücre genişlemesi riski). Burada, bir hastanın kendi trombosit bakımından zengin plazması (PRP) kullanılarak insan derisi fibroblast hücrelerinin in vitro genişlemesi için otolog bir kültür sistemi geliştirilmiştir. İnsan dermal fibroblastları abdominoplasti yapılırken hastadan izole edilir. Kültürler, fetal sığır serumu (FBS) veya PRP ile desteklenmiş bir ortam kullanılarak 7 güne kadar takip edilir. PRP preparatlarında kan hücresi içeriği, proliferasyonu ve fibroblast farklılaşması değerlendirilir. Bu protokol, özel bir tıbbi cihaz kullanarak standartlaştırılmış, aktive edilmemiş bir PRP preparatı elde etme yöntemini açıklamaktadır. Hazırlık sadece bir tıbbi cihaz (CuteCell-PRP) ve santrifüj gerektirir. Bu cihaz, yeterli tıbbi uygulama koşulları altında uygundur ve 5 dakika boyunca 1.500 x g'lık tek, yumuşak bir spin santrifüjleme gerektiren tek adımlı, aprilojenik ve steril bir kapalı sistemdir. Santrifüjlemeden sonra, kan bileşenleri ayrılır ve trombosit bakımından zengin plazma kolayca toplanır. Bu cihaz, insan hücrelerinin in vitro genişlemesi için bir hücre kültürü takviyesi olarak kullanılabilecek hızlı, tutarlı ve standartlaştırılmış bir PRP preparatına izin verir. Burada elde edilen PRP, kırmızı ve beyaz kan hücrelerinin tercihli olarak uzaklaştırılmasıyla, birlikte tam kana kıyasla 1.5 kat trombosit konsantrasyonu içerir. PRP'nin FBS'ye (7.7x) kıyasla hücre proliferasyonunda artırıcı bir etki gösterdiği ve PRP tedavisi üzerine fibroblastların aktive olduğu gösterilmiştir.

Bu patentli teknoloji, standartlaştırılmış PRP preparatları üretmek için kullanılan basit, hızlı ve tekrarlanabilir bir tıbbi cihazdır. 1.500 x g'de 5 dakikalık santrifüjlemeden sonra (ayırıcı jel teknolojisi nedeniyle) PRP'nin venöz tam kandan hazırlanmasını sağlayan tek adımlı, tamamen kapalı bir sistemdir. Santrifüjleme sonrası elde edilen PRP, jelin altına oturan kırmızı ve beyaz kan hücrelerinden temizlenir. Birkaç tüp inversiyonundan sonra jelin üstünde bulunan trombositler plazmada tekrar askıda tutulur v...

Bu protokol, %100 otolog fibroblast kültür sisteminde hücrelerin in vitro genişlemesini artırmak için PRP üreten bir cihaz sunar.

In Vitro İnsan Fibroblast Genişlemesini Artırmak için Otolog Trombosit Bakımından Zengin Plazma Üretimi

There is currently great clinical interest in the use of autologous fibroblasts for skin repair. In most cases, culture of skin cells in vitro is ...

Bu protokol, hastanın kendi trombosit bakımından zengin plazması ve beş dakika boyunca standartlaştırılmış bir preparat ile insan fibroblast kültürü için otolog bir sistemdir. PRP, kültürde fibroblastın büyük bir hücre genişlemesini teşvik eder. Otolog hücre tedavileri için masif dere ve güvenli hücre genişlemesine ihtiyaç duyduğunuzda PRP'yi hücre takviyesi olarak kullanarak bu yöntemi kullanmanızı tavsiye ederim.Bu protokolü denediğinizde PRP bütünlüğünü kontrol etmenizi tavsiye ederim. Plazmanız, kırmızı kan hücrelerinin yokluğunda çok temiz olmalıdır. Aktardığınızda, çok dikkatli bir şekilde yapmanız gerekir.Ve dokunuzun sindirimi ile ilgili olarak, devam etmeden önce çok temiz olması gerekir. Başlamak için, kanı antikoagülanla karıştırmak için kanla dolu trombosit bakımından zengin plazma veya PRP tüplerini dikkatlice üç kez baş aşağı çevirin. Kan örneklerini sabit 45 derecelik açılı bir rotorda beş dakika boyunca 1500g'de santrifüj edin ve tüpleri dengeleyin.Santrifüjlemeden sonra, fraksiyone edilmiş kan, jelin yüzeyindeki ayırıcı jel ve trombositlerin altında sıkışmış kırmızı ve beyaz kan hücrelerine sahiptir. Plazma süpernatanındaki trombosit birikintisini yeniden askıya almak için PRP tüpünü 20 kez yavaşça ters çevirin. Trombositlerin jelden tamamen ayrıldığından ve plazmanın berrak ve şeffaftan bulanıklığa değişmesinden emin olun.10 mililitrelik bir şırıngaya bağlı bir transfer cihazı kullanarak plazma çözeltisini tüpten toplayın. Cilt örneklerini PBS ile 50 mililitrelik bir polipropilen tüpe yerleştirin ve tüpü yavaşça sallayın. Cilt örneği nispeten büyükse, epidermal tarafı aşağı bakacak şekilde 150 santimetrekarelik bir doku kültürü kabının kapağına yerleştirin.Bir çift forseps ve makas kullanarak deri altı yağ dokusunu çıkarın. Dokunun kurumasını önlemek için, PBS'de birkaç dakikada bir dokuyu durulayın. Yağ alımı tamamlandığında, cilt örneklerini yaklaşık 0,5 x 1,5 santimetre şeritler halinde kesmek için bir neşter kullanın.Daha sonra, steril 15 mililitrelik bir tüpe beş mililitre Kollajenaz / Dispase karışımı ekleyin. Kesilen dokuyu tüpe aktarın. Doku parçalarının çözeltiye batırıldığından emin olun ve tüpü güvenli bir şekilde kapatın.Tüpleri 150 dakika boyunca orbital sallanarak 37 santigrat derecede bir inkübatöre yerleştirin. İnkübasyondan sonra, dokuyu içeren tüpü biyogüvenlik kabinine taşıyın. 100 milimetrelik steril bir kültür kabının kapağını biyogüvenlik kabinine baş aşağı yerleştirin.Doku süspansiyonunu sıçramadan 100 milimetrelik kültür kabının altına aktarın. Tüpte herhangi bir doku parçası kalırsa, parçaları kültür kabının altına aktarmak için steril bir mililitrelik pipet veya steril forseps kullanın. Epidermis yukarı bakacak şekilde, dermisi bir çift forseps ile tutun.Epidermisin kenarını başka bir forseps çifti ile kavrayın ve dermis ile epidermisi birbirinden ayırın. Ayrılan parçaları aynı kapakta tutarak, dermal parçaları PBS içeren yeni bir 100 milimetrelik kültür kabına yerleştirin. Daha sonra, laboratuvar forsepslerini kullanarak, dermal parçaları üç mililitre% 0.3 Tripsin PBS içeren 15 mililitrelik bir polipropilen tüpe aktarın.Tüpü 37 santigrat derecelik bir su banyosunda inkübe edin ve tüpü birkaç kez ters çevirerek içeriği her iki ila üç dakikada bir karıştırın. 10 ila 20 dakika sonra, üç ila beş mililitre buz gibi soğuk tam büyüme ortamı ekleyerek reaksiyonu durdurun. Tüpü birkaç kez kuvvetlice vorteksleyin.Fibroblastları içeren süspansiyonu 85 mikronluk bir naylon ağdan 50 mililitrelik bir tüpe filtreleyin. Fibroblast çözeltisini 150 g'da 10 dakika boyunca santrifüj edin. Süpernatantı aspire edin ve hücre sayımı için hücre peletini 100 ila 200 mikrolitre tam büyüme ortamında yeniden askıya alın.Hücreleri 25 santimetrekarelik bir doku kültürü şişesinde kaplayın. Ardından, şişeyi 37 santigrat derecede inkübe edin. Yapışkan olmayan hücreleri içeren ortamı ertesi gün ve yine her üç ila dört günde bir değiştirin.Fibroblastlar% 70 ila% 80 akıcılığa ulaştığında, PBS ile yıkayın ve Tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin. Şişeyi 37 santigrat derecede üç dakika inkübe ettikten sonra, üç ila beş mililitre sıcak tam büyüme ortamı ekleyerek reaksiyonu durdurun. Ardından, hücre süspansiyonunu beş dakika boyunca 200 g'da santrifüj edin.Süpernatantı aspirasyonla çıkarın. PRP ortamında fibroblastları kültürleyin ve 37 santigrat derecede inkübe edin. Önerilen minimum hücre yoğunluğu, santimetre kare başına 4.000 canlı hücredir.10 farklı hastadan tam kan işlenerek PRP üretmek için özel bir tıbbi cihaz kullanıldı. Cihaz, kırmızı kan hücrelerinin ve beyaz kan hücrelerinin çoğunu çıkardı. PRP'deki ortalama trombosit konsantrasyonu, tam kandaki trombosit konsantrasyonundan yaklaşık %50 daha yüksekti.Otolog fibroblastlar% 10 FBS ile ortamda veya% bir ila% 50 arasında değişen PRP konsantrasyonlarına sahip ortamlarda yetiştirildiYedi günlük kültürden sonra, ortamı değiştirmeden,% 20 PRP ile hazırlanan kültürler daha fazla sayıda canlı fibroblast sergiledi. PRP, FBS'ye kıyasla 7.7 kata kadar proliferasyon arttırıcı olarak güçlü etkilere sahipti. Phalloidin boyaması, PRP aktivasyonu üzerine gözlenen morfolojik değişikliğin, fibroblast aktivasyonunun bir imzası olan F-aktin reorganizasyonu ile ilişkili olduğunu göstermiştir.Hızlı hücre genişlemesinin önemli bir endişesi, genomik modifikasyon riskidir. Bunu değerlendirmek için, hücrelerinizin genomik stabilitesini değerlendirmek için karşılaştırmalı genomik hibridizasyon testi yapabilirsiniz. Bu tekniğin temel avantajı, FBS'yi daha güçlü bir otolog biyolojik takviye olan bir PRP ile değiştirmektir.Bununla, araştırmacı herhangi bir ksenojenik madde ilavesi olmadan daha hızlı hücre büyütebilir. Bu tekniği klinik uygulamadan önce ex vivo genişlemeye ihtiyaç duyan diğer hücre tipleri için de kullanabiliriz, örneğin keratinosit veya mezenkimal kök hücre.

production-autologous-platelet-rich-plasma-for-boosting-vitro-human

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

İnsan trombosit lizat, büyüme faktörleri ve hücre kültüründe güçlü bir ek zengin bir kaynak. Bu protokol, zengin plazma, trombosit başlayarak, çeşitli donma-çözülme döngüsünden performans ve trombosit parçaları tüketen insan trombosit lizat büyük bir havuz hazırlama süreci sunar.

Hayvan Serum Ücretsiz İnsan Kök Hücre Kültürleri Verimli Ek olarak Pooled İnsan Trombosit Lizat (pHPL) hazırlanması

Bu video, megakaryositlerin farklılaşması ve trombosit oluşumu için bir teknik göstermektedir. İnsan göbek kordonu kanından izole edilen hematopoietik kök progenitör hücreler, trombopoietin varlığında olgun megakaryositlere farklılaşır. Olgun megakaryositler, tek tek trombositlere yol açan proplateletler adı verilen sitoplazmik uzantılar üretir.

Megakaryositlerin Farklılaşması ve Trombosit Oluşumu için İn Vitro Yöntem

Bu video, trombosit sayımı taraması, kanın toplanması ve santrifüjlenmesi ve trombositlerin izole edilmesi yoluyla yüksek kaliteli Trombositten Zengin Plazmanın (PRP) hazırlanmasını göstermektedir. Bu PRP, doku yenilenmesi ve iyileşmesi için terapötik uygulamalarda kullanılır.

İnsan Periferik Kanından Trombositten Zengin Plazma Hazırlanması

Lökosit-Trombositten Zengin Fibrin (L-PRF), benzersiz fibrin mimarisine, zenginleştirilmiş trombositlere ve bol miktarda büyüme faktörüne sahip otolog trombosit konsantrelerinin FDA onaylı bir preparatını temsil eder. Burada, L-PRF'nin hasta başı üretimi için bir protokol sunmanın yanı sıra, tek eksenli test ve sütür tutma gücü testi dahil olmak üzere mekanik özelliklerini değerlendiriyoruz.

Lökosit-trombosit Zengin Fibrin, Yeni Bir Biyomateryalinin Karakterizasyonu

Burada sunulan, mekanistik çalışmalar, hastalık modelleme ve tarama uygulamaları için uygun, çift kutuplu çok kuyulu bir plakada 48 dokudan oluşan paralel bir kültür için tasarlanmış bağ dokuları üretmek için bir protokoldür. Protokol, farklı organ ve türlerden fibroblastlarla uyumludur ve burada insan primer kardiyak fibroblastlarla örneklenmiştir.

Fibroblast Türetilmiş İnsan Tarafından Tasarlanmış Bağ Dokusu Tarama Uygulamaları için

Trombositten zengin plazma (PRP), at kas-iskelet sistemi rahatsızlıklarının tedavisinde kullanılır. Farklı teknikler, değişen trombosit ve lökosit konsantrasyonları ile PRP verir. Bu makale, at kanından PRP elde etmek için bir yöntemi açıklamaktadır.

At Kanından Trombositten Zengin Plazma Elde Etmek için Basit Bir Çift Santrifüj Tüpü Yöntemi

Ön çapraz bağ (ACL) kısmi gözyaşı onarmak için bir yama olarak gelecek uygulamalar için, insan ACL türetilmiş hücreler, in vitro olarak genişletilebilir ve doku mühendisliği iskeleleri yetiştirilen rekonstrüktif prosedürler sırasında elde edilen dokudan izole edilmiştir. Hücresel yapışma ve morfolojisi sonra iskele yüzeyinde biyouyumluluk onaylamak için yapıldı.

Cerrahi Alma, İzolasyon ve<em&gt; In vitro</em&gt; Doku Mühendisliği Uygulamaları için İnsan Ön Çapraz Bağ-türevli Hücreleri Genişleme

Bu yazının üretimi, karakterizasyonu ve normal birincil insan özofagus fibroblast ve de-cellularized domuz iskele içinde ekilmiş skuamöz epitel hücrelerinden hazırlanan bir dokuya işlenmiş 3D özofagus yapı potansiyel kullanımlarını açıklar. Sonuçlar normal insan yemek borusunda benzer olgun tabakalı epitel oluşumunu göstermektedir.

3D Doku mühendisliği İnsan Özofagus Mukozal Modeli Üretimi, Karakterizasyonu ve Potansiyel Kullanımları

Tüm viral kodlama dizilerinden yoksun yüksek kapasiteli adenoviral vektörlerin üretilmesi için bir protokol sunulmuştur. Vektör genomunda bulunan transgenlerin klonlanması, hedef güdümlü endonükleazlara dayanmaktadır. Yapışık hücreler olarak büyütülen ve süspansiyon halinde üretilen üretici hücrelerde virüs amplifikasyonu, trans halinde viral genler sağlayan yardımcı bir virüse dayanır.

İnsan Adenovirüs Tip 5 dayanarak Yüksek Kapasiteli Adenoviral Vektörler klonlanması ve Büyük Ölçekli Üretim

Biz üç boyutlu yeniden insan kornea gibi epitel (RHCE) doku modelini kullanan bir göz tahrişi testi geliştirdi. Test göz irritan ve korozif malzemeler (GHS kategorileri 1 ve kombine 2) ve etiketleme (GHS yok Kategori) gerekmez olanlar arasında ayrım yapabiliyor.

Yeniden İnşa İnsan Kornea gibi Epitelyal (RHCE) Doku Modeli kullanılarak Göz tahriş Kimyasalların Tehlike Tanımlaması Göz tahrişi Testi (EIT)

Öğrenin, trombosit bakımından zengin plazma kullanarak in vitro insan fibroblast genişlemesini nasıl artıracağınızı. Bu otolog yöntem, hücre tedavileri için güvenli ve etkili bir protokol sunar.

In Vitro İnsan Fibroblast Genişlemesini Artırmak için Otolog Trombosit Bakımından Zengin Plazma Üretimi

Daha fazla video keşfet